Продукування каротиноїдів у оліїстих дріжджах і грибах

1. Рекомбінантний гриб, який характеризується тим, що: a) гриб є оліїстим, тобто він може накопичувати ліпід принаймні до 20 % його сухої клітинної маси; і b) гриб продукує принаймні один каротиноїд, і може накопичувати продукований каротиноїд принаймні до приблизно 1 % його сухої клітинної маси; причому гриб включає принаймні одну модифікацію, відібрану із групи, що складається з каротино 2 (19) 1 3 16. Гриб за будь-яким із пунктів 10-13, причому принаймні одна олеагенна модифікація збільшує експресію або активність принаймні одного олеагенного поліпептида і знижує експресію або активність принаймні одного олеагенного поліпептида. 17. Гриб за пунктом 11, причому гриб належить до виду Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffla rhodozyma). 18. Гриб за пунктом 11, причому гриб належить до виду Saccharomyces cerevisae. 19. Гриб за пунктом 14 або 15, причому принаймні один олеагенний поліпептид, відібраний із групи, що складається з поліпептиду ацетил-СоА карбоксилази, поліпептиду піруватдекарбоксилази, поліпептиду ізоцитратдегідрогенази, поліпептиду АТРцитратліази, поліпептиду яблучного ферменту, поліпептиду AMP деамінази і їх комбінації. 20. Гриб за пунктом 14 або 15, причому принаймні один олеагенний поліпептид являє собою принаймні один поліпептид, відібраний із групи, що складається із поліпептида в будь-якій із Таблиць 1-6. 21. Гриб за будь-яким із пунктів 14-16, причому принаймні одна олеагенна модифікація включає експресію принаймні одного гетерологічного олеагенного поліпептиду в грибі. 22. Гриб за пунктом 21, причому принаймні одна олеагенна модифікація включає експресію принаймні одного гетерологічного гена, що кодує принаймні один гетерологічний олеагенний поліпептид. 23. Гриб за пунктом 21, причому принаймні один гетерологічний олеагенний поліпептид включає тваринний поліпептид, ссавцевий поліпептид, поліпептид комахи, рослинний поліпептид, грибковий поліпептид, поліпептид дріжджів, водоростевий поліпептид, бактеріальний поліпептид, ціанобактеріальний поліпептид, архебактеріальний поліпептид або протозойний поліпептид. 24. Гриб за пунктом 21, причому принаймні один гетерологічний олеагенний поліпептид включає принаймні два гетерологічних олеагенних поліпептида. 25. Гриб за пунктом 24, причому принаймні два гетерологічних олеагенних поліпептида походять від єдиного вихідного організму. 26. Гриб за пунктом 24, причому принаймні два гетерологічних олеагенних поліпептида походять принаймні від двох різних вихідних організмів. 27. Гриб за будь-яким із пунктів 1-9, причому гриб містить принаймні одну каротиногенну модифікацію. 28. Гриб за пунктом 27, причому принаймні одна каротиногенна модифікація надає грибу здатність продукувати принаймні один каротиноїд до рівня, що становить принаймні приблизно 1 % його сухої клітинної маси. 29. Гриб за пунктом 27, причому принаймні одна каротиногенна модифікація надає грибу здатність продукувати принаймні один каротиноїд, який гриб природно не продукує. 30. Гриб за пунктом 27, причому гриб додатково включає принаймні одну олеагенну модифікацію, причому олеагенна модифікація змінює олеагенність гриба або надає грибу олеагенність. 94038 4 31. Гриб за будь-яким із пунктів 27-30, причому принаймні одна каротиногенна модифікація надає грибу здатність продукувати принаймні один каротиноїд до рівня, що вибирається із групи, що складається принаймні із приблизно 2 %, принаймні приблизно 3 %, принаймні приблизно 5 % і принаймні приблизно 10 % сухої клітинної маси гриба. 32. Гриб за будь-яким із пунктів 27-31, причому принаймні один каротиноїд вибирається із групи, що складається з астаксантину, β-каротину, кантаксантину, зеаксантину, лютеїну, лікопіну і їх комбінацій. 33. Гриб за будь-яким із пунктів 27-31, причому принаймні один каротиноїд є переважно астаксантином. 34. Гриб за будь-яким із пунктів 27-31, причому принаймні одна каротиногенна модифікація збільшує експресію або активність каротиногенного поліпептиду. 35. Гриб за будь-яким із пунктів 27-31, причому принаймні одна каротиногенна модифікація знижує експресію або активність каротиногенного поліпептиду. 36. Гриб за будь-яким із пунктів 27-31, причому принаймні одна каротиногенна модифікація збільшує експресію або активність принаймні одного каротиногенного поліпептиду й знижує експресію або активність принаймні одного іншого каротиногенного поліпептиду. 37. Гриб за будь-яким із пунктів 34-36, причому принаймні одна каротиногенна модифікація включає експресію принаймні одного гетерологічного каротиногенного поліпептиду. 38. Гриб за пунктом 37, причому принаймні одна каротиногенна модифікація включає експресію принаймні одного гетерологічного гена, що кодує принаймні один гетерологічний каротиногенний поліпептид. 39. Гриб за пунктом 34 або 35, причому каротиногенний поліпептид вибирається із групи, що складається з: поліпептидів біосинтезу ізопреноїдів, поліпептидів біосинтезу каротиноїдів, конкурентних поліпептидів біосинтезу ізопреноїдів і їх комбінацій. 