Спосіб виробництва злитого білка tnfr-ig (варіанти)

1. Спосіб продукування TNFR-Ig у клітинній культурі великомасштабного виробництва, що включає кроки: забезпечення клітинної культури, що включає клітини ссавців, які містять ген, що кодує TNFR-Ig, ген якого експресується за умов клітинної культури; і середовище, що містить глутамін і має характеристику середовища, вибрану із групи, що складається із нижченаведених характеристик: і) сукупна кількість амінокислот на одиницю об’єму більша ніж приблизно 70 мМ; іі) молярне співвідношення сукупної кількості глутаміну до сукупної кількості аспарагіну становить менше ніж приблизно 2; ііі) молярне співвідношення сукупної кількості глутаміну до сукупної кількості амінокислот в цілому становить менше ніж приблизно 0,2; iv) молярне співвідношення сукупної кількості неорганічних іонів до сукупної кількості амінокислот в цілому становить приблизно від 0,4 до 1; v) об’єднана сукупна кількість глутаміну й аспарагіну на одиницю об’єму становить більше ніж приблизно 16 мМ, та їх комбінації; підтримання вказаної культури в початковій фазі росту при першому наборі умов культивування упродовж першого проміжку часу, достатнього для надання можливості вказаним клітинам репродукуватися до щільності життєздатних клітин в ме 2 (19) 1 3 89383 4 якщо вказана культура підтримувалась при пертури, (іі) рН, (ііі) осмоляльності, (iv) рівня хімічних шому наборі умов культивування; індуктантів та їх комбінації. зміну принаймні однієї з умов культивування таким 20. Спосіб за п. 18, у якому вказаний третій набір чином, щоб застосувати другий набір умов культиумов включає третій температурний діапазон, що вування; становить приблизно 27-37 градусів Цельсія. підтримання вказаної культури упродовж другого 21. Спосіб за п. 1, у якому вказаний перший проміпроміжку часу при другому наборі умов і упродовж жок часу становить від 1 до 7 днів. другого проміжку часу таким чином, щоб TNFR-Ig 22. Спосіб за п. 1, у якому вказаний перший промінакопичився в клітинній культурі. жок часу становить приблизно 4 дні. 3. Спосіб за п. 1, в якому вказана умова клітинної 23. Спосіб за п. 1, у якому вказаний перший промікультури у вказаній зміні на принаймні одному жок часу й вказаний другий проміжок часу сумарно кроці умов культивування вибирається із групи, що становлять принаймні 5 днів. складається із: (і) температури, (іі) рН, (ііі) осмоля24. Спосіб за п. 1, у якому в кроці підтримання вкальності, (iv) рівня хімічних індуктантів та їх комбізаної культури упродовж другого проміжку часу нації. рівень лактату зменшується слідом за рівнем лак4. Спосіб за п. 1, у якому початкова концентрація тату у культурі, досягаючи максимального рівня. глутаміну вказаного середовища становить менше 25. Спосіб за п. 1, у якому в кроці підтримання вканіж або дорівнює 10 мМ. заної культури упродовж другого проміжку часу 5. Спосіб за п. 1, у якому початкова концентрація рівень амонію зменшується услід за рівнем амонію глутаміну вказаного середовища становить менше в культурі, досягаючи максимального рівня. ніж або дорівнює 4 мМ. 26. Спосіб за п. 1, у якому вказана сумарна кіль6. Спосіб за п. 1, у якому сумарна сукупна кількість кість вказаного виробленого TNFR-Ig є принаймні глутаміну на одиницю об’єму вказаного середовиу 1,5 рази вищою, ніж кількість TNFR-Ig, вироблеща становить менше ніж або дорівнює 10 мМ. ного за інакших ідентичних умов в інакшому іден7. Спосіб за п. 1, у якому сумарна сукупна кількість тичному середовищі, що немає вказаних характеглутаміну на одиницю об’єму вказаного середовиристик середовища. ща становить менше ніж або дорівнює 4 мМ. 27. Спосіб за п. 1, у якому вказана сумарна кіль8. Спосіб за п. 1, у якому глутамін забезпечується кість вказаного виробленого TNFR-Ig є принаймні тільки в початковому середовищі на початку кліу 2 рази вищою, ніж кількість TNFR-Ig, виробленотинної культури. го за інакших ідентичних умов в інакшому ідентич9. Спосіб за п. 1, у якому початкова щільність вканому середовищі, що немає вказаних характерисзаних клітин ссавців становить принаймні 2x105 тик середовища. клітин/мл. 28. Спосіб за п. 1, у якому вказана клітинна куль10. Спосіб за п. 1, у якому початкова щільність тура у подальшому постачається додатковими вказаних клітин ссавців становить принаймні 2x106 компонентами. клітин/мл. 29. Спосіб за п. 28, у якому вказані додаткові ком11. Спосіб за п. 1, у якому крок забезпечення поненти постачаються в множинних інтервалах. включає забезпечення принаймні приблизно 1000 30. Спосіб за п. 28, у якому вказані додаткові комл культури. поненти вибираються із групи, що складається з 12. Спосіб за п. 1, у якому крок забезпечення гормонів і/або інших факторів росту, певних іонів включає забезпечення принаймні приблизно 10000 (таких як натрію, хлориду, кальцію, магнію і фосл культури. фату), буферів, вітамінів, нуклеозидів або нуклео13. Спосіб за п. 1, у якому вказаний перший набір тидів, мікроелементів (неорганічних сполук, що умов включає перший температурний діапазон, що зазвичай присутні у дуже низьких кінцевих конценстановить приблизно 30-42 градусів Цельсія. траціях), амінокислот, ліпідів або глюкози чи інших 14. Спосіб за п. 1, у якому вказаний перший набір джерел енергії. умов включає перший температурний діапазон, що 31. Спосіб продукування TNFR-Ig у клітинній кульстановить приблизно 37 градусів Цельсія. турі великомасштабного виробництва, що включає 15. Спосіб за п. 1, у якому вказаний другий набір кроки: умов включає другий температурний діапазон, що забезпечення клітинної культури, що включає становить приблизно 25-41 градус Цельсія. клітини ссавців, які містять ген, що кодує TNFR-Ig, 16. Спосіб за п. 1, у якому вказаний другий набір ген якого експресується за умов клітинної культуумов включає другий температурний діапазон, що ри; і становить приблизно 29-35 градусів Цельсія. визначене середовище, що містить глутамін і має 17. Спосіб за п. 1, у якому вказаний другий набір принаймні дві характеристики середовища, які умов включає другий температурний діапазон, що вибираються із групи, що складається із нижченастановить приблизно 31 градусів Цельсія. ведених характеристик: і) початкова концентрація 18. Спосіб за п. 1, що додатково включає другий амінокислот більша ніж приблизно 70 мМ; іі) молякрок змін услід за першою вказаною зміною прирне співвідношення глутаміну до аспарагіну станонаймні однієї з умов культивування, що включає вить менше ніж приблизно 2; ііі) молярне співвідзміну принаймні однієї з умов культивування таким ношення глутаміну до загальної кількості чином, щоб застосувати третій набір умов до кульамінокислот становить менше ніж приблизно 0,2; тури. iv) молярне співвідношення кількості неорганічних 19. Спосіб за п. 18, у якому другий крок змін вклюіонів до загальної кількості амінокислот становить чає зміну принаймні однієї умови культивування, приблизно від 0,4 до 1; та v) об’єднана концентравибраної із групи, що складається із: (і) темпера 5 89383 6 ція глутаміну й аспарагіну становить більше ніж об’єднана початкова концентрація глутаміну й поприблизно 16 мМ; чаткова концентрація аспарагіну становить більше підтримання вказаної культури в початковій фазі ніж приблизно 16 мМ, та їх комбінацій. росту при першому наборі умов культивування 34. Спосіб за будь-яким із пп. 1, 2 або 31-33, у упродовж першого проміжку часу, достатнього для якому: надання можливості вказаним клітинам репродурівні лактату є нижчими, ніж ті рівні, що спостерікуватися в межах діапазону приблизно 20 % - 80 % гаються за інакших ідентичних умов в інакшому від максимальної можливої щільності життєздатідентичному середовищі, що не має вказаної хараних клітин, якщо вказана культура підтримувалась ктеристики середовища; при першому наборі умов культивування; рівні амонію є нижчими, ніж ті рівні, що спостерізміну принаймні однієї з умов культивування таким гаються за інакших ідентичних умов в інакшому чином, щоб застосувати другий набір умов культиідентичному середовищі, що не має вказаної харавування; ктеристики середовища; і підтримання вказаної культури упродовж другого загальна кількість виробленого TNFR-Ig є принайпроміжку часу при другому наборі умов і упродовж мні настільки ж високою, як та, що спостерігається другого проміжку часу таким чином, щоб TNFR-Ig за інакших ідентичних умов в інакшому ідентичнонакопичився в клітинній культурі. му середовищі, що не має вказаної характеристи32. Спосіб продукування TNFR-Ig у клітинній кульки середовища. турі великомасштабного виробництва, що включає 35. Спосіб за п. 1, у якому вказана культура не кроки: постачається додатковими компонентами протязабезпечення клітинної культури, що включає гом продукування вказаного TNFR-Ig. клітини ссавців, які містять ген, що кодує TNFR-Ig, 36. Спосіб за п. 1, у якому гліцилглутамін заміняген якого експресується за умов клітинної культується на глутамін у вказаній культурі. ри; і 37. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кільвизначене середовище, що містить глутамін, яке кість гістидину, ізолейцину, лейцину, метіоніну, характеризується нижченаведеними особливостяфенілаланіну, триптофану, тирозину і проліну на ми: і) початкова концентрація амінокислот більша одиницю об’єму у вказаному середовищі станоніж приблизно 70 мМ; іі) молярне співвідношення вить більше ніж приблизно 25 мМ. глутаміну до аспарагіну становить менше ніж при38. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кільблизно 2; ііі) молярне співвідношення глутаміну до кість гістидину, ізолейцину, лейцину, метіоніну, загальної кількості амінокислот становить менше фенілаланіну, триптофану, тирозину і проліну на ніж приблизно 0,2; iv) молярне співвідношення одиницю об’єму у вказаному середовищі станокількості неорганічних іонів до загальної кількості вить більше ніж приблизно 35 мМ. амінокислот становить приблизно від 0,4 до 1; або 39. Спосіб за п. 1, у якому вказане середовище v) об’єднана концентрація глутаміну й аспарагіну має характеристику середовища, вибрану із групи, становить більше ніж приблизно 16 мМ; що складається із нижченаведених характеристик: підтримання вказаної культури в початковій фазі (і) сукупна загальна кількість гістидину на одиницю росту при першому наборі умов культивування об’єму становить більше ніж приблизно 1,7 мМ; упродовж першого проміжку часу, достатнього для (іі) сукупна загальна кількість ізолейцину на одинадання можливості вказаним клітинам репродуницю об’єму становить більше ніж приблизно куватися в межах діапазону приблизно 20 % - 80 % 3,5мМ; від максимальної можливої щільності життєздат(ііі) сукупна загальна кількість лейцину на одиницю них клітин, якщо вказана культура підтримувалась об’єму становить більше ніж приблизно 5,5 мМ; при першому наборі умов культивування; (iv) сукупна загальна кількість метіоніну на одинизміну принаймні однієї з умов культивування таким цю об’єму становить більше ніж приблизно 2, мМ; чином, щоб застосувати другий набір умов культи(v) сукупна загальна кількість фенілаланіну на вування; одиницю об’єму становить більше ніж приблизно підтримання вказаної культури упродовж другого 2,5 мМ; проміжку часу при другому наборі умов і упродовж (vi) сукупна загальна кількість проліну на одиницю другого проміжку часу таким чином, щоб TNFR-Ig об’єму становить більше ніж приблизно 2,5 мМ; накопичився в клітинній культурі. (vii) сукупна загальна кількість триптофану на оди33. Спосіб за п. 1, у якому вказане середовище ницю об’єму становить більше ніж приблизно включає середовище, що містить глутамін і має 1,0мМ; характеристики середовища, які вибираються із (viii) сукупна загальна кількість тирозину на одинигрупи, що складається із нижченаведених харакцю об’єму становить більше ніж приблизно 2,0 мМ. теристик: 40. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кільі) початкова концентрація амінокислот більша ніж кість серину на одиницю об’єму у вказаному сереприблизно 70 мМ; іі) молярне співвідношення подовищі становить більше ніж приблизно 10 мМ. чаткової кількості глутаміну до початкової кількості 41. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кільаспарагіну становить менше ніж приблизно 2; ііі) кість аспарагіну на одиницю об’єму у вказаному молярне співвідношення початкової кількості глусередовищі становить більше ніж приблизно 8 мМ. таміну до початкової загальної кількості амінокис42. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кільлот становить менше ніж приблизно 0,2; iv) молякість аспарагіну на одиницю об’єму у вказаному рне співвідношення початкової кількості середовищі становить більше ніж приблизно неорганічних іонів до початкової загальної кількос12мМ. ті амінокислот становить приблизно від 0,4 до 1; v) 7 89383 8 43. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кільсередовище, що містить глутамін і має характерикість фосфору на одиницю об’єму у вказаному стику середовища, вибрану із групи, що складасередовищі становить більше ніж приблизно 5 мМ. ється із нижченаведених характеристик: і) сукупна 44. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кількількість амінокислот на одиницю об’єму більша кість глутамату на одиницю об’єму у вказаному ніж приблизно 70 мМ; іі) молярне співвідношення середовищі становить менше ніж приблизно 1 мМ. сукупної кількості глутаміну до сукупної кількості 45. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кільаспарагіну становить менше ніж приблизно 2; ііі) кість кальцію пантотенату на одиницю об’єму у молярне співвідношення сукупної кількості глутавказаному середовищі становить більше ніж приміну до сукупної кількості амінокислот в цілому близно 20 мг/л. становить менше ніж приблизно 0,2; iv) молярне 46. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кільспіввідношення сукупної кількості неорганічних кість нікотинаміду на одиницю об’єму у вказаному іонів до сукупної кількості амінокислот в цілому середовищі становить більше ніж приблизно становить приблизно від 0,4 до 1; v) об’єднана 25мг/л. сукупна кількість глутаміну й аспарагіну на одини47. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кільцю об’єму становить більше ніж приблизно 16 мМ, кість піридоксину й піридоксалю на одиницю та їх комбінації; об’єму у вказаному середовищі становить більше підтримання вказаної культури в початковій фазі ніж приблизно 35 мг/л. росту при першому наборі умов культивування 48. