Нові lнrн-антагоністи, спосіб їх одержання та застосування як лікарського засобу

Винахід стосується LHRH-антагоністів з поліпшеними властивостями розчинності, способу одержання цих сполук, лікарських засобів, які містять ці сполуки, а також застосування лікарських засобів для лікування гормональнозалежних пухлин та застосування гормональних препаратів при незлоякісних захворювання, таких як доброякісна гіперплазія передміхурової залози (ВРН) та ендометріоз. Застосовувана для визначення пептидів номенклатура узгоджується з номенклатурою, яка тлумачиться Комісією IUPAC-IUB з біохімічної номенклатури [European J. Biochem. 1984, 138, 9-37], за якою, згідно з традиційним уявленням, аміногрупи на N-кінці розташовані справа наліво, а карбоксильна група на С-кінці зліва направо. LH-RH-антагоністи, такі як пептиди згідно з винаходом, охоплюють природні та синтетичні амінокислоти, причому до перших належать Ala, Val, Leu, lle, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Phe, Туr, Pro, Trp та His. В основі скорочень для окремих амінокислотних залишків лежать традиційні назви амінокислот: АІааланін , Аrg=аргінін, GІугліцин , Lеu=лейцин, Lуs=лізин, РаІ(3)=3-(3-піридил)аланін, = = NaІ(2)=3-(2-нафтил)аланін, Рhе=фенілаланін, Сра=4-хлорфенілаланін, Рrо=пролін, Sen=cepин, Тhr=треонін, Тrр=триптофан, Туr=тирозин і Sаr=саркозин. Усі описані авторами амінокислоти походять від L-серії, якщо не вказано іншого. Наприклад D-Nal(2) є скороченням для 3-(2-нафтил)-О-аланіну, a Ser - скороченням для L-серину. Заміщення в e-аміногрупі у боковому ланцюгу лізину представлено через Lys у дужках, необов'язково у формі скорочення. Інші скорочення: Ас Ацетил В 4-(4-амідино-феніл)-аміно-1,4-діоксобутил Вос Tрет-бутилоксикарбоніл Вор Бензотриазол-1-окси-трис(диметиламіно)-фосфонійгексафторофосфат DCC Дициклогексилкарбодіїмід DCM Дихлорметан Ddz Диметоксифенілдиметилметиленокси-карбоніл (Диметокси-диметил-Z) DIC Діізопропілкарбодіїмід DIPEA Ν,Ν-діізопропілетиламін DMF Диметилформамід Fmoc Флуоренілметилоксикарбоніл HF Фтористоводнева кислота HOBt 1-гідроксибензотриазол HPLC Рідинна хроматофафія високого тиску Me Метил TFA Трифтороцтова кислота Ζ Бензилоксикарбоніл Пептиди згідно з винаходом являють собою аналоги гормону вивільнення лютеїнізуючого гормону (LHRH), що має таку структуру: p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2, [LH-RH, гонадорелін]. Понад 20 років дослідники шукають селективно активні антагоністи LH-RH-декапептидів [M.Karten und J.E.Rivier, Endocrine Reviews 7, 44-66 (1986)]. Великий інтерес до таких антагоністів пояснюється їх корисністю в галузях ендокринології, гінекології, попередження вагітності та онкології. Було одержано велику кількість таких сполук, як потенційні LH-RHантагоністи. Найцікавішими сполуками, які було виявлено на цей час, є сполуки, структура яких являє собою модифікацію LH-RH-структури. Першу серію ефективних антагоністів одержували через введення ароматичних амінокислотних залишків у позиції 1, 2, 3 та 6 або 2, 3 та 6. Звичне написання сполук виглядає так: спочатку вказують амінокислоти, які у пептидному ланцюгу LH-RH займають місце амінокислот, які там первісно перебували, причому позиції, в яких відбувався обмін, позначаються цифрами верхнього індексу. Крім того, через позначення "LH-RH" було продемонстровано, що йдеться про аналоги LH-RH, на яких відбувається обмін. Відомі антагоністи: [Ac-D-Cpa1,2, D-Trp3,6] LH-RH [D.H.Coy et al., in: Gross, E. and Meienhofer, J. (Eds) Peptides; Proceedings of the 6th American Peptide Symposium, S.775-779, Pierce Chem.Co., Rockville III. (1979)]; [Ac-Pro1, D-Cpa2, D-Nal(2)3,6] LH-RH [Патент