40. Гриб за пунктом 39, причому поліпептиди біосинтезу ізопреноїдів вибираються із групи, що складається з: поліпептиду ацетоацетил-СоА тіолази, поліпептиду HMG-СоА синтази, поліпептиду HMG-CoA редуктази, поліпептиду мевалонаткінази, поліпептиду фосфомевалонаткінази, поліпептиду мевалонатпірофосфатдекарбоксилази, поліпептиду ІРР ізомерази, поліпептиду FPP синтази і поліпептиду GGPP синтази. 41. Гриб за пунктом 39, причому поліпептиди біосинтезу каротиноїдів вибираються із групи, що складається з: поліпептиду фітоенсинтази, поліпептиду фітоендегідрогенази, поліпептиду лікопінциклази, поліпептиду каротиноїдкетолази, поліпептиду каротиноїдгідроксилази, поліпептиду астаксантинсинтази, поліпептиду каротиноїдепсилонгідроксилази, поліпептиду каротиноїдглюкозилтрансферази, поліпептиди лікопінциклази (бета й епсилон субодиниці) і поліпептид ацил СоА: діацилгліцеринацилтрансферази. 5 42. Гриб за пунктом 39, причому конкурентні поліпептиди біосинтезу ізопреноїдів вибираються із групи, що складається з поліпептиду скваленсинтази, пренілдифосфатсинтази й РНВ поліпренілтрансферази. 43. Гриб за пунктом 39, причому каротиногенний поліпептид вибирається із групи, що складається з будь-якого із поліпептидів із Таблиць 7-25, Таблиці 29 і Таблиці 30 та їх комбінацій. 44. Гриб за пунктом 37, причому принаймні один гетерологічний каротиногенний поліпептид включає тваринний поліпептид, ссавцевий поліпептид, поліпептид комахи, рослинний поліпептид, грибковий поліпептид, поліпептид дріжджів, водоростевий поліпептид, бактеріальний поліпептид, ціанобактеріальний поліпептид, архебактеріальний поліпептид або протозойний поліпептид. 45. Гриб за пунктом 37, причому принаймні один гетерологічний каротиногенний поліпептид включає принаймні два гетерологічних каротиногенних поліпептида. 46. Гриб за пунктом 45, причому принаймні два гетерологічних каротиногенних поліпептида походять від єдиного вихідного організму. 47. Гриб за пунктом 45, причому принаймні два гетерологічних каротиногенних поліпептида походять від двох різних вихідних організмів. 48. Гриб за будь-яким із попередніх пунктів, причому гриб накопичує вироблений принаймні один каротиноїд до рівня, що вибирається із групи, що складається із: приблизно вище 1 %, приблизно вище 2 %, приблизно вище 3 %, приблизно вище 5 % і приблизно вище 10 % сухої клітинної маси гриба. 49. Гриб за будь-яким із попередніх пунктів, який характеризується тим, що гриб накопичує ліпід у вигляді цитоплазматичних тілець. 50. Гриб за пунктом 49, причому принаймні один каротиноїд накопичується в цитоплазматичних олійних тільцях. 51. Штам Yarrowia lipolytica, що включає одну або більше модифікацій, відібраних із групи, що складається з олеагенної модифікації, каротиногенної модифікації і їх комбінації, таким чином, що штам накопичує від 1 % до 10 % його сухої клітинної маси у вигляді принаймні одного каротиноїду. 52. Штам за пунктом 51, який додатково характеризується тим, що він накопичує від 20 % до 50 % його сухої клітинної маси у вигляді ліпіду. 53. Штам за пунктом 52, причому штам накопичує від 20 % до 50 % його сухої клітинної маси у вигляді ліпіду у формі цитоплазматичних олійних тілець. 54. Штам за пунктом 51, причому штам включає каротиногенну модифікацію, відібрану із групи, що складається з: a) експресії поліпептиду, відібраного із групи, що складається зі зрізаного ендогенного поліпептиду HMG СоА редуктази, що не містить Nтермінального трансмембранного домену, ацетоацетил-СоА тіолази, HMG-CoA синтази, FPP синтази і GGPP синтази; b) експресії гетерологічного поліпептиду, відібраного із групи, що складається з фітоенсинтази, 94038 6 фітоендесатурази, лікопінциклази, каротиноїдкетолази, каротиноїдгідроксилази і їх комбінацій; с) зниженої експресії або активності ендогенного поліпептиду, відібраного із групи, що складається з поліпептиду скваленсинтази, поліпептиду пренілдифосфатсинтази й поліпептиду РНВ поліпренілтрансферази; і їх комбінацій. 55. Штам за будь-яким із пунктів 51-54, причому штам накопичує 1-10 % його сухої клітинної маси у вигляді β-каротину. 56. Штам за пунктом 51, причому штама включає каротиногенну модифікацію, відібрану із групи, що складається із: a) експресії поліпептиду, відібраного із групи, що складається зі зрізаного ендогенного поліпептиду HMG СоА редуктази, що не містить Nтермінального трансмембранного домену, ацетоацетил-СоА тіолази, HMG-CoA синтази, FPP синтази і GGPP синтази; b) експресії гетерологічного поліпептиду, відібраного із групи, що складається з фітоенсинтази, фітоендесатурази, лікопінциклази, каротиноїдкетолази, каротиноїдгідроксилази, астаксантинсинтази, каротиноїдепсилонгідроксилази, лікопінциклази (бета й епсилон субодиниці), каротиноїдглюкозилтрансферази, ацил СоА: діацилгліцеринацилтрансферази і їх комбінацій; с) зниженої експресії або активності ендогенного поліпептиду скваленсинтази; і їх комбінацій. 57. Штам за будь-яким із пунктів 51-53 або 56, причому штам накопичує 1-10 % його сухої клітинної маси у вигляді астаксантину або лютеїну. 