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кільупродовж першого проміжку часу, достатнього для кість рибофлавіну на одиницю об’єму у вказаному надання можливості вказаним клітинам репродусередовищі становить більше ніж приблизно куватися до щільності життєздатних клітин в ме2,0мг/л. жах діапазону приблизно 20 % - 80 % від максима49. Спосіб за п. 1, у якому сукупна загальна кільльної можливої щільності життєздатних клітин, кість тіаміну гідрохлориду на одиницю об’єму у якщо вказана культура підтримувалась при первказаному середовищі становить більше ніж пришому наборі умов культивування; близно 35 мг/л. зміну принаймні однієї з умов культивування таким 50. Спосіб продукування TNFR-Fc у клітинній кульчином, щоб застосувати другий набір умов культитурі великомасштабного виробництва, що включає вування; кроки: підтримання вказаної культури упродовж другого забезпечення клітинної культури, що включає проміжку часу при другому наборі умов і упродовж клітини ссавців, які містять ген, що кодує TNFR-Fc, другого проміжку часу таким чином, щоб TNFR-Fc ген якого експресується за умов клітинної культунакопичився в клітинній культурі. ри; і Ця заявка заявляє пріоритет попередньої Патентної заявки США №60/605 379, яка була подана 27 серпня 2004 року, зміст якої включено шляхом посилання у повному обсязі. Білки й поліпептиди набувають все більшого й більшого значення у якості терапевтичних засобів. У більшості випадків, терапевтичні білки й поліпептиди отримують в клітинній культурі, із клітин, які були створені й/або відібрані з метою продукування незвично високих рівнів певного білка або поліпептиду, що розглядається. Контроль і оптимізація умов клітинної культури є критично важливими для успішного комерційного виробництва білів і поліпептидів. Багато білків і поліпептидів, отриманих у клітинній культурі, продукуються в серійному або підживлювальному процесі, при якому клітини культивують упродовж певного періоду часу, а потім культуру завершують, й отриманий білок або поліпептид виділяють. На остаточну кількість і якість виробленого білка або поліпептиду можуть істотно впливати умови клітинної культури. Наприклад, традиційні процеси серійної й підживлювальної культури часто призводять до продукування відходів метаболізму, які негативно впливають на ріст, життєздатність клітин і виробництво або стабільність білка чи поліпептиду, що розглядається. У той час як було докладено зусиль для поліпшення виробництва білків і поліпептидів у процесах серійної й підживлювальної культури, залишається потреба в додаткових удосконаленнях. Крім того, значне зусилля було зроблене для розробки визначених середовищ (тобто, середовищ, зібраних із відомих індивідуальних компонентів, що не містять сироватки або інших побічних продуктів тваринного походження) для використання при культивуванні клітин, особливо клітин ссавців. Особливості росту клітини можуть бути зовсім різними у визначених середовищах на відміну від середовищ, отриманих із сироватки. Існує певна потреба в розробці удосконалених систем для продукування білків й поліпептидів за допомогою клітинної культури у визначених середовищах. Даний винахід пропонує удосконалену систему для великомасштабного виробництва білків і/або поліпептидів у клітинній культурі. Наприклад, даний винахід пропонує комерційні масштабні (наприклад, 500 л або більше) способи культивування, які використовують середовище, що характеризується однією або кількома нижчезазначеними особливостями: і) сукупна кількість амінокислот на одиницю об'єму більша ніж приблизно 70мМ; іі) молярне співвідношення сукупної кількості глутаміну до сукупної кількості аспарагіну становить менше ніж приблизно 2; ііі) молярне співвідношення сукупної кількості глутаміну до сукупної кількості амінокислот в цілому становить менше ніж приблизно 0,2; iv) молярне співвідно 9 89383 10 шення сукупної кількості неорганічних іонів до супочатку культивування або можуть додаватись в купної кількості амінокислот в цілому становить більш пізній період з метою поповнення вичерпаприблизно від 0,4 до 1; або ν) об'єднана сукупна них поживних речовин або з іншої причини. Зазвикількість глутаміну й аспарагіну на одиницю об'єму чай, відповідно до даного винаходу бажано обирастановить більше ніж приблизно 16мМ. Звичайний ти початковий склад середовища таким чином, спеціаліст у даній галузі зрозуміє, що термін "сукущоб мінімізувати підживлення. пний", який використовується вище, стосується Відповідно до даного винаходу може проводисумарної кількості певного компоненту або компотися моніторинг різних умов культивування, вклюнентів, доданих упродовж клітинної культури, чаючи рН, щільність клітин, життєздатність клітин, включаючи компоненти, що додаються на початку рівні лактату, рівні амонію, осмолярність або титр культури й компоненти, що додаються згодом. У поліпептиду чи білка, що експресується. певних варіантах втілення винаходу, яким надаФігура 1 показує порівняння Середовища 1 1 і ється перевага, бажано мінімізувати "підживлення" Середовища 2 у колбах для струшування з викокультури протягом довгого часу, таким чином, баристанням клітин анти-GDF-8. жано максимально збільшити кількості, присутні Фігура 2 показує ріст й життєздатність клітин спочатку. Звичайно, протягом культури компоненанти-GDF-S у Середовищі 1. ти середовища метаболізуються і, таким чином, Фігура 3 показує ріст клітин клітинних культур культури з тими ж самими сукупними кількостями анти-GDF-8 у контрольних умовах й умовах кульданих компонентів матимуть різні абсолютні рівні, тивування без підживлення глутаміном. якщо ці компоненти додаються в різний час (наФігура 4 показує життєздатність клітин клітинприклад, всі присутні спочатку у порівнянні з дених культур анти-GDF-8 у контрольних умовах й якими, що додаються шляхом підживлення). умовах культивування без підживлення глутаміВідповідно до даного винаходу, використання ном. такого середовища надає можливість отримувати Фігура 5 показує рівні амонію клітинних кульвисокі рівні продукування білка й зменшує накопитур анти-GDF-8 у контрольних умовах й умовах чення певних небажаних факторів, таких як амоній культивування без підживлення глутаміном. і/або лактат. Фігура 6 показує рівні лактату клітинних кульЗвичайний спеціаліст у даній галузі зрозуміє, тур анти-GDF-8 у контрольних умовах й умовах що композиції середовищ відповідно до даного культивування без підживлення глутаміном. винаходу охоплюють визначені й невизначені сеФігура 7 показує титр анти-GDF-S у контрольредовища. У певних варіантах втілення даного них умовах й умовах культивування без підживвинаходу, яким надається перевага, культуральне лення глутаміном. середовище - це визначене середовище, в якому Фігура 8 показує щільність клітин клітинних склад середовища відомий й контролюється. культур анти-GDF-8 у контрольних умовах й умоУ певних варіантах втілення даного винаходу, вах підживлюваної культури з низьким рівнем глуяким надається перевага, до способів культивутаміну. вання належать зміна культивування від першого Фігура 9 показує життєздатність клітин клітиннабору умов культивування до другого набору них культур анти-GDF-8 у контрольних умовах й умов культивування у такий спосіб, щоб досягнути умовах підживлюваної культури з низьким рівнем метаболічного зсуву для клітин. У деяких варіанглутаміну. тах втілення ця зміна виконується, коли культура Фігура 10 показує рівні амонію клітинних кульдосягла приблизно 20-80% її максимальної щільтур анти-GDF-8 у контрольних умовах й умовах ності клітин. У деяких варіантах втілення зміна підживлюваної культури з низьким рівнем глутамівключає зміну температури (або температурного ну. діапазону), при якій підтримується культура. АльФігура 11 показує рівні лактату клітинних культернативно або додатково, даний винахід пропотур анти-GDF-S у контрольних умовах й умовах нує способи, пристосовані таким чином, щоб після підживлюваної культури з низьким рівнем глутамідосягнення піку, рівні лактату і/або амонію в кульну. турі зменшувалися з часом. В інших варіантах втіФігура 12 показує титр анти-GDF-S у контролення зміна включає зсув рН, осмолярності або льних умовах й умовах підживлюваної культури з рівня хімічних індуктантів, таких як алканові кислонизьким рівнем глутаміну. ти або їх солі. Фігура 13 показує відповідь на дози заліза кліДо клітинних культур відповідно до даного витин анти-GDF-8 у Середовищі 1 і Середовищі 2. находу можуть довільно додаватись поживні речоФігура 14 показує щільність клітин культур з вини й/або інші компоненти середовища, включапідживленням глутаматом і глутаміном. ючи гормони й/або інші фактори росту, певні іони Фігура 15 показує життєздатність клітин куль(такі як натрію, хлориду, кальцію, магнію і фосфатур з підживленням глутаматом і глутаміном. ту), буфери, вітаміни, нуклеозиди або нуклеотиди, Фігура 16 показує титр анти-Льюїс Υ у культумікроелементи (неорганічні сполуки, що зазвичай рах з підживленням глутаматом і глутаміном. присутні у дуже низьких кінцевих концентраціях), Фігура 17 показує рівні лактату у культурах з амінокислоти, ліпіди або глюкозу чи інше джерело підживленням глутаматом і глутаміном. енергії. У певних варіантах втілення даного винаФігура 18 показує рівні амонію у культурах з ходу може бути вигідним доповнювати середовипідживленням глутаматом і глутаміном. ща хімічними індуктантами, такими як гексаметиФігура 19 показує осмолярність культур з підлен-біс(ацетамід) ("НΜΒΑ") і натрію бутират живленням глутаматом і глутаміном. ("NaB"). Ці довільні добавки можуть додаватись на 11 89383 12 Фігура 20 показує щільність клітин анти-Льюїс Фігура 43 показує рівні амонію культур антиY. Кожен графік - це середнє із двох колб для GDF-8 у середовищах, що містять різні рівні аспаструшування, вирощених з використанням тих сарагіну й цистеїну. мих умов. Фігура 44 показує рівні глутаміну культур антиФігура 21 показує життєздатність клітин антиGDF-8 у середовищах, що містять різні рівні аспаЛьюїс Y. Кожен графік - це середнє із двох колб рагіну й цистеїну. для струшування, вирощених з використанням тих Фігура 45 показує рівні глутамату культур ансамих умов. ти-GDF-8 у середовищах, що містять різні рівні Фігура 22 показує середній титр культури антиаспарагіну й цистеїну. Льюїс Y. Кожен графік - це середнє із двох колб Фігура 46 показує титр анти-GDF-8 у середодля струшування, вирощених з використанням тих вищах, що містять різні рівні аспарагіну й цистеїну. самих умов. Фігура 47 показує осмолярність культур антиФігура 23 показує рівні амонію клітин антиGDF-S у середовищах, що містять різні рівні аспаЛьюїс Y. Кожен графік - це середнє із двох колб рагіну й цистеїну. для струшування, вирощених з використанням тих Фігура 48 показує ріст клітин анти-GDF-8 у сесамих умов. редовищах, що містять різні рівні амінокислот і Фігура 24 показує лопастний пристрій, що вивітамінів. користовується у серійно-підживлюваних культуФігура 49 показує рівні лактату культур антирах. GDF-8 у середовищах, що містять різні рівні аміноФігура 25 показує ріст клітин анти-GDF-8 за рікислот і вітамінів. зних експериментальних умов. Фігура 50 показує рівні амонію культур антиФігура 26 показує життєздатність клітин антиGDF-8 у середовищах, що містять різні рівні аміноGDF-S за різних експериментальних умов. кислот і вітамінів. Фігура 27 показує титр анти-GDF-8 за різних Фігура 51 показує рівні глутаміну культур антиекспериментальних умов. GDF-S у середовищах, що містять різні рівні аміФігура 28 показує рівні лактату культур антинокислот і вітамінів. GDF-8 за різних експериментальних умов. Фігура 52 показує титр анти-GDF-8 у середоФігура 29 показує рівні амонію культур антивищах, що містять різні рівні амінокислот і вітаміGDF-8 за різних експериментальних умов. нів. Фігура 30 показує ріст клітин анти-GDF-S за ріФігура 53 показує ріст клітин анти-GDF-S у сезних експериментальних умов. редовищах, що містять різні рівні вітамінів, мікроФігура 31 показує титр анти-GDF-S за різних елементів Ε і заліза. експериментальних умов. Фігура 54 показує рівні лактату культур антиФігура 32 показує рівні лактату культур антиGDF-S у середовищах, що містять різні рівні вітаGDF-8 за різних експериментальних умов. мінів, мікроелементів Ε і заліза. Фігура 33 показує рівні амонію культур антиФігура 55 показує рівні амонію культур антиGDF-8 за різних експериментальних умов. GDF-8 у середовищах, що містять різні рівні вітаФігура 34 показує ріст клітин анти-GDF-8 у момінів, мікроелементів Ε і заліза. дифікованому Середовищі 9, що містить різні рівні Фігура 56 показує титр анти-GDF-8 у середоглутаміну й аспарагіну. вищах, що містять різні рівні вітамінів, мікроелеФігура 35 показує життєздатність клітин антиментів Ε і заліза. GDF-S у модифікованому Середовищі 9, що місФігура 57 показує ріст клітин анти-GDF-8 у Сетить різні рівні глутаміну й аспарагіну. редовищах 1, 3 і 9. Фігура 36 показує рівні лактату культур антиФігура 58 показує титр анти-GDF-S у СередоGDF-8 у модифікованому Середовищі 9, що місвищах 1, 3 і 9. тить різні рівні глутаміну й аспарагіну. Фігура 59 показує екстрапольовані титри антиФігура 37 показує рівні амонію культур антиGDF-8 для різних рівнів глутаміну окремо й сумарGDF-8 у модифікованому Середовищі 9, що місного об'єднаного глутаміну й аспарагіну. тить різні рівні глутаміну й аспарагіну. Фігура 60 показує ріст клітин анти-АБета за ріФігура 38 показує рівні глутаміну культур антизних умов середовищ, що випробовуються. GDF-8 у модифікованому Середовищі 9, що місФігура 61 показує життєздатність клітин антитить різні рівні глутаміну й аспарагіну. АБета за різних умов середовищ, що випробовуФігура 39 показує титр анти-GDF-8 у модифіються. кованому Середовищі 9, що містить різні рівні глуФігура 62 показує рівні лактату культур антитаміну й аспарагіну. АБета за різних умов середовищ, що випробовуФігура 40 показує осмолярність культур антиються. GDF-8 у модифікованому Середовищі 9, що місФігура 63 показує рівні амонію культур антитить різні рівні глутаміну й аспарагіну. АБета за різних умов середовищ, що випробовуФігура 41 показує ріст клітин анти-GDF-S у сеються. редовищах, що містять різні рівні аспарагіну й цисФігура 64 показує титр анти-АБета за різних теїну. умов середовищ, що випробовуються. Фігура 42 показує рівні лактату культур антиФігура 65 показує осмолярність культур антиGDF-8 у середовищах, що містять різні рівні аспаАБета за різних умов середовищ, що випробовурагіну й цистеїну. ються. Фігура 66 показує ріст клітин, що експресують TNFR-Ig за різних експериментальних умов. 13 89383 14 Фігура 67 показує життєздатність клітин, що "Серійна культура": вжитий авторами термін експресують TNFR-Ig за різних експериментальних "серійна культура" стосується способу культивуумов. вання клітин, при якому всі компоненти, які будуть Фігура 68 показує залишкову глюкозу в культув остаточному підсумку використовуватися при рах клітин, що експресують TNFR-Ig за різних екскультивуванні клітин, включаючи середовище периментальних умов. (див. визначення "середовища" нижче), а також Фігура 69 показує рівні глутаміну в культурах самі клітини, надаються на початку процесу кульклітин, що експресують TNFR-Ig за різних експетивування. Як правило, в деякий момент серійна риментальних умов. культура припиняється, а клітини і/або компоненти Фігура 70 показує концентрацію лактату в в середовищі збираються й, довільно, очищуютькультурах клітин, що експресують TNFR-Ig за різся. них експериментальних умов. "Біореактор": вжитий авторами термін "біореаФігура 71 показує рівні амонію в культурах кліктор" стосується будь-якого контейнера, що викотин, що експресують TNFR-Ig за різних експериристовується для росту культури клітин ссавців. ментальних умов. Біореактор може бути будь-якого розміру, що приФігура 72 показує відносний титр TNFR-Ig за датний для культивування клітин ссавців. Як прарізних експериментальних умов. вило, біореактор буде мати об'єм, що становить Фігура 73 показує щільності клітин анти-GDF-8, принаймні 1 літр і може бути об'ємом 10, 100, 250, вирощених в 6000л і 1л біореакторах. 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10000, 12,0000 літрів Фігура 74 показує титри анти-GDF-8 клітин, або більше, або будь-якого проміжного об'єму в вирощених в 6000л і 1л біореакторах. цих межах. Внутрішні умови біореактора, включаФігура 75 показує рівні лактату клітин антиючи, крім інших, рН і температуру, як правило, GDF-8, вирощених в 6000л і 1л біореакторах. контролюють упродовж періоду культивування. Фігура 76 показує рівні амонію клітин антиБіореактор може складатися з будь-якого матеріаGDF-8, вирощених в 6000л і 1л біореакторах. лу, що є прийнятним для утримування культур "Близько", "Приблизно": вжиті авторами терміклітин ссавців, суспендованих в середовищах за ни "близько" і "приблизно", що застосовуються до умов культивування відповідно до даного винахооднієї або кількох певних умов клітинної культури, ду, включаючи скло, пластмасу або метал. Вжитий стосуються діапазону значень, які є подібними до авторами термін "виробничий біореактор" стосузазначеного еталонного значення для тієї умови ється кінцевого біореактору, що використовується або умов культури. У певних варіантах втілення у виробництві поліпептиду або білка, що розглядатермін "близько" стосується діапазону зичень, які ється. Об'єм біореактора для великомасштабного перебувають у межах 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, виробництва клітинної культури, як правило, ста13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 відсотка або новить принаймні 500 літрів і може бути 1000, менше зазначеного еталонного значення для тієї 2500, 5000, 8000, 10000, 12,0000 літрів або більше, умови або умов культури. або будь-якого проміжного об'єму в цих межах. "Амінокислота": вжитий авторами термін "аміЗвичайний спеціаліст в даній галузі буде знати й нокислота" стосується будь-якої із двадцяти призможе обрати прийнятні біореактори для викорисродних амінокислот, які зазвичай використовуютьтання в практичному втіленні даного винаходу. ся в утворенні поліпептидів, або аналогів чи "Щільність клітин": вжитий авторами термін похідних цих амінокислот. Амінокислоти відповідно "щільність клітини" стосується кількості клітин, до даного винаходу забезпечуються в середовищі присутніх у даному об'ємі середовища. до клітинних культур. Амінокислоти, що забезпе"Життєздатність клітин": вжитий авторами течуються в середовищі, можуть пропонуватися у рмін "життєздатність клітини" стосується здатності вигляді солі або у формі гідрату. клітин у культурі виживати при даному наборі умов "Антитіло": вжитий авторами термін "антитіло" культивування або експериментальних змін. Вжистосується молекули імуноглобуліну або імунолотий авторами термін також стосується тієї частини гічно активної частини молекули імуноглобуліну, клітин, які є живими