Спосіб одержання ліполітичного ферментного препарату

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к технологии получения липолитически ферментных препаратов медицинского назначения типа солизима, и может быть использовано в производстве ферментных препаратов липолитического действия для сельского хозяйства, медицины, кожевенной и текстильной промышленности, для получения жирных кислот и других продуктов гидролиза жиров. Известен способ получения липолитических ферментных препаратов, в частности, неспецифических липаз, на продуценте по авторскому свидетельству №534489 "Штамм - продуцент липазы", и опытно-промышленному регламенту. Недостатком этого аналога является низкая активность культуральной жидкости на стадии биосинтеза (не выше 1500 - 2500ЛЕ/мл по методике Ота и Ямада) и высокое содержание балластных белков. Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения лилолитического ферментного препарата солизима (А.с. СССР №1655029 "Способ получения липолитического ферментного препарата солизима"), выбранный в качестве прототипа. Способ предусматривает глубинное культивирование продуцента или питательной среде, содержащей: (г/л), соевой муки - 10; подсолнечного масла - 5; соль на 0,25, остальное водопроводная вода. Для повышений активности фермента и увеличения выхода целевого продукта культивирование проводят в условиях ступенчатого изменения интенсивности массопередачи кислорода с начала до 15 - 24ч при менее 20мг/л.мин; с 15 - 24ч до конца процесса при более 20мг/л.мин, что позволяет обеспечить оптимальный режим аэрации и получить увеличение активности культуральной жидкости (к.ж) до 15000ЛЕ/мл; в полученную к.ж. при перемешивании добавляют 0,5% целлюлозы или 1 - 2% древесной муки для коагуляции высокомолекулярных примесей и коллоидных частиц с последующей фильтрацией на ленточном вакуум-фильтре через капроновую ткань с намывным слоем наполнителя (целлюлозы или древесной муки). Для более полной очистки проводят фильтрацию полученного нативного раствора черед специальные картоны, например, КФ-1, КФО-1 или КФО-2. Очистку полученного фильтрата от низкомолекулярных веществ (пигментов, углеводов, солей и др.) проводят методом диафильтрации через мембрану на основе ацетилцеллюлозы, полиакрилонитрила и других полимеров, задерживающих целевой продукт и проницаемых для низкомолекулярных балластных веществ. При диафильтрации предусмотрено использование 0,005М фосфатного буфера (при pH 7,9 + 0,1), что позволяет стабилизировать pH, необходимое для получения медицинского препарата. С целью получения препарата со стандартной активностью (2600 + 300ЛЕ/мг) концентрированно проводят до активности 180000 - 280000ЛЕ/мг. В концентрат добавляют лактозу, при распылительной сушке, и сушат распыливанием. Выход фермента от активности культуральной жидкости составляет 50 - 52%, удельная активность препарата достигает 9000ЛЕ/мг белка. При осуществлении описанного способа в промышленных условиях (в ферментаторах большой емкости) процесс биосинтеза липаз плохо воспроизводим, удельная активность готового препарата низкая и не соответствует требованию ФС 42 - 2605 - 88, ГФ - XI. Задачей, которую решают авторы заявляемого способа, является повышение активности липаз на стадии биосинтеза в промышленных ферментаторах и одновременно достижение стабильно высоких результатов по выходу, активности и качеству готового продукта. Поставленная задача решается тем, что в способе получения липолитических ферментных препаратов, предусматривающем глубинное культивирование продуцентов липаз на питательных средах, содержащих источники липидов, с последующей фильтрацией культуральной жидкости через ткань, асбестоцеллюлозные мембраны, ультрафильтрацию на полимерных мембранах с диаметром пор, задерживающих липазу, диафильтрацию и распылительную сушку, согласно изобретению, в процессе культивирования при снижении pH питательной среды до значения 6,8 - 7,3 проводят многократно подпитку аммиаком или аммонийными соединениями до установления значения pH 7,3 - 7,6, а на биосинтетической стадии роста производят разбавление стерильной водой в количестве 10 - 58% от объема питательной среды. Способ осуществляется следующим образом. Продуценты липолитического ферментного препарата солизима штамм выращивают на питательной среде следующего состава (г/л): соевая мука (мучка) - 5 - 10; подсолнечное масло (или другой источник жиров - рыбий жир, олеиновая кислота и т.