Спосіб діагностики алергії, харчової непереносимості і корисності харчових продуктів

Винахід відноситься до медицини, зокрема, до імунології, алергології, дієтології і може застосовуватися для діагностики алергії, харчової зношу непереносності і корисності харчових продуктів для будь-якого живого організму (людини, тварини). Відомий спосіб діагностики алергії реакціями нейтрофілів крові (В.А. Фрадкин, 1985), заснований на показнику ушкодження нейтрофілів. Відомий також спосіб діагностики харчової алергії подвійним сліпим провокаційним тестом з використанням плацебо-ДСПТИП [Bock S.A. et al. Double-blind, placebo-controlled food challenge (DBPCFC) as an office procedure: a manual // J.Allergy Clin. Immunol. - 1988. - Vol.82.-P.986.], що полягає в постановці тесту на підозрілий у відношенні алергії харчовий продукт при вживанні невеликої його кількості випробуваною людиною повторно в зростаючих дозах (починаючи від дози 125-500мг із наступним подвоєнням дози через кожні 15-60 хвилин) і визначенні реакції організму. Якщо дозу продукту в 10г пацієнт переносить без розвитку реакції, результат тесту вважають негативним; при наявності алергії після вживання конкретного харчового продукту в людини з'являються симптоми захворювання (диспепсія, задишка, тахікардія, гіпотонія, кропивниця, діарея та ін.) і тест вважають позитивним. Недоліком описаних способів є неспецифічність тесту з ушкодженням нейтрофілів крові і відсутність регламентації для його використання при визначенні непереносності харчових продуктів. Крім того тестування з вживанням підозрілих на алергію харчових продуктів in vivo займає тривалий період часу (у день тестується реакція на один чи невелике число харчових алергенів) і може сприяти розвитку побічних реакцій або ускладнень для пацієнта. Найбільш близьким по суті до пропонованого є спосіб діагностики алергійних захворювань [див. патент РФ №2098826, МПК6G01N33/53, 33/48, опубл. 10.12.1997] шляхом постановки навантажувального тесту з антигеном теофіліном in vitro і одночасного визначення показників крові, по зміні яких проводять діагностику, при цьому одночасно з постановкою тесту з теофіліном як антигеном для визначення показників крові проводять реакцію спонтанного розеткоутворення з еритроцитами барана і при кількості розеткоутворюючих нейтрофілів, що дорівнює 1067 у 1мкл крові і менше, а теофілінрезистентних Т-лімфоцитів - 27% і менше, - діагностують алергійне захворювання. Основним недоліком цього способу є його недостатня інформативність для діагностики різних форм алергійних захворювань, а також істотна неспецифічність методу оцінки імунних порушень, що звужує область його практичного застосування. При цьому не розроблені умови для діагностики харчової алергії і непереносності харчових продуктів, не визначені умови для об'єктивної оцінки можливого корисного впливу речовини, що тестується, на організм. В основу винаходу покладено завдання такого удосконалення способу діагностики алергії, харчовій непереносності і корисності харчових продуктів, при якому за рахунок використання як антигену речовини, що тестується, і визначення як показника крові тіол-дисульфідного співвідношення (ТДС) розширюється область діагностики різних видів алергії, у тому числі і харчової, крім того, з'являється можливість діагностики непереносності харчових продуктів або їх корисного впливу на досліджуваний організм, пропонований спосіб дозволяє проводити одночасне тестування практично необмеженої кількості алергенів in vitro, що є ще і безпечним для пацієнта. Означене завдання досягається завдяки тому, що в способі діагностики алергії, харчової непереносності і корисності харчових продуктів шляхом постановки навантажувального тесту з антигеном in vitro і одночасного визначення показників крові, по зміні яких проводять діагностику, згідно винаходу як антиген використовують речовину, що тестується, а як зміну показників крові визначають тіол-дисульфідне