в певний час по відношенню такої як фрагменти Fab або F(аb')2, що містить до загальної кількості клітин, живих й мертвих, у одну або кілька антиген-зв'язуючих ділянок, які культурі на той момент часу. специфічно зв'язуються (імунореагують) з антиге"Культура", "клітинна культура" і "культура кліном. Вжиті авторами терміни "моноклональні антин ссавців": ці вжиті авторами терміни стосуються титіла" і "склад моноклонального антитіла" стосупопуляції клітин ссавців, яка суспендована в сереються клонової популяції молекул антитіл, які довищі (див. визначення "середовища" нижче) за містять тільки один вид антиген-зв'язуючої ділянумов, що підходять для виживання й/або росту ки, що має здатність імунореагувати зі специфічклітинної популяції. Як буде очевидно для звичайною антигенною детермінантою, тоді як терміни них спеціалістів в даній галузі, ці вжиті авторами "поліклональні антитіла" і "склад поліклонального терміни можуть стосуватися комбінації, що містить антитіла" стосуються популяції молекул антитіл, популяцію клітин ссавців й середовище, у якому ця які містять різні види антиген-зв'язуючих ділянок, популяція суспендована. що мають здатність до взаємодії з певним антиге"Підживлювана культура": вжитий авторами ном. Визначення моноклональних антитіл включає термін "підживлювана культура" стосується спосоклонові молекули, отримані за допомогою традибу культивування клітин, при якому до культури ційних технологій, й молекули певної послідовносдодаються додаткові компоненти в певний час ті, отримані шляхом маніпуляції або мутації певних після початку процесу культивування. До компонезалишків, наприклад, гуманізовані антитіла. нтів, що додаються, як правило, належать харчові 15 89383 16 добавки для клітин, які були вичерпані протягом тя умертвленої клітини, отриманої з імунологічного процесу культивування. Підживлювана культура джерела, й клітини, що продукує антитіла. Отризазвичай в деякий момент припиняється, а клітини мана гібридома представляє собою умертвлену і/або компоненти в середовищі збираються й, доклітину, що продукує антитіла. Окремі клітини, що вільно, очищуються. використовуються для створення гібридоми мо"Фрагмент": вжитий авторами термін "фрагжуть походити з будь-якого ссавцевого джерела, мент" стосується поліпептидів і визначається як включаючи, крім іншого, щура, свиню, кролика, будь-яка дискретна частина даного поліпептиду, вівцю, свиню, козу і людину. Термін також охоплює що є унікальною або характерною для цього політріомні клітинні лінії, які отримують, коли потомстпептиду. Вжитий авторами термін також стосуєтьво гетерогібридних мієломних злиттів, що є продуся будь-якої дискретної частини даного поліпептиктом злиття між людськими клітинами й мишачої ду, що зберігає принаймні частку активності мієломної клітинної лінії, у подальшому зливаєтьповнорозмірного поліпептиду. Бажано, щоб частка ся із плазмацитом. Крім того, вважається, що терзбереженої активності становила принаймні 10% мін включає будь-яку умертвлену гібридну клітинактивності повнорозмірного поліпептиду. Більш ну лінію, що продукує антитіла, таку як, наприклад, бажано, щоб частка збереженої активності станоквадроми (див., наприклад, Mіlstein et al., Nature, вила принаймні 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 537:3053 (1983)). 80% або 90% активності повнорозмірного поліпеп"Інтегрована щільність життєздатних клітин": тиду. Ще більш бажано, щоб частка збереженої вжитий авторами термін "інтегрована щільність активності становила принаймні 95%, 96%, 97%, життєздатних клітин" стосується середньої щіль98% або 99% активності повнорозмірного поліпепності життєздатних клітин протягом культивування, тиду. Найбільш бажано, щоб частка збереженої помноженої на час перебігу культивування. Припуактивності становила 100% активності повнорозскаючи, що кількість продукованого поліпептиду мірного поліпептиду. Вжитий авторами термін тай/або білка пропорційна кількості життєздатних кож стосується будь-якої частини даного поліпепклітин, присутніх упродовж культивування, інтегтиду, що включає принаймні елемент рована щільність життєздатних клітини є корисним встановленої послідовності, виявлений у повнороінструментом для оцінки кількості поліпептиду змірному поліпептиді. Бажано, щоб елемент пой/або білка, виробленого протягом культивування. слідовності охоплював принаймні 4-5, більш бажа"Середовище", "клітинне культуральне серено принаймні приблизно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, довище", "культуральне середовище": ці вжиті 45, 50 або більше амінокислот повнорозмірного авторами терміни стосуються розчину, що містить поліпептиду. поживні речовини, які живлять зростаючі клітини "Ген": вжитий авторами термін "ген" стосуєтьссавців. Як правило, ці розчини забезпечують неся будь-якої нуклеотидної послідовності, ДНК або замінимі й замінимі амінокислоти, вітаміни, джереРНК, принаймні деяка частина якої кодує дискретла енергії, ліпіди та мікроелементи, необхідні кліний кінцевий продукт, як правило, крім іншого, потині для мінімального росту й/або виживання. ліпептид, що функціонує в деякому аспекті клітинРозчин може також містити компоненти, які збільного метаболізму або розвитку. Вважається, що шують ріст і/або виживання вище мінімального термін стосується не тільки кодуючої послідовносрівня, включаючи фактори росту й гормони. В опті, що кодує поліпептид або інший дискретний кінтимальному варіанті розчини готують у такий споцевий продукт, але може також охоплювати ділянсіб, що рН й концентрації солей є оптимальними ки до і після кодуючої послідовності, які для виживання та проліферації клітин. Середовимодулюють основний рівень експресії (див. визнаще може також належати до "визначених середочення "генетичного контрольного елемента" нижвищ" - середовищ без сироватки, що не містять че), а також проміжні послідовності ("інтрони") між жодних білків, гідролізатів або компонентів невііндивідуальними кодуючими сегментами ("екзонадомого складу. Визначені середовища не містять ми"). компонентів тваринного походження, і всі компо"Генетичний контрольний елемент": вжитий ненти мають відому хімічну структуру. авторами термін "генетичний контрольний еле"Підходи метаболізму": вжитий авторами термент" стосується будь-якого елементу послідовномін "відходи метаболізму" стосується сполук, що сті, що модулює експресію гена, з яким він операпродукуються клітинною культурою внаслідок нотивно зв'язаний. Генетичні контрольні елементи рмальних або патологічних метаболічних процесів, можуть функціонувати шляхом збільшення або які є до певної міри шкідливими для клітинної зменшення рівнів експресії й можуть бути розтакультури, особливо по відношенню до експресії шовані до, у межах або після кодуючої послідовабо активності бажаного рекомбінантного поліпепності. Генетичні контрольні елементи можуть діяти тиду або білка. Наприклад, відходи метаболізму на будь-якій стадії генної експресії, регулюючи, можуть бути шкідливими для росту або життєздатнаприклад, ініціацію, елонгацію або термінацію ності клітинної культури, можуть зменшувати кільтранскрипції, сплайсинг іРНК, редагування іРНК, кість продукованого рекомбінантного поліпептиду стабільність іРНК, локалізацію іРНК в межах клітиабо білка, можуть змінювати згортання, стабільни, ініціацію, елонгацію або термінацію трансляції ність, глкозилювання або іншу посттрансляційну або будь-яку іншу стадію генної експресії. Генетимодифікацію експресованого поліпептиду або білчні контрольні елементи можуть функціонувати ка, чи можуть бути шкідливими для клітин і/або індивідуально або в комбінації один з одним. експресії чи активності рекомбінантного поліпеп"Гібридома": вжитий авторами термін "гібритиду або білка у будь-який інший спосіб. До придома" стосується клітини, створеної шляхом злиткладів відходів метаболізму належать лактат, що 17 89383 18 виробляється внаслідок метаболізму глюкози, і ми або подібними до поліпептидів, що зазвичай амоній, що виробляється внаслідок метаболізму експресуються в ссавцевій клітині-хазяїні, у той глутаміну. Одна мета даного винаходу полягає в час як інші частини є сторонніми для клітинисповільненні виробництва, зниженні або навіть хазяїна. усуненні відходів метаболізму в культурах клітин "Посів": вжитий авторами термін "посів" стосуссавців. ється процесу переносу клітинної культури в біо"Осмолярність" і "осмоляльність": "осмоляльреактор або інший контейнер. Клітини можуть поність" - міра осмотичного тиску розчинених часток передньо розмножуватись в іншому біореакторі у водному розчині. Частки включають іони й неіоабо контейнері. Альтернативно, клітини можуть нізовані молекули. Осмоляльність виражається як бути заморожені й розморожені безпосередньо концентрація осмотично активних часток (тобто, перед їх переносом в біореактор або контейнер. осмолі), розчинених в 1кг розчину (1мОсм/кг Н2О Термін стосується будь-якої кількості клітин, вклюпри 38°С відповідає осмотичному тиску, рівному чаючи одну клітину. 19мм рт.ст). "Осмолярність", на відміну від цього, "Титр": вжитий авторами термін "титр" стосустосується кількості часток, розчинених в 1 літрі ється загальної кількості рекомбінантно експресорозчину. Вжите авторами скорочення "мОсм" ваного поліпептиду або білка, продукованого кульозначає "міліосмолі/кг розчину". турою клітин ссавців, розділеної на дану кількість "Перфузійна культура": вжитий авторами тероб'єму середовища. Титр, як правило, виражаєтьмін "перфузійна культура" стосується способу ся в одиницях міліграмів поліпептиду або білка на культивування клітин, при якому до культури домілілітр середовища. даткові компоненти додаються безперервно або Даний винахід пропонує удосконалені системи напівбезперервно після початку процесу культивудля виробництва білків і/або поліпептидів клітинвання. Додані компоненти, як правило, включають ною культурою. Зокрема, винахід пропонує систепоживні добавки для клітин, які були вичерпані ми, які мінімізують продукування одного або кільпротягом процесу культивування. Частина клітин кох продуктів метаболізму, шкідливих для росту, і/або компонентів у середовищі, як правило, збижиттєздатності клітин і/бо виробництва або якості рається на безперервній або напівбезперервній білка. В оптимальному варіанті втілення даного основі й, довільно, очищується. винаходу, клітинна культура є серійною або піджи"Поліпептид": вжитий авторами термін "полівлювальною культурою. Інші певні варіанти втіпептид" стосується послідовного ланцюга амінокилення винаходу, яким надається перевага, докласлот, з'єднаних за допомогою пептидних зв'язків. дно обговорюються нижче. Звичайні спеціалісти в Вжитий термін стосується амінокислотного ланцюданій галузі зрозуміють, однак, що різні модифікага будь-якої довжини, але звичайний спеціаліст в ції до цих переважних варіантів втілення охоплюданій галузі розумітиме, що термін не обмежуєтьються обсягом представленої нижче формули вися довгими ланцюгами й може стосуватися мініманаходу. Формула винаходу та її рівноцінні льного ланцюга, що включає дві амінокислоти, варіанти, що визначають обсяг даного винаходу, з'єднані разом за допомогою пептидного зв'язку. не є й не повинні обмежуватись певними переваж"Білок": вжитий авторами термін "білок" стосуними варіантами втілення або цим описом певних ється одного або кількох поліпептидів, які функціопереважних варіантів втілення. нують як дискретна одиниця. Якщо окремий поліПоліпептиди пептид є дискретною функціонуючою одиницею й Будь-який поліпептид, що може експресуване потребує постійної фізичної асоціації з іншими тись в клітині-хазяїні, може бути вироблений відполіпептидами для утворення дискретної функціоповідно до даного винаходу. Поліпептид може нуючої одиниці, вжиті авторами терміни "поліпепекспресуватись із гена, що є ендогенним для клітид" і "білок" використовуються почергово. Якщо тини-хазяїна, або із гена, що введений в клітинудискретна функціональна одиниця складається з хазяїна шляхом генної інженерії. Поліпептид може більш ніж одного поліпептиду, які фізично асоціюбути пептидом, що зустрічається в природі, або ються один з одним, вжитий авторами термін "біможе, альтернативно, мати послідовність, що була лок" стосується кількох поліпептидів, які фізично створена або відібрана рукою людини. Створений з'єднані й функціонують разом як дискретна одигенною інженерією поліпептид може бути зібраний ниця. із інших поліпептидних сегментів, які окремо зу"Рекомбінантно експресований поліпептид" і стрічаються в природі, або може включати один "рекомбінантний поліпептид": ці вжиті авторами або кілька сегментів, які не зустрічаються в приротерміни стосуються поліпептиду, експресованого із ді. ссавцевої клітини-хазяїна, що була генетично Поліпептиди, які можуть, за бажанням, бути створена для експресії цього поліпептиду. Рекомекспресовані відповідно до даного винаходу, часто бінантно експресований поліпептид може бути будуть відбиратися на підставі потрібної біологічідентичним або подібним до поліпептидів, які заної або хімічної активності. Наприклад, даний визвичай експресуються в ссавцевій клітині-хазяїні. нахід може використовуватися для експресії будьРекомбінантно експресований поліпептид може якого фармацевтично або комерційно доцільного також бути стороннім для клітини-хазяїна, тобто ферменту, рецептора, антитіла, гормону, регулягетерологічним до пептидів, що зазвичай експреторного фактора, антигену, зв'язуючого агента і суються в ссавцевій клітині-хазяїні. Альтернативт.п. но, рекомбінантно експресований поліпептид може Антитіла бути химерним, оскільки частини поліпептиду місЗ огляду на велику кількість антитіл, що викотять амінокислотні послідовності, які є ідентичниристовуються у даний час або досліджуються у 19 89383 20 якості фармацевтичних або інших комерційних В іншому оптимальному варіанті втілення, мозасобів, виробництво антитіл представляє особноклональні, химерні або гуманізовані антитіла, ливий інтерес відповідно до даного винаходу. Анописані вище, можуть містити амінокислотні залититіла - це білки, які мають здатність специфічно шки, які у природі не зустрічаються в жодному анзв'язувати певний антиген. Відповідно до даного титілі в жодних видах. Ці сторонні залишки можуть винаходу може використовуватися будь-яке антивикористовуватися, наприклад, для надання нової тіло, що може бути ексцресоване в клітині-хазяїні. або модифікованої специфічності, афінності або В оптимальному варіанті втілення, антитіло, що ефекторної функції моноклональному, химерному експресується, є моноклональним антитілом. або гуманізованому антитілу. В іншому оптимальВ іншому оптимальному варіанті втілення, моному варіанті втілення, описані вище антитіла моноклональне антитіло є химерним антитілом. Хижуть бути кон'югованими із препаратами для сисмерне антитіло містить амінокислотні фрагменти, темної фармакотерапії, такими як токсини, які отримані з більш ніж одного організму. Молекунизькомолекулярні цитотоксичні препарати, моли химерного антитіла можуть включати, напридифікатори біологічної відповіді та радіонукліди клад, антиген-зв'язуючий домен із антитіла миші, (див. наприклад, Kunz et al., Кон'югати носійщура або інших видів, з людськими константними похідне каліхеаміцину (Calicheamicin derivativeділянками. Описані різноманітні тактики для ствоcarrier conjugates). US20040082764 Α1). рення химерних антитіл. Див. наприклад, Morrison В одному варіанті втілення антитіло є антитіet al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851 (1985); лом, що специфічно зв'язується із фрагментом Αb Takeda et al., Nature 314, 452 (1985), Cabilly et al., амілоїдного білка-попередника або з іншими комПатент США №4816567; Boss et al., Патент США понентами амілоїдної бляшки, і є корисним в бо№4816397; Tanaguchi et al., Публікація Європейсьротьбі з накопиченням амілоїдних бляшок у мозку, кого Патенту ЕР 171496; Публікація Європейського що характерне для хвороби Альцгеймера. (див., Патенту 0173494, Патент Великобританії GB наприклад, Патентна заявка США 60/636 684). 