Антагоністи рглг з поліпшеними властивостями розчинності, спосіб їх отримання та фармацевтична композиція на їх основі

1. Сполука загальної формули І A-Xxx1-Xxx2-Xxx3-Xxx4-Xxx5-Xxx6-Xxx7-Xxx8-Xxx9Xxx10-NH2 (І), де А являє собою ацетил або 3-(4-фторфеніл)пропіонільну груп у, Ххх1 — D-Nal(1) або D-Nal(2), Xxx2-Xxx3 — D-Cpa-D-Pal(3) або простий зв'язок, Ххх4 — Ser, Ххх5 — N-Me-Tyr, Ххх6 — D-Cit, D-Hci або D-амінокислотну груп у загальної формули (II) 2 (19) 1 3 70997 4 ня сполуки загальної формули І традиційним спонезлоякісних захворювань, лікування яких вимагає собом з амідуванням у ланці Ххх10 відщеплюють пригнічення РГЛГ-гормону. від твердої фази. 15. Спосіб одержання медикаментів, який відріз14. Застосування речовин за пп. з 1 по 11 для няється тим, що сполуки за пп. з 1 по 11 змішують одержання медикаментів для лікування залежних із традиційними носіями або допоміжними речовивід гормонів пухлин, зокрема карциноми передмінами й розфасовують як медикаменти. хурової залози або раку молочної залози, а також Винахід стосується антагоністів РГЛГ з поліпшеними властивостями розчинності, способу одержання цих сполук, медикаментів, які містять ці сполуки, а також застосування медикаментів для лікування гормонозалежних пухлин та спричинених гормонами незлоякісних захворювань, таких як доброякісна гіперплазія передміхурової залози (ВРН) та ендометріоз. Визначення пептидів, подано за номенклатурою, прийнятою комісією МСТПХ-МБХС з біохімічної номенклатури (European J. Biochem. 1984, 138, 9-37), у якій згідно з традиційними відображеннями аміногрупи на N-кінці подаються справа наліво, а карбоксильна група на С-кінці - зліва направо. Антагоністи РГЛГ, такі як пептиди, згідно з винаходом містять природні та синтетичні амінокислоти, причому до перших належать Ala, Val, Leu, lle, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp та His. Скорочення окремих амінокислотних залишків робляться на основі традиційних назв амінокислот: АІаланін , а = Аrg=аргінін, СІугліцин , Leu=лейцин, Lys=лізин, Pal(3)=3-(3= піридил)аланін, NaІ(2)=3-(2-нафтил)аланін, фенілаланін = Рhе , Сра=4-хлорфенілаланін, пролін = Рrо , Ser=серин, Тhn=треонін, Тrр=триптофан , Туr=тирозин і Sаr=саркозин. Переважно всі описані авторами амінокислоти походять від L-серії. Наприклад, D-Nal(2) є скороченням для 3-(2-нафтил)-D-аланіну, a Ser є скороченням для L-серину. Заміщення на eаміногрупі у боковому ланцюгу лізину показуються після Lys у дужках за допомогою відповідної форми скорочення. Інші скорочення: Ac Ацетил Atz 3-аміно-1,2,4-триазол-5-карбоніл В 4-(4-амідино-феніл)-аміно-1,4-діоксобутил Воc трет-бутилоксикарбоніл Вор Бензотриазол-1-окси-tris(диметиламіно)-фосфонійгексафторофосфат DCC Дициклогексилкарбодіімід DCM Дихлорметан Ddz Диметоксифенілдиметилметиленокси-карбоніл (диметокси-диметил-Z) DІC Діізопропілкарбодіімід DIPEA Ν,Ν-діізопропілетиламін DMF Диметилформамід Fmoc Флуоренілметилоксикарбоніл HF Плавикова кислота HOBt 1-гідроксибензотриазол HPLC Рідинна хроматографія високого тиску Me Метил TFA Трифтороцтова кислота Ζ Бензилоксикарбоніл Hci Гомоцитрулін Cpa 4-хлорфенілаланін Пептиди згідно з винаходом є аналогами гормону, що вивільнює лютеїнізований гормон (РГЛГ), який має таку стр уктуру: p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gl y-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, [РГЛГ, гонадорелін]. Понад 20 років дослідники шукали вибірково ефективні антагоністи РГЛГ-декапептиду [M. Karten und J.E. Rivier, Endocrine Reviews 7, 44-66 (1986)]. Велика зацікавленість у подібних антагоністах зумовлена їх корисністю в галузях ендокринології, гінекології, запобігання вагітності та при ракових захворюваннях. Велику частку сполук було одержано як потенційні РГЛГ-антагоністи. Найцікавішими сполуками, що були відомі до нинішнього часу, є сполуки, структура яких являє собою модифікації РГЛГ-структури. Першу серію ефективних антагоністів