58. Спосіб продукування каротиноїду, що включає кроки: a) культивування гриба за будь-яким із попередніх пунктів за умов, що дозволяють виробництво каротиноїду; b) і виділення виробленого каротиноїду. 59. Спосіб за пунктом 58, причому крок виділення включає фракціонування середовища культивування для одержання принаймні однієї збагаченої каротиноїдом фракції. 60. Спосіб за пунктом 58, причому: крок культивування включає культивування гриба за умов, які дозволяють накопичувати каротиноїд в цитоплазматичних олійних тільцях; і крок виділення включає виділення олії, отриманої із цитоплазматичних олійних тілець. 61. Спосіб за пунктом 58, причому каротиноїд вибирається із групи, що складається з астаксантину, β-каротину, кантаксантину, зеаксантину, лютеїну, лікопіну і їх комбінацій. 62. Спосіб за пунктом 58, причому каротиноїд включає астаксантин. 63. Спосіб приготування харчової або кормової добавки, що містить каротиноїд, що включає кроки: a) культивування гриба за будь-яким із пунктів 157 за умов, які дозволяють виробництво каротиноїду; b) виділення каротиноїду; і с) комбінацію виділеного каротиноїду з одним або кільком іншими компонентами харчової або кормової добавки. 7 Споріднені заявки Ця заявка заявляє пріоритет Патентної заявки США № 60/663 621, поданої 18 березня 2005 року, зміст якої включено акторами шляхом посилання у повному обсязі. Передумови створення винаходу Каротиноїди - органічні пігменти, забарвлені у колір від жовтого до червоного, що продукуються в природі певними організмами, включаючи фотосинтетичні організми (наприклад, рослини, морські водорості, ціанобактерії), та деякими грибами. Каротиноїди зумовлюють помаранчевий колір моркви, а також рожевий у фламінго й лосося, та червоний в омарів і креветок. Проте тварини не можуть виробляти каротиноїди й повинні отримувати їх при харчуванні. Каротиноїдні пігменти (наприклад, β-каротин й астаксантин) використовуються промислово як компоненти для харчових й кормових добавок, виконуючи як харчову функцію, так й підвищуючи рівень прийнятності для споживача. Наприклад, астаксантин широко використовується в аквакультурі лосося для забезпечення помаранчевого забарвлення, притаманного їхнім диким родичам. Деякі каротиноїди також є попередниками вітаміну А. Крім того, каротиноїди мають антиоксидантні властивості, і можуть пропонувати різні переваги для здоров'я [див., наприклад, Jyonouchi et al., Nutr. Cancer 16:93, 1991; Giovannucci et al., J. Natl. Cancer Inst. 87:1767, 1995; Miki, Pure Appl. Chem 63:141, 1991; Chew et al., Anticancer Res. 19:1849, 1999; Wang et al., Antimicrob. Agents Chemother. 44:2452, 2000]. Деякі каротиноїди, такі як βкаротин, лікопін і лютеїн у даний час продаються як харчові добавки. В цілому, біологічні системи, які продукують каротиноїди, складні для промислового застосування та/або продукують сполуки на таких низьких рівнях, що комерційне масштабне виділення не є практичним. Таким чином, більшість каротиноїдів, що використовуються у промисловості, створені за допомогою хімічного синтезу. Існує потреба у поліпшенні біологічних систем, які продукують каротиноїди. У минулому були прикладені деякі зусилля, щоб генетично створити певні бактерії або гриби для продукування вищих рівнів каротиноїдів [див., наприклад, Misawa et al., J. Biotechnol. 59:169, 1998; Visser et al., FEMS Yeast Research 4:221, 2003]. Однак, необхідні удосконалені системи, які зроблять можливим створення вищих рівнів виробництва й більшу легкість виділення. Короткий опис винаходу Даний винахід пропонує удосконалені системи для біологічного виробництва каротиноїдів. В одному аспекті, винахід охоплює відкриття, яке полягає в тому, що бажано продукувати каротиноїди в оліїстих організмах. Не бажаючи обмежуватись будь-якою певною теорією, дані винахідники пропонують, щоб біологічні системи мали здатність накопичувати вищі рівні каротиноїдів, якщо сполуки ізольовані в ліпідних тільцях. Проте, незалежно від того, чи вищими є 94038 8 абсолютні рівні, каротиноїди, які накопичені в ліпідних тільцях в оліїстих організмах, легко виділяються шляхом ізоляції ліпідних тілець. Зважаючи на це, даний винахід пропонує оліїсті гриби (включаючи, наприклад, дріжджі або інші одноклітинні гриби), які продукують один або кілька каротиноїдів. Даний винахід також пропонує способи конструювання таких дріжджів і грибів, способи використання таких дріжджів і грибів для продукування каротиноїдів, і способи приготування композицій, що містять каротиноїди, таких як харчові або кормові добавки, або харчових добавок, використовуючи каротиноїди, продуковані в таких оліїстих дріжджах або грибах. Зокрема, даний винахід пропонує системи й способи для отримання дріжджів й грибів, що містять одну або кілька олеагенних та/або каротиногенних модифікацій, які збільшують олеагенність та/або змінюють їх здатність до продукування каротиноїдів в порівнянні з інакше ідентичними організмами, які не мають модифікації (ій). Даний винахід додатково охоплює загальне визнання того, що ліпід-акумулюючі