2177096В. В іншому варіанті втілення антитіла відповідно В іншому оптимальному варіанті втілення, модо даного винаходу спрямовані проти антигенів ноклональне антитіло є людським антитілом, поверхні клітини, що експресуються на цільових отриманим, наприклад, за допомогою рибосомклітинах і/або тканинах при проліферативних задисплейних або фаг-дисплейних бібліотек (див., хворюваннях, таких як рак. В одному варіанті втінаприклад, Winter et al., Патент США №6291159 і лення антитіло є антитілом анти-Льюїс Υ IgGl. Kawasaki, Патент США №5658754), або викорисЛьюїс Υ - це вуглеводневий антиген зі структурою тання ксенотрансплантатних видів, у яких нативні Fuca1®2Galb1®4[Fuca1®3] GlcNacb1®3R (Abe et гени антитіла інактивовані й функціонально заміal. (1983) J. Biol. Chem., 258 11793-11797). Антиген нені людськими генами антитіла, при цьому залиЛьюїс Υ експресується на поверхні від 60% до 90% шаючи неушкодженими інші компоненти нативної людських епітеліальних пухлин (включаючи пухімунної системи (див., наприклад, Kucherlapati et лини молочної залози, товстої кишки, легені та al., Патент США №6657103). передміхурової залози), принаймні 40% яких надеВ іншому оптимальному варіанті втілення, мокспресують цей антиген, і має обмежену експресію ноклональне антитіло є гуманізованим антитілом. в нормальних тканинах. Гуманізоване антитіло є химерним антитілом, в Для того, щоб спрямовуватися на Ley й ефекякому значна більшість амінокислотних залишків тивно націлюватися на пухлину, в ідеалі потрібне отримана з людських антитіл, у такий спосіб звоантитіло з винятковою специфічністю до антигену. дячи до мінімуму будь-яку потенційну імунну реакТаким чином, бажано, щоб антитіла анти-Льюїс Υ цію при переносі у людський суб'єкт. В гуманізовавідповідно до даного винаходу не реагували перених антитілах амінокислотні залишки в ділянках, хресно зі структурами типу 1 (тобто, лакто-серіями що визначають комплементарність, замінені, пригруп крові (Lea і Leb)) і, бажано, не зв'язували інші наймні частково, залишками із не людських видів, антигенні детермінанти типу 2 (тобто, неолактоякі обумовлюють бажану антиген-специфічність структуру), таку як структури Lex й Н-типу 2. Приабо афінність. Такі змінені молекули імуноглобулікладом оптимального антитіла анти-Льюїс Υ є ну можуть бути створені за допомогою будь-якого створене hu3S193 (див. Патенти США №№ з декількох способів, відомих в даній галузі (напри6310185; 6518415; 5874060, зміст яких включений клад, Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, авторами у повному обсязі). Гуманізоване антиті7308-7312 (1983); Kozbor et al., Immunology Today, ло hu3S193 (Attia, M.A., et al. 1787-1800) було 4, 7279 (1983); Olsson et al., Meth Enzymol, 92, 3-16 отримане шляхом пересадки CDR від 3S193, яке є (1982)), і бажано вироблені відповідно до поломишачим моноклональным антитілом, що утворюжень РСТ Публікації WO92/06193 або ЕР 0239400, ється проти клітини аденокарциноми з винятковою зміст кожної з яких включений авторами шляхом специфічністю до Ley (Kitamura, К., 12957-12961). посилання). Гуманізовані антитіла можуть виробHu3S193 не тільки зберігає специфічність 3S193 лятись комерційно, наприклад, Scotgen Limited, 2 до Ley, але й також набуває здатності опосередHolly Road, Twickenham, Middlesex, Великобритаковувати комплемент-залежну цитотоксичність нія. Для ознайомлення з додатковою літературою, (далі зазначається як CDC) і антитіло-залежну див. Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); клітинну цитотоксичність (далі зазначається як Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); і ADCC) (Attia, M.A., et al. 1787-1800). Це антитіло Pкesta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992), зміст спрямовується на ксенотрансплантати, що екскожного з них включений авторами шляхом посипресують Ley, у голих мишах, як демонструється в лання. дослідженнях біорозподілу з hu3S193, міченим 21 89383 22 1251, 111Іn або 18F, а також іншими радіоактивного ендотеліального клітинного фактора росту 1 ними мітками, що потребують хелатуючого агента, (VEGFR-1 - vascular endothelial cell growth factor типу 111In, 99mTc, або 90Y (Clark, et al. 4804receptor 1), нейропілін-1, ендоглін, ендозиалін і 4811). Ax1, але не обмежуються ними. Звичайні спеціаліВ іншому варіанті втілення антитіло є одним з сти в даній галузі знатимуть інші рецептори, які людських антитіл анти-GDF-S, названих Муо29, можуть оптимально бути експресовані відповідно Муо28 та Муо22, і антитілами та антигендо даного винаходу. зв'язуючими фрагментами, отриманими з них. Ці У варіанті втілення, якому надається особлива антитіла здатні зв'язувати зрілий GDF-8 з високою перевага, відповідно до даного винаходу експреафінністю, інгібувати активність GDF-8 in vitro та in суються інгібітори фактору некрозу пухлини, у фоvivo, як продемонстровано, наприклад, шляхом рмі альфа й бета рецепторів фактора некрозу пуінгібування зв'язування ActRIIB і випробувань генахлини (TNFR-1; EP417 563, опублікований 20 репортера, і можуть інгібувати активність GDF-8, березня 1991 року; і TNFR-2, ЕР 417 014 опублікопов'язану з негативним регулюванням скелетнований 20 березня 1991 року) (для огляду, див. м'язової маси й кісткової щільності. Див., наприNaismith and Sprang, J Inflamm. 47(1-2):1-7 (1995клад, Veldman, et al., Патент США №20040142382. 96), зміст якого включений авторами шляхом поРецептори силання). Відповідно до одного варіанту втілення Інший клас поліпептидів, які продемонструваінгібітор фактору некрозу пухлини містить розчинли свою ефективність у якості фармацевтичних ний рецептор TNF і, бажано, TNFR-Ig. В одному й/або комерційних засобів, включає рецептори. варіанті втілення оптимальними інгібіторами TNF Рецептори - це, як правило, трансмембранні гліковідповідно до даного винаходу є розчинні форми протеїни, які функціонують шляхом розпізнання TNFRI і TNFRII, а також розчинні TNF-зв'язуючі позаклітинного сигнального ліганду. Рецептори, як білки, в іншому варіанті втілення злиття TNFR-Ig є правило, містять протеїнкіназний домен на додаTNFR:Fc, термін, що використовується авторами, ток до домену, який розпізнає ліганд, що ініціює стосується "etanercept", що є димером двох молесигнальний шлях, фосфорилюючи цільові внутрікул позаклітинної частини р75 TNF-.альфа. рецепшньоклітинні молекули після зв'язування ліганду, тора, кожна молекула складається з 235що призводить до змін, пов'язаних з розвитком або амінокислотної Fc частини субодиниці 1 людського метаболізмом, усередині клітини. В одному варіаIgG. нті втілення рецептори, що розглядаються, модиФактори росту та інші сигнальні молекули фікуються таким чином, щоб вилучити у них Інший клас поліпептидів, які показали свою трансмембранний й/або внутрішньоклітинний доефективність у якості фармацевтичних й/або комен(и), замість якого може довільно бути прикріпмерційних засобів, включає фактори росту та інші лений Ig-домен. В оптимальному варіанті втілення сигнальні молекули. Фактори росту це, як правило, рецептори, що виробляються відповідно до даного глікопротеїни, які секретуються клітинами й зв'явинаходу, є рецепторними тирозинкіназами (RTK). зуються із та активують рецептори на інших клітиРодина RTK включає рецептори, які є критичними нах, ініціюючи зміни, пов'язані з розвитком або для різних функцій численних типів клітин (див., метаболізмом, в рецепторній клітині. В одному наприклад, Yarden and Ullrich, Ann. Rev. Biochem. варіанті втілення білок, що розглядається, є зли57:433-478, 1988; Ullrich and Schlessinger, Cell тим поліпептидом ActRIIB, що містить позаклітин61:243-254, 1990, зміст яких включений авторами ний домен рецептора ActRIIB і частину Fc антитіла шляхом посилання). До прикладів RTK, належать, (див., наприклад, Wolfman, et al., Злитий поліпепкрім інших, члени родини рецепторів фактора ростид ActRIIB та його використання (ActRIIB fusion ту фібробластів (FGF - fibroblast growth factor), polypeptides and uses therefor), US2004/0223966 члени родини рецепторів епідермального фактора Α1). Β іншому варіанті втілення фактором росту росту (EGF - epidermal growth factor), рецептор може бути модифікований пропептид GDF-8 (см., тромбоцитарного фактора росту (PDGF - platelet наприклад, Wolfman, et al., Модифіковані та стабіderived growth factor), тирозинкіназа з імуноглобулізовані пропептиди GDF та їх використання лін- і EGF-гомологічними доменами-1 (ТІЕ-1) і ре(Modifed and stabilized GDF propeptides and uses цептори ТІЕ-2 (Sato et al., Nature 376(6535):70-74 thereof), US2003/0104406 A1). Альтернативно, бі(1995), зміст якого включений авторами шляхом лок, що розглядається, міг би бути білком, що міспосилання) і c-Met рецептор, деякі з яких, як притить домен фолістатину (див., наприклад, Hill, et пускається, стимулють ангіогенез, прямо або неal., GASP1: білок, що містить домен фолістатину прямо (Mustonen and Alitalo, J. Cell ВЫ. 129:895(GASP1: a follistatin domain containing protein). US 898, 1995). До інших прикладів RTK належать ем2003/0162714 A1, Hill, et al., GASP1: білок, що місбріональна печінкова кіназа 1 (FLK-1 - fetal liver тить домен фолістатину (GASP1: a follistatin kinase 1) (іноді зазначається як рецептор, що місdomain containing protein), US 2005/0106154 А1, тить кіназний домен-вставку (KDR - kinase insert Hill, et al., Білки, що містять домен фолістатину domain-containing receptor) (Terman et al., (Follistatin domain containing proteins). US Oncogene 6:1677-83, 1991) або рецептор судинно2003/0180306 А1). го ендотеліального клітинного фактора росту 2 До прикладів факторів росту ссавців й інших (VEGFR-2 - vascular endothelial cell growth factor сигнальних молекул належать, крім інших, цитокіreceptor 2)), fms-подібна тирозинкіназа 1 (Fit-1 ни; епідермальний фактор росту (EGF); тромбоциfins-like tyrosine kinase-1) (DeVries et al. Science тарний фактор росту (PDGF); фактори росту фіб255;989-991, 1992; Shibuya et al., Oncogene 5:519робластів (FGF), такі як aFGF і bFGF; 524, 1990), іноді зазначається як рецептор судинтрансформуючі фактори росту (TGF), такі TGF 23 89383 24 альфа й TGF-бета, включаючи TGF-бета 1, TGFкації гену (або інших процесів), на противагу ортобета 2, TGF-бета 3, TGF-бета 4 або TGF-бета 5; логам, тим же рецепторам від різних видів. Суперінсуліноподібний фактор росту-І і -II (IGF-I і IGF-II); родина може бути розділена на п'ять родин: дec(1-3)-IGF-I (IGF-I мозку), білки, що зв'язують Родина І, рецептори, типовими представниками інсуліноподібні фактори росту; CD білки, такі як яких є родопсин і бета2-адренергічний рецептор, і CD-3, CD-4, CD-8 і CD-19; еритропоетин; остеоінна даний час представлена більш ніж 200 унікальдуктивні фактори; імунотоксини; кістковий морфоними членами; Родина II, що нещодавно охаракгенетичний білок (BMP - bone morphogenetic теризована родиною рецепторів секретиprotein); інтерферон, такий як інтерферон-альфа, ну/кальцитоніну/паратиреоїдного гормону; Родина бета, і -гама; колонієстимулюючі фактори (CSF III, родина метаботропного глутаматного рецептоcolony stimulating factors), наприклад, М- CSF, GMру в ссавців; Родина IV, родина сАМР рецепторів, CSF і G-CSF; інтерлейкіни (TL), наприклад, від IL-1 важлива при хемотаксисі і розвитку D. discoideum; до IL-10; фактор некрозу пухлини (TNF) альфа й і Родина V, грибкові спряжені рецептори феромобета; А-ланцюг інсуліну; В-ланцюг інсуліну; проіннів, такі як STE2. сулін; фолікулостимулюючий гормон; кальцитонін; GPCR включають рецептори для біогенних лютеїнізуючий гормон; глюкагон; коагулюючі факамінів, для ліпідних медіаторів запалення, пептидтори, такі як фактор VIIIC, фактор IX, тканинний них гормонів і сенсорних сигнальних медіаторів. фактор і фактор фон Віллебранда; антикоагулююGPCR стає активованим при зв'язуванні рецепточі фактори, такі як Білок С; передсердний натрійуром його позаклітинного ліганду. Конформаційні ретичний фактор; легеневий сурфактант; активазміни в GPCR, які спричинені взаємодією лігандтор плазміногена, такий як урокіназа або людський рецептор, впливають на зв'язуючу афінність Gсечовий або тканинний активатор плазміногена (tбілка із внутрішньоклітинними доменами GPCR. PA); бомбезин; тромбін, гемопоетичний фактор Це дає GTP можливість зв'язуватись з G білком із росту; енкефаліназа; RANTES (regulated on підвищеною афінністю. activation normallу T-cell expressed and secreted Активація G білка за допомогою GTP призворегульований при активації звичайно Т-клітин, дить до взаємодії a субодиниці G білка з аденилаекспресований і секретований); людський запальтциклазою або іншими генераторами молекул втоний білок макрофагів (МІР-1-альфа); мулеріанринних мессенджерів. Ця взаємодія регулює інгібуюча речовина; Α-ланцюг релаксину; В-ланцюг активність аденилатциклази, а отже продукування релаксину; прорелаксин; мишачий гонадотропінмолекули вторинного мессенджеру, сАМР. сАМР асоційований пептид; нейротрофічні фактори, такі регулює фосфорилювання й активацію інших внуяк кістковий нсйротрофічний фактор (BDNF - boneтрішньоклітинних білків. Альтернативно, клітинні derived neurotrophic factor), нейротрофін-3, -4, -5, рівні інших молекул вторинних мессенджерів, таабо -6 ( NT-3, NT-4, NT-5, або NT-6), або фактор ких як cGMP або ейкозиноїди, можуть підвищуваросту нервів, такий як NGF-бета. Звичайні спеціатись або знижуватись активністю GPCR. a субодилісти в даній галузі знатимуть інші фактори росту ниця G білка дезактивується шляхом гідролізу або сигнальні молекули, які можуть бути експресоGTP за допомогою GTPaзи, а a, b, і g субодиниці вані відповідно до даного винаходу. повторно асоціюють. Після цього гегеротримерний G-білок спряжені рецептори G білок відокремлюється від аденилатциклази або Інший клас поліпептидів, які показали свою іншого генератора молекул вторинних мессенджеефективність у якості фармацевтичних й/або корів. Активність GPCR може також регулюватися мерційних засобів, включає фактори росту та інші шляхом фосфорилювання внутрішньо- і позаклісигнальні молекули. G-білок спряжені рецептори тинних доменів або петель. (GPCR - G-protein coupled receptor) - це білки, які Глутаматні рецептори формують групу GPCR, мають сім трансмембранних доменів. Після зв'язуякі є важливими в нейротрансмісії. Глутамат є говання ліганда із GPCR, всередині клітини трансдуловним трансміттером в ЦНС і, як вважається, кується сигнал, що призводить до зміни біологічної грає важливу роль в нейрональній пластичності, або фізіологічної властивості клітини. когнітивній функції, пам'яті, навчанні і при декільGPCR, разом з G-білками та ефекторами (внукох неврологічних захворюваннях, таких як епілептрішньоклітинними ферментами й каналами, які сія, інсульт і нейродегенеративні порушення модулюються G-білками), є компонентами моду(Watson, S. and S. Arkinstall (1994) The G-Protein льної сигнальної системи, що з'єднує стан внутріLinked Receptor Facts Book, Academic Press, San шньоклітинних вторинних мессенджерів із позакліDiego CA, pp. 130-132). Ці ефекти глутамата опотинними вхідними сигналами. Ці гени й генні середковуються двома різними класами рецептопродукти є потенційними збудниками захворюванрів під назвою іонотропні і метаботропні. Іонотропня. ні рецептори містять внутрішній катіонний канал й Певні дефекти в гені родопсину й гені рецепопосередковують швидкі збуджувальні дії глутаматора вазопресину V2, як показано, спричинює різні ту. Метаботропні рецептори є модуляторними, форми аутосомальної домінантної й аутосомальзбільшуючи мембранну збудливість нейронів шляної рецесивної пігментної дегенерації сітківки, нехом інгібування кальцієзалежної калієвої провідноцукрового ниркового діабету. Ці рецептори мають сті і шляхом інгібування та потенціювання збуджукритичне значення для центральної нервової сисвальної передачі іонотропних рецепторів. теми і для периферійних фізіологічних процесів. Метаботропні рецептори класифікуються на п'ять Суперродина білків GPCR на даний час містить підтипів, базуючись на фармакології агоніста й більш ніж 250 типів паралогів, рецепторів, які шляхах трансдукції сигналу, й широко розподіляпредставляють варіанти, отримані шляхом дупліються в тканинах головного мозку. 