США №4.419.347] та [Ac-Pro1, D-Cpa2, D-Trp3,6] LH-RH [J.L.Pineda, et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 56, 420, 1983]. Для поліпшення дії антагоністів у позицію 6 згодом вводили основні амінокислоти, наприклад D-Arg. Наприклад [Ac-D-Cpa1,2, D-Trp3, D-Arg6, D-Ala10] LH-RH (ORG-30276) [D.H.Coy, et al., Endocrinology 100, 1445, 1982]; та [Ac-D-Nal(2)1, D-Phe(4-F)2, D-Trp3, D-Arg6] LH-RH (ORF 18260) [J.E. Rivier et al., in: Vickery B.H. Nestor, Jr. J.J., Hafez, E.S.E (Eds). LHRH and its Analogs, S.11-22 MTP Press, Lancaster, UK1984]. Інші ефективні LH-RH-антагоністи описано у [WO 92/19651, WO 94/19370, WO 92/17025, WO 94/14841, WO 94/13313, US-A 5,300,492, US-A 5,140,009, ЕР 0413209 А1 та DE 19544212 А1]. В останньому описано сполуки з модифікованою орнітиновою або лізиновою ланкою у позиції 6, які відповідають такій формулі: Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-Tyr5-D-Xxx6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2, де DXxx являє собою амінокислотну групу загальної формули (VI) Іншими відомими LH-RH-антагоністами є Antarelix, Ganirelix та Cetrorelix. Antarelix Ò (INN: Teverelix): Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-Tyr5-D-Hci6-Leu7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2 Ganirelix: Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-Tyr5-D-hArg(Et)26-Leu7-hArg(Et)28-Pro9-D-Ala10-NH2 Cetrorelix: Ac-D-Nar(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-Tyr5-D-Cit6-Leu7-Arge-Pro9-D-Ala10-NH2 Метою винаходу є забезпечення нових LH-RH-антагоністів, які мають підвищену ферментну стабільність і значно поліпшену розчинність у воді. Ця задача вирішується завдяки сполукам загальної формули (І) A-Xxx1-Xxx2-Xxx3-Xxx4 -Xxx5-Xxx6 -Xxx7-Xxx8Xxx9-Xxx10-NH2 (I) у якій А означає ацетильну групу, Ххх1 D-Nal(2), Xxx2D-Cpa, Ххх3 D-Pal(3), Ххх4 Ser, Ххх5 N-Me-Tyr, Ххх6 D-Cit, D-Hci або D-[e-N'-4-(4-амідинофеніл)-аміно-1,4-діоксо-бутил]-Lуs (скорочено: D-Lys(B)), Ххх7 Leu або Nle, Ххх8 Arg або Lys(iPr), Ххх9 Pro, і Ххх10 D-Ala або Sar, за умови, що у разі, коли Ххх6 означає D-Lys(B), то Ххх7 є Nle, коли Ххх6 означає D-Cit, то Ххх7 є Nle і Ххх10 є D-Ala, або коли Ххх6 означає D-Hci, то Ххх7 є Leu і Ххх10 є D-Ala, та їх солям з фармацевтично прийнятними кислотами, зокрема ацетатам, ембонатам та трифторацетатам. Згідно з іншим аспектом винаходу, особливу перевагу віддають таким сполукам, а також їх солям з фармацевтично прийнятними кислотами: Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Nle7-Arg8-Pro9-Sar10-NH2 Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Nle7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2 Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-Sar10-NH2 Ac-D-Nal(2)1-D-Phe(4-CI)2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2 Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Cit6-Nle7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2 Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2 Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Cit6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2 Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hcie-Leu7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2 Згідно з іншим аспектом винаходу, сполуки згідно з винаходом існують у формі ацетатних, трифторацетатних або ембонатних солей. Згідно з іншим аспектом винаходу, сполуки згідно з винаходом застосовують як лікарські засоби або фармацевтичні композиції. Згідно з іншим аспектом винаходу, одержують фармацевтичні композиції, які включають принаймні одну зі сполук згідно з винаходом і традиційні носії та допоміжні речовини. Згідно з іншим аспектом