одержують через введення ароматичних амінокислотних залишків у позиціях 1, 2, 3 та 6 або 2, 3 та 6. Традиційна форма запису сполук виглядає так: спочатку вказують амінокислоти, які у пептидному ланцюгу РГЛГ розташовані на місці первісних амінокислот, причому позиції, на яких відбувалося заміщення, позначають цифрами, набраними верхнім індексом. Крім того, "РГЛГ" означає, що йдеться про аналоги РГЛГ, у яких відбувалося заміщення. Відомі антагоністи: [Ac-D-Cpa1,2, D-Trp 3,6 ] РГЛГ (D, Η. Coy et al., In: Gross, E. and Meienhofer, J. (Eds) Peptides; Proceedings of the 6th American Peptid Symposium, S.775-779, Pierce Chem. Co., Rockville III. (1979): [Ac-Pro1 ,D-Cpa2, D-Nal(2)3,6] РГЛГ (Патент США №4419347) і [Ac-Pro1 , D-Cpa2, D-Trp3,6] РГЛГ (J.L. Pineda, et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 56, 420, 1983). Для посилення дії антагоністів пізніше у позиції 6 вводили основні амінокислоти, наприклад, DArg. Наприклад [Ac-D-Gpa1,2, D-Trp3, D-Arg6, DAla10 ] РГЛГ (ORG-30276) (D.H. Coy, et al., Endocrinology 100, 1445, 1982); та [Ac-D-Nal(2)1, DPhe(4-F)2, D-Trp3, D-Arg6] РГЛГ (ORF 18260) (J.E. Rivier et al., in: Vickery B.H. Nestor, Jr. JJ.( Hafez, E.S.E (Eds). LH-RH and its Analogs, S.11-22 MTP Press, Lancaster, UK 1984). Інші ефективні РГЛГ-антагоністи описано у WO 92/19651, WO 94/19370, WO 92/17025, WO 94/14841, WO 94/13313, US-A 5,300,492, US-A 5,140,009, ЕР 0 413 209 А1 та DE 19544212 А1. 5 70997 6 В останньому описано сполуки з модифіковаводню або алкільну гр упу, R5 означає атом водню ною орнітиновою або лізиновою ланками у позиції або алкільну груп у, і X означає атом кисню або 6, які відповідають такій формулі: AC-D-Nal(2)1-Dсірки, Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-Tyr 5-D-Xxx6-Leu7-Arg8-Pro9-DХхх7 - Leu або Nle, 10 Ala -NH2, де D-Xxx представляє амінокислотну Ххх8 - Arg або Lys(iPr), груп у загальної формули (VI) Ххх9 - Pro, і Ххх10 - Ala або Sar, та їхні солі з фармацевтично прийнятними кислотами, зокрема ацетати, ембонати та трифторацетати. Серед сполук згідно з винаходом перевагу віддають тим сполукам, де Ххх6 означає D-[e-N’(імідазолідин-2-он-4-іл)-форміл]-Іуs, D-(3-аміноРГЛГ-антагоністи також описано у WO 1,2,4-триазол-3-карбоніл)-Іуs, скорочено D-Lys(Atz) 97/19953 та ЕР-А2 0 328 090. Іншими відомими РГЛГ-антагоністами є або D-[e-N'-4-(4-амідинофеніл)-аміно-1,4-діоксоAntarelix, GanirelixTa Cetrorelix. бутил]-L ys, скорочено D-Lys(B). Antarelix: Іншими сполуками, яким згідно з винаходом Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-Tyr5-D-Hci6віддають перевагу, є: Leu7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2 Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5Ganirelix: D-Hci6-Nle7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2, Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-Tyr5-DAc-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr56 7 8 9 10 hArg(Et)2 -Leu -hArg(Et)2 -Pro -D-Ala -NH2 D-Lys(Atz)6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2, Cetrorelix: Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr51 2 3 4 5 6 Ac-D-Nal(2) -D-Cpa -D-Pal(3) -Ser -Tyr -D-Cit D-Lys(B)6-Leu7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2, Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2 Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5Метою винаходу є створення РГЛГD-Lys(B)6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2 , антагоністів, які виявляють підвищену ферментаAc-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5тивну стабільність і значно кращу розчинність у D-Hci6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-Ala10-NH2, воді. Ac-D-NaI(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5Цю задачу вирішують завдяки сполукам загаD-Hci6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-Sar10-NH2, льної формули (І), Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr51 2 3 4 5 6 7 8 9 A-Xxx -Xxx -Xxx -Xxx -Xxx -Xxx -Xxx -Xxx -Xxx D-Hci6-Nle7-Arg8-Pro9-Sar10-NH2, (l) Xxx10-NH2 3-(4-фторфеніл)-пропіоніл-D-NаІ(1)1-Sеr4-Nде Ме-Туr5-D-L уs(Аtz) 6-Lеu7-Аrg8-Рrо9-D-Ala10-NH2, А являє собою ацетил- або 3-(4-фторфеніл)а також їхні солі з вищевказаними фармацевпропіонільну груп у, тично прийнятними кислотами. 