25 89383 26 рівнях ніж інший поліпептид або білок, вирощений Родина вазоактивних кишкових поліпептидів при ідентичних умовах культури. Звичайний спеці(VIP - vasoactive intestinal polypeptide), є групою аліст в даній галузі матиме змогу відповідним чиспоріднених поліпептидів, дії яких також опосередном модифікувати кроки й композиції даного винаковуються GPCR. Ключовими членами цієї родини ходу з метою оптимізації клітинного росту й/або є безпосередньо VIP, секретин і фактор, що вивівиробництва будь-якого даного поліпептиду або льняє гормон росту (GRF - growth hormone білка, що експресується. releasing factor). VIP має широкий спектр фізіологіГенетичні контрольні елементи чної дії, включаючи розслаблення гладких м'язів, Як буде очевидно для звичайних спеціалістів в стимуляцію або інгібування секреції в різних ткаданій галузі, генетичні контрольні елементи монинах, модуляцію різних видів активності імунних жуть використовуватися з метою регулювання клітин та різні збуджувальні й інгібувальні види генної експресії поліпептиду або білка. Такі генеактивності в ЦНС. Секретин стимулює секрецію тичні контрольні елементи повинні відбиратися на ферментів та іонів у підшлунковій залозі й кишечоснові їх активності у відповідній клітині-хазяїні. нику й також є присутнім у маленьких кількостях в Контрольні елементи можуть бути конститутивно мозку. GRF є важливим нейроендокринним агенактивними або можуть бути індуцибельними за том, що регулює синтез і вивільнення гормону ропевних обставин. Індуцибельні контрольні елеменсту із передньої частки гіпофізу (Watson, S. and S. ти є особливо корисними у випадках, коли експреArkinstall вище, pp. 278-283). сований білок є токсичим або іншим чином шкідПісля зв'язування ліганда з GPCR, конформаливо впливає на ріст і/або життєздатність клітин. У ційна зміна передається до G білка, що змушує aтаких випадках, регулювання експресії поліпептисубодиницю обміняти зв'язану молекулу GDP на ду або білка через індуцибельні контрольні елемолекулу GTP і відокремитись від bg-субодиниць. менти може покращити життєздатність клітин, GTP-зв'язана форма a-субодиниці, як правило, щільність клітини і/або сумарний вихід експресофункціонує як ефектор-модулюючий залишок, ваного поліпептиду або білка. В даній галузі відопризводячи до продукування вторинних мессенма й доступна велика кількість контрольних еледжерів, таких як циклічний AMP (наприклад, шляментів, корисних у практичному втіленні даного хом активації аденилатциклази), диацилгліцерину винаходу. або фосфатів інозиту. Для людини відомо більш Представники конститутивних ссавцевих проніж 20 різних типів a-субодиниць, які зв'язуються з мотерів, які можуть використовуватися відповідно меншим об'єднанням b і g-субодиниць. До прикладо даного винаходу, включають, крім інших, продів ссавцевих G білків належать Gi, Go, Gq, Gs і мотер гіпоксантин фосфорибозилтрансферази Gt. G білки докладно описані в Lodish H. et al. (HPTR - hypoxanthine phosphoribosyl transferase), Molecular Cell Biology, (Scientific American Books промотер аденозиндеамінази, промотер піруваткіInc., New York, N.Y., 1995), зміст якої включений нази, промотер бета-актину, а також інші конституавторами шляхом посилання. тивні промотери, відомі звичайним спеціалістам в GPCR є головною мішенню для дії й розробки даній галузі. Додатково, до вірусних промотерів, препаратів. Фактично, рецептори призвели до які, як показано, стимулюють конститутивну ексрозробки більш ніж половини відомих на даний час пресію кодуючих послідовностей в еукаріотичних препаратів (Drews, Nature Biotechnology, 1996, 14: клітинах, належать, наприклад, промотер мавп'я1516), і GPCR представляють найважливішу мічого вірусу, промотери вірусу герпесу простого, шень для терапевтичного втручання, причому 30% промотери папіломавірусу, промотери аденовірупрепаратів, що клінічно призначаються, антагонісу, промотери вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ), зують або агонізують GPCR (Milligan, G. and Rees, промотери вірусу саркоми Рауса, промотери циS., (1999) TIPS. 20: 118-124). Це демонструє, що томегаловірусу (ЦМВ), довгі термінальні повтовикористання рецепторів такого типу у якості терення (LTR) вірусу мишачої лейкемії Молоні та рапевтичних мішеней є добре встановленим, доінших ретровірусів, промотер тимідинкінази вірусу веденим фактом. герпесу простого, а також інші вірусні промотери, Взагалі, спеціалісти при практичному втіленні відомі звичайним спеціалістам в даній галузі. даного винаходу будуть обирати поліпептид, що їх Індуцибельні промотери запускають експресію цікавить, і знатимуть його точну амінокислотну оперативно зв'язаних кодуючих послідовностей в послідовність. Способи відповідно до даного винаприсутності індукуючого агенту й можуть також ходу успішно застосовувались у виробництві різвикористовуватися відповідно до даного винаходу. номанітних поліпептидів, включаючи, наприклад, Наприклад, у клітинах ссавців, металотіонеїновий людське моноклональне антитіло, спрямоване на промотер індукує транскрипцію низхідних кодуюфактор росту й диференціювання 8 (Приклади 1, чих послідовностей у присутності певних іонів ме3, 4, 7-14), гуманізоване антитіло анти-Льюїс Υ талу. Інші індуцибельні промотери будуть визнані (Приклади 5 і 6), анти-АБета (Приклад 15) і димерй/або відомі звичайним спеціалістам в даній галузі. ний Fc-злитий білок рецептора фактора некрозу Зазвичай, генна послідовність експресії також пухлини (Приклад 16), що свідчить про те, що давключатиме 5'нетранскрибуючі і 5'нетранслюючі ний винахід буде корисним для експресії цілого послідовності, пов'язані з ініціюванням транскрипспектру різних поліпептидів і білків. Будь-який дації й трансляції, відповідно, такі як рамка ТАТА, ний білок, що повинен бути експресований відпокеппінг послідовність, послідовність СААТ і т.п. відно до даного винаходу, матиме свої власні осоДля збільшення рівнів експресії поліпептидів або бливі характеристики й може впливати на білків, які будуть експресуватися, можуть довільно щільність або життєздатність культивованих клівикористовуватися елементи-посилювачі. До притин, і може бути експресований на більш низьких 27 89383 28 кладів елементів-посилювачів, які, як показано, ломи BALB/c (NSO/1, ЕСАСС No: 85110503); людфункціонують в клітинах ссавців, належить SV40 ські ретинобласти (PER.C6 (CruCell, Leiden, Нідерранній генний посилювач, як описано в Dijkema et ланди)); лінія CV1 нирки мавпи, трансформована al., EMBO J. (1985) 4: 761 і посилювач/промотер, за допомогою SV40 (COS-7, АТСС CRL 1651); лінія отриманий із довгого термінального повторення людської ембріональної нирки (клітини 293 або (LTR) вірусу саркоми Рауса (RSV - Rous Sarcoma 293, субклоновані для росту в суспензійній культуVirus), як описано в Gorman et al., Proc. Natl. Acad. рі, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); клітиSci. USA (1982b) 79:6777 і людського цитомегалони нирки дитинчат хом'яків (ВНК, АТСС CCL 10); вірусу, як описано в Boshart et al., Cell (1985) клітини яєчника китайського хом'яка +/-DHFR 41:521. (СНО, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. Системи для зв'язування контрольних елемеUSA, 77:4216 (1980)); клітини Сертолі миші (ТМ4, нтів із кодуючими послідовностями відомі в даній Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); клітини галузі (загальні методи молекулярної біології та нирки мавпи (CV1 АТСС CCL 70); клітини нирки рекомбінантної ДНК описані в Sambrook, Fritsch, африканської зеленої мавпи (VERO-76, АТСС and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory CRL-1 587); клітини людського раку шийки матки Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor (HeLa, АТСС CCL 2); клітини нирки собаки (MDCK, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, АТСС CCL 34); клітини печінки щура Буффало зміст якого включений авторами шляхом посилан(BRL 3А, АТСС CRL 1442); клітини людської легені ня). Комерційні вектори, що підходять для вставки (W138, АТСС CCL 75); клітини людської печінки оптимальної кодуючої послідовності для експресії (Hep G2, НВ 8065); мишача пухлина молочної зав різних клітинах ссавців за різних умов росту та лози (ММТ 060562, АТСС CCL51); клітини ТРІ індукції також добре відомі в даній галузі. (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 Введення кодуючих послідовностей і відповід(1982)); клітини MRC 5; клітини FS4; і лінія людсьних контрольних елементів в клітини-хазяїни кої гепатоаденоми (Hep G2). У варіанті втілення, Способи, що підходять для введення в ссавякому надається особлива перевага, даний винацеві клітини-хазяїни нуклеїнових кислоти, достатхід використовується для культивування та ексніх для досягнення експресії поліпептидів або білпресії поліпептидів і білків із клітинних ліній СНО. ків, що розглядаються, відомі в даній галузі. Див., Крім цього, відповідно до даного винаходу монаприклад, Gething et al., Nature, 293:620-625 же використовуватися будь-яка кількість комерцій(1981); Mantei et al., Mure, 281:40-46 (1979); но й некомерційно доступних клітинних лінії гібриLevinson et al.; EP 117,060; and EP 117058, зміст доми, які експресують поліпептиди або білки. кожного з яких включений авторами шляхом посиСпеціаліст, кваліфікований в даній галузі, добре лання. розумітиме, що клітинні лінії гібридоми можуть Для клітин ссавців, оптимальні способи мати різні вимоги щодо живлення й/або можуть трансформації включають спосіб осадження фоспотребувати різних умов культивування для оптифатом кальцію Graham і van der Erb, Virology, мального росту й експресії поліпептиду або білка, і матиме змогу модифікувати умови, у разі необхід52:456-457 (1978) або спосіб з ліпофектаміномÔ ності. (Gibco BRL) Hawley-Nelson, Focus 15:73 (1193). Як відзначено вище, у багатьох випадках кліЗагальні аспекти системних трансформацій ссавтини будуть відбиратися або створюватися для цевих клітин-хазяїнів були описані Axel у Патенті продукції високих рівнів білка або поліпептиду. США №4399216, виданому 16 серпня 1983 року. Часто, клітини створюються генетично для продуДля ознайомлення з різними способами для кції високих рівнів білка, наприклад, шляхом вветрансформації ссавцевих клітин, див. Keown et al., дення гена, що кодує білок або поліпептид, який Methods in Enzymology (1989), Keown et al., розглядається, й/або за допомогою введення конMethods in Enzymology, 185:527-537 (1990), і трольних елементів, які регулюють експресію гена Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988). До хара(ендогенного або введеного), що кодує поліпепктерних прикладів прийнятних векторів для екстид, який розглядається. пресії поліпептидів або білків у клітинах ссавців Певні поліпептиди можуть шкідливо впливати належать, крім інших, pCDNAl; pCD, див. Okayama, на ріст клітини, життєздатність клітини або деякі et al. (1985) Mol. СеІl Вiol. 5:1136-1142; pMClneo інші характеристики клітин, що в остаточному підPoly-A, див. Thomas, et al. (1987) Cell 51:503-512; і сумку до певної міри обмежує виробництво полівектор бациловірусу, такий як ρ АС 373 або ρ АС пептиду або білка, який розглядається. Навіть се610. ред популяції клітин одного певного типу, В оптимальних варіантах втілення, поліпептид створеного для експресії певного поліпептиду, або білок стійко трансфектується в клітинуіснує варіабельність у межах клітинної популяції, хазяїна. Однак, звичайний спеціаліст в даній галузі таким чином, що певні індивідуальні клітини бувизнає, що даний винахід може використовуватися дуть рости краще й/або продукуватимуть більше у випадку транзиторно або стійко трансфектоваполіпептиду, що розглядається. У певних оптиманих клітин ссавців. льних варіантах втілення даного винаходу, клітинКлітини на лінія відбирається практиком еміпіричним шляВідповідно до даного винаходу може викорисхом для здорового росту за певних умов, обраних товуватися будь-яка клітина ссавця або тип клітин, для культивування клітин. У варіантах втілення, сприйнятливий до клітинної культури і до експресії яким надається особлива перевага, індивідуальні поліпептидів. До прикладів клітин ссавців, які моклітини, створені для експресії певного поліпептижуть використовуватися відповідно до існуючого ду обираються для великомасштабного виробницвинаходу, належать, крім інших, лінія мишачої міє 29 89383 30 тва, базуючись на рості клітин, кінцевій щільності зують і навіть нівелюють накопичення лактату та клітин, відсотку життєздатності клітин, титрі ексамонію. Композиції середовищ даного винаходу, пресованого поліпептиду або будь-якої їх комбінаякі, як показано, чинять сприятливий вплив на ріст ції чи будь-яких інших умовах, що вважаються й/або життєздатність клітин або на експресію поліпрактиком важливими. пептиду чи білка, включають одну або кілька з ниФаза клітинної культури жченаведених характеристик: і) сукупна кількість До типових процедур для продукування поліамінокислот на одиницю об'єму більша ніж припептиду, що розглядається, належать серійні кульблизно 70мМ; іі) молярне співвідношення сукупної тури й підживлювані культури. Процеси серійної кількості глутаміну до сукупної кількості аспарагіну культури традиційно включають інокуляцію кульстановить менше ніж приблизно 2; ііі) молярне тури для великомасштабного виробництва посівспіввідношення сукупної кількості глутаміну до ною культурою з певною конкретною щільністю сукупної кількості амінокислот в цілому становить клітин, вирощування клітин за умов, що сприяють менше ніж приблизно 0,2; iv) молярне співвідноросту й життєздатності клітин, збір культури, коли шення сукупної кількості неорганічних іонів до суклітини досягають зазначеної щільності клітин, і купної кількості амінокислот в цілому становить очищення експресованого поліпептиду. Процедури приблизно від 0,4 до 1; або ν) об'єднана сукупна підживлюваної культури включають додатковий кількість глутаміну й аспарагіну на одиницю об'єму крок або кроки підживлення серійної культури за становить більше ніж приблизно 16мМ. Звичайний допомогою поживних речовин й інших компоненспеціаліст у даній галузі зрозуміє, що термін "сукутів, які споживаються упродовж росту клітин. Попний", який використовується вище, стосується стійна й невирішена проблема, що стосується сумарної кількості певного компоненту або компотрадиційних серійних й підживлюваних культур, нентів, доданих упродовж клітинної культури, полягає в утворенні відходів метаболізму, які чивключаючи компоненти, що додаються на початку нять шкідливий вплив на ріст, життєздатність клікультури й компоненти, що додаються згодом. тин і виробництво експресованих поліпептидів. Звичайний спеціаліст у даній галузі зрозуміє, що Два продукти-відходи метаболізму, які чинять осокомпозиції середовищ відповідно до даного винабливо шкідливий вплив - це лактат і амоній, що ходу охоплюють визначені й невизначені середоутворюються внаслідок метаболізму глюкози та вища. глутаміну, відповідно. Крім ферментативного проТрадиційні композиції середовищ починаються дукування амонію внаслідок метаболізму глутаміз відносно низького рівня сумарної кількості амінону, амоній також накопичується в клітинних кулькислот у порівнянні з композиціями середовищ турах внаслідок неметаболічного розщеплення, даного винаходу. Наприклад, загальний вміст аміщо відбувається з часом. Даний винахід пропонує нокислот традиційного середовища для клітинної поліпшений спосіб великомасштабного виробницкультури, відомого як DME-F12 (суміш 50:50 серетва поліпептидів, що мінімізує шкідливі ефекти довища Ігла в модифікації Дульбекко й середовиамонію й лактата шляхом сповільнення і навіть ща Хема F12) становить 7,29мМ, а загальний нівелювання накопичення цих відходів у клітинних вміст амінокислот традиційного середовища для культурах. Звичайний спеціаліст в даній галузі клітинної культури, відомого як RPMI-1640, становизнає, що даний винахід може використовуватися вить 6,44мМ (Див. наприклад, H.J. Morton, In Vitro, в будь-якій системі, у якій культивуються клітини, 6:89-108 (1970), R.G. Ham, Proc. Nat. Assoc. Sci. включаючи, крім інших, серійні, підживлювані йпе(USA), 53:288-293 (1965), G.E. Moore et al., J. Am. рфузійні системи. У певних оптимальних варіантах Medical Assn., 199:519-24 (1967), вміст кожного з втілення даного винаходу, клітини вирощують в яких включений авторами шляхом посилання). У серійних або підживлюваних системах. певних варіантах втіленнях даного винаходу, конСередовища центрація амінокислот в культуральних середоТрадиційні композиції середовищ, включаючи вищах бажано є більшою ніж приблизно 70мМ. Ще комерційно доступні середовища, такі як Хема F10 більш бажано, композиції середовищ відповідно (Ham's F10, Sigma), середовище MEM (Minimal до даного винаходу містять концентрації амінокиEssential Medium, Sigma), RPMI-1640 (Sigma), і слот, більші ніж приблизно 70мМ у вихідних сересередовище Ігла в модифікації Дульбекко ([DMEM довищах. Показано, що у випадку, коли концент- Dulbecco's Modified Eagle's Medium], Sigma), місрації амінокислот вихідних середовищ тять в своєму складі відносно високі рівні глюкози перебувають у цьому діапазоні, щільність клітин й й глутаміну в порівнянні з іншими амінокислотами. титр збільшуються протягом періоду росту культуЦі компоненти, як вважалось, були потрібні в надри (див. Приклад 13). лишку, оскільки вони є первинними метаболічними Крім того, у певних варіантах втілення даного джерелами енергії для клітин. Однак, швидке сповинаходу, молярне співвідношення глутаміну до живання цих поживних речовин призводить до аспарагіну в культуральних середовищах є зниженакопичення лактату й амонію, як описано вище. ним у порівнянні з іншими комерційно й некомерДодатково, високі початкові рівні глюкози й глутаційно