Спосіб визначення концентрації низькомолекулярних s-нітрозотіолів у хімічній системі

/• 98073955 C07C 201/00 СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ КОНЦЕНТРАЦІї НИЗЬКОМОЛЕКУЛЯРНИХ 5-НІТРОЗОТІОЛІВ У ХІМІЧНІЙ СИСТЕМІ Винахід відноситься до біохімії, зокрема до способу визначення низькомолекулярних З-нітрозотюлів, наприклад S-нітрозоглутатіона та S-нітрозоцистеїна, і може бути використаний в модельних біологічних системах при дослідженні механізмів дії оксида авота в клітинах крові. Відомий спосіб визначення концентрації S-нітрозотіолів (див. J,S,3tarnIer, J.Loscalzo // Anal.Obern.-1992, ~V,64. ~N7. P.779-785) шляхом високовольтного капілярного електрофореза за допомогою системи Bio-Rad HPE-10G (США). Дослідну сполуку одержують за реакцією S-нітрозування тіолат-аніона іоном нітрозонія у кислому середовищі. Концентрацію 5-нітрозотіолів визначають эа методом абсорбційної спектроскопії. Недоліком відомого способу є те, ідо він передбачає використання багатокоштовного закордонного обладнання, який споживав велику кількість електроенергії (11 кВт протягом ЗО хвилин) і потребує спеціальних мір по дотриманню правил техніки безпеки. Крім того, метод абсорбційної спектроскопії дозволяє визначати вміст 5-нітрозотіолів Е межах мікромолярних концентрацій, шо знижує чутливість способу. Відомий спосіб визначення концентрації S-нітрозотіолів з м о д е л ь н і й х і м і ч н і й с и с т е м і ( д и в - P . R . M y e r s Nature,1990--N345.-P.6271-6276) - прототип, який включає одержання Sнітрозотіолїв за реакцією 5-нітрозування тіолат-аніона іоном нітрозонія еа відомою методикою. S-нітровоцистеін - представник класу низькомолекулярних S-нїтрозотюлів. Розведення дослідної проби проводять в органічному розчиннику - метанолі г послідуючім фізико-хімічним аналізом шляхом рідинної хроматографії. Під час проведення хроматографічного дослідження використовують елюент, який містить метанол, фосфат натрія і октилсульфонову кислоту. Недоліком прототипу є те, що він придатний тільки для визначення оного вида 3-нітрозотіолів - 5-нітрозоцистеіна, який має час нзлівросладу, що рівняється декільком хвилинам тобто він є , нестабільним, що обмежує використання способу у модельних біоло гічних системах та його функціональні можливості . Використання у прототипі органічного токсичного розчинника - метанола погіршує умови праці під час проведення дослідження . Задача виниходу: розширення функціональних можливостей спо собу та покращення умов праці під час проведення дослідження . Для рішення поставленої задачі авторами запропоновано спо сіб визначення концентрації низькомолекулярних 5-нітрозотіолів у хімічній системі, який включає одержання 5-нітроаотіолів за реакцією 5-нітрозування тіолат-аніона іоном нітровонія у кислому середовищі. Дослідну пробу розводять фосфатним буфером з рН 2,2. під час проведення рідинної хроматографії використовують колонку розміром 75 к 2 мм з сорбентом Nucleosil 100-5 CIS та елюент з співвідношенням компонентів : метанол , об.% - 5, фосфатний буфер - і мМ октилсульфонова кислота рН £,£, об.% - 95;, концентрацію S-нітровотіолів визначають по заздалегідь побудованій калібру вальній кривій. Відрізняючими ознаками винаходу є: - Дослідну пробу розводять фосфатним буфером з рН ЕД \ - Під час проведення рідинної хроматографії використовують колонку розміром 75 х 2 мм з сорбентом Nucleosil 100-5 CIS та елюент з співвідношенням компонентів метанол, об." - 5, фосфат ; ний буфер - 1 мМ октилсульфонова кислота рН 2.2, о5.