1 Xxx - D-Nal(l) або D-Nal(2), Сполуки згідно з винаходом застосовуються Xxx2-Xxx3 - D-Cpa-D-Pal(3) або простий зв'язок, для лікування гормонозалежних пухлин, зокрема Ххх4 - Ser, карциноми передміхурової залози або раку молоХхх5 - N-Me-Tyr, чної залози, а також для незлоякісних захворюХхх6 - D-Cit, D-Hci або D-амінокислотну груп у вань, лікування яких вимагає пригнічення РГЛГзагальної формули (II) гормону. Для цього їх змішують з традиційними носіями або допоміжними речовинами й розфасовують як медикаменти. Синтез сполук за формулою (І) може відбуватися як шляхом класичної конденсації фрагментів, так і шляхом синтезу на твердій фазі за Мерифілдом з послідовною побудовою при застосуванні у боковому ланцюгу вже з карбоновою кислотою загальної формули R1-COOH ацильованого DЛізину, а також шляхом обміну декапептидної ланде n означає число 3 або 4, причому R1 предки на відповідні карбонові кислоти через амідне ставляє гр упу з загальною формулою III, зв'язування у боковому ланцюгу D-Лізину6. Після — (СН2)p — CO — NR 2R3 (III) 2 цього здійснюють введення R1-CO-групи на трьох де p означає ціле число від 1 до 4, R означає 3 різних етапах способу: перед конденсацією окреводень або алкільну груп у, R означає незаміщену мих ланок пептиду, після введення лізину або орабо заміщену арильну груп у або гетероарильну нітину у пептидний ланцюг, але до конденсації груп у, R1 представляє 3-аміно-1,2,4-триазол-5наступної ланки, або після конденсації всіх ланок. карбонільну гр упу, або R1 представляє кільце заСполуки формули (І) можуть синтезуватися вігальної формули (IV) домими способами, наприклад шляхом повного синтезу на твердій фазі, часткового синтезу на твердій фазі (так званої конденсації фрагментів) або класичного зв'язування розчинів (див. М. Bodanszky, "Principles of Peptide Synthesis", Springer Verlag 1984). де q означає число 1 або 2, R4 означає атом Наприклад, способи синтезу на твердій фазі 7 70997 8 описано у підручнику "Solid Phase Peptide ботах Jesse P. Greenstein und Milton Winitz, Synthesis" J.M. Stewart and J.D. Young, Pierce Chemistry of Amino Acids, New York 1961, John Chem. Company, Rockford, III, 1984 та у роботах G. Wiley and Sons, Inc., Volume 2, наприклад, Barany and R.B. Merrifield "The Peptides", Ch. 1, cтop.883 і далі, "Principles of Peptide Synthesis", S.1-285, 1979, Academic Press Inc. Класичні спосоSpringer Verlag 1984, "Solid Phase Peptide би синтезу на основі розчинів докладно описано у Synthesis" J.M. Stewart and J.D. Young, Pierce роботі "Methoden der Organischen Chemie (HoubenChem. Company, Rockford, III, 1984, G. Barany and Weyl), Synthese von Peptiden" E. Wünsch R.B. Merrifield "The Peptides", Ch.1, стор.1-285, (Herausgeber) 1974, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1979, Academic Press Inc. а також The Peptides, BRD. Volume 2, Ed.E. Gross and J. Maienhofer, Academic Наприклад, під час здійснення поетапної поPress, New York. Ці захисні групи переважно забудови спочатку карбоксикінцева амінокислота, в стосовуються і для захисту інши х функціональних бокових груп (ОН-гр упи, NH2-rpynn) відповідних якій a-постійна аміногрупа є захищеною, коваленамінокислот. тно зв'язується зі звичним у таких випадках нерозВ оптимальному варіанті наявні гідроксигрупи чинним носієм, a-амінозахисна група цієї аміноки(серин, треонін) захищаються бензильними групаслоти відщеплюється, внаслідок цього виникає ми та подібними групами. Інші аміногрупи, які не є вільна аміногрупа, з якою через свою карбоксигрупу зв'язується наступна захищена амінокислота, і a-постійними (наприклад, аміногрупи у