доступними середовищами. Бажано, щоб міну, й подальше накопичення лактату й амонію молярне співвідношення глутаміну до аспарагіну в зумовлюють високу осмолярність, стан, що сам по культуральних середовищах становило менше ніж собі часто є шкідливим для росту, життєздатності приблизно два. клітин й виробництва поліпептидів. Крім того, у певних варіантах втілення даного Даний винахід пропонує різні композиції серевинаходу, молярне співвідношення глутаміну до довищ, які, при використанні відповідно до інших сумарної кількості амінокислот у культуральних кроків культивування, описаних авторами, мінімісередовищах є зниженим у порівнянні з іншими 31 89383 32 комерційно й некомерційно доступними середотрій, хлорид, кальцій, магній і фосфат), буферами, вищами. Бажано, щоб молярне співвідношення вітамінами, нуклеозидами або нуклеотидами, мікглутаміну до сумарної кількості амінокислот у роелементами (неорганічними сполуками, що закультуральних середовищах становило менше ніж звичай присутні у дуже низьких кінцевих концентприблизно 0,2. раціях), амінокислотами, ліпідами, гідролізатами Цікавий і несподіваний результат зниження білка або глюкозою чи іншим джерелом енергії. У молярного співвідношення глутаміну до аспарагіну певних варіантах втілення даного винаходу допоабо до сумарної концентрації амінокислот у вихідвнення середовищ хімічними індуктантами, такими них середовищах відповідно до даного винаходу як гексаметилен-біс(ацетамід) ("ГМБА") і натрію полягав у тому, що на додаток до відзначеного бутират ("NaB") може мати сприятливий ефект. Ці зменшення в накопиченні амонію, також спостерідодаткові добавки можуть додаватися на початку галося зменшення в накопиченні лактату. У певних культивування або можуть додаватися в більш варіантах втілення, накопичені рівні амонію й лакпізній період часу з метою поповнення вичерпаних тату не тільки нижчі ніж в контрольних культурах, поживних речовин або з іншої причини. Звичайний але й дійсно фактично зменшуються після початспеціаліст в даній галузі знатиме будь-які бажані кового накопичення (наприклад, див. Приклади 3 і або необхідні добавки, які можуть бути включені в 7). описані композиції середовищ. Boraston (Патент США №5871999) описав Підготовка культури клітин ссавців культуральне середовище, у якому молярне співВ даній галузі відомі різні способи підготовки відношення сумарної кількості неорганічних іонів клітин ссавців для виробництва білків або поліпепдо сумарної кількості амінокислот становить від 1 тидів за допомогою серійної й підживлюваної до 10. Boraston показав, що при забезпеченні культури. Як описано вище, нуклеїнова кислота, культурального середовища, у якому молярне достатня для досягнення експресії (як правило співвідношення сумарної кількості неорганічних вектор, що містить ген, який кодує поліпептид або іонів до сумарної кількості амінокислот перебуває білок, що розглядається, й будь-які оперативно в цьому діапазоні, агрегація клітин СНО, вирощезв'язані генетичні контрольні елементи) може бути них у середовищі, зменшується. В іншому оптимавведена в лінію клітин-хазяїнів за допомогою вельному варіанті втілення даного винаходу, молярликої кількості добре відомих способів. Як правине співвідношення сумарної кількості неорганічних ло, клітини підлягають скринінгу для визначення, іонів до сумарної кількості амінокислот у культураякі із клітин-хазяїнів фактично поглинули вектор і льному середовищі зменшене навіть ще більше, експресують полі пептид або білок, що розглядадо приблизно від 0,4 до 1. Як показано в Прикладі ється. До традиційних способів виявлення певного 13, зменшення цього співвідношення від 1,75 до поліпептиду або білка, що розглядається, експреприблизно 0,7 призводить до помітного збільшенсованого клітинами ссавців належать, крім інших, ня щільності клітин й виробництва експресованого імуногістохімія, імунопреципітація, проточна цитополіпептиду або білка упродовж періоду росту метрія, імунофлуоресцентна мікроскопія, SDSкультури. PAGE, метод імуноблотингу (Western blot), метод В іншому оптимальному варіанті втілення давиявлення за допомогою імобілізованого ферменного винаходу, культуральне середовище містить ту (ELISA - enzyme-linked immunosorbentassay), об'єднану концентрацію глутаміну і аспарагіну, що методи високоефективної рідинної хроматографії становить приблизно від 16 до 36мМ. Як показано (ВЕРХ), тести на біологічну активність й афінна в Прикладі 14, Таблиці 22, у середовищ, які місхроматографія. Звичайний спеціаліст в даній галутять об'єднану сумарну концентрацію глутаміну та зі знатиме інші відповідні способи для виявлення аспарагіну в межах цього діапазону, відзначаються експресованих поліпептидів або білків. У разі, яквищі титри експресованого поліпептиду ніж у сещо полі пептид або білок, що розглядається, ексредовищ, які містять об'єднану сумарну кількість пресують різні клітини-хазяїни, можуть використоглутаміну і аспарагіну поза цим діапазоном. Звивуватися кілька або всі перелічені способи для чайний спеціаліст в даній галузі матиме змогу обвизначення, яка із клітин ехспресує цей поліпептид рати точну об'єднану концентрацію глутаміну і або білок на найвищих рівнях. аспарагіну в межах цього діапазону з метою оптиЯк тільки клітину, що експресує поліпептид мізації росту й/або життєздатності клітин і збільабо білок, що розглядається, ідентифікували, клішення до максимуму виробництва експресованого тину розмножують у культурі за допомогою будьполіпептиду. якого із широкого спектру способів, добре відомих Крім того, звичайний спеціаліст в даній галузі звичайному спеціалісту в даній галузі. Клітину, яка визнає, що будь-яка із вище зазначених умов моекспресує поліпептид або білок, що розглядається, же використовуватися або окремо або в різних як правило, розмножують шляхом вирощування її комбінаціях одна з одною. Використовуючи компопри температурі й у середовищі, що є сприятлизиції середовищ, яким властива одна, кілька або вим для виживання, росту й життєздатності клітивсі вищезгадані характеристики, звичайний спеціни. Початковий об'єм культури може бути будьаліст в даній галузі матиме змогу оптимізувати ріст яким, але часто меншим ніж об'єм культури вирой/або життєздатність клітин і збільшити до максибничого біореактора, що використовується у кінмуму виробництво експресованого поліпептиду. цевому виробництві поліпептиду або білка, що Кожна із цих композицій середовищ, розкритих розглядається, і часто клітини проходять кілька в даному винаході, може, довільно, доповнювациклів у біореакторах зі збільшенням об'єму до тись у міру необхідності гормонами й/або іншими посіву у виробничий біореактор. Клітинна культура факторами росту, певними іонами (такими, як наможе збовтуватися або струшуватися з метою 33 89383 34 збільшення насичення середовища киснем й дисня об'єм виробничого біореактору становить персії поживних речовин до клітин. Альтернативно принаймні 500 літрів. В інших оптимальних варіанабо додатково, для збільшення й контролю наситах втілення об'єм виробничого біореактору стачення культури киснем можуть використовуватися новить 1000, 2500, 5000, 8000, 10000, 12000 літрів спеціальні барботуючі пристрої, які є відомими в або більше, чи має будь-який проміжний об'єм в даній галузі. Відповідно до даного винаходу, звицих межах. Звичайний спеціаліст в даній галузі чайний спеціаліст в даній галузі розумітиме, що знатиме й матиме змогу обрати підходящий біореможе бути вигідним контролювати або регулювати актор для використання в практичному втіленні певні внутрішні умови біореактора, включаючи, даного винаходу. Виробничий біореактор може крім інших, рН, температуру, насичення киснем і бути сконструйований з будь-якого матеріалу, що т.д. є сприятливим для росту й життєздатності клітин, Початкова щільність клітин у виробничому що не перешкоджає експресії або стабільності біореакторі може обиратися звичайним спеціалісполіпептиду або білка, що експресується. том в даній галузі. Відповідно до даного винаходу Температура клітинної культури в початковій початкова щільність клітин у виробничому біореакфазі росту буде обиратися на підставі насамперед торі може становити всього одну клітину на об'єм діапазону температур, при яких клітинна культура культури. В оптимальних варіантах втілення данозалишається життєздатною. Наприклад, протягом го винаходу, початкові щільності клітин у виробнипочаткової фази росту, клітини СНО добре ростуть чому біореакторі можуть коливатися від приблизно при 37°С. Зазвичай, більшість клітин ссавців добре 2х102 життєздатних клітин на мл до приблизно ростуть в межах діапазону приблизно від 25°С до 2х103, 2х104, 2х105, 2х106, 5х106 або 10х106 життє42°С. Бажано, щоб клітини ссавців добре росли в здатних клітин на мл і вище. межах діапазону приблизно від 35°С до 40°С. ЗвиПочаткові й проміжні клітинні культури можуть чайні спеціалісти в даній галузі матимуть змогу бути вирощені до будь-якої бажаної щільності пеобрати відповідну температуру або температури ред посівом у наступний проміжний або кінцевий для вирощування клітин, залежно від потреб клівиробничий біореактор. Бажано, щоб більшість тин і виробничих вимог практичного виконавця. клітин залишалися живими до посіву, хоча не виВ одному варіанті втілення даного винаходу магається повна або майже повна життєздатність. температура початкової фази росту підтримується В одному варіанті втілення даного винаходу, кліяк єдина, постійна температура. В іншому варіанті тини можуть бути вилучені із супернатанта, напривтілення температура початкової фази росту підклад, шляхом низькооборотного центрифугування. тримується в межах діапазону температур. НаприМоже також бути бажаним промити вилучені кліклад, протягом початкової фази росту температутини середовищем перед посівом у наступний біора може стійко збільшуватись або зменшуватись. реактор з метою видалення будь-яких небажаних Альтернативно, упродовж початкової фази росту відходів метаболізму або компонентів середовитемпература може збільшуватись або зменшуваща. Середовище може бути тим середовищем, у тись дискретними кількостями в різні проміжки якому попередньо вирощувались клітини, або мочасу. Звичайний спеціаліст в даній галузі матиме же бути іншим середовищим чи промивним розчизмогу визначити доцільність застосування однієї ном, обраним практичним виконавцем даного виабо кількох температур і стійкого чи дискретного находу. характеру зміни температури. Після цього клітини можуть бути розведені до Протягом початкової фази росту клітини мовідповідної щільності для посіву у виробничий біожуть вирощуватися упродовж довшого або коротреактор. В оптимальному варіанті втілення даного шого проміжку часу, залежно від потреб практика й винаходу, клітини розводять в тому ж самому сепотреб безпосередньо клітин. В одному варіанті редовищі, що буде використовуватися у виробнивтілення клітини вирощують упродовж періоду чому біореакторі. Альтернативно, клітини можуть часу, який є достатнім для досягнення щільності бути розведені в іншому середовищі або розчині, життєздатних клітин, що є встановленим відсотком залежно від потреб і бажань практичного виконаввід максимальної щільності життєздатних клітин, ця даного винаходу, або з метою пристосування якої б клітини врешті-решт досягай, якщо б їм надо конкретних потреб безпосередньо клітин, надали можливість рости без втручань. Наприклад, приклад, якщо вони повинні зберігатися упродовж клітини можуть бути вирощені упродовж періоду короткого проміжку часу до посіву у виробничий часу, достатнього для досягнення бажаної щільнобіореактор. сті життєздатних клітин, що становить 1, 5, 10, 15, Початкова фаза росту 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, Як тільки виробничий біореактор був засіяний 90, 95 або 99 відсотків від максимальної щільності в описаний вище спосіб, клітинну культуру підтрижиттєздатних клітин. мують в початковій фазі росту за умов, що сприяВ іншому варіанті втілення клітинам надають ють виживанню, росту й життєздатності клітинної можливість рости упродовж певного проміжку чакультури. Точні умови варіюють залежно від типу су. Наприклад, залежно від початкової концентраклітин, організму, з якого клітина була отримана, і ції клітинної культури, температури, при якій виприроди та характеру поліпептиду або білка, що рощуються клітини і властивого клітинам темпу експресується. росту, клітини можуть вирощуватися упродовж 0, Відповідно до даного винаходу виробничий 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, біореактор може бути будь-якого об'єму, що підхо18, 19, 20 або більше днів. У деяких випадках, клідить для великомасштабного виробництва поліпетинам можна надати можливість рости протягом птидів або білків. В оптимальному варіанті втіленмісяця або більше. Клітини б вирощувались упро 35 89383 36 довж 0 днів у виробничому біореакторі, якби їхній діапазону температур, при яких клітинна культура ріст у біореакторі для посіву, при температурі позалишається життєздатною й експресує рекомбічаткової фази росту, був достатній для того, щоб нантні поліпептиди або білки на комерційно прищільність життєздатних клітини у виробничому йнятних рівнях. Зазвичай, більшість клітин ссавців біореакторі під час його інокуляції уже була на залишаються життєздатними й експресують рекорівні бажаного відсотка від максимальної щільносмбінантні поліпептиди або білки на комерційно ті життєздатних клітин. Практичний виконавець прийнятних рівнях в межах діапазону приблизно даного винаходу матиме змогу обрати тривалість від 25 °С до 42°С. Бажано, щоб клітини ссавців початкової фази росту залежно від вимог виробзалишалися життєздатними й експресували рекоництва поліпептиду або білка й потреб безпосерембінантні поліпептиди або білки на комерційно дньо клітин. прийнятних рівнях в межах діапазону приблизно Клітинну культуру можна збовтувати або від 25°С до 35°С. Звичайні спеціалісти в даній гаструшувати протягом початкової фази культивулузі матимуть змогу обрати відповідну температування з метою збільшення насичення киснем й ру, або температури для вирощування клітин, задисперсії поживних речовин до клітин. Відповідно лежно від потреб клітин і виробничих вимог до даного винаходу звичайний спеціаліст в даній практичного виконавця. галузі розумітиме, що може бути вигідним контроВ одному варіанті втілення даного винаходу лювати або регулювати певні внутрішні умови біотемпература наступної фази росту підтримується реактора протягом початкової фази росту, вклюяк єдина, постійна температура. В іншому варіанті чаючи, крім інших, рН, температуру, насичення втілення температура наступної фази росту підкиснем і т.