Спосіб гістохімічного визначення жирних кислот в м’ясі та м’ясопродуктах за мікроскопічного дослідження

Реферат: Спосіб гістохімічного визначення жирних кислот в м'ясі та м'ясопродуктах за мікроскопічного дослідження, в якому від проби м'яса в кількості 40-50 г нарізають зрізи у кількості 2-4 на заморожувальному мікротомі, товщиною 10-15 мкм, наклеюючи їх на предметні скельця за допомогою суміші яєчного білка і гліцерину в співвідношенні 1:1 упродовж 30-35 хв. Фарбують водним розчином нільського синього з масовою часткою 1 % упродовж 5-6 хв та промивають дистильованою водою упродовж 10-12 с. Фарбують водним розчином нільського синього з масовою часткою 0,1 % упродовж 1-2 хв та промивають дистильованою водою упродовж 10-12 с. Диференціюють у водному розчині оцтової (етанової) кислоти з масовою часткою 1 % упродовж 20-30 с та заводять в гліцериновий гель на 1 годину із подальшим розгляданням х препаратів під світловим мікроскопом з об'єктивом зі збільшенням 40 і окуляром - зі х збільшенням 10 для виявленням відкладень нейтральних ліпідів червоного кольору та кислих ліпідів синього кольору. UA 98828 U (12) UA 98828 U UA 98828 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до сільського господарства, зокрема до ветеринарної медицини, і може бути використана для визначення жирних кислот в м'ясі та м'ясопродуктах за мікроскопічного дослідження при визначенні їх якості у виробничих лабораторіях на потужностях по переробці м'яса, на підприємствах по реалізації та зберіганні м'яса, у патоморфологічних відділах державних лабораторій ветеринарної медицини. За результатами цього методу можна отримати якісні показники при гістохімічному визначенні жирних кислот в м'ясі та м'ясопродуктах за мікроскопічного дослідження. Аналогом корисної моделі є спосіб гістохімічного визначення жирів суданами [1], який базується на визначенні жиру за допомогою використання індиферентних барвників групи суданів, які абсорбуються жиром, що міститься в тканинах досліджуваних препаратів. Недоліком даного способу є те, що він громіздкий, фарба для нього складна у приготуванні та дає похибку від 20 до 40 %. Прототипом корисної моделі є спосіб визначення жирних кислот за допомогою нільблау (нільського синього) [2], в якому застосовують розчини барвника, різні за концентрацією. Недоліком даного способу є те, що він значно залежить від коливань температури зовнішнього середовища, і, крім того, дає похибку у 20-30 % і застосовується тільки під час визначення жирів у тканинах організму тварин, в яких розвиваються патолого-анатомічні зміни. В основу даної корисної моделі поставлено задачу - розробити спосіб гістохімічного визначення жирних кислот в м'ясі та м'ясопродуктах за мікроскопічного дослідження шляхом застосування заморожувального мікротому, зміни часу при послідовному фарбуванні зрізів в кількості 2-4 за температури 55-60 °C водним розчином нільського синього з масовою часткою 1 %, промиванні дистильованою водою, фарбуванні водним розчином нільського синього з масовою часткою 0,1 %, промиванні дистильованою водою, диференціюванні у водному розчині оцтової (етанової) кислоти з масовою часткою 1 %, та заведенням в гліцериновий гель на 1 годину і подальшим розгляданням препаратів під світловим мікроскопом із виявленням відкладень нейтральних ліпідів червоного кольору (барвник виявляє властивість метахромазії), а відкладень кислих ліпідів - синього кольору. Задача вирішується тим, що використовують зрізи з м'яса або м'ясопродуктів у кількості 2-4, виготовлені на заморожувальному мікротомі, товщиною 10-15 мкм (мікрометрів), які наклеюють на предметні скельця за допомогою суміші яєчного білка і гліцерину в співвідношенні 1:1 і витримують упродовж 30-35 хв. за кімнатної температури (20±2 °C) і, використовуючи хімічний посуд з відповідними реактивами, послідовно фарбують отримані препарати за температури 5560 °C: - фарбують препарати у водному розчині нільського синього з масовою часткою 1 % протягом 5-6 хв.; - промивають препарати у дистильованій воді упродовж 10-12 с; - фарбують препарати у водному розчині нільського синього з масовою часткою 0,1 % протягом 1-2 хв.; - промивають препарати у дистильованій воді упродовж 10-12 