w-позиції, гуанідиногрупа аргініну) в оптимальному варіанті є таким чином поступово, у правильній послідовносортогонально захищеними. ті, зв'язуються звичні амінокислоти пептиду, який Окремі амінокислотні ланки, за винятком мосинтезується, і після зв'язування всіх амінокислот дифікованих R1-CO-групою лізину або орнітину, готовий пептид відщеплюється від носія, і за певвипускаються серійно. Можлива послідовність них умов відщеплюються інші наявні захисні групи способу одержання останніх сполук є такою: побічної функції. Поетапну конденсацію здійснюють традиційним способом шляхом синтезу відпо1. a-карбоновокислотну гр упу амідують. відних звичайним чином захищених амінокислот. 2. e-аміногрупу захищають Z-групою. Зв'язування окремих амінокислот між собою 3. a-аміногрупу захи щають Вос-групою для заздійснюється традиційними способами, зокрема безпечення вибірковості щодо подальшого відщетакими: плення амінозахисної групи. - Способи симетричних ангідридів у присутно4. Z-rpyn y в e-аміногрупі відщеплюють. сті дициклогексилкарбодііміду або діізопропілкар5. В e-аміногрупу вводять потрібну гр упу R4бодііміду (DCC, DIC) CO. - Карбодіімідні способи 6. Вос-груп у в a-аміногрупі відщеплюють. - Карбодіімідно-гідроксибензотриазольні спо7. a-аміногрупу забезпечують Z-гр упою. соби (див. The Peptides, Volume 2, Ed. E. Gross and Для введення R1-CO-групи шляхом обміну J. Meienhofer). аміногрупи лізину на відповідну карбонову кислоту В оптимальному варіанті при з'єднанні фрагв принципі застосовують такий самий спосіб, який ментів застосовується з'єднання азидів, яке відбубуло описано вище для зв'язування амінокислот. вається без рацемізації, або DCC-1Однак особливу перевагу віддають конденсації з гідроксибензотриазольний або ОСС-3-гідроксі-4застосуванням карбодііміду, наприклад 1-етил-3оксо-3,4-дигідро-1,2,3-бензотриазиновий способи. (3-диметиламінопропіл)-карбодіімід та 1Застосовують також активовані естери фрагменгідроксибензотриазол. тів. Реакція зв'язування амінокислот відбувається Для поетапної конденсації амінокислот найу традиційному для таких цілей нейтральному краще підходять активовані естери N-захищених розчиннику або суспендуючому агенті (наприклад, амінокислот, наприклад N-гідроксисукцинімідний дихлорметані), причому у разі потреби для поліпабо 2,4,5-трихлорфеніловий естери. Аміноліз добшення розчинності додають диметилформамід. ре каталізується N-гідроксисполуками, які мають Як синтетичні носії застосовують нерозчинні кислотність оцтової кислоти, наприклад 1полімери, наприклад полістиролову смолу у формі гідроксибензотриазолом. гранул, які набухають в органічному розчиннику Як проміжні амінозахисні групи можна засто(наприклад співполімеризат з полістиролу та 1% совува ти дегідруючі гр упи, наприклад бензилоксидивінілбензолу). Побудова захищеного декапептикарбонільний залишок (= Z-залишок) або слабокидаміду в метилбензгідриламідній смолі (МВНАслі відщеплювані групи. Як захисні групи для aсмолі, тобто полістироловій смолі з метилбензгідпостійних аміногруп можна застосовувати напририламідними групами), яка забезпечує потрібну Склад такі: кінцеву амідну функцію пептиду після відщеплення третинні бутилоксикарбонільні групи, флуореHF від носія, здійснюється згідно з послідовністю у нілметилоксикарбонільні групи, карбобензоксигрунижчеподаній діаграмі: пи або карбобензтіогрупи (у даному випадку або з р-бром, або р-нітробензиловим залишком), триДіаграма послідовності фторацетильна група, фталільний залишок, оПротокол синтезу пептиду І нітрофеноксіацетильна група, тритильна група, ртолуолсульфонільна група, бензильна група, заРозчинник/Реагент Етап Функція Час міщені у бензольному ядрі бензильні залишки (р(об'єм/об'єм) бром, або р-нітробензильний залишок) та a1 Промивання Метанол 2х2хв. фенілетиловий залишок. Вони також вказані у ро 9 70997 10 D-Hci6-Nle7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2 DCM 3x3хв. Синтез здійснювали