системи є корисними для виробництва та/або виділення ліпофільних агентів (таких як, крім інших, ізопреноїди або отримані з ізопреноїдів сполуки). Таким чином, відповідно до даного винаходу, бажано створити організми для продукування таких ліпофільних агентів та/або для накопичення ліпіду. Різні інші аспекти даного винаходу будуть очевидними для звичайних спеціалістів в даній галузі з даного опису, включаючи формулу винаходу, що додається. Короткий опис Фігур Фігура 1A-1D зображує певні характерні каротиноїди. Фігура 2 зображує, як у цитозолі оліїстих організмів можуть бути накопичені достатні рівні ацетил-CoА й NADPH, щоб зробити можливим виробництво значних рівнів цитозольних ліпідів. Ферменти: 1, піруватдекарбоксилаза; 2, малатдегідрогеназа; 3, яблучний фермент; 4, піруватдегідрогеназа; 5, цитратсинтаза; 6, ATФцитратліаза; 7, цитрат/малаттранслоказа. Фігури 3А й 3B зображують мевалонатний шлях біосинтезу ізопреноїдів, що, як правило, функціонує в еукаріотах, включаючи гриби. Фігура 4 зображує немевалонатний шлях біосинтезу ізопреноїдів, також відомий як шлях DXP, що, як правило, функціонує в бактеріях й пластидах рослин. Фігура 5 зображує проміжні продукти в шляху біосинтезу ізопреноїдів і як вони потрапляють у біосинтетичні шляхи інших біомолекул, включаючи каротиноїди, а також некаротиноїдні сполуки, такі як стерини, стероїди і вітаміни, типу вітаміну Е або вітаміну K. Фігури 6A-6D ілюструють різні шляхи біосинтезу каротиноїдів. Фігура 6A висвітлює шляхи, що призводять до отримання різних циклічних і нециклічних ксантофілів; Фігура 6B 9 показує певні шляхи X dendrorhous, за якими отримують біциклічні і моноциклічні каротиноїди, включаючи aстаксантин; Фігура 6C показує перехресні шляхи для перетворення -каротину у будь-який з низки інших каротиноїдів, включаючи aстаксантин; Фігура 6D зображує можливі шляхи синтезу циклічних каротиноїдів і поширених рослинних й водорослевих ксантофілів із нейроспорену. Фігури 7A-7C показують вирівнювання певних характерних поліпептидів грибкової HMG-CoА редуктази. Як можна помітити, цим поліпептидам притаманна дуже висока ідентичність вздовж каталітичної ділянки, і вони також мають складні трансмембранні домени. У деяких варіантах втілення винаходу, ці трансмембранні домени зруйновані або вилучені таким чином, щоб, наприклад, можна було створити гіперактивну версію поліпептиду. Фігури 8A-8D зображують схематичні представлення плазмід, отриманих й докладно описаних в ілюстративних прикладах. Визначення Каротиногенна модифікація: вжитий авторами термін "каротиногенна модифікація" стосується модифікації організму-хазяїна, що регулює виробництво одного або кількох каротиноїдів, як описано авторами. Наприклад, каротиногенна модифікація може збільшити рівень виробництва одного або кількох каротиноїдів, і/або може змінити відносні рівні виробництва різних каротиноїдів. У принципі, каротиногенна модифікація винаходу може бути будь-якою хімічною, фізіологічною, генетичною або іншою модифікацією, що відповідним чином змінює виробництво одного або кількох каротиноїдів в організмі-хазяїні, що продукується цим організмом у порівнянні з рівнем, що продукується в інших відношеннях ідентичному організмі, який не підлягав тій же модифікації. Проте, у більшості варіантів втілення каротиногенна модифікація буде включати генетичну модифікацію, що, як правило, призводить до збільшення виробництва одного або кількох обраних каротиноїдів. У деяких варіантах втілення, обраний каротиноїд представляє собою один або кілька з астаксантину, β-каротину, кaнтaксaнтину, лютеїну, лікопіну, фітоену, зeaксaнтину, і/або модифікацій зeaксaнтину або aстaксaнтину (наприклад, глюкозиду, етерифікованого зeaксaнтину або aстaксaнтину). У деяких варіантах втілення, обраний каротиноїд представляє собою один або кілька з ксaнтофілів і/або їх модифікацій (наприклад, глюкозиду, етерифікованих ксaнтофілів). У певних варіантах втілення, обраний ксaнтофіл представляє собою обраний із групи, що складається з астаксантину, лютеїну, зеаксантину, лікопіну та їх модифікацій. У деяких варіантах втілення обраний каротиноїд представляє собою один або кілька з астаксантину, β-каротину, кантаксантину, лютеїну, лікопіну і зеаксантин та/або модифікацій зеаксантину або астаксантину. У деяких варіантах втілення каротиноїд представляє собою β-каротин. У деяких варіантах втілення обраний каротиноїд 94038 10 представляє собою астаксантин. У деяких варіантах втілення обраний каротиноїд представляє собою відмінний від β-каротину. Каротиногенний поліпептид: вжитий авторами термін "каротиногенний поліпептид" стосується будь-якого поліпептиду, що залучений у процес продукування каротиноїдів у клітині, і може включати поліпептиди, які залучені в процеси, відмінні від виробництва каротиноїдів, проте активність яких впливає на ступінь або рівень виробництва одного або кількох каротиноїдів, наприклад, шляхом зв’язуваня субстрату або реагенту, що використовується каротиноїдним поліпептидом, що безпосередньо залучений у виробництво