винаходу, пропонується спосіб одержання сполук згідно з винаходом загальної формули І, при якому фрагменти ланок Хххm з відповідними захисними групами, де т означає ціле число від 1 до 10, і Ххх1 є ацетилованим, будують традиційним способом на твердій фазі або у розчині, відразу за цим фрагменти зв'язують із твердою фазою шляхом сегментного з'єднання і по завершенню з'єднання сполуки загальної формули І традиційним способом з амідуванням на ланці Ххх10 відщеплюють від твердої фази. Згідно з іншим аспектом винаходу, пропонується застосування сполук згідно з винаходом для одержання лікарських засобів для лікування гормональнозалежних пухлин, зокрема карциноми передміхурової залози або раку молочної залози, а також незлоякісних показань, лікування яких вимагає пригнічення LH-RH-гормону. Згідно з іншим аспектом винаходу, пропонується спосіб одержання фармацевтичних композицій, при якому принаймні одну сполуку за одним з пп. з 1 по 10 змішують з традиційними носіями та допоміжними речовинами і розфасовують як лікарський засіб. Згідно з іншим аспектом винаходу, пропонується спосіб лікування гормональнозалежних пухлин, зокрема карцином передміхурової залози, раку молочної залози або міоми матки, а також незлоякісних показань, лікування яких вимагає пригнічення LH-RH-гормону, таких як ендометріоз, доброякісна гіперплазія передміхурової залози (ВРН), а також лікування порушень жіночої або чоловічої плідності у ссавців, зокрема людини, через введення активної дози принаймні однієї сполуки згідно з винаходом. Сполуки згідно з винаходом можуть застосовуватися для лікування гормональнозалежних пухлин, зокрема карциноми передміхурової залози, раку молочної залози або міоми матки, а також незлоякісних показань, лікування яких вимагає пригнічення LH-RH-гормону, таких як ендометріоз або доброякісна гіперплазія передміхурової залози (ВРН). Крім того, вони можуть застосовуватися для лікування порушень плідності жінок та чоловіків, наприклад, для контрольованої оваріальної суперстимуляції у межах штучного запліднення (запліднення in vitro). Для цього їх зазвичай відомими спеціалістам способами змішують з традиційними носіями та допоміжними речовинами і розфасовують як лікарські засоби. Синтез сполук згідно з формулою (І) здійснюють як через послідовну побудову з застосуванням у боковому ланцюгу уже ацетильованого карбоновою кислотою загальної формули R1-COOH D-лізину шляхом класичної фрагментної конденсації або через твердофазний синтез за Мерифілдом, так і через перетворення декапептидної ланки з відповідними карбоновими кислотами через амідний зв'язок у боковому ланцюгу D-лізину6. Таким чином, введення R1-СО-групи може відбуватися у три різні моменти здійснення способу: перед конденсацією окремих ланок до пептиду, після вставлення лізину або орнітину у пептидний ланцюг, але до конденсації наступної ланки, або після конденсації всіх ланок. Сполуки формули (І) можуть бути синтезовані відомими способами, наприклад, суто твердофазним способом, частково твердофазним способом (так звана фрагментна конденсація) або через класичне з'єднання розчинів [див. M.Bodanszky, "Principles of Peptide Synthesis", Springer Verlag 1984]. Наприклад, способи твердофазного синтезу описано в роботах [Lehrbuch "Solid Phase Peptide Synthesis", J.M.Stewart and J.D.Young, Pierce Chem.Company, Rockford, III, 1984, та G.Barany and R.B.Merrifield "The Peptides", Ch.1, S.1-285,1979, Academic Press Inc.]