с; - диференціюють препарати у водному розчині оцтової (етанової) кислоти з масовою часткою 1 % протягом 20-30 с; - заводять препарати у гліцериновий гель: на поверхню зрізів наносять 1 краплю гліцеринового гелю, зверху кладуть покривне скельце і притискають його вантажем на 1 год. Пофарбовані препарати розглядають під світловим мікроскопом з об'єктивом зі збільшенням х х 40 і окуляром - зі збільшенням 10 . У кожному зрізі виявляють відкладення нейтральних ліпідів червоного кольору, а кислих ліпідів - синього кольору. Етапи вирішення даної задачі наведено у нижчезазначених прикладах. Приклад 1. З проби м'яса чи м'ясопродуктів вагою 40-50 г виготовляють зрізи на заморожувальному мікротомі, товщиною 10-15 мкм (мікрометрів) у кількості 2-4, які наклеюють на предметні скельця за допомогою суміші яєчного білка і гліцерину в співвідношенні 1:1 і витримують упродовж 30-35 хв. за кімнатної температури (20±2 °C) і, використовуючи хімічний посуд з відповідними реактивами, послідовно фарбують отримані препарати за температури 3740 °С: - фарбують препарати у водному розчині нільського синього з масовою часткою 1 % упродовж 2-3 хв.; - промивають препарати у дистильованій воді упродовж 8-10 с; - фарбують препарати у водному розчині нільського синього з масовою часткою 0,05 % упродовж 0,5-1,0 хв.; - промивають препарати у дистильованій воді упродовж 8-10 с; 1 UA 98828 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 - диференціюють препарати у водному розчині оцтової (етанової) кислоти з масовою часткою 1 % протягом 15-20 с; - заводять препарати у гліцериновий гель: на поверхню зрізів наносять 1 краплю гліцеринового гелю, зверху кладуть покривне скельце і притискають його вантажем на 1 год. Пофарбовані препарати розглядають під світловим мікроскопом з об'єктивом зі збільшенням х х 40 і окуляром - зі збільшенням 10 . У кожному зрізі виявляють відкладення нейтральних ліпідів блідо-червоного кольору, а кислих ліпідів - блідо-блакитного кольору. Приклад 2. З проби м'яса чи м'ясопродуктів вагою 40-50 г виготовляють зрізи на заморожувальному мікротомі, товщиною 10-15 мкм (мікрометрів) у кількості 4-6, які наклеюють на предметні скельця за допомогою суміші яєчного білка і гліцерину в співвідношенні 1:1 і витримують упродовж 30-35 хв. за кімнатної температури (20±2 °C) і, використовуючи хімічний посуд з відповідними реактивами, послідовно фарбують отримані препарати за температури 3740 °С: - фарбують препарати у водному розчині нільського синього з масовою часткою 0,5 % протягом 4-5 хв.; - промивають препарати у дистильованій воді упродовж 10-12 с; - фарбують препарати у водному розчині нільського синього з масовою часткою 0,1 % протягом 0,5-1 хв.; - промивають препарати у дистильованій воді упродовж 10-12 с; - диференціюють препарати у водному розчині оцтової (етанової) кислоти з масовою часткою 1 % протягом 20-30 с; - заводять препарати у гліцериновий гель: на поверхню зрізів наносять 1 краплю гліцеринового гелю, зверху кладуть покривне скельце і притискають його вантажем на 1 год. Пофарбовані препарати розглядають під світловим мікроскопом з об'єктивом зі збільшенням х х 40 і окуляром - зі збільшенням 10 . У кожному зрізі виявляють відкладення нейтральних ліпідів блідо-червоного кольору, а кислих ліпідів - блідо-блакитного кольору. Приклад 3. З проби м'яса чи м'ясопродуктів вагою 40-50 г виготовляють зрізи на заморожувальному мікротомі, товщиною 10-15 мкм (мікрометрів) у кількості 2-4, які наклеюють на предметні скельця за допомогою суміші яєчного білка і гліцерину в співвідношенні 1:1 і витримують упродовж 30-35 хв. за кімнатної температури (20±2 °C) і, використовуючи хімічний посуд з відповідними реактивами, послідовно фарбують отримані препарати за температури 5560 °С: - фарбують препарати у водному розчині нільського синього з масовою часткою 1 % протягом 5-6 хв.; - промивають препарати у дистильованій воді упродовж 10-12 с; - фарбують препарати у водному розчині нільського синього з масовою часткою 0,1 % протягом 1-2 хв.; - промивають препарати у дистильованій воді упродовж 10-12 с; - диференціюють препарати у водному розчині оцтової (етанової) кислоти з масовою часткою 1 % протягом 20-30 с; - заводять препарати у гліцериновий гель: на поверхню зрізів наносять 1 краплю гліцеринового гелю, зверху кладуть покривне скельце і притискають його вантажем на 1 год. Пофарбовані препарати розглядають під світловим мікроскопом з об'єктивом зі збільшенням х х 40 і окуляром - зі збільшенням 10 . У кожному зрізі виявляють відкладення нейтральних ліпідів червоного кольору, а кислих ліпідів - синього кольору. Порівняльна оцінка результатів випробування вищезазначених способів гістохімічного визначення жирних кислот в м'ясі та м'ясопродуктах за мікроскопічного дослідження до прототипу наведені в таблиці 1. 