каротиноїдів. Каротиногенні поліпептиди включають поліпептиди біосинтезу ізопреноїдів, поліпептиди біосинтезу каротиноїдів і конкурентні поліпептиди біосинтезу ізопреноїдів, оскільки ці терміни визначені авторами. Термін також охоплює поліпептиди, які можуть впливати на ступінь, до якого каротиноїди накопиченуються у ліпідних тільцях. Каротиноїд: в даній галузі вважається, що термін "каротиноїд" стосується структурно різноманітного класу пігментів, отриманих з проміжних продуктів ізопреноїдного шляху. Обов'язковий крок в біосинтезі каротиноїдів – це утворення фітоену із гeрaнілгeрaнілпірофосфату. Каротиноїди можуть бути нециклічними або циклічними, і можуть містити кисень або ні, отже термін каротиноїди включає як каротини, так і ксантофіли. В цілому, каротиноїди представляють собою вуглеводневі сполуки, що мають кон’югований поліенкарбоновий скелет, формально отриманий з п'ятивуглецевої сполуки IPP, включаючи тритерпени (C30 дiaпoкaрoтиноїди) і тетратерпени (C40 каротиноїди), а також як їх окиснені похідні та інші сполуки, які, наприклад, C35, C50, C60, C70, C80 у довжину або іншої довжини. Багато каротиноїдів мають сильні світлоабсорбуючі властивості й можуть за довжиною перевищувати C200. C30 дiaпoкaрoтиноїди, як правило, складаються із шести ізопреноїдних одиниць, поєднаних у такий спосіб, що ізопреноїдні одиниці розташовані зустрічно в центрі молекули таким чином, щоб дві центральних метильних групи знаходились у положенні 1, 6 одна відносно одної, а інші не кінцеві метильні групи перебували в положенні 1, 5 одна відносно одної. Такі C30 каротиноїди можуть бути формально отримані з нециклічної структури C30H42, що має довгий центральний ланцюг кон’югованих подвійних зв’язків, шляхом: (i) гідрогенізації (ii) дeгідрогенізації, (iii) циклізації, (iv) окиснення, (v) етерифікації/глікозилювання, або будь-якої комбінації цих процесів. C40 каротиноїди, як правило, складаються з восьми ізопреноїдних одиниць, поєднаних у такий спосіб, що ізопреноїдні одиниці розташовані зустрічно в центрі молекули таким чином, щоб дві центральних метильних групи знаходились у положенні 1, 6 одна відносно одної, а інші не кінцеві метильні групи перебували в положенні 1, 5 одна відносно одної. Такі C40 каротиноїди можуть бути формально отримані з нециклічної структури 11 С40Н56, що має довгий центральний ланцюг кон’югованих подвійних зв’язків, шляхом: (i) гідрогенізації (ii) дeгідрогенізації, (iii) циклізації, (iv) окиснення, (v) етерифікації/глікозилювання, або будь-якої комбінації цих процесів. Клас C40 каротиноїдів також включає певні сполуки, які є результатом перегрупувань вуглецевого скелету, або (формальним) видаленням частини цієї структури. В природі було ідентифіковано більш ніж 600 різних каротиноїдів; певні поширені каротиноїди зображені на Фігурі 1. До каротиноїдів належать, крім інших: aнтeрaксaнтин, aдoнiрaбiн, aдoнiксaнтин, астаксантин, кантаксантин, кaпсoрубрiн, β-криптоксaнтин, каротин, β-каротин, β,ψ-каротин, -каротин, ε-каротин, eхiнeнoн, 3гідроксиехіненон, 3'-гідроксиехіненон, -каротин, ψкаротин, 4-кетo--каротин, -каротин, криптоксантин, дeoксифлексіксантин, дiaтoксантин, 7,8-дидегідроастаксантин, дидегідролікопін, фукоксантин, фукоксантинол, ізорeніeрaтен, -ізорeніeрaтен, лaктукaксaнтин, лютеїн, лікопін, міксобактон, нeoксaнтин, нейрoспорен, гідроксинейрoспорен, перідинін, фітоен, рoдoпiн, родопіну глюкозид, 4-кeтoрубіксaнтин, сифонaксантин, сфероїден, сфероїденон, спiриллоксантин, тoрулен, 4-кeтoторулен, 3-гідрокси-4-кетo-торулен, урioлід, уріоліду ацетат, вioлaксантин, зеаксантину-диглюкозид, зеаксантин і C30 каротиноїди. Додатково, каротиноїдні композиції включають похідні цих молекул, які можуть включити гідрокси, метокси-, oкси-, епокси-, кaрбокси- або альдегідні функціональні групи. Крім того, включені каротиноїдні композиції включають естерні (наприклад, естер глюкозиду, естер жирної кислоти) і сульфатні похідні (наприклад, eтерифіковані ксантофіли). Поліпептид біосинтезу каротиноїдів: термін «поліпептид біосинтез каротиноїдів» стосується будь-якого поліпептиду, що залучений у синтез одного або кількох каротиноїдів. Щоб зазначити тільки деякі, до цих поліпептидів біосинтезу каротиноїдів належать, наприклад, поліпептиди фітоенсинтази, фітоендегідрогенази (або дeсатурази), лікопінциклази, каротиноїдкетолази, каротиноїдгідроксилази, астаксантинсинтази, каротиноїдепсилонгідроксилази, лікопінциклази (бета й епсилон субодиниць), каротиноїдглюкозилтрансферази і ацил CoА:дiaцигліцеринацилтрансферази. Характерні приклади поліпептидних послідовностей біосинтезу каротиноїдів представлені в Таблицях 17-25. Ген: вжитий авторами термін «ген» зазвичай стосується нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, довільно включаючи певні регулюючі елементи, які можуть впливати на експресію одного або кількох генних продуктів (тобто, РНК або білка). Гетерологічний: вжитий авторами термін «гетерологічний» стосується генів або поліпептидів, стосується гену або поліпептиду, що в природі не зустрічається в організмі, у