. Класичні способи синтезу в розчинах докладно описано в роботі ["Methoden der Organischen Chemie (Houben-Weyl), Synthese von Peptides" E. Wiinsch (Herausgeber) 1974, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, BRD]. Поетапну побудову здійснюють, наприклад, так: спочатку карбокси-кінцеву амінокислоту, a-постійна аміногрупа якої є захищеною, ковалентно зв'язують із зазвичай застосовуваним для цього нерозчиннти носієм, який відщеплює a-аміно-захисну групу цієї амінокислоти, з утвореною таким чином вільною аміногрупою через свою карбоксигрупу зв'язується наступна захищена амінокислота, і таким чином поступово у належній послідовності з'єднується решта амінокислот пептиду, який має бути синтезований, а після з'єднання всіх амінокислот готові бокові функціональні захисні групи. Поетапна конденсація відбувається традиційним способом через синтез із відповідних звичайним способом захищених амінокислот. З'єднання окремих амінокислот одна з одною відбувається зазвичай такими способами, зокрема: способом симетричного ангідриду у присутності дициклогексилкарбодіїміду або діізопропілкарбодіїміду (DCC, DIC) - карбодіїмідним способом в цілому - карбодіїмідно-гідроксибензотриазольним способом [див. The Peptides, Volume 2, Ed. E. Gross and J. Meienhofer]. При з'єднанні фрагментів в оптимальному варіанті застосовують азидне з'єднання, яке здійснюють без рацемізації, або DCC-1-гідроксибензотриазольний або DСС-3-лдрокси-4-оксо-3,4-дигідро-1,2,3бензотриазиновий спосіб. Також можуть бути застосовані активовані естери фрагментів. Для поетапної конденсації амінокислот особливо придатними є активовані естери N-захищених амінокислот, такі як, наприклад, N-гідроксисукцинімідний естер або 2,4,5-трихлорфеніловий естер. Аміноліз добре каталізується N-гідроксисполуками, які мають кислотність оцтової кислоти, наприклад, 1гідроксибензотриазолом. Як проміжні амінозахисні групи, придатними є дегідратуючі групи, такі як, наприклад, бензилоксикарбонільний залишок (= Z-залишок) або слабкокислі відщеплювані групи. Як захисні групи для α-постійних аміногруп придатними є, наприклад: третинні бутилоксикарбонільні групи, флуоренілметилоксикарбонільні групи, карбобензоксигрупи або карбобензтіогрупи (необов'язково з відповідним р-бром- або р-нітро-бензильним залишком), трифторацетильна група, фталільний залишок, о-нітрофеноксіацетильна група, тритильна група, ртолуолсульфонільна група, бензильна група, заміщені у бензольному каркасі бензильні залишки (р-бромабо р-нітро-бензильний залишок) та а-фенілетильний залишок. На них також вказано в роботах [Jesse P. Greenstein und Milton Winitz, Chemistry of Amino Acids, New York 1961", John Wiley and Sons, Inc., Volume 2, наприклад, стор.883 і далі, "Principles of Peptide Synthesis", Springer Verlag 1984, "Solid Phase Peptide Synthesis" J.M.Stewart and J.D.Young, Pierce Chem.Company, Rockford, III, 1984, G.Barany and R.B.Merrifield "The Peptides", Ch. 1, S.1-285,1979, Academic Press Inc. а також The Peptides, Volume 2, Ed. E. Gross and J. Maienhofer, Academic Press, New York]. В принципі, ці захисні групи є придатними також для захисту інших функціональних бокових груп (ОН-груп, NH2 -груп) відповідних амінокислот. Наявні гідроксигрупи (серин, треонін) в оптимальному варіанті захищаються бензильними та подібними до них групами. Інші не a-постійні аміногрупи (наприклад аміногрупи у w -позиції, гуанідиногрупа аргініну) в оптимальному варіанті є ортогонально захищеними. Окремі амінокислотні ланки, за винятком модифікованого R1-CO-групою лізину, виробляються серійно. Можливий порядок здійснення способу одержання модифікованого R1-CO-групою лізину є таким: 1. a-карбоновокислотну групу відповідним чином захищають, наприклад, шляхом етерифікації. 