д.) - 4 - 22, пеногаситель (пропинол Б-400, ниоген) - 0,4 - 1,5; при постоянном перемешивании и интенсивности аэрации 0,2 - 0,6м3 воздуха/м3 питательной среды в час. pH среды перед засевом 7,2 - 7,8. В процессе роста и развития продуцента происходит самопроизвольное понижение pH культуральной жидкости до значений 6,9 - 7,3. Такое понижение pH является критерием для начала проведения подпиток источником аммонийных групп, обычно в промышленных условиях является раствор аммиака; значительно реже применяют аммонийные соли (сульфат аммония или аммоний фосфорнокислый). При внесении аммиака pH среды сдвигается в щелочную сторону; концом подпитки является снижение pH до 7,3 - 7,55. Идет интенсивное потребление аммиака и pH снова опускается до первоначального, после чего снова делается подпитка. Количество аммиачных подпиток варьируют от 2 - 5 до 10 - 16 за операцию. При переходе культуры на активный синтез липаз проводятся дробные доливы стерильной водой в количестве от 10 до 46 - 58% от объема питательной среды. Культуральная жидкость после ферментации имеет активность до 22000 - 66000ЛЕ/мл (по ФС 42 - 2605 - 88, ГФ-XI). Полученная культуральная жидкость подвергается обработке по следующей схеме: - фильтрация на ленточном вакуум-фильтре через ткань с намывным слоем древесных опилок или фильтроперлита для удаления биомассы продуцента; - стерильная фильтрация полученного нативного раствора через фильтровальные картоны; - ультраконцентрирование с диафильтрацией на полимерных мембранах; - стандартизация и распылительная сушка. Таким образом, общими с прототипом существенными признаками являются: - глубинное культивирование продуцентов; - введение при фильтрации древесной муки; - проведение фильтрации на тканях, ультраконцентрирование с диализом 0,005М фосфатным буфером; - стандартизация и распылительная сушка. Отличительными признаками являются; - значительное увеличение содержания липидов в питательной среде (до 20 - 25г/л); - проведение многократных подпиток аммонийсодержащими растворами до величины pH 7,3 - 7,55 при самопроизвольном его снижении в процессе культивирования; - разбавление водой культуральной жидкости в процессе биосинтеза в количестве от 10 до 46 - 58% от объема питательной среды; - кроме рода предлагаемый способ культивирования пригоден и для других родов продуцентов. При осуществлении предлагаемого способа удалось повысить активность липаз на стадии биосинтеза в ферментаторах до 37000 - 60000ЛЕ/мл, а также увеличить выход конечного целевого продукта до 7 - 14млрд. 1м3, культуральной жидкости, с хорошей воспроизводимостью результатов в промышленных условиях и высокой удельной активностью препарата (11027ЛЕ/мг белка). Таким образом, совокупность существенных признаков, используемых в заявляемом способе, позволяет решить поставленную авторами задачу. Промышленная применимость способа получения липолитического ферментного препарата показана в примерах конкретного выполнения. Пример 1. (прототип а.с. №1565029) Процесс ферментации солизима проводят в аппарате вместимостью 120м.куб, оснащенный 3 - х ярусной лопастной мешалкой. Для ферментации используют посевной материал продуцента штамм 1М в количестве 1,0 - 6,0% к объему питательной среды. Для выращивания использовалась среда следующего состава (по ПР 64 - 5509-91): г/л В процессе биосинтеза получена культуральная жидкость солизима с активностью 7750ЛЕ/мм общим объемом 43,6м3. В полученную культуральную жидкость при перемешивании внесли древесную муку из расчета 15кг на 1м3. Затем культуральную жидкость фильтруют на ленточном вакуум-фильтре. Одновременно с фильтрацией проводит промывку биомассы водой в количестве 15 - 20% к объему исходной культуральной жидкости. Полученные 54м3 нативного фильтрата фильтруют на фильтр-прессе "Омега", заправленном картоном КФ-1 и КФ-2. Условно стерильный фильтрат подвергают ультра- и диафильтрации на ультрафильтрационной установке "Дорр-Оливер" с ультрафильтрационными модулями задерживающими липазу на 98 - 99%. Процесс происходит в режиме 2-кратного концентрирования и трех диафильтрации 0,005М фосфатным буфером (pH 7,9 - 8,0) при температуре 6°C. После процесса концентрирования получено 1,43м3 концентрата с активностью 149930ЛЕ/мл. Концентрат солизима