2 UA 98828 U Таблиця 1 Порівняння способів гістохімічного визначення жирних кислот в м'ясі та м'ясопродуктах за мікроскопічного дослідження до прототипу № п/п 1. 2. 3. 4. 5. 6 7. 8. Показники, що порівнюються Складові способу: Застосування приладу Кількість тканин або м'яса Кількість зрізів Фіксування на предметних скельцях сумішшюзі співвідношенням Час фіксування зрізів, хв. Температурний режим за послідуючого фарбування, промивання у дистильованій воді та диференціюванні в оцтовій кислоті, °C Фарбування препаратів Час фарбування препаратів водним розчином, хв. масова частка, % Час промивання дистильованою водою, с Час фарбування препаратів водним розчином, хв. масова частка, % Час промивання дистильованою водою, с Час диференціації препаратів у водному розчині, сек. масова частка, % Час заведення у 9. гліцериновий гель, год. Мікроскопія препаратів під 10. світловим мікроскопом Інтенсивність кольору 11. відкладень нейтральних ліпідів Прототип Приклади 2 1 3 заморожувальний заморожуваль- заморожуваль- заморожувальмікротом ний мікротом ний мікротом ний мікротом 100 г 40-50 г 40-50 г 40-50 г 2-4 2-4 яєчного білка і гліцерину 1:1 2-4 2-4 яєчного білка і яєчного білка і яєчного білка і гліцерину гліцерину гліцерину 1:1 1:1 1:1 30-35 30-35 30-35 30-35 60 37-40 37-40 55-60 Суданом чорним в у етанолі з мас. часткою 70 % Нільський синій 6,0 Нільський синій Нільський синій Нільський синій 2-3 4-5 5-6 1,0 1,0 0,5 1,0 10 8-10 10-12 10-12 Нільський синій 6,0 Нільський синій Нільський синій Нільський синій 0,5-1,0 0,5-1,0 1,0-2,0 0,1 0,05 0,1 0,1 10 8-10 10-12 10-12 1,0 оцтова (етанова) кислота 15-20 1,0 оцтова (етанова) кислота 20-30 1,0 оцтова (етанова) кислота 20-30 1,0 1 1 1 1 оцтова (етанова) кислота 30 х х х х збільшення 40 ; окуляр зі збільшенням х 10 збільшення 40 ; збільшення 40 ; збільшення 40 ; окуляр зі окуляр зі окуляр зі збільшенням збільшенням збільшенням х х х 10 10 10 блідо-червоний блідо-червоний блідо-червоний 3 червоний UA 98828 U Таблиця 1 Порівняння способів гістохімічного визначення жирних кислот в м'ясі та м'ясопродуктах за мікроскопічного дослідження до прототипу № п/п 12. 13. 14. 15. 16. 5 10 Показники, що порівнюються Інтенсивність кольору відкладень кислих ліпідів Швидкість визначення досліду, хв. Стабільність показників по гістохімічному визначенню жирних кислот в м'ясі та м'ясопродуктах за мікроскопічного дослідження, % % співвідношення результатів гістохімічних досліджень до виявлення загального білка в м'ясі та м'ясопродуктах % співвідношення результатів гістохімічних досліджень до виявлення глікогену в м'ясі та м'ясопродуктах 1 Приклади 2 блакитний блідоблакитний блідоблакитний синій 85 хв. 66 хв. 68 хв. 68 хв. 62,1 76,7 75,5 95,3 76,0-78,4 79,9-82,5 82,8-84,3 88,6-91,1 80,7-83,1 82,5-84,2 83,9-86,3 92,0-94,6 Прототип 3 Дані таблиці 1 свідчать, що більш достовірні дані порівняно із результатами гістохімічних досліджень до виявлення загального білка в м'ясі та м'ясопродуктах - у 88,6-91,1 % [3] та до результатів гістохімічних досліджень до виявлення глікогену в м'ясі та м'ясопродуктах - у 92,094,6 % [4] були отримані при застосуванні методу за прикладом № 3. Також найвища стабільність показників по гістохімічному визначенню жирних кислот в м'ясі та м'ясопродуктах за мікроскопічним дослідженням була за прикладом № 3-95,3 %. Використовуючи метод за прикладом № 3, ми провели гістохімічне визначення жирних кислот в м'ясі та м'ясопродуктах на 56 пробах: м'ясо яловичини - 7 проб; м'ясо свинини - 6 проб; м'ясо баранини - 5 проб; м'ясо козлятини - 4 проби; ковбаса варена - 9 проб; ковбаса варенокопчена - 9 проб; ковбаса копчена - 8 проб; ковбаса сирокопчена - 8 проб. Попередньо проби м'яса та м'ясопродуктів були досліджені на виявлення загального білка та глікогену гістохімічними методами. Результати наведені в таблиці 2. 