2. e-аміногрупу захищають, наприклад Z-групою, 3. a-аміногрупу (наприклад, Вос-групу) захищають таким чином, що забезпечується селективність щодо наступного відщеплення амінозахисних груп. 4. Z-групу на e-аміногрупі відщеплюють. 5. На e-аміногрупі водять потрібну групу R1-CO. 6. Захисну групу на a-аміногрупі відщеплюють. 7. a-аміногрупу необов'язково піддають оборотній дериватизації, наприклад, Z-групою. Для введення R1-CO-групи через перетворення аміногрупи лізину відповідною карбоновою кислотою або похідною карбонової кислоти придатним є в принципі такий самий спосіб, як описаний вище для з'єднання амінокислот. Однак особливу перевагу віддають конденсації з застосуванням карбодіїміду, наприклад 1-етил-3-(3-диметиламінопропіл)-карбодіїмід, та 1-гідроксибензотриазолу. Реакція для з'єднання амінокислот відбувається у зазвичай застосовуваному для цього розчиннику або суспендуючому агенті (наприклад, дихлорметані), причому для поліпшення розчинності необов'язково додають диметилформамід. Як синтетична основа, придатними є нерозчинні полімери, наприклад, полістиролова смола у формі гранул, яка набухає в органічному розчиннику (наприклад, співполімеризат з полістиролу та 1% дивінілбензолу). Побудову захищеного декапептидаміду на метил-бензгідриламіновій смолі (МВНА-смола, тобто, полістиролова смола, яка має метил-бензгідриламіногрупи), яка забезпечує потрібну С-кінцеву амідну функцію пептиду після HF-відщеплення носія, здійснюють згідно з такою схемою послідовності операцій: Схема послідовності операцій Протокол синтезу пептидів із застосуванням Вос-захищених амінокислот Етап о 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Функція Промивання Промивання Відщеплення Промивання Промивання Промивання Нейтралізація Промивання Промивання STOP З'єднання Промивання Промивання Розчинник/реактив (об'єм/об'єм) Метанол DCM DCM/TFA(1:1) Ізопропанол Метанол DCM DCM/DIPEA(9:1) Метанол DCM Додавання Boc-As у DCM+DIC+HOBt DCM, необов. DCM/DCF Метанол DCM Час 2´2хв 3´3хв 1´30хв 2´2хв 2´2хв 2´3хв 3´5хв 2´2хв 3´3хв прибл. 90хв 3´2хв 2´3хв Νa-Вос-захищені амінокислоти зазвичай з'єднують у потрійній молярній надлишковій кількості у присутності діізопропілкарбодіїміду (DIC) та 1-гідроксибензотриазолу (HOBt) у CH2Cl2/DMF протягом 90хв і Вос-захисну групу відщеплюють через півгодинну дію 50% трифтороцтової кислоти (TFA) у СН2СІ 2. Для контролю повного перетворення може служити випробування хлоранілом за Кристенсеном та випробування нінгідрином за Кайзером. Решта вільних амінофункцій блокується через ацетилювання у п'ятиразовій надлишковій кількості ацетилімідазолу в СН2СІ 2. Черговість етапів реакції з побудови пептидів на смолі представлено у таблиці. Для відщеплення зв'язаних смолою пептидів відповідний кінцевий продукт твердофазного синтезу висушують у вакуумі над P2O5 і обробляють у 500-разовій надлишковій кількості на HF/анізолі 10:1/об'єм:об'єм 60хв при 0°С. Після відгону HF та анізолу у вакуумі через екстрагування безводним етиловим етером у вигляді білої твердої речовини одержують пептиди, відокремлення паралельно одержаного полімерного носія здійснюють через вимивання 50% водним розчином оцтової кислоти. Шляхом обережного звуження розчинів в оцтовій кислоті у вакуумі одержують відповідні пептиди у вигляді високов'язких олій, які перетворюються після додавання абс. етеру в холодильнику на білу тверду речовину. Подальше очищення відбувається стандартними способами препаративної рідинної хроматографії високого тиску (HPLC). Перетворення пептидів на їхні кислі адиційні солі здійснюють з використанням кислот відомим спеціалістам способом. І навпаки, вільні пептиди одержують шляхом перетворення їхніх кислих адиційних солей основами. Пептидоембонати можуть бути одержані через перетворення