співвідношення (ТДС) по відношенню до контрольного виміру, здійснюваному після введення в кров фізіологічного розчину (негативний коні роль) та гістаміну (позитивний контроль), при цьому ТДС визначають багаторазово протягом часу інкубації, достатнього для виявлення ранньої і/або пізньої реакції організму, але не менше, ніж протягом 24 годин, причому в процесі визначення ТДС у кров повторно вводять речовину, що тестується, в інтервалі часу не менше 0,5-3,0 години, а кожну наступну дозу речовини, що тестується, збільшують у 2-4-8 разів і більше, потім будують графік залежності величини ТДС від часу інкубації, а для проведення діагностики порівнюють площу цієї залежності з показниками контрольних вимірів; для визначення алергійної реакції речовини, що тестується, оцінюють величину зменшення площі кривої залежності ТДС від часу інкубації в межах величини позитивного контролю; для визначення непереносності речовини, що тестується, оцінюють величину зменшення площі кривої залежності ТДС від часу інкубації в порівнянні з негативним контролем, але не сягаючи величини позитивного контролю; для визначення корисного впливу речовини, що тестується, оцінюють величину збільшення площі кривої залежності ТДС від часу інкубації в порівнянні з негативним контролем. Причинно-наслідковий зв'язок між пропонованою сукупністю ознак і медичними результатами, що досягаються при їх реалізації, полягає у наступному. Кожен біологічний індивідуум має неповторний генотип, що реалізується індивідуальним спектром біохімічних і ферментативних реакцій, у тому числі і для взаємодії з продуктами харчування, лікарськими чи іншими уживаними речовинами. У залежності від можливого результату такої взаємодії реакція на організм може бути оцінена як корисна, шкідлива чи індиферентна. Установити об'єктивні критерії такого впливу на біохімічні процеси допомагає саме пропонований спосіб, що дозволяє оцінити дію екзогенних речовин, що тестуються, на характер окислювально-відновних процесів, що протікають, баланс про-антиоксидантного стану, а також рівень неспецифічної резистентності і адаптаційних можливостей організму через оцінку стану тіол-дисульфідного обміну. По своїй суті тіол-дисульфідне співвідношення в крові на рівні макроорганізму відображає інтегральний біохімічний баланс "здоров'я-хвороба". Речовини, що сприяють підвищенню відновних процесів в організмі, потенційно можуть відігравати роль корисних для здоров'я факторів, а ті, що впливають у зворотному напрямку, навпаки, збільшувати недостатність адаптаційних механізмів або сприяти погіршенню біохімічного і фізіологічного гомеостазу, а також розвитку або поглибленню патологічних процесів. Для вибору діагностичних критеріїв проводили дослідження у 37 осіб з алергійними захворюваннями, а також у 78 пацієнтів з відсутністю алергії з використанням комплексу біохімічних тестів і методів алергологічної діагностики in vitro. Для виявлення алергії до різних алергенів (пилковим, побутовим, лікарським, інфекційним, харчовим) застосовували скарифікаційний метод, а також навантажувальний тест із конкретним антигеном з кров'ю in vitro. При постановці навантажувального тесту в пацієнта робили забір крові з ліктьової вени в об'ємі 15мл, змішували її з 5% розчином цитрату натрію. Потім цитратну кров інкубували з різними алергенами, причому через 30 хвилин, 1 годину і 3 години після початку інкубації в пробірку з кров'ю повторно додавали послідовно збільшену в 2, 4, і 8 разів, відповідно, дозу конкретного алергену. Одночасно перед початком інкубації, а потім через 30 хвилин, 1 годину, 3 години і 24 години інкубації крові з алергеном визначали вміст тіолових (-SH) і дисульфідних (-SS-) груп у лізаті цільної крові методом амперметричного титрування з нітратом срібла, після чого обчислювали тіол-дисульфідне співвідношення ([-SH]/[-SS-]=ТДС). Таким чином, досліджували ТДС у крові в динаміці з інтервалами в 30 хвилин, 1 годину, 3 години, 24 години