якому він експресується. Вважатиметься, що, в цілому, при виборі гетерологічного гену або поліпептиду для 94038 12 введення в клітину-хазяїна та/або еспресії клітиною-хазяїном, певний конкретний вихідний організм, з якого можуть бути обрані гетерологічний ген або поліпептид, немає суттєвого значення для практичного втілення даного винаходу. Розгляди з цього приводу можуть включати, наприклад, наскільки близько споріднені потенційний вихідний організм і організм-хазяїн в еволюції, або як споріднений вихідний організм з іншими вихідними організмами, з яких були відібрані послідовності інших відповідних поліпептидів. Клітина-хазяїн: вжитий авторами термін «клітина-хазяїн» представляє собою дріжджову або грибкову клітину, що підлягає маніпуляціям відповідно до даного винаходу для накопичення ліпіду та/або експресії одного або кількох каротиноїдів, як описано авторами. Вжитий авторами термін «модифікована клітина-хазяїн» представляє собою клітину-хазяїна, що містить принаймні одну олеагенну модифікацію та/або принаймні одну каротиногенну модифікацію відповідно до даного винаходу. Виділений: вжитий авторами термін «виділений» означає, що виділений об’єкт був відокремлений принаймні від одного компонента, з яким він був попередньо зв'язаний. При вилученні більшості інших компонентів, виділений об’єкт є «очищеним». Виділення та/або очистка можуть бути виконані за допомогою будьяких методів, відомих в галузі, включаючи, наприклад, фракціонування, екстракцію, преципітацію або інше розділення. Конкурентний поліпептид біосинтезу ізопреноїдів: вжитий авторами термін «конкурентний поліпептид біосинтезу ізопреноїдів» стосуться поліпептиду, експресія якого в клітині знижує рівень геранілгеранілдифосфату (GGPP), наявний для входження в шлях біосинтезу каротиноїдів. Наприклад, конкурентні поліпептиди біосинтезу ізопреноїдів включають ензими, які діють на проміжні продукти ізопреноїдів до GGPP, таким чином, що утворюється менше GGPP (див., наприклад, Фігуру 5). Скваленсинтаза представляє собою усього лише один конкурентний поліпептид біосинтезу ізопреноїдів відповідно до даного винаходу; характерні послідовності скваленсинтази представлені в Таблиці 16. Ферменти фенілдифосфатсинтаза та парагідроксибензоат (PHB) поліпренілтрансферази також представляють собою додаткові конкурентні поліпептиди біосинтезу ізопреноїдів відповідно до даного винаходу; характерні поліпептиди ферментів фенілдифосфатсинтази й PHB поліпренілтрансферази представлені в Таблиці 29 й 30 відповідно. Поліпептид біосинтезу ізопреноїдів: термін «поліпептид біосинтезу ізопреноїдів» стосується будь-якого поліпептиду, що залучений у синтез ізопреноїдів. Наприклад, як обговорюється авторами, ацетoaцетил-CoА тіолаза, HMG-CoА синтаза, HMG-CoА редуктаза, мевалонаткіназа, фосфомевалонаткіназа, мевалонатпірофосфатдекарбоксилаза, IPP ізомераза, FPP синтаза і GGPP синтаза залучені в 13 мевалонатний шлях для біосинтезу ізопреноїдів. Кожний із цих білків також представляє собою поліпептид біосинтезу ізопреноїдів для цілей даного винаходу, а послідовності характерних прикладів цих ферментів представлені в Таблицях 7-15. Ізопреноїдний шлях: в даній галузі вважається, що термін «ізопреноїдний шлях» стосується метаболічного шляху, що або продукує, або використовує п'ятивуглецевий метаболіт iзопентилпірофосфат (IPP). Як обговорюється авторами, два різних шляхи можуть продукувати загальний попередник ізопреноїдів IPP – «мевалонатний шлях» й «немевалонатний шлях». Термін «ізопреноїдний шлях» є досить загальним, щоб охоплювати обидва типи цих шляхів. Біосинтез ізопреноїдів із IPP відбувається шляхом полімеризації кількох п'ятивуглецевих ізопренових субодиниць. Метаболіти ізопреноїдів, отримані з IPP, мають різний розмір і хімічну структуру, включаючи циклічні й нециклічні молекули. До метаболітів ізопреноїдів належать, крім інших, монотерпени, сесквітерпени, дитерпени, стерини і поліпреноли, такі як каротиноїди. Олеагенна модифікація: вжитий авторами термін «олеагенна модифікація» стосується модифікації організму-хазяїна, що регулює бажану олеагенність цього організму-хазяїна, як описано авторами. У деяких випадках, організм-хазяїн вже буде оліїстим, тобто від буде мати здатність накопичувати ліпід принаймні до приблизно 20 % його сухої клітинної маси. Проте може бути бажано застосувати олеагенну модифікацію до такого організму, відповідно до даного винаходу, наприклад, для збільшення (або, у деяких випадках, можливо для зменшення) його загального накопичення ліпідів, або для регулювання типів або кількостей одного або кількох певних ліпідів, які він накопичує (наприклад, для збільшення відносного накопичення триацилгліцерину). В інших випадках, організм-хазяїн може бути не оліїстим (хоча може містити деякі ферментативні й регулюючі компоненти, що використовуються в інших організмах для накопичення ліпіду), і може потребувати олеагенної модифікації для того, щоб стати оліїстим відповідно до даного винаходу. Даний винахід також розглядає застосування олеагенної модифікації