за діаграмою послідовноDCM/TFA(1:1) 1х30хв. сті твердофазного синтезу (протокол синтезу пепІзопропанол 2х2хв. тидів, S.11) із DIC/HOBt-зв'язуванням, з вихідною Метанол 2х2хв. кількістю 3,3г МВН А-смоли (завантажувальна гусDCM 2х3хв. тина 1,08ммоль/г). Після відщеплення HF від поліDCM/DIPEA(9:1) 3x5хв. мерного носія одержували 3,4г сирого пептиду, Метанол 2х2хв. який очищали шляхом стандартної препаративної DCM 3x3хв. НРСІ. Після сублімаційного сушіння, яке здійснюДодавання Boc-As вали відразу після цього, одержували 1,43г HPLC10 STOP у DCM + DIG + однорідного продукту сумарної формули С72, Н96, HOBt N17, О14, СІ з правильним FAB-MS: 1458,7 (М+Н+) DCM або (ber: 1457,7), та відповідним спектром 1Н-ЯМР. 11 Зв'язування бл. 90хв. 1 DCM/DCF Н-ЯМР (500МГц, D2 O/D MSO-d 6, d у млн -1): 12 Промивання Метанол 3х2хв. Від 8,7 до 7,2, кілька m, аром. Η і неповністю 13 Промивання DCM 2х3хв. заміщен. ΝΗ; 6,92 u. 6,58, 2d, 2х2Н, аром. Η p-CIPhe; від 5,2 до 3,5, кілька m, Сa-Н u. aliph.H; 3,2 до Захи щені Νa-Вос амінокислоти зазвичай з'єд2,6, кілька m, аромат. Cb-Η, від 2,1 до 0,7, кілька нують у триразовій молярній надлишковій кількості m, залишк. аліфат. Н; 1,70, s, 3Н, ацетил; 1,20, d, у присутності діізопропілкарбодіїміду (DIC) та 13Н, Cb-Η Ala; 0,8, m, Cd-H Leu гідроксибензотриазолу (HOBt) в CH2CI2 /DMF проПриклад 2 тягом 90 хвилин і Вос-захисну гр уп у при частковій Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5дії 50% трифторооцтової кислоти (TFA) в СН2СІ2 D-Lys(B)6-Leu7-Lys(iPr)8-Pro9-D-AIa10-NH2 відділяють. Для контролю за повним обміном здійСинтез здійснювали за діаграмою послідовноснюють хлоранільний тест за Кристенсеном та сті (протокол синтезу пептидів, S.11) із DIC/HOBtнінгідриновий тест Кайзера. Залишки вільної амізв'язуванням, з вихідною кількістю 4,0г МВНАнофункції блокують шляхом ацетилування у п'ятисмоли (завантажувальна густина 1,11ммоль/г). разовій надлишковій кількості ацетилімідазолу в Після відщеплення HF від полімерного носія одеСН2СІ2. Послідовність етапів реакції побудови пепржували 4,87г сирого пептиду, який очищали шлятидів можна бачити на діаграмі послідовності. Для хом стандартної препаративної НРСІ. Після сублівідщеплення зв'язаних смолою пептидів відповідмаційного сушіння, яке здійснювали відразу після ний кінцевий продукт синтезу на твердій фазі вицього, одержували 0,93г HPLC-однорідного продусушують у вакуумі над Р2О5 і обробляють у 500кту, який за допомогою 4-амідинофеніламіно-4разовій надлишковій кількості на HF/анізолі оксомасляної кислоти у присутності ВОР як зв'язу10:1/об'єм/об'єм протягом 60 хвилин при 0°С. вального реагенту перетворювали на потрібну Після відгону HF та анізолу у вакуумі одержусполуку. Після повторного HPLC-очищення одерють пептидаміди шляхом перемішування з безвожували 148мг названої сполуки сумарної формули дним етиловим етером у вигляді білої твердої реС85, Н112, N17, 015, СІ з правильним ESI-MS: човини, відокремлення паралельно утвореного 1647,6 (М+Н+), (ber: 1645,8), та відповідним спектполімерного носія здійснюють вимиванням 50% ром 1Н-ЯМР. 1 водним розчином оцтової кислоти. Шляхом обеН-ЯМР (500МГц, D MSO-d6 , d у млн -1): режного звужування оцтовокислих розчинів у ва10,4, s, 1H u. 9,13, s, 2H, u. 8,94, s, 2H, NH's з куумі одержують відповідні пептиди у вигляді ви4-амідиноаніліну; від 8,6 до 7,35, кілька m, аром. Η соков'язких олій, які після додавання етеру на і ΝΗ; 7,22 і 7,18, 2d, 4Н, аром. Η (pCI)Phe; 6,95 u. холоді перетворюються на білу тверду речовину. 