% - 95; кон центрацію 5-нітрозотіолів визначають по заздалегідь побудованій калібрувальній кривій. Використання для розбавлення дослідної проби фосфатного бу фера г рН 2,2 замість метанолу сприяв стабілізації S-HiTposoTioЛІЕ та збільшує час напіврозпаду цих сполук до семи днів , а також знижує токсичність під час проведення дослідження . Використанн я колон ки розм іром 75 х 2 мм з сорб ен том Nucleosil 100-5 з привитою фазою 018 під час проведення рі динної хроматографії дозваляє вменшити витрату елюента . Як показали проведені дослідження , використання елюента в завначенному співвідношенні дозволяє проводити одночасно розділ різних видів низькомолекулярних 5-нітрозотіолів в одній дослід жуваній пробі, що розширює функціональні можливості способу . Заздалегідь побудована калібрувальна крива , яка відображує залежність плюші хроматографічних піків що відповідають дослід, жуваним пробам в різними розведеннями від концентрації досліджуваних проб тих же розведень, знайдених ва методом абсорбційної спектроскопії, дозволяє визначити концентрацію досліджуваної проби, тобто провести кількісний аналїв . Порівняно р прототипом відрізняючі ознаки заявляемого спо собу дозволяють визначити концентрацію не тільки S-нітровоцистеїна, зл$ і інших низькомолекулярних S-нітровотіолів, наприклад З-нітровоглутатІона, 5-нітрозого^оцистеїна. Відрізняючі ознаки винаходу відповідають критерію "новизна" та вимогам винахідницького рівня. Дослідження за запропонованим способом проведені у відділі біохімії Інститута терапії АМН України та у Науковій виробничій фірмі (НБФ) "Аналітика" (м, Харків^, Вірогідність способу - 37%, Використання заявляемого способу у хімічній системі дозво ляє розширити функціональні можливості методики експерименти, сприяє зменшенню витрати елюента під час проведення хроматогра фічного анапїза та покращує умови праці . £аявляБїлий спосіб здійснюють слідуючим чином : і. Одержують дослідну сполуку , наприклад S-нІтровоглутатіон , ва реакцією S-нітрозування тіолат-аніона іоном нітрозонія у кислому середовищі. 2. Розбавляють пробу у фосфатному буфері з рН 2,£. 3, Проводять фізико-х імічний аналіз проби в КІЛЬКОСТІ ВІД 2 де 10 мм шляхом рідинної хроматографії за допомогою хроматографа "ШліХром A-D2". При цьому використовують елюент , який містить слідуючі компоненти: - м&танол, оо\% - 20 - фосфатний буфер - і мМ октилсульфонова кислота рН 2,2, об Л - SO, та колонну резміром 75 к £ мм э сорбентом Nucleosil 100-5 CIS при Т - 45 С, р - 4,6 МПа, та довжині хвилі детектування від 254 до 338 нМ. 4- Фіксують час виходу хроматографічного піка , тобто час утри мання дослідної сполуки, та визначають площу піка, величина якої прямо пропорційна концентрації дослідної проби 5. Для визначення . концентрації S-нітровотіоліь будують калібрувальну криву , яка відображує залежність площі хроматографічних піків , яр відповідають досліджуванім пробам з різними розведеннями від , концентрації дослід -4жуваних проб тих же розведень, знайдених за методом абсорбційної спектроскопії. 8. Визначають концентрацію S-нітрогоглутатіона та інших видів низькомолекулярних 5-нітроаотіолів за калібрувальною кривою по, будованою по п- 5. Можливість здійснення запропонованого способу підтверджується на прикладі визначення концентрації S-нітрозоглутатіона. Дослідну сполуку одержують за реакцією 5-нітрозування тіолат-аніона іоном нітрозонія у кислому середовищі . Перед проведенням хроматографічного аналіза розбавляють дослідну пробу у фосфатному буфері в рН 2,2. Хроматографічний аналіз проводять на хроматограф "МіліХром ! А-02*\ при цьому використовують елюент аа пунктом 3. Розмір колонки: 75 х 2 мм. Витрата елюента - 150 мкл у хвилину; Т - 45 С_, р - 4,5 МПа; кількість проби - 2 мм . Час виходу хроматографічного піка, { час утримання даної сполуки) для S-нітрозоцистеїна - 35 0 хвилин, для S-нітрозоглутатіона - 9,0 хвилин. Під час проведення аналіга фіксують площу хроматографічного піку, яка прямо пропорціональна концентрації даної сполуки та є його кількісною характеристикою. Концентрацію досліджуємо! проби визначають по калібрувальній кривій , побудованій по п. 5, концентрація S-нітрозоглутатіона дорівнює і * 10 М. Одержані дані відповідають результатам визначення концент рації S-нітрозоглутатіона шляхом абсорбційної спектроскопії за інтенсивністю смуги поглинання при довжині хвилі 338 нм. Вірогідність способу - 97%. ВИСНОВОК: Заявляємий спосіб дозволяє визначити якісні та кількісні характеристики низькомолекулярних 3-нітрозотіолів , зменшити витрату елюента., а також покращ/є умови праці.