до не оліїстих штамів хазяїна таким чином, що їх олеагенність збільшується навіть у тому випадку, що, навіть будучи модифікованими, вони можуть не бути оліїстими, як визначено авторами. У принципі, олеагенна модифікація може представляти собою будь-яку хімічну, фізіологічну, генетичну або іншу модифікацію, що відповідно змінює олеагенність організму-хазяїна в порівнянні з ідентичним у інших відношеннях організмом, що не підлягає олеагенній модифікації. Проте, у більшості варіантів втілення олеагенна модифікація буде включати генетичну модифікацію, що, як правило, призводить до збільшення виробництва та/або активності одного або кількох олеагенних поліпептидів. У деяких варіантах втілення, олеагенна модифікація включає принаймні одну 94038 14 хімічну, фізіологічну, генетичну або іншу модифікацію; в інших варіантах втілення, олеагенна модифікація включає більш ніж одну хімічну, фізіологічну, генетичну або іншу модифікацію. У певних аспектах при застосуванні більш ніж однієї модифікації, такі модифікації можуть включати будь-яку комбінацію хімічної, фізіологічної, генетичної або іншої модифікації (наприклад, одну або кілька генетичних модифікацій і хімічну або фізіологічну модифікацію). Олеагенний поліпептид: вжитий авторами термін «олеагенний поліпептид» стосується будьякого поліпептиду, що залучений у процес накопичення ліпідів у клітині й може включати поліпептиди, які залучені в процеси, відмінні від біосинтезу ліпідів, але активності яких впливають на ступінь або рівень накопичення одного або кількох ліпідів, наприклад, шляхом зв’язування субстрату або реагенту, який використовується олеагенним поліпептидом, що безпосередньо залучений у накопичення ліпідів. Наприклад, як обговорюється авторами, ацетил-CoА карбоксилаза, піруватдекарбоксилаза, ізоцитратдегідрогеназа, ATФ-цитратліаза, яблучний фермент і АМР деаміназа, серед інших білків, приймають участь в накопиченні ліпідів в клітинах. В цілому, зниження активності піруватдекарбоксилази або ізоцитратдегідрогенази, і/або збільшення активності ацетил CoА карбоксилази, ATФцитратліази, яблучного ферменту і/або АМР деамінази, як очікується, сприяють олеагенності. Кожний із цих білків представляє собою олеагенний поліпептид для цілей даного винаходу, і послідовності характерних прикладів цих ферментів наведені в Таблицях 1-6. Оліїстий: термін «оліїстий» стосується здатності організму до накопичення ліпіду принаймні до приблизно 20 % його сухої клітинної маси. У певних варіантах втілення винаходу, оліїсті дріжджі або гриби накопичують ліпід принаймні до приблизно 25 % їх сухої клітинної маси. В інших варіантах втілення, оліїсті дріжджі або гриби відповідно до винаходу накопичують ліпід у межах діапазону приблизно 20-45 % їх сухої клітинної маси. У деяких варіантах втілення, оліїсті організми можуть накопичувати ліпід аж до приблизно 70 % їх сухої клітинної маси. У деяких варіантах втілення винаходу, оліїсті організми можуть накопичувати велику фракцію загального накопичення ліпіду у вигляді триацилгліцерину. У певних варіантах втілення більшість накопичених ліпідів перебуває у вигляді триацилгліцерину. Альтернативно або додатково, ліпід може накопичуватися у вигляді внутрішньоклітинних ліпідних тілець або олійних тілець. У певних варіантах втілення даний винахід використовує дріжджі або гриби, які є природно оліїстими. У деяких аспектах, з природно оліїстими організмами здійснюють маніпуляції (наприклад, генетично, хімічно або іншим чином) з метою подальшого збільшення рівня накопиченого ліпіду в організмі. В інших варіантах втілення, з дріжджами або грибами, які не є природно 15 оліїстими, здійснюють маніпуляції (наприклад, генетично, хімічно або іншим чином) з метою накопичення ліпіду, як описано авторами. У контексті даного винаходу, Xantophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozymа) і Candida utilis не є природно оліїстими грибами. Поліпептид: вжитий авторами термін «поліпептид» зазвичай має визнане в даній галузі значення полімеру з принаймні трьох амінокислот. Однак, термін також використовується для визначення певних функціональних класів поліпептидів, таких як, наприклад, олеагенні поліпептиди, каротиногенні поліпептиди, поліпептиди біосинтезу ізопреноїдів, поліпептиди біосинтезу каротиноїдів і конкурентні поліпептиди біосинтезу ізопреноїдів. Для кожного такого класу дана специфікація надає кілька прикладів відомих послідовностей таких поліпептидів. Проте, спеціалісти зі звичайними навичками в даній галузі врахують, що термін «поліпептид» є досить узагальнюючим і охоплює не тільки поліпептиди, що мають повну послідовність, зазначену авторами (або у посиланні або базі даних, спеціально вказаній авторами), але також охоплює поліпептиди, які представляють функціональні фрагменти (тобто, фрагменти, що зберігають принаймні один вид активності) таких повних поліпептидів. Крім того, спеціалісти зі звичайними навичками в даній галузі розуміють, що послідовності білків зазвичай допускають деякі заміни, при цьому не ліквідуючи активності. Таким