6,58, 2d, 4H, аром. Η Туr; від 5,2 до 3,5, кілька m, Подальше очищення здійснюється традиційCa-H і аліфат. Η; від 3,3 до 2,4, кілька m, Сb-Н і Nним способом препаративної рідинної хроматогСН3, 2,1 до 1,1, кілька m, залишк. аліфат. Н, 1,68, рафії під високим тиском (HPLC). s, 3H, ацетил; 1,20, d, 3Н, Сb-Н Ala; 0,83, dd, 6Н, Перетворення пептидів на їх кислі адиційні соСd-Н Leu лі здійснюється шляхом реакції з кислотами відоПриклад 3 мим спеціалістам способом. У зворотному порядку Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5одержують вільні пептиди шляхом реакції їх кисD-Lys(B)6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2 лих адиційних солей з основами. Пептидні ембоСинтез здійснювали за діаграмою послідовнонати одержують шляхом реакції солей трифтороцсті твердофазного синтезу (протокол синтезу пептової кислоти (TFA-солей) пептиду з вільною тидів, S.11) із DIC/HOBt-зв'язуванням, з вихідною ембоновою кислотою (памовою кислотою) або кількістю 4,0г МВН А-смоли (завантажувальна гусвідповідною динатрієвою сіллю ембонової кислотина 0,97ммоль/г). Після відщеплення HF від політи. Для цього до водного розчину пептидно-ТРАмерного носія одержували 4,0г сирого пептиду, солі додають розчин динатрій-ембонату в полярякий очищали шляхом стандартної препаративної ному апротонному середовищі, в оптимальному НРСІ. Після сублімаційного сушіння, яке здійснюваріанті - диметилацетамід, внаслідок чого утвовали відразу після цього, одержували 1,39г HPLCрюється світло-жовтий осад. однорідного продукту, який за допомогою 4Нижчеподані приклади служать для пояснення амідинофеніламіно-4-оксомасляної кислоти у привинаходу, не обмежуючи його обсягу.сутності ВОР як зв'язувального реагенту перетвоПриклад 1 рювали на потрібну сполуку. Після повторного Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr52 3 4 5 6 7 8 9 Промивання Відщеплення Промивання Промивання Промивання Нейтралізація Промивання Промивання 11 70997 12 очищення через HPLC одержували 440мг названої Ме-Туr5-D-L уs(Аtz) 6-Lеu7-Аrg8-Рrо9-D-Ala10-NH2 сполуки сумарної формули С82, Н106, N19, O15, Синтез здійснювали за діаграмою послідовноСІ з правильним ESI-MS: 1632,7 (М+Н+) (ber: сті твердофазного синтезу (протокол синтезу пеп1631,7) та відповідним спектром 1Н-ЯМР. тидів, S.11) із DIC/HOBt-зв'язуванням, з вихідною 1 кількістю 9,2г МВН А-смоли (завантажувальна гусН-ЯМР (500МГц, D MSO-d6 , d у млн -1): тина 1,08ммоль/г). Після відщеплення HF від полі10,4, s, 1Н u. 9,15, s, 2H, u. 9,0, s, 2H, NH's 4мерного носія одержували 5,8г сирого пептиду, амідиноаніліну; 8,60, m, 2H, аром. Η; від 8,3 до 7,2, кілька m, аром. Η і ΝΗ; 7,27 і 7,20, 2d, 4Н, аром. Η який очищали шляхом стандартної препаративної НРСІ. Після сублімаційного сушіння, яке здійсню(pCI)Phe; 6,96 u. 6,60, 2d, 4H, аром. Η Туr; від 5,2 вали відразу після цього, одержували 2,0г HPLCдо 3,5, кілька m, Ca-H і аліфат Н; від 3,2 до 2,4, однорідного незаміщеного октапептиду, з якого кілька m, Cb-H і N-CH3, від 2,1 до 1,1, кілька m, 0,4моль за допомогою 0,5ммоль 3-аміно-1,2,4залишк. аліфат Н, 1,70, s, 3Н, ацетил; 1,20, d, 3Н, триазол-5-карбонової кислоти у присутності РуСb-Н Ala; 0,85, dd, 6Н, Сd-Н Leu ВОР як зв'язувального реагенту перетворювали на Приклад 4 790мг сирого продукту потрібної сполуки. Після Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr56 7 8 9 10 повторного очищення через HPLC одержували D-Hci -Nie -Lys(iPr) -Pro -Ala -NH2 200мг названої сполуки сумарної формули С64, Синтез здійснювали за діаграмою послідовноН86, N17, O12, F з правильним FAB-MS: 1304,6 сті твердофазного синтезу (протокол синтезу пеп(М+Н+), (ber: 1303,6). тидів, S.11) із DIC/HOBt-зв'язуванням, з вихідною 1 Н-ЯМР (500МГц, D2 O/D MSO-d 6, d у млн -1): кількістю 2,5г МВН А-смоли (завантажувальна гус8,14, m, 1H, 7,90, m, 1H, 7,80, m, 1H, 7,50, m, тина 1,08ммоль/г). Після відщеплення HF від полі2Н, 7,35, m, 2H, 7,0, m, 6H, 7,63, m, 2Н, аромат. Н; мерного носія одержували 2,78г сирого пептиду, 5,0, m, 1Н, 4,83, m, 2Н, 4,41, m, 1Н, 4,30-4,05, кільякий очищали шляхом стандартної препаративної ка m, 4Н, Сa-Н; від 3,66 до 2,25, кілька m, аліфат. і НРСІ. Після сублімаційного сушіння, яке здійснюΗ аромат, боков. ланцюгів; 2,95, s, u. 2,75, s, N-Me; вали відразу після цього, одержували 400мг HPLCвід 2,05 до 1,1, кілька m, залишк. аліфат. Н; 1,20, однорідного продукту сумарної формули С75, Н102, N15, 014, СІ з правильним ESI-MS: 1472,6 d, Cb-Η Ala; 0,75, m, 6H, Cd-H Leu Сполуки згідно з винаходом за формулою І (М+Н+) (ber: 1471,7) і відповідним 1Н-ЯМРдосліджували на рецепторне зв'язування. Цей спектром. 