д. Наприклад, рН можна контролювати тримується в межах діапазону температур. Напришляхом додавання відповідної кількості кислоти клад, протягом наступної фази росту температура або основи, а насичення киснем можна контролюможе стійко збільшуватись або зменшуватись. вати за допомогою барботуючих пристроїв, які є Альтернативно, упродовж наступної фази росту відомими в даній галузі. температура може збільшуватись або зменшуваЗаміна умов культивування тись дискретними кількостями в різні проміжки Відповідно до тактики даного винаходу, напричасу. Звичайний спеціаліст в даній галузі розумікінці початкової фази росту може бути замінена тиме, що багаторазові дискретні заміни темперапринаймні одна з умов культивування для того, тур охоплюються в даному варіанті втілення. Нащоб застосувати другий набір умов культивування, приклад, температура може бути замінена один і відбувся метаболічний зсув у культурі. Накопираз, клітини підтримуються при цій температурі чення інгібіторних метаболітів, особливо лактату й або температурному діапазоні упродовж певного амонію, інгібує ріст. Метаболічний зсув, що досяпроміжку часу, після якого температура може бути гається шляхом, наприклад, зміни в температурі, замінена знову - на вищу або нижчу температуру. рН, осмоляльності або рівня хімічного індуктанта Температура культури після кожної дискретної клітинної культури, може характеризуватися знизаміни може бути постійною aбo може підтримуваженням співвідношення певної швидкості продукутися в межах певного діапазону температур. вання лактату до певної швидкості споживання У Прикладі 16 показані дані, що демонструють глюкози. В одному необмежуючому варіанті втіефективність використання двох послідовних змін лення умови культивування замінюють шляхом температур, хоча для звичайних спеціалістів в заміни температури культивування. Однак, як віданій галузі буде зрозуміло, що відповідно до дадомо у даній галузі, заміна температури не є єдиного винаходу, можуть використовуватися три або ним механізмом, через який можна досягнути відбільше послідовних змін температур з метою збіповідного метаболічного зсуву. Наприклад, такий льшення життєздатності чи щільності клітин і/або метаболічний зсув може також бути досягнутий збільшення експресії рекомбінантних поліпептидів шляхом заміни інших умов культивування, вклюабо білків. Температура або температурні діапачаючи, крім інших, рН, осмоляльність і рівні натрію зони клітинної культури після кожної послідовної бутирату. Як обговорювалося вище, вибір часу зміни температури можуть бути вищими або нижзаміни культури буде визначатися практичним чими ніж температура(и) або температурний діавиконавцем даного винаходу, базуючись на вимопазон(и) перед заміною. В оптимальному варіанті гах виробництва поліпептиду або білка чи потревтілення даного винаходу, кожна послідовна тембах безпосередньо клітин. пература або температурний діапазон є нижчими При заміні температури культивування темпеніж попередня температура або температурний ратурна заміна може бути відносно поступовою. діапазон. Наприклад, здійснення зміни температури може Наступна фаза виробництва займати кілька годин або днів. Альтернативно, Відповідно до даного винаходу, як тільки умотемпературна заміна може бути відносно різкою. ви клітинної культивування були замінені як обгоНаприклад, зміна температури може завершитися ворювалося вище, клітинну культуру підтримують через менше ніж кілька годин. З огляду на відповіупродовж наступної фази виробництва при другодне виробництво й контрольне устаткування, таке му наборі умов культивування, що сприяють вижияк застосовується в якості стандартного в комерванню й життєздатності клітинної культури й підційному великомасштабному виробництві поліпепходять для експресії бажаного поліпептиду або тидів або білків, зміна температури може звершибілка на комерційно прийнятних рівнях. тися навіть упродовж менш ніж години. Як обговорювалося вище, культивування може Температура клітинної культури в наступній бути замінене шляхом заміни однієї або кількох з фазі росту буде обиратися на підставі насамперед низки умов культивування, включаючи, крім інших, 37 89383 38 температуру, рН, осмоляльність і рівні натрію бутуру перед наступною фазою виробництва. У тирату. В одному варіанті втілення замінюється якості прикладів, крім іншого, може бути вигідно температура культивування. Відповідно до цього або необхідно постачати клітинну культуру гормоваріанту втілення упродовж наступної фази виронами й/або іншими факторами росту, певними бництва, культуру підтримують при температурі іонами (такими як натрію, хлориду, кальцію, магнію або температурному діапазоні, що є нижчим ніж і фосфату), буферами, вітамінами, нуклеозидами температура або температурний діапазон початабо нуклеотидами, мікроелементами (неорганічкової фази росту. Наприклад, протягом наступної ними сполуками, що зазвичай присутні у дуже нифази виробництва, клітини СНО добре експресузьких кінцевих концентраціях), амінокислотами, ють рекомбінантні поліпептиди й білки в межах ліпідами або глюкозою чи іншим джерелом енергії. діапазону від 25°С до 35°С. Як обговорювалося Ці додаткові компоненти можуть всі додававище, можуть використовуватися багаторазові тись до клітинної культури одночасно, або їх мождискретні зміни температури з метою збільшення на постачати клітинній культурі в серії додавань. В щільності або життєздатності клітин чи збільшення одному варіанті втілення даного винаходу додатекспресії рекомбінантного поліпептиду або білка. кові компоненти постачаються клітинній культурі в Відповідно до даного винаходу, клітини морізні проміжки часу в пропорційних кількостях. В жуть підтримуватися в наступній фазі виробництва іншому варіанті втілення може бути бажано надати до досягнення бажаної щільності клітини або титру тільки певну кількість додаткових компонентів сповиробництва. В одному варіанті втілення клітини чатку, і постачати компоненти, що залишаються, підтримують в наступній фазі виробництва до допізніше. У ще одному варіанті втілення даного висягнення максимального титру до рекомбінантного находу, клітинна культура постійно підживлюється поліпептиду або білка. В інших варіантах втілення цими додатковими компонентами. культура може бути зібрана до цього часу, залежВідповідно до даного винаходу, повний об'єм, но від виробничих вимог практичного виконавця що додається до клітинної культури повинен, опабо потреб безпосередньо клітин. Наприклад, клітимально, підтримуватися на мінімальному рівні. тини можуть підтримуватися упродовж періоду Наприклад, повний об'єм середовища або розчичасу, достатнього для досягнення щільності житну, що містить додаткові компоненти, які додаютьтєздатних клітин, що становить 1, 5, 10, 15, 20, 25, ся до клітинної культури може становити 1, 2, 3, 4, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70,75, 80, 85, 90, 95 5, 6, 7, 8, 9,10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 або 50% або 99 відсотків від максимальної щільності життєоб'єму клітинної культури до постачання додаткоздатних клітин. У деяких випадках, може бути бавих компонентів. жаним надати можливість щільності життєздатних Клітинну культуру можна збовтувати або клітин досягати максимуму, а потім надати можлиструшувати протягом наступної фази виробництва вість щільності життєздатних клітин зменшитися з метою збільшення насичення киснем й дисперсії до деякого рівня перед збором урожаю культури. У поживних речовин до клітин. Відповідно до даного надзвичайному прикладі, може бути бажаним навинаходу звичайний спеціаліст в даній галузі родати можливість щільності життєздатних клітини зумітиме, що може бути вигідним контролювати наблизитися або досягти нуля перед збором уроабо регулювати певні внутрішні умови біореактора жаю культури. протягом наступної фази росту, включаючи, крім В іншому варіанті втілення даного винаходу, інших, рН, температуру, насичення киснем і т.д. клітинам надають можливість рости упродовж пеНаприклад, рН можна контролювати шляхом довного проміжку часу протягом наступної фази видавання відповідної кількості кислоти або основи, робництва. Наприклад, залежно від концентрації а насичення киснем можна контролювати за допоклітинної культури на початку наступної фази росмогою барботуючих пристроїв, які є відомими в ту, температури, при якій вирощуються клітини і даній галузі. властивого клітинам темпу росту, клітини можуть Контроль умов культивування вирощуватися упродовж 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, У певних варіантах втілення даного винаходу 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18,19, 20 або більше днів. практик може виявити, що вигідно або необхідно У деяких випадках, клітинам можна надати можпроводити періодичний моніторинг певних умов ливість рости протягом місяця або більше. Праквирощування клітинної культури. Моніторинг умов тичний виконавець даного винаходу матиме змогу культивування клітин дозволяє практикові визнаобрати тривалість наступної фази виробництва чати, чи продукує клітинна культура рекомбінантзалежно від вимог виробництва поліпептиду або ний поліпептид або білок на субоптимальних рівбілка й потреб безпосередньо клітин. нях або, чи збирається культура входити в У певних випадках, може бути вигідно або несубоптимальну фазу продукування. Щоб проводиобхідно постачати клітинну культуру протягом нати моніторинг певних умов культивування клітин, ступної фази виробництва поживними речовинами буде необхідно відбирати невеликі аліквоти кульабо іншими компонентами середовища, які були тури для аналізу. Звичайний спеціаліст в даній вичерпані або метаболізовані клітинами. Напригалузі розумітиме, що існує потенційна можликлад, могло б бути вигідним постачати клітинну вість, що такий відбір може бути джерелом контакультуру поживними речовинами або іншими коммінації клітинної культури, і вживатиме відповідних понентами середовища, які, як виявилось під час заходів з метою мінімізації ризику такої контамінамоніторингу клітинної культури, були вичерпані ції. (див. розділ 'Моніторинг умов культивування' нижУ якості прикладів, крім іншого, може бути виче). Альтернативно або додатково, може бути вигідно або необхідно проводити моніторинг темпегідно або необхідно підживлювати клітинну кульратури, рН, щільності клітин, життєздатності клі 39 89383 40 тин, інтегрованої щільності життєздатних клітин, S.J. and Hames, B.D. (eds.), Protein Expression : A рівнів лактату, рівнів амонію, осмолярності або Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999; and титру поліпептиду або білка, що експресується. В Deutscher, M.P., Simon, M.I., Abelson, J.N. (eds.), даній галузі відомі численні способи, що дозволять Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology звичайному спеціалісту в даній галузі визначати ці (Methods in Enzymology Series, Vol 182), Academic умови. Наприклад, щільність клітини може виміPress, 1997, зміст всіх з них включений авторами рюватись за допомогою гемацитометра, лічильнишляхом посилання). Для імуноафінної хроматогка Coulter або дослідження цільності клітин рафії, зокрема, білок може бути виділений шляхом (CEDEX). Щільність життєздатних клітин може бузв'язування його з афінною колонкою, що містить ти визначена шляхом фарбування зразка культури антитіла, які були утворені проти цього білка й трипаном синім. Оскільки тільки мертві клітини прикріплені до стаціонарної фази. Альтернативно, поглинають трипан синій, щільність життєздатних таги афінності, такі як послідовність оболонки віклітин може бути визначена шляхом підрахунку русу грипу, полігістидин або глутатіон-Sзагальної кількості клітин, поділу кількості клітин, трансфераза можуть бути приєднані до білка за які поглинули барвник на загальну кількість клітин і допомогою стандартних рекомбінантних способів, взяття зворотного дробу. Для визначення рівнів щоб надати можливість для легкого очищення лактату, амонію або експресованого поліпептиду пропусканням через відповідну афінну колонку. чи білка може використовуватися ВЕРХ. АльтерІнгібітори протеази, такі як фенілметилсульфонілнативно, рівень експресованого поліпептиду або фторид (ФМСФ), лейпептин, пепстатин або апробілка може бути визначений за допомогою стандатинін можуть додаватись на будь-яких або на всіх ртних методів молекулярної біології, таких як фарстадіях з метою зменшення або нівелювання дебування coomassie гелів SDS-PAGE, метод імуноградації поліпептиду або білка упродовж процесу блотингу (Western blotting), тест Бредфорда, тест очищення. Особливо бажано застосовувати інгібіЛоурі, тест Бюрета і УФ адсобція. Може також бути тори протеази, коли необхідно розщепити клітини вигідно або необхідно проводити моніторинг постдля виділення й очищення експресованого поліпетрансляційних модифікацій експресованого поліптиду або білка. Звичайний спеціаліст в даній гапептиду або білка, включаючи фосфорилювання й лузі оцінить, що точна техніка очищення буде ваглікозилювання. ріювати залежно від природи поліпептиду або Виділення експресованого поліпептиду білка, що підлягає очистці, природи клітин, із яких Зазвичай, як правило, буде бажано виділяти ескспресується поліпептид або білок, і складу сей/або очищувати білки або поліпептиди, що ексредовища, у якому були вирощені клітини. пресуються відповідно до даного винаходу. В опФармацевтичні композиції тимальному варіанті втілення, експресований поВ певних оптимальних варіантах втілення виліпептид або білок секретується у середовище, і, находу, вироблені поліпептиди або білки будуть таким чином, наприклад, шляхом центрифугуванмати фармакологічну активність і будуть корисниня або фільтрування, можуть бути вилучені клітими для приготування фармацевтичних препаратів. ни й інші тверді частки, як перший крок у процесі Сполуки відповідно до винаходу, що описані вище, очищення. Цей варіант втілення особливо корисможна вводити суб'єктові або можна спочатку приний при використанні відповідно до даного винаготувати у лікарській формі для доставлення будьходу, тому що способи й композиції, описані автояким доступним шляхом, включаючи, крім інших, рами, призводять до збільшення життєздатності парентеральний (наприклад, внутрішньовенний), клітин. Внаслідок цього, менше клітин вмирає провнутрішньошкірний, підшкірний, пероральний, натягом процесу культивування, і у середовище визальний, бронхіальний, офтальмічний, трансдервільняється менше протеолітичних ферментів, що мальний (місцевий), трансмукозальний, ректальпотенційно можуть зменшувати вихід експресований і вагінальний шляхи. Фармацевтичні ного поліпептиду або білка. композиції відповідно до винаходу, як правило, Альтернативно, експресований поліпептид або включають очищений поліпептид або білок, ексбілок зв'язується із поверхнею клітини-хояїна. У пресований із клітинної лінії ссавців, агент для цьому варіанті втілення, середовище видаляється, доставлення (тобто, катіонний полімер, пептидний а клітини-хазяїни, що експресують поліпептид або молекулярний транспортер, поверхнево-активна білок, розщеплюються як перший крок у процесі речовина, і т.д., як описано вище) у комбінації з очищення. Лізис ссавцевих клітин-хазяїнів можна фармацевтично прийнятним носієм. Вжитий автодосягти за допомогою низки засобів, добре відорами термін "фармацевтично прийнятний носій" мих звичайним спеціалістам в даній галузі, вклювключає розчинники, дисперсійні середовища, чаючи фізичне руйнування скляними кільками і дію покриття, протибактеріальні та протигрибкові зависоких рН. соби, ізотонічні агенти і засоби для затримки всмоПоліпептид або білок можуть бути виділені й ктування, і т.п., сумісні з фармацевтичним введеночищені стандартними способами, включаючи, ням. В композиції можуть також бути включені крім інших, хроматографію (наприклад, іоннообдодаткові активні сполуки. мінну, афінну, ексклюзійну і гідроксиапатитну хроФармацевтичну композицію готують у вигляді матографію), гель-фільтрацію, центрифугування лікарської форми таким чином, щоб вона була або різницю в розчинності, осадження етанолом, сумісною з наміченим шляхом введення. Розчини або за допомогою будь-яких інших наявних спосоабо суспензії, що використовуються для парентебів для очищення білків (Див., наприклад, Scopes, рального, внутрішньошкірного або підшкірного Protein Purification Principles and Practice 2nd застосування можуть включати нижченаведені Edition, Springer-Verlag, New York, 1987; Higgins, компоненти: стерильний розчинник, такий як вода 41 89383 42 для ін'єкцій, фізіологічний розчин, фіксовані олії, лежать вакуумне висушування й сушіння поліетиленгліколі, гліцерин, пропіленгліколь або сублімацією, що дає можливість отримати пороінші синтетичні розчинники; протибактеріальні зашок активного компонента плюс будь-який додатсоби, такі як бензиловий спирт або метилпарабековий бажаний компонент із попередньо стерильни; антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота або но-відфільтрованого розчину. натрію дисульфіт; хелатуючі агенти, такі як етилеПероральні композиції, зазвичай, включають ндиамінтетраоцтова кислота; буфери, такі як ацеінертний розчинник або харчовий носій. Для перотати, цитрати або фосфати і засоби для коригурального терапевтичного введення очищений повання тонічності, такі як натрію хлорид або ліпептид або білок можуть бути поєднані з допомідекстроза. рН може бути відкоригований за допожними речовинами й використовуватися у вигляді могою кислот або основ, таких як натрію гідроксид таблеток, драже або капсул, наприклад, желатиабо хлористоводнева кислота. Препарати для панових капсул. Пероральні композиції можуть також рентерального застосування можуть бути розфабути приготовані з використанням рідкого носія совані в ампули, одноразові шприци або флакони для застосування у вигляді рідини для полоскання з кількома дозами, виготовлені зі скла або пластрота. У якості складової частини композиції момаси. жуть бути включені фармацевтично сумісні агенти До фармацевтичних композицій, що підходять зв'язування і/або допоміжні матеріали. Таблетки, для ін'єкційного використання, як правило, налепігулки, капсули, драже й т.