солей трифтороцтової кислоти (TFA-солей) пептиду вільною ембоновою кислотою (памовою кислотою) або відповідною динатрієвою сіллю ембонової кислоти. Для цього сіль пептид-TFA у водному розчині перемішують із розчином динатрій-ембонату у полярному апротонному середовищі, в оптимальному варіанті диметилацетаміді, і відокремлюють утворений світло-жовтий осад. Представлені нижче приклади пояснюють винахід, не обмежуючи його обсягу. Приклад 1 (D-68968): Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Nle7-Arg8-Pro9-Sar10-NH2 Синтез декапептиду відбувається на полімерному носії з густиною завантаження 0,55ммоль/г (амінометил-заміщена смола, Fmoc-захист, тип D-1675, Fa. Bachem). Лізин з'єднували як Fmoc-D-Lys(Boc)OH, Fmoc-захисні групи відщеплювали 20% піперидином у DMF. Після одночасного відщеплення всіх захисних груп бокових ланцюгів та відокремлення полімерного носія виділений необроблений пептид очищали шляхом препаративної HPLC. Після висушування заморожуванням одержували 98,5% декапептид. Заміщення на e-азоті D-лізину 4-(4-амінофеніл)-аміно-1,4-діоксомасляною кислотою здійснювали за допомогою РуВор у DMF при додаванні DIPEA. Очищення виділеного необробленого пептиду відбувалося шляхом препаративної HPLC. Здійснене відразу за цим висушування заморожуванням забезпечувало приблизно 99%-й продукт (трифторацетат) сумарної формули C82H106CIN19O15 з правильним FAB-MS 1633 (М+Н) (розрах. 1631,78096) Приклад 2 (D-68969): Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Nle7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2 Синтез декапептиду здійснювали на полімерному носії з густиною завантаження 0,55ммоль/г (амінометил-заміщена смола, Fmoc-захист, тип D-1675, Fa. Bachern). Лізин з'єднували як Fmoc-D-Lys(Boc)OH, Fmoc-захисні групи відщеплювали 20% піперидином у DMF. Після одночасного відщеплення всіх захисних груп бокових ланцюгів та відокремлення полімерного носія виділений необроблений пептид з вмістом приблизно 71% (HPLC) без очищення перетворювали далі. Заміщення у боковому ланцюгу D-лізину 4-(4-амінофеніл)-аміно-1,4-діоксо-масляного кислотою здійснювали за допомогою РуВор у DMF при додаванні DIPEA. Виділений необроблений пептид очищали шляхом препаративної HPLC. Після здійсненого відразу за цим висушування заморожуванням одержували 98,8%-й продукт (трифторацетат) сумарної формули C82H106CIN19O15 з правильним FAB-MS 1633 (М+Н) (розрах. 1631,78096) Приклад 3 (D-68971): Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-Sar10-NH2 Синтез декапептиду здійснювали на полімерному носії з густиною завантаження 0,55ммоль/г (амінометил-заміщена смола, Fmoc-захист, тип D-1675, Fa. Bachern). Лізин з'єднували як Fmoc-D-Lys(Boc)OH, Fmoc-захисні групи відщеплювали 20% піперидином у DMF. Після одночасного відщеплення всіх захисних груп бокових ланцюгів та відокремлення полімерного носія виділений необроблений пептид (Gehalt ca. 59%, HPLC) очищали шляхом препаративної HPLC. Після висушування заморожуванням одержували 95%-й декапептид. Заміщення у боковому ланцюгу D-лізину 4-(4-амінофеніл)-аміно-1,4-діоксо-масляною кислотою здійснювали за допомогою РуВор у DMF при додаванні DIPEA. Виділений необроблений пептид очищали шляхом препаративної HPLC. Після здійсненого відразу за цим висушування заморожуванням одержували 96,6%-й продукт (трифторацетат) сумарної формули C85H112CIN17O15 з правильним FAB-MS 1648 (М+Н) (розрах. 