высушивают на распылительной сушилке Получено 103,8кг готового препарата с активностью 1354ЛЕ/мг; содержание белка 0,68 - 0,74мг, удельная активность составляет 1934ЛЕ/мг белка. Суммарный выход солизима субстанции с операции составил 140,5млрд. липолитических единиц. Полный материальный баланс операции приведен в табл.1. Анализируя табл.1, конечный результат следующий: - суммарная липазная активность с 1м3 культуральной жидкости составила - 6,570млрд. ЛЕ; - съем целевого продукта на конечной стадии - 140,6млрд. ЛЕ; - съем солизима-субстанции с 1м3 - 2,8млрд./м3. Характеристика солизима-субстанции не соответствует требованиям ФС 42 - 2605 - 88 удельная белка) Пример 2. Процесс ферментации солизима проводят в аппарате вместимостью 120м3 на питательной среде следующего состава (в г/л): Для ферментации используется посевной материал продуцента в количестве 1,0 - 6,0проц. к объему питательной среды. К 78 часу роста активность готовой культуральной жидкости составила 11982ЛЕ/мл (по ФС 42 - 2605 - 88), конечный объем 58,6м3. В процессе ферментации проводилось 8 подпиток аммиачной водой, а также подпитки стерильной водой в объеме 11,0 - 12,0м3. В полученную культуральную жидкость внесли древесную муку из расчета 13 - 15кг/м3. Культуральную жидкость фильтруют на ленточном вакуум-фильтре через капроново-лавсановую ткань. Нативный раствор фильтруют через картоны КФО-1 и КФО-2 на рамном пресс-фильтре "Омега". Условно стерильный фильтрат (нативный раствор разбавленный водой в 1,3 - 1,5 раза при промывке биомассы) подвергают ультра- и диафильтрации на ультрафильтре "Дорр Одивер" при температуре 6 - 8град, в режиме 5-кратного концентрирования и двух диафильтрации 0,005М фосфатным буфером (pH = 7,9 8,0). После процесса концентрирования получают 2,13м3 концентрата с активностью 197065ЛЕ/мл. Концентрат высушивают на распылительной сушилке Сводный материальный баланс в табл.2. Анализируя табл.2, можно сделать следующие выводы: - липолитическая активность с 1м3 - 11,98млрд. ЛЕ; - суммарный выход солизима-субстанции с 1 операции - 401,7млрд.; - съем готового продукта из 1м3 - 6,85млрд./м.куб; - продукт соответствует качеству по ФС 42 - 2605 - 88, так как активность препарата равна удельная белка, белок = 0,34мг/мг препарата. Пример 3. Процесс ферментации проводят в аппарате вместимостью 8м3, на питательной среде, аналогичной предыдущему примеру за исключением 2 - х показателей, а именно: содержание соевой муки уменьшено до 7,5г/л, а содержание подсолнечного масла увеличено до 7,0г/л. Для ферментации используют посевной материал в количествах ранее оговоренных. Процесс выращивания продуцента длился 64 часа при непрерывном перемешивании мешалкой с введением дробных подпиток аммиаком и разбавлением водой. Полученная культуральная жидкость с активностью 20000ЛЕ/мл подвергалась обработке по очистке и выделению солизима по ранее описанной схеме. Суммарный материальный баланс операции следующий: - активность липазы с 1м3 - 20,0млрд. ЛЕ; - съем готового продукта с 1м3 - 7,5млрд. ЛЕ/м.куб; - активность готового препарата - 4080ЛЕ/мг; - белок - 0,37мг/мг препарата; - удельная активность - 11027ЛЕ/мг белка. Пример 4. Процесс ферментации проводят в аппарате вместимостью 10м3 на питательной среде, аналогичной предыдущей с увеличенным количеством подсолнечного масла до концентрации 22кг/м3 питательной среды. Для ферментации использовали посевной материал продуцента Процесс выращивания длился 98 часов при непрерывном перемешивании. В результате проведения биосинтеза по ранее описанной схеме была получена культуральная жидкость с активностью 70000ЛЕ/мл, т.е. съем с 1м.куб культуральной жидкости составил 70млрд. ЛЕ против 6,75млрд. ЛЕ в прототипе (а.с. 1565029). Таким образом, при проведении биосинтеза солизима с введением дробных подпиток аммиаком (солями аммония) в процессе роста и разбавлением водой, можно получить увеличение выхода целевого продукта (солизима-субстанции) с 6млрд. ЛЕ с 1м3 к.ж. до 12 25млрд. ЛЕ с 1м3 к.ж., при том, что качество субстанции соответствует требованиям ФС 42 - 2605 - 88. Предлагаемый способ даст еще более высокий эффект при получении технических ферментных препаратов для сельского хозяйства и производства моющих средств, так как там требования к очистке препарата более низкие и, соответственно, более высокий выход целевого продукта.