1 спосіб був наближений до способу, описаного в Н-ЯМР (500МГц, D2 O/D MSO-d 6, d у млн -1): роботі Beckers et al., Eur. J. Biochem. 231, 535-543 8,62, m, 2H, 8,30, m, 2H, 7,80, m, 4H, 7,66, s, (1995). Одержаний згідно з вищеописаним синте1H, 7,47, m, 2H, 7,36, d, 1H, аромат. Η; 7,25 і 7,20, зом Cetrorelix йодували за допомогою [125І] 2 d, 4Н, аром, Η (pCI)Phe; 6,96 і 6,63, 2 d, 4Н, аро(Amersham; питома активність 80,5Bq/фмоль) при мат. Η Туr; від 5,10 до 4,0, кілька m, Сa-Н і аліфат застосуванні реагенту lodoGen (Pierce). Реакційну Н; 3 75 до 2,65, кілька m, Сb-Н і N-CH3; від 2,1 до суміш очи щали шляхом високоефективної рідин1,05, кілька m, залишк. аліфат Н; 1,74, s, 3Н, аценої хроматографії з оберненням фаз, причому мотил; 1,23, d, 3Н, Сb-Н Ala; 1,20, m, СН3 ізопроп.; нойодований Cetrorelix одержували без застосу0,8, m, 3Н, Сd-Н Nle вання міченого пептиду. Для специфічного Приклад 5 1 2 3 4 5 рецепторного зв'язування потрібно приблизно по Ac-D-Nal(2) -D-Cpa -D-Pal(3) -Ser -N-Me-Tyr 80% [125l]-Cetrorelix та неміченої сполуки згідно з D-Hci6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-Sar10-NH2 винаходом. Синтез здійснювали за діаграмою послідовноСполуки згідно з винаходом випробують описті твердофазного синтезу (протокол синтезу пепсаними нижче способами 1 та 2 на їх дію in-vitro, тидів, S.11) із DIC/HOBt-зв'язуванням, з вихідною причому спорідненість зв'язування визначали в кількістю 2,5г МВН А-смоли (завантажувальна гусаналізі зв'язування за допомогою [125l]-Cetrorelix тина 1,08ммоль/г). Після відщеплення HF від полі(Спосіб 1), а функціональну активність визначали мерного носія одержували 2,74г сирого пептиду, за допомогою Triptorelin як агоністичного стимулу який очищали шляхом стандартної препаративної (Спосіб 2). НРСІ. Після сублімаційного сушіння, яке здійснюСпосіб 1. вали відразу після цього, одержували 840мг HPLCАналіз рецепторного зв'язування згідно з однорідного продукту сумарної формули С75, Beckers, Т., Marheineke, K., Reiländer, Η., Hilgard P. Н102, N15, 014, СІ з правильним ESI-MS: 1472,6 (1995) "Selection and characterization of mammalian (М+Н+) (ber: 1471,7) та відповідним спектром 1Нcell lines with stable overexpression of human ЯМР. 1 -1 pituitary receptors for gonadoliberin (GnRH)" Eur. J. Н-ЯМР (500МГц, D2 O/D MSO-d 6, d у млн ): Biochem. 231, 535-543. 8,6, m, 2H, 8,3, m, 2H, 7,85, m, 2H, 7,8, m, 2H, Для дослідження рецепторного зв'язування 7,65, s, 1H, 7,46, m, 2H, 7,35, d, 1H, аромат. Н; 7,23 Cetrorelix йодували з застосуванням реагенту і 7,17, 2 d, 4Н, аром. Η(pCI)Phe; 7,0 і 6,6, 2 d, 4Н, locloGen (Pierce) з [125І] (Amersham; питома активаромат. Η Туr; від 5,10 до 3,8, кілька m, Сa-Н і аліність 80,5Bq/фмоль). Реакційну суміш очищали за фат Н; від 3,75 до 2,6, кілька m, Сb-Н і N-CH3; від допомогою високоефективної фазообмінної рідин2,2 до 1,05, кілька m, залишк. аліфат Н; 1,70, s, 3Н, ної хроматографії, причому монойодований ацетил; 1,23, d, 3Н, Cb Ala; 1,20, m, СН3 ізопроп. Cetrorelix одержували без застосування міченого ;0,8, т, 3Н, Сd Nle пептиду. Для специфічного рецепторного зв'язуПриклад 6 вання застосовували приблизно 80% [125I] 1 4 3-(4-фторфеніл)-пропіоніл-D-НаІ(1) -Sеr -NCetrorelix. 