1645,8218) Приклад 4 (D-68987) Ac-D-Nal(2)1-D-Phe(4-CI)2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Lys(B)6-Nle7-Lys(iPr)8-Pro9-D-Ala10-NH2 Синтез D-Lys-6-незаміщеного декапептиду здійснювали на 9,09 г полімерного носія з густиною завантаження 0,55ммоль/г, лізин6 з'єднували як Fmoc-D-Lys(Boc)-OH. Після відщеплення смоли виділяли 8,15г необробленого пептиду. Очищення необробленого пептиду здійснювали шляхом препаративної HPLC. Заміщення у боковому ланцюгу D-лізину 4-(4-амінофеніл)-аміно-1,4-діоксо-масляною кислотою здійснювали за допомогою РуВор у DMF при додаванні DIPEA. Виділений необроблений пептид очищали шляхом препаративної HPLC. Після здійсненого відразу за цим висушування заморожуванням одержували 94,6%-й продукт (трифторацетат) сумарної формули C85H112CIN17O15 з відповідним FAB-MS: 1646,8 (М+Н; розрах.: 1645.82) Приклад 5: Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Cit6-Nle7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2 Приклад 6: Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Leu7-Arg8-Pro9-D-Ala10-NH2 Приклад 7: Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Cit6-Nle7-Lys(iPr8)-Pro9-D-Ala10-NH2 Приклад 8: Ac-D-Nal(2)1-D-Cpa2-D-Pal(3)3-Ser4-N-Me-Tyr5-D-Hci6-Leu7-Lys(iPr8)-Pro9-D-Ala10-NH2 Загальні технологічні вказівки для одержання пептидів згідно з Прикладами від 5 по 8: Декапептиди можуть бути одержані як шляхом твердофазного синтезу за Мерифілдом (SPPS), так і шляхом класичної фрагментної конденсації у розчині. Побудові пептидної послідовності на полімерному носії віддають перевагу з економічних міркувань, і її здійснюють на вибір за методиками (1)Вос або (2)Fmoc; відповідним чином, застосовують або метил-бензгідриламінову смолу (для 1), або Fтос-2,4-диметокси-4'(карбоксиметилокси)-бензгідриламінову смолу (для 2) для С-кінцевого приєднання D-аланіну. Твердофазний синтез. Спосіб Мерифілда: Декапептиди синтезують за стандартизованих умов реакції (схема послідовності операцій, Таблиця 1) для твердофазного синтезу за Fmoc-методикою з застосуванням 5 грамів полімерного носія Fтос-2,4диметокси-4'-(карбоксиметилокси)-бензгідриламінової смоли, Fa. Bachern D1675, густина завантаження приблизно 0,55ммоль/г, розмір частинок 200-400меш. Поетапну побудову послідовності на смолі здійснюють за допомогою Na-Fmoc-захищених амінокислот згідно з такою схемою послідовності операцій: Таблиця 1 Етап 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Функція Промивання Відщеплення Промивання Промивання Промивання Промивання Промивання З'єднання Промивання Промивання Промивання Промивання Промивання Промивання Контрольне випробування Pозчинник DMF 20% піперидин у DMF DMF Ізопропанол DMF Ізопропанол DMF Boc-AS-OH, HOBT, DIC у DMF DMF Ізопропанол DMF Ізопропанол DMF Ізопропанол випробування хлораніловим барвником* Час 2хв 5хв 2хв 2хв 2хв 2хв 2хв 90хв 2хв 2хв 2хв 2хв 2хв 2хв Повторення 2х 2х 2х 1х 2х 1х 2х 1х 1х 1х 1х 1х 1х 1х [*див. Т. Christensen, Ada Chem. Scand. В 33, 763-766, 1979] Типові для способу (повторювані) параметри реакції твердофазного синтезу декапептидів згідно з вищевказаною схемою: - відщеплення Fmoc-захисної групи 20 % піперидином у DMF, 2´5хв при кімнатній температурі (Етап 2). з'єднання у триразових молярних надлишкових кількостях Fmoc-амінокислот з діізопропілкарбодіїмідом (DIC) у присутності гідроксибензотриазолу (HOBt) (Етап 8). - С-кінцеве відщеплення полімерного носія, включаючи видалення захисних груп амінокислотних бокових ланцюгів трифтороцтовою кислотою (TFA). Після відщеплення полімерного носія при застосуванні 5 грамів смоли одержують приблизно 5-6 грамів необробленої пептидної суміші з вмістом приблизно 70-80 % потрібних компонентів; їх одержують шляхом здійсненої відразу після цього препаративної HPLC. Очищення декапептидів шляхом препаративної HPLC: умови хроматографії: 19 Преп. HPLC, Fa. Shimadzu, колонка Dynamax RP18.12мкм, 