інкубації при ескалаційному підвищенні дози алергену, що вводиться в кров in vitro, починаючи від 1 дози (вихідної), потім - 2 дози (додаються в кров через 30 хвилин після інкубації попередньої 1 дози), потім - 4 дози (додаються ще через 30 хвилин після попередніх 2 доз) і, нарешті, додавали ще 8 доз алергену (через 2 години після попереднього введення 4 доз алергену); усього за дослідження в кров вводилося 1+2+4+8=15 доз алергену, що тестується. У контролі замість алергену в аналогічні інтервали часу вводився фізіологічний розчин (негативний контроль) або в аналогічному режимі дози, що збільшуються, гістаміну (позитивний контроль). Після цього будували графік залежності величини ТДС від часу інкубації і порівнювали площу цієї залежності з контрольними показниками. Діагностику алергії, харчової непереносності або корисності харчових продуктів здійснювали на підставі зниження кривої залежності "ТДС - час інкубації" у порівнянні з негативним контролем та одночасно враховували ступінь такого зниження в порівнянні з позитивним контролем (тобто в реакції з гістаміном). При максимальному зниженні кривої аж до рівня позитивного контролю реакція на антиген розцінювалась як прояв алергії, а при менш вираженому зниженні, тобто яке не досягало рівня позитивного контролю, - як харчова нестерпність. Позитивний вплив антигену або харчового алергену па окислювально-відновний баланс і неспецифічну резистентність оцінювали по збільшенню площі під графіком залежності "ТДС - час інкубації" у порівнянні з негативним контролем. Виконані дослідження показали (див. таблицю залежності кривої "ТДС-час інкубації" в обстежених пацієнтів, додасться), що у осіб з алергійними захворюваннями або харчовою нестерпністю спостерігається достовірне зниження площі залежності "ТДС - час інкубації" у порівнянні з показниками в осіб, у яких відсутні такі порушення. Виявлено, що у пацієнтів з наявністю симптомів харчової непереносності, яка не виявляється клінічними ознаками алергії (у тому числі і при відсутності позитивних скарифікаційних проб з алергенами), мав місце різний ступінь зниження площі під графіком кривої "ТДС - час інкубації" у порівнянні з негативним контролем, що однак не досягало показників у позитивному контролі. Це відображає різний характер і/або ступінь біохімічної реакції крові на той чи інший харчовий продукт у конкретного індивідуума. Представлені результати динаміки середніх величин підтверджуються даними кореляційного аналізу. У хворих з алергією виявлений достовірний негативний зв'язок залежності площі кривої "ТДС-час інкубації" (r-0,89) у порівнянні з контролем. Виявлені результати дають підставу діагностувати in vitro як наявність алергії, так і виявити нестерпність до конкретних харчових продуктів, в тому числі і у осіб з відсутністю позитивних реакцій при алергологічних (скарифікаційних) тестах з харчовими алергенами. Крім того, спосіб дозволяє також оцінити ступінь позитивного впливу конкретних харчових продуктів на стан окислювально-відновних процесів і рівень неспецифічної резистентності організму. Приклад 1. Хворий С., 49 років. Пред'являє скарги на сверблячку і висипання на шкірі голови і грудини, що вперше з'явилися близько 1 року тому. Конкретного зв'язку між захворюванням і яким-небудь алергеном або харчовою нестерпністю встановити не вдавалося. Об'єктивно: загальний стан пацієнта - задовільний, шкірні покриви чисті, на шкірі волосистої частини голови й в області грудини визначається папульозна сипка, сухість шкіри. Проведено дослідження впливу на хворого харчових продуктів шляхом постановки алергологічних внутрішньошкірних проб з харчовими алергенами, позитивної реакції не виявлено. Поставлено діагноз: алергійний дерматит голови і грудини. Враховуючи анамнез, відсутність явних причин алергійної реакції з боку шкіри, проведене пробне тестування крові шляхом постановки навантажувального тесту з харчовими алергенами (усього досліджувалися