15 4 UA 98828 U Таблиця 2 Показники гістохімічних методів визначення якості м'яса та м'ясопродуктів й визначення жирних кислот за мікроскопічного дослідження за прикладом № 3 №/№ Види м'яса забійних тварин і птиці 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 5 10 15 20 25 30 М'ясо яловичини, n=7 М'ясо свинини, n=6 М'ясо баранини, n=5 М'ясо козлятини, n=4 Ковбаса варена, n=9 Ковбаса варено-копчена, n=9 Ковбаса копчена, n=8 Ковбаса сирокопчена, n=8 Гістохімічні дослідження м'яса Виявлення Виявлення Виявлення жирних кислот загального білка глікогену за прикладом № 3 Утворення забарвлення Утворення червоного Утворення забарвлення кольору забарвлення червонувато(нейтральні червоного оранжевого ліпіди) та кольору кольору синього кольору (кислі ліпіди) Проведеними дослідженнями встановлено, що при фарбуванні м'яса та м'ясопродуктів за розробленим способом на пофарбованих препаратах, які розглядали під світловим мікроскопом х х з об'єктивом зі збільшенням 40 і окуляром - зі збільшенням 10 , виявляли відкладення нейтральних ліпідів червоного кольору та кислих ліпідів синього кольору. Ці дані були стабільними та достовірними, отже, ці показники можна використовувати при якісному оцінюванні м'яса та м'ясопродуктів. Крім цього слід зазначити, що спосіб є експресним, простим у виконанні, а його результати дають конкретні якісні показники по інтенсивності фарбування відкладень нейтральних ліпідів у червоний колір та кислих ліпідів у синій колір. Метод за прикладом № 3 нами пропонується як якісний спосіб гістохімічного визначення жирних кислот в м'ясі та м'ясопродуктах за мікроскопічного дослідження поряд з іншими методами визначення якості м'яса та м'ясопродуктів [5]. Метод має перевагу перед існуючими якісними методами визначення доброякісності м'яса в тому, що результати мають достовірні показники по інтенсивності забарвлення. Джерела інформації: 1. Горальський Л.П. Основи гістологічної техніки і морфофункціональні методи досліджень в нормі та при патології / Л.П. Горальський, В.Т. Хомич, О.І. Кононський. - Житомир: Полісся, 2005. - 288 с. 2. Омеляненко М.М. Основи патогістологічних досліджень: Методичні вказівки для студентів та лікарів ветеринарної медицини / М.М. Омеляненко, Л.М. Потоцька. - К., 2013. - 137 с. 3. Меркулов Г.А. Курс патологогистологической техники / Г.А. Меркулов. - Л.: Медицина, 1979. - 423 с. 4. Шабадаш А.Л. Рациональная методика гистохимического обнаружения гликогена и ее теоретическое обоснование /А.Л. Шабадаш // Изв. АН СССР. Серия биологических наук. - № 6, 1947. - С. 745-760. 5. Правила передзабійного ветеринарного огляду тварин і ветеринарно-санітарної експертизи м'яса та м'ясопродуктів, затверджені наказом Голови Держдепартаменту ветеринарної медицини за № 28 від 7.06.2002 р. та зареєстровані в Мінюсті України 21.06.2002 р. за № 524/6812. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 40 Спосіб гістохімічного визначення жирних кислот в м'ясі та м'ясопродуктах за мікроскопічного дослідження, який відрізняється тим, що від проби м'яса в кількості 40-50 г нарізають зрізи у кількості 2-4 на заморожувальному мікротомі, товщиною 10-15 мкм, наклеюючи їх на предметні скельця за допомогою суміші яєчного білка і гліцерину в співвідношенні 1:1 упродовж 30-35 хв, при подальшому фарбуванні водним розчином нільського синього з масовою часткою 1 % упродовж 5-6 хв, промиванні дистильованою водою упродовж 10-12 с, фарбуванні водним розчином нільського синього з масовою часткою 0,1 % упродовж 1-2 хв, промиванні 5 UA 98828 U 5 дистильованою водою упродовж 10-12 с, диференціюванні у водному розчині оцтової (етанової) кислоти з масовою часткою 1 % упродовж 20-30 с та заведенні в гліцериновий гель на 1 годину із подальшим розгляданням препаратів під світловим мікроскопом з об'єктивом зі збільшенням х х 40 і окуляром - зі збільшенням 10 і виявленням відкладень нейтральних ліпідів червоного кольору та кислих ліпідів синього кольору. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6