300Å, L=250мм, ID=41,4мм Градієнтна система з програмним керуванням, 40% В®90% В, 50хв Розчинник А: 970мл Н2О+30мл CH3CN+1мл CF3COOH Розчинник В: 300мл Н2О+700мл CH3CN+1мл CF3COOH УФ-виявлення, l=220нм, швидкість потоку 60мл/хв Одержані фракції звужують у вакуумі і ліофілізують. Декапептиди утворюються у вигляді легкого безбарвного матеріалу. Перетворення на потрібну для подальшої фармакологічної переробки форму ацетатної солі здійснюють відразу після цього шляхом хроматографічного іонного обміну. Дослідження біологічної дії: Сполуки згідно з винаходом за формулою І досліджують на їх рецепторне зв'язування. Спосіб базується на описаному в роботі [Beckers et al., Eur. J. Biochem. 231,535-543 (1995)] способі. Одержаний шляхом описаного вище синтезу Cetrorelix йодують [125І] (Amersham; питома активність 80,5Бк/фмоль) із застосуванням реактива lodoGen (Pierce). Реакційну суміш очищають шляхом оберненофазової високоефективної рідинної хроматографії, причому одержують моно-йодований Cetrorelix без неміченого пептиду. Придатними для специфічного рецепторного зв'язування є приблизно 80% [125l]-Cetrorelix і неміченої сполуки згідно з винаходом. Сполуки згідно з винаходом випробують на їх дію in vitro представленими нижче способами 1та 2, причому спорідненість зв'язування визначають в аналізі зв'язування з [125l]-Cetrorelix (Спосіб 1) та функціональну активність з Triptorelin як агоністичним стимулом (Спосіб 2). Спосіб 1 (визначення KD на прикладі Cetrorelix): Аналіз рецепторного зв'язування згідно з [Beckers, Т., Marheineke, K., Reilander, Η., Hilgard P. (1995) "Selection and characterization of mammalian cell lines with stable overexpression of human pituitary receptors for gonadoliberin (GnRH)" Eur. J. Biochem. 231, 535-543]. Для дослідження рецепторного зв'язування Cetrorelix із застосуванням реактиву lodoGen (Pierce) йодують [125І] (Amersham; питома активність 80,5Бк/фмоль). Реакційну суміш очищають шляхом високоефективної рідинної хроматографії з оберненням фаз, причому одержують моно-йодований Cetrorelix без неміченого пептиду. Приблизно 80% [125І] Cetrorelix були придатними для специфічного рецепторного зв'язування. Аналіз рецепторного зв'язування здійснюють з інтактними клітинами за фізіологічних умов, як описано [Beckers et al. 1995]. Субконфлюентні культури стабільно трансфікованих LTK-клітин, які експресують LHRH-рецептор людини, відокремлюють шляхом інкубації у NaCI/Pi (137мМ NaCI, 2,7мМ KСІ, 8,1мМ Na2HPO4, 11,47мМ KН2РО4)/1мМ EDTA і збирають шляхом центрифугування. Осад клітин ресуспендують у зв'язувальному буфері (DMEM без Н2СО3, з 4,5г/л глюкози, 10мМ Hepes, pH 7,5, 0,5% (маса/об'єм) BSA, 1г/л бацитрацину, 0,1г/л SBTI, 0,1% (маса/об'єм) NaN3). Для аналізів витіснення 0,25´106клітин/100мкл інкубують з приблизно 225пМ [125l]-Cetrorelix (питома активність 5-10´105dpm/пмоль) та різними концентраціями неміченої сполуки згідно з винаходом як конкурентної сполуки. Шар суспензії клітин у 100мкл зв'язувального середовища наносять у 400мкл трубках на 200мкл 84 % (за об'ємом) силіконової олії (Merck Тур 550)/16% (за об'ємом) парафінової олії. Після інкубації протягом 1год при 37°С при повільному безперервному струшуванні клітини шляхом центрифугування протягом 2хв при 9000об./хв (Тип ротора HTA13.8; Heraeus Sepatec, Osterode/Germany) відокремлюють від інкубаційного середовища. Кінці трубок, які містять осад клітин, зрізають. Осад клітин та надосадову рідину відразу за цим піддають аналізу шляхом підрахунку gвипромінення. Кількість неспецифічно зв'язаного матеріалу визначають при включенні неміченого Cetrorelix з кінцевою концентрацією 1мкМ, і вона, як правило, становить