13 70997 14 Аналіз рецепторного зв'язування здійснювали кількісного визначення клітинної Luc-активності. з інтактними клітинами у фізіологічних умовах, як Розрахунок значень IC50 на основі кривої дозаописано у роботі Beckers et al., 1995. Субконфлюефективність здійснювали через нелінійний регреентні культури стабільно трансфікованих LТК-сивний аналіз із застосуванням Hill-моделі клітин, які експресують РГЛГ-рецептори людини, (Programm EDX 2,0 від С. Grunwald, відокремлювали шляхом інкубування у NaCI/Pj Arzneimittelwerk Dresden). (137мМ NaCI, 2,7мМ КСІ, 8,1мМ Na2HPO4 , 11,47мМ Кількісне визначення Luc-активності двічі здійКН2РО4)/1мМ EDTA і збирали шляхом центрифуснювали так, як описано в Promega Technical гування. Гранули клітин ресуспендували у зв'язуBulletins #101/161, із застосуванням відповідної вальному буфері (DMEM без Н2СО3, з 4,5г/л глюсистеми аналізу люциферази (Promega E4030). кози, 10мМ Hepes, pH7,5, 0,5% (маса/об'єм) BSA, Шляхом додавання коферменту А (СоА) відбува1г/л Bacitracin, 0,1г/л SBTI, 0,1% (маса/об'єм) ється окиснення Luciferyl-CoA зі сприятливою кінеNaN3). Для аналізу витіснення тикою. Після видалення культурального середо0,25x106клітин/100мкл інкубували з приблизно вища з мікротитрувального планшета клітини 225пМ [125l]-Cetrorelix (питома активність 5розчиняли додаванням 100мкл лізисного буфера 10x105дпм/пмоль) та різними концентраціями не(25мМ Tris-фосфату, рН 7,8, 2мМ дитіотреїтолу, міченої сполуки згідно з винаходом як конкурую2мМ 1,2-діаміноциклогексан-N,N,N’,N’-тетрачою сполукою. Шар суспензії клітин у 100мкл зв'яоцтової кислоти (СОТА), 10% (об'єм:об'єм) гліцезувального середовища у 400мк пробірці рину, 1% (об'єм:об'єм) Triton X-100). Через 15хв поміщали на 200мкл 84об'ємн.% силіконової олії інкубації при кімнатній температурі 10мкл лізату (Merck Тур 550)/16об'ємн.% парафінової олії. Пісклітин переносили до придатного для люмінометля інкубації протягом 1год при 37°С під час повільричного детектування білого мікротитрувального ного безперервного збовтування клітини шляхом планшета (Dynatech). Ферментативну реакцію ініцентрифугування протягом 2хв при 9000об./хв (тип ціювали через додавання 50мкл буфера для анадвигуна НТА13.8; Heraeus Sepatec, лізу (20мМ Тrісіn, рН 7,8, 1,07мМ Osterode/Germany) відокремлювали від інкубацій(MgCO3)4 Mg(OH)2, 2,67мМ MgSO4, 0,1мМ етиленного середовища. Кінчики пробірок, які містили діамін-тетраоцтової кислоти (EDTA), 33,3мМ дитіогранули клітин, зрізали. Гранули клітин та інші затреїтолу, 270мМ коферменту А, 470мМ люцифелишки відразу після цього піддавали аналізу за рину світляка (Photinus pyralis), 530мМ rATPNa 2). Через одну хвилину для загального часу в одну допомогою g-лічильника. Кількість неспецифічних секунду визначали люмінесценцію з напівперіодом зв'язувань визначали з включенням неміченого сигналу у п'ять хвилин з застосуванням EG&G Cetrorelix при остаточній концентрації 1мМ, і вона Berthold MicroLumat LB 96 P. становила, як правило, £10% від загальної кількоТаким чином отримували нижченаведені inсті зв'язувань. Аналіз даних зв'язування здійснюvitro дані, причому КD означає спорідненість зв'явали за допомогою програми аналізу EBD A/ліганд зування, a IC50 - функціональну активність, і рМ (Biosoft V3,0). означає пмоль на літр: Спосіб 2. Функціональний аналіз для визначення антаСполука КD [рМ] ІС50 [рМ] гоністичної ефективності Аналіз з окремими видозмінами здійснювали, Cetrorelix 170 (21) 198 (5) як описано у роботі Beckers, Т., Reiländer, Η., Приклад 1 (Ацен. в. 242 (3) Hilgard, P. (1997) „Characterization of gonadotropinтатна сіль) releasing hormone analogs based on a sensitive Приклад 2 181 (1) 684 (2) cellular luciferase reporter gene assay", Analyt. Приклад 3 154(1) 492 (2) Biochem. 251, 17-23 (Beckers et al. 1997). 10000 Приклад 6 н. в. 221 (2) клітин на лунку, які експресували РГЛГ-рецептор людини та ген-репортер люциферази, культивуван. в. = не визначено ли 24год у мікротитрувальних планшетах із засто() = кількість незалежних один від одного досуванням DMEM з домішками і 1% (о:о) FCSі. Кліслідів тини відразу після цього протягом 6год 6 стимулювали 1нМ [D-Trp ] РГЛГ. Перед стимулюванням додавали антагоністичні сполуки згідно з винаходом і клітини на завершення розчиняли для Комп’ютерна в ерстка О. Гапоненко Підписне Тираж 37 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601