алергени 52 харчових продуктів). Виявлено значне зниження (у порівнянні з негативним контролем) кривої залежності "ТДС - час інкубації" при навантажувальному тесті з казеїном коров'ячого молока (зниження на 111%) і з білком курячого яйця (зниження на 105%), що відповідало рівню позитивного контролю з гістаміном (зниження на 122%). Після виключення з харчування зазначених харчових продуктів (елімінаційна дієта) ознаки алергійного дерматиту регресували протягом 4-х тижнів без застосування якого-небудь додаткового лікування. Приклад 2. Хворий Й., 47 років. Пред'являє скарги на те, що після вживання в їжу деяких харчових продуктів (фрукти, м'ясо) з'являється почуття ваги в надчеревній області, метеоризм, легка діарея. Епізодично з'являється сверблячка і сип на шкірі кистей. Дані явища звичайно тривають від декількох годин до доби. Чіткого зв'язку між прийомом якого-небудь харчового продукту і зазначеними скаргами виявити не вдавалося. Гастроентерологічне обстеження патологічних змін з боку шлунково-кишкового тракту не виявило. Проведені скарифікаційні проби з харчовими алергенами, реакції оцінені як негативні. Дослідження крові шляхом постановки навантажувального тесту з набором алергенів харчових продуктів (усього - 52 харчові алергени) виявило зменшення (у порівнянні з негативним контролем) площі кривої залежності "ТДС-час інкубації" при навантажувальному тесті з антигеном м'яса свинини (зменшення на 56%) і з антигеном груші (зменшення на 44%); спостерігалося також менш виражене 8 зменшення площі кривої "ТДС- час інкубації" (у межах 10-30%)-у тестуванні ще 7 харчових алергенів. Одночасно спостерігалося підвищення (у межах 10-98% у порівнянні з негативним контролем) кривої "ТДС - час інкубації" в реакції з алергенами 30 інших продуктів харчування, і без істотної зміни, - ще з 13 харчовими алергенами (зміни площі під кривої "ТДС- час інкубації" практично відповідали зміні в негативному контролі). Виходячи з отриманих результатів було рекомендоване вживання тільки тих харчових продуктів, що сприяли в тесті in vitro збільшенню або, як мінімум, не зменшенню показника ТДС у крові, що відбиває, очевидно, їхній позитивний вплив на окислювально-відновний баланс і рівень неспецифічної резистентності макроорганізму. Застосування такої індивідуальної дієти протягом 4-х тижнів сприяло повному відновленню нормального самопочуття пацієнта, підвищенню працездатності, нормальній переносності уживаної їжі. Унаслідок реалізації пропонованих відмінностей, що по своїй суті є новими критеріями для оцінки впливу на живий організм речовини, що тестується, при діагностиці алергії або харчової непереносності або корисності останньої, забезпечуються наступні переваги пропонованого способу: 1) спосіб здійснюється простим і доступним методом, що може бути здійснено не тільки в імунологічній або алергологічній, але й у будь-якій загальноклінічній лабораторії; 2) відсутня небезпека провокування в пацієнта побічних чи алергійних реакцій; 3) спосіб дозволяє проводити одночасне тестування практично необмеженої кількості алергенів; 4) методика тестування крові за допомогою ТДС - реакції на алергени дозволяє виявляти і диференціювати не тільки алергійну реакцію, але також неімунологічні форми алергії або непереносності харчових продуктів; 5) установлення кількісних характеристик зміни показників кривої залежності "ТДС - час інкубації" як критерію оцінки харчової непереносності дозволяє підвищити точність діагностики в порівнянні з прототипом, де такі критерії відсутні. Таблиця 1 Пацієнти без алергійних Пацієнти з Пацієнти без чи Показники захворювань, алергійними алергії харчової непереносност але з ознаками непереносності захворюваннями і харчової (n=37) (n=30) непереносност і (n=48) Площа кривої "ТДС - час інкубації" у крові при навантаженні 61,4 ± 2,3%* 78,3 ± 3,1 %* 124,6 ± 4,4%* антигеном у порівнянні з контролем in vitro * - статистично достовірне розходження між групами (Р