п. можуть містити будьжать стерильні водні розчини (у випадку водорозякий з нижченаведених компонентів або сполук чинних речовин) або дисперсії й стерильні порошподібної природи: зв'язуючий засіб, такий як мікроки для екстемпорального приготування кристалічна целюлоза, трагакантова камідь або стерильних ін'єкційних розчинів або дисперсії. У желатин; наповнювач, такий як крохмаль або лаквипадку внутрішньовенного введення прийнятні тоза, дезінтегруючий агент, такий як альгінова киносії включають фізіологічний розчин, бактеріостаслота, Примогель (Primogel)або зерновий крохмаль; любрикант, такий як магнію стеарат або тичну воду, Cremophor ELÔ (BASF, Parsippany, NJ) Sterotes; глідант, такий як колоїдний кремнію діокабо фосфатний буферний розчин (PBS). У всіх сид; підсолоджувач, такий як сахароза або сахавипадках, композиція повинна бути стерильною і рин; або ароматизатор, такий як м'ята, метилсаліповинна бути рідкою до того ступеня, щоб легко цилат або помаранчевий ароматизатор. У вводитися шприцем. Оптимальні фармацевтичні композиціях для перорального введення можуть композиції є стабільними за умов виготовлення й вигідно застосовуватись засоби для поліпшення зберігання й повинні оберігатися від контамінації стабільності усередині шлунково-кишкового тракту мікроорганізмами, такими як бактерії та гриби. й/або збільшення всмоктування. Зазвичай, відповідний носій може бути розчинниДля введення шляхом інгаляції композиції відком або дисперсійним середовищем, що містить, повідно до винаходу, що містять очищений полінаприклад, воду, етанол, поліол (наприклад, гліпептид або білок, експресований із клітинної лінії церин, пропіленгліколь і рідкий поліетиленгліколь, і ссавців й агента для доставлення, в оптимальному т.п.) та їх прийнятними сумішами. Належна текуваріанті доставляються у вигляді аерозолю з упачість може підтримуватися, наприклад, за допомоковок під тиском або розпилювача, з застосувангою покриття, такого як лецитин, шляхом підтриням прийнятного витискувача, наприклад, газу, мування необхідного розміру часток у випадку такого як вуглекислий газ, або розпилювача. Дадисперсії й шляхом використання поверхневоний винахід, зокрема, охоплює доставлення споактивних речовин. Запобігання контамінації мікролук, використовуючи назальний спрей, інгалятор організмами можна досягнути за допомогою різних або інше пряме доставлення до верхніх й/або нипротибактеріальних й протигрибкових засобів, жніх дихальних шляхів. Внутрішньоназальне ввенаприклад, парабенів, хлорбутанолу, фенолу, асдення ДНК вакцин, спрямованих проти вірусів грикорбінової кислоти, тимерозалу, і т.п.. У багатьох пу, як було показано, індукує відповіді CD8 Τ випадках, буде бажаним включити в композицію клітин, що вказує на те, що принаймні деякі клітиізотонічні агенти, наприклад, цукор, багатоатомні ни в дихальних шляхах можуть поглинати ДНК при спирти, такі як манітол, сорбітол або натрію хлодоставленні цим шляхом, і агенти для доставленрид. Пролонгованої адсорбції ін'єкційних композиня відповідно до винаходу збільшать клітинне поцій можна досягти шляхом включенням до її склаглинання. Відповідно до певних варіантів втілення ду агента, що затримує всмоктування, наприклад, винаходу композиції, що містять очищений поліпеалюмінію моностеарату і желатину. птид, експресований із клітинної лінії ссавців й Стерильні ін'єкційні розчини можуть готуватиагент для доставлення, готуються у вигляді велися шляхом введення очищеного поліпептиду або ких пористих часток для аерозольного введення. білка у необхідній кількості у відповідний розчинСистемне введення може також здійснюватися ник з одним або комбінацією перелічених вище трансмукозальним або трансдермальним шляхом. компонентів, у разі потреби, після чого проводитьДля трансмукозального або трансдермального ся фільтрована стерилізація. Зазвичай, дисперсії введення у композиції використовуються проникаготують шляхом введення очищеного поліпептиду ючі засоби у відповідності із бар'єром, через який або білка, що експресується із клітинної лінії ссавнеобхідно проникнути. Такі проникаючі засоби є ців, в стерильний носій, що містить основне дисзагальновідомими в даній галузі, і включають, наперсійне середовище й інші необхідні компоненти приклад, для трансмукозального введення, детеріз перелічених вище. У випадку стерильних порогенти, жовчні солі і похідні фусидової кислоти. шків для приготування стерильних ін'єкційних розТрансмукозального введення можна досягнути за чинів до оптимальних способів приготування на 43 89383 44 допомогою назальних спреїв або супозиторіїв. Для тваринного суб'єкта може залежати від різних фатрансдермального введення, очищений поліпепкторів, включаючи активність певного поліпептиду тид або білок і агенти для доставлення готують у або білка, що застосовується, вік, масу тіла, загавигляді мазей, бальзамів, гелей або кремів, які є льний стан здоров'я, стать і раціон харчування загальновідомими в даній галузі. суб'єкта, час введення, шлях введення, швидкість Композиції можуть також бути приготовані у екскреції, будь-яку комбінацію препаратів і ступінь формі супозиторіїв (наприклад, зі звичайними осекспресії або активності, що буде змодульована. новами для супозиторіїв, такими як какаомасло й Даний винахід включає використання компоінші гліцериди) або утримуючих клізм для ректазицій відповідно до винаходу для лікування нельного застосування. свійських тварин. Відповідно, дози й способи ввеВ одному варіанті втілення композиції готують дення можуть бути відібрані відповідно до відомих з носіями, які захистять поліпептид або білок від принципів ветеринарної фармакології й медицини. швидкого виведення з організму, такі як лікарські Керівні принципи можна знайти, наприклад, в форми з контрольованим вивільненням, включаюAdams, R. (ed.), Veterinary Pharmacology and чи імплантати й мікроінкапсульовані системи для Therapeutics, 8th edition, Iowa State University Press; доставлення. Можуть використовуватися біологічISBN: 0813817439; 2001. но сумісні полімери, що розкладаються мікрооргаФармацевтичні композиції відповідно до винанізмами, такі як етиленвінілацетат, поліангідриди, ходу можуть бути включені в контейнер, пакування полігліколева кислота, колаген, поліортоестери і або розподіляючий пристрій разом з інструкціями полімолочна кислота. Способи для підготовки тадля застосування. ких лікарських форм будуть очевидні для спеціаліПредставлений вище опис є пояснювальним і ста, кваліфікованого в даній галузі. Матеріали можодним чином не обмежує обсяг винаходу. Альтежуть також бути отримані комерційно від Alza рнативні методи й матеріали для втілення винахоCorporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. Ліпосоду, а також додаткові заявки будуть очевидними мальні суспензії (включаючи ліпосоми, спрямовані до спеціаліста в даній галузі, і призначені для на інфіковані клітини з моноклональними антитівключення у межах супровідної формули винахолами до вірусних антигенів) можуть також викориду. стовуватися у якості фармацевтично прийнятних Приклади носіїв. Вони можуть бути приготовлені відповідно Приклад 1: Удосконалене середовище 1 для до способів, відомих спеціалістам, кваліфікованим підживлюваного процесу анти-GDF-8 у даній галузі, наприклад, як описано в Патенті Традиційні підживлювані процеси для культиСША №4522811. вування клітинних ліній мають кілька недоліків, Вигідно готувати пероральні або парентеральвключаючи час і зусилля, необхідні для введення ні композиції у формі одиниці дозування для проспідживлень і потребу в спеціальному устаткуванні тоти введення й однорідності дозування. Термін у великомасштабних біореакторах. Мета полягала «форма одиниці дозування», вжитий авторами, у розробці серійних середовищ для виробництва стосується фізично дискретних одиниць, які відпобілків, що розглядаються, у великомасштабних відають одиничним дозуванням для суб'єкта, що біореакторах, що потребує мінімального підживпідлягає лікуванню; кожна одиниця, що містить лення. попередньо визначену кількість активного поліпепМатеріали й методи тиду або білка в кількості, з розрахунку для досягШтами й середовища: клітини яєчника китайнення бажаного терапевтичного ефекту у комбінаського хом'яка ("СНО"), були модифіковані генною ції з необхідним фармацевтичним носієм. інженерією для експресії моноклонального антитіПоліпептид або білок, експресований відповіла проти фактора росту й диференціювання 8 дно до даного винаходу можна вводити в різні ін("анти-GDF-S клітини") (див. Veldman et al., тервали і упродовж різних проміжків часу, як поNeutralizing Antibodies Against GDF-8 and Uses трібно, наприклад, один раз на тиждень упродовж Therefor, US20040142382 А1). Клітини анти-GDF-8 приблизно від 1 до 10 тижнів, від 2 до 8 тижнів, використовувалися для випробування нових сеприблизно від 3 до 7 тижнів, приблизно 4, 5, або 6 рійних середовищ. Середовище 1 і Середовище 2 тижнів, і т.д. Кваліфікований спеціаліст оцінить, що порівнювали на їхні здатності підтримувати високу певні фактори можуть впливати на дозування й щільність й життєздатність клітин. Композиції цих вибір часу, що необхідні для ефективного лікувансередовищ, а також Середовища 3 перелічені в ня суб'єкта, включаючи, крім інших, ступінь тяжкоТаблиці 1. Середовища готують шляхом додавансті хвороби або розладу, попереднє лікування, ня всіх компонентів, за винятком FeSО4·7Н2O. Пісзагальний стан здоров'я й/або вік суб'єкта та інші ля цього середовища доводять до рН 7.25, фіксунаявні хвороби. Зазвичай, лікування суб'єкта за ють осмолярність і після цього додають допомогою поліпептиду або білку, як описано авFeSО4·7Н2O. торами, може включати окреме лікування або, у Умови культивування: Для експериментів в багатьох випадках, може включати низку схем ліколбах, клітини анти-GDF-8 вирощували у колбах кування. Крім того зрозуміло, що відповідні дози струшування й пропускали три рази. Для експериможуть залежати від сили дії поліпептиду або білментів в біореакторі клітини анти-GDF-8 вирощука й можуть бути довільно пристосовані до конкревали упродовж 12 днів, щодня постачали 2% за тного реципієнта, наприклад, шляхом введення об'ємом 20Х середовища для підживлення Середоз, що збільшуються, до досягнення попередньо довища 4 (Таблиця 3) або 3% за об'ємом 16Х Севстановленої бажаної відповіді. Вважається, що редовища 4 (Таблиця 4) після дня 5. Протягом певний рівень дози для будь-якого конкретного 45 89383 46 перших 4 днів клітини вирощували при 37°С. На Аналіз зразків: Щоденні зразки відбирали із день 5 температуру замінили на 31°С. культур і аналізували на рівні амінокислот, вітамінів, заліза, фосфату, глюкози й глутаміну. 47 89383 48 49 Результати й висновки Фігура 1 показує, що темп росту клітин airraGDF-8 був подібний і в Середовищі 1, і в Середовищі 2 в експериментах у колбах. Фігура 2 показує, що в бїореакторах, Середовище 1 показало істотне збільшення кінцевої щільності й життєздатності клітин у порівнянні з Середовищем 3. Кінцевий титр також значно збільшився, від 551мг/л для платформного процесу до 976мг/л із Середовищем 1 (дані не показані). Температура була замінена із 37°С на 31°С у день 5. Через несподіваний високий ріст клітин, культури підживлювали щодня після дня 5 або за допомогою 2% за об'ємом 20Х Середовища 4 або за допомогою 3% за об'ємом 16Х Середовища 4. Таким чином, це не справжній серійний експеримент, як спочатку планувалося. Аспарагін і тіамін додавались в середовища для підживлення, починаючи з дня 10. При розробці концентрованих серійних середовищ потрібно розглянути кілька можливих проблем. По-перше, концентровані поживні речовини могли б виявитися токсичними для клітин. У середовищах, розроблених у цьому Прикладі, всі поживні речовини й компоненти, як визначено, були нижче меж токсичності (дані не показані). По-друге, концентровані серійні середовища обов'язково мають більш високу осмолярність ніж неконцентровані середовища, що як показано, чинить шкідливий вплив на ріст й життєздатність клітин. Цю проблему можна усунути шляхом зниження кількості NaCl у початкових середовищах. Крім того, концентровані серійні середовища містять недостатні рівні глюкози для підтримки росту 89383 50 упродовж усього періоду культивування. Таким чином, культури постачали щодня після дня 5 підживленням у вигляді глюкози. По-третє, інсулін і глутамін сприйнятливі до деградації протягом 12-денного періоду культивування. Таким чином, культура постачалась цими компонентами на додаток до глюкози. Нарешті, залізо осаджується із розчину, що містить високі концентрації фосфату при високому рН. Цю проблему можна усунути шляхом додавання заліза наприкінці процесу приготування середовища, після коригування рН до відповідного рівня. Приклад 2: Розробка концентрованого середовища для підживлення (Середовища 5) для клітин анти-GDF-8 у підживлюваному процесі. У Прикладі 1 був розроблений серійний процес для культивування клітин анти-GDF-8 з використанням Середовища 1. Через високу щільність клітин, що спостерігалася протягом процесу, було визначено, що постачання поживними речовинами на додаток до глюкози й глутаміну, все ще є вигідним. Однак, підживлення серії за допомогою 8Х середовища для підживлення Середовища 4 призвело б до надмірного розведення культури. Щоб обійти цю проблему, були розроблені більше концентровані середовища для підживлення. Матеріали й методи та результати В Таблиці 2 зазначається склад Середовища 4А-1, Середовища 4В, Мікроелементи В і Мікроелементи D, що використовуються у композиціях Таблиць 3-7. 51 89383 52 53 20X Середовище 4. Перші концентровані середовища були розроблені як 20ХСередовище 4. Композиція сере 89383 54 довищ для 20Х Середовища 4 надається в Таблиці 3. 55 89383 56 Примітка: NucellinÔ виготовляється компанією Eli Lilly (Індіанаполіс, IN, США); вихідний розчин Γ/Π=0,036мг/мл гідрокортизону, 1,08мг/мл путресцину·2НСІ. Композиція середовищ складається з 3 частин: І, II, III. Перша частина - концентрована версія 8ХСередовища 4 з індивідуальними компонентами Середовища 4В, окрім фолієвої кислоти через проблеми з розчинністю цього вітаміну. Друга частина - вихідний розчин заліза, Мікроелементи D і кислотний цистеїн, для уникнення можливого осадження заліза при додаванні в частину І. Частина III - вихідний розчин фолієвої кислоти. Частина І додається 2% за об'ємом щодня, починаючи з дня 5, а частини II й III додаються один раз у день 5 разом з частиною І. Кінцеве значення рН середовищ для підживлення було доведене до 7.0, а осмолярність становила приблизно 1064мОсм. 2% підживлення призведе до зростання глюкози на 2г/л, глутаміну на 2мМ і осмолярності на 14мОсм для культури. 2.16X Середовище 4. Для зменшення зростання осмолярності середовища для підживлення змінили із 20Х Середовища 4 (2% за об'ємом щодня) до 16ХСередовища 4 (3% за об'ємом щодня). Композиція середовищ для 16Х Середовища 4 надається в Таблиці 4. 57 89383 58 Примітка: NucellinÔ виготовляється компанією Eli Lilly (Індіанаполіс, IN, США); вихідний розчин Г/П=0,036мг/мл гідрокортизону, 1,08мг/мл путресцину·2НСІ. У цьому модифікованому 16Х Середовищі 4 також усунули глюкозу з метою подальшого зменшення осмолярності і надання певної гнучкості підживлення глюкозою. Сумарна осмолярність середовищ для підживлення тепер становить 295мОсм. 3.16Х Середовище 4. В композицію 16Х Середовища 4 були внесе ні зміни. В підживлення додавали вихідний розчин заліза, що призвело до добавки 0,45мкМ з кожним підживленням. Крім цього, знову додали глюкозу, щоб надавати 1,5г/л з кожним підживленням. Композиція середовищ для цього модифікованого 16Х Середовища 4 надається в Таблиці 5. Примітка: NucellinÔ виготовляється компанією Eli Lilly (Індіанаполіс, IN, 59 89383 60 США); вихідний розчин Γ/Π=0,036мг/мл гідрокортизону, 1,08мг/мл путресцину·2НСІ. 4. 16Х Середовище 4. У цьому випадку, середовища для підживлення (16Х Середовище 4) були зроблені в комбінованих середовищах замість 3 окремих підживлень як в останніх кількох серіях. Були проведені тести, щоб гарантувати, що фолієва кислота може бути розчинена при необхідній концентрації й, що ні залізо, ні фолієва кислота не випадуть в осад з розчину після зберігання або при 4°С, або при кімнатній температурі упродовж 6 днів. Композиція середовищ для комбінованого 16Х Середовища 4 надається в Таблиці 6. Кінцева осмолярність середовищ становить 724мОсм, із щоденним додаванням глюкози у кількості 2г/л і додаванням глутаміну у кількості 1,5мМ. 5. 12Х Середовище 4. У цьому випадку, кілька змін були внесені у середовища для підживлення. Використовувався порошок Середовища 4В замість додавання кожного індивідуального компоненту в Середовище 4В. Порошок Середовища 4В змішували із глюко зою й розчиняли окремо за основних умов, титруючи розчин рН 10,25. Додавали додатковий аспарагін і тіамін, оскільки результати аналізів на амінокислоти і вітаміни показали, що ці два компоненти були вичерпані до кінця підживлюваного процесу. Використання 12Х Середовища 4 додатково зменшило зростання осмолярності при підживленні культури. Композиція середовищ для 12Х Середовища 4 надається в Таблиці 7.