чином, будь-який поліпептид, що зберігає активність і характеризується ідентичністю принаймні приблизно на 30-40 % від загальної ідентичності послідовності, часто більше ніж приблизно 50 %, 60 %, 70 % або 80 %, і додатково звичайно включаючи принаймні одну ділянку набагато вищої ідентичності, часто більшої ніж 90 % або навіть 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % в одній або кількох високо консервативних ділянках (наприклад, поліпептиди ізцитратдегідрогенази часто характеризуються АМР-зв’язуючим мотивом; поліпептиди HMG-CoА редуктази, як правило, включають високо консервативний каталітичний домен (див., наприклад, Фігуру 7); ацетил сoА карбоксилаза, як правило, містить домен карбоксилтрансферази; див., наприклад, Downing et al., Chem. Abs. 93:484, 1980; Gil et al., Cell 41:249, 1985; Jitrapakdee et al. Curr Protein Pept Sci. 4:217, 2003; Патент США Номер 5 349 126, кожен з яких включений авторами шляхом посилання у повному обсязі), звичайно охоплюючи принаймні 3-4 і часто до 20 або більше амінокислот, з іншим поліпептидом того ж самого класу, включається у зміст відповідного терміну «поліпептид», як використовується авторами. Вихідний організм: вжитий авторами термін «вихідний організм» стосується організму, у якому певна поліпептидна послідовність може бути виявлена в природі. Таким чином, наприклад, якщо один або кілька гетерологічних поліпептидів експресується/експресуються в організмі-хазяїні, організм, у якому поліпептиди експресуються в природі (і/або з якого були спочатку клоновані їхні гени) вважається «вихідним організмом». У разі, 94038 16 якщо в організмі-хазяїні експресується більше ніж один гетерологічний поліпептид, для незалежного вибору кожного гетерологічного поліпептиду(ів) можуть використовуватися один або кілька вихідних організмів. Буде розглядатися, що будьякий і всі організми, які природно містять відповідні поліпептидні послідовності, можуть використовуватися як вихідні організми відповідно до даного винаходу. До характерних вихідних організмів належать, наприклад, тваринний, ссавцевий організми, організми комахи, рослинний, грибковий, дріжджовий, водорослевий, бактеріальний, ціанобактеріальний, архебактеріальний й протозойний вихідні організми. Детальний опис певних оптимальних варіантів втілення винаходу Як відзначено вище, даний винахід охоплює відкриття можливості за бажанням продукувати каротиноїди в оліїстих дріжджах і грибах. Відповідно до даного винаходу, штами, що як (i) накопичують ліпід, часто у вигляді цитоплазматичних олійних тілець і, як правило, принаймні приблизно до 20 % їх сухої клітинної маси; так і (ii) продукують каротиноїд(и) на рівні принаймні приблизно 1 %, і у деяких варіантах втілення принаймні приблизно 320 %, їх сухої клітинної маси, отримують шляхом маніпуляції з клітинами-хазяями (тобто, штами, включаючи, наприклад, штами, що зустрічаються в природі, штами, які були попередньо модифіковані, і т.д.). після цього ці клітини-хазяїни, які підлягають маніпуляції, використовуються для продукування каротиноїдів у такий спосіб, що каротиноїди, які розподілені у ліпідні тільця, можуть бути легко виділені. В цілому, буде бажано зрівноважити виробництво каротиноїду й олеагенність у клітинах відповідно до винаходу таким чином, щоб досягти якогомога мінімального бажаного рівня олеагенності, щоб практично весь додатковий вуглець, який можна використати і направити на біосинтез продуктів, направити на шлях виробництва каротиноїду. У деяких варіантах втілення винаходу, ця стратегія включає розробку клітин, що будуть оліїстими; в інших варіантах втіленнях вона включає розробку клітин для накопичення вищого рівня ліпіду, особливо цитоплазматичного ліпіду, ніж вони накопичили б за відсутності такої розробки навіть за умови, що розроблені клітини можуть не ставати «оліїстими», як визначено авторами. В інших варіантах втілення, фактично зменшена ступінь, до якого оліїста клітина-хазяїн накопичує ліпід таким чином, щоб залишки вуглецю можна було використати у виробництві каротиноїдів. Клітини-хазяїни Спеціалісти зі звичайними навичками в даній галузі легко оцінять, що існує ціла низка дріжджових і грибкових штамів, які є природно оліїстими або які природно продукують каротиноїди. Кожен з таких штамів може використовуватися як штамхазяїн відповідно до даного винаходу, і може розроблятися або з ним здійснюватися інші маніпуляції для отримання оліїстих продукуючих каротиноїд штамів відповідно до винаходу. Альтернативно, можуть використовуватися штами, які природно не 17 є ні оліїстими, ні продукуючими каротиноїд. Крім того, навіть коли певний штам має природну здатність до олеагенності або до виробництва каротиноїда, його природні здатності можуть бути пристосовані як описано авторами у такий спосіб, щоб змінити рівень виробництва ліпіду та/або каротиноїду. У певних варіантах втілення розробка або маніпуляція із штамом призводить до модифікації типу ліпіду та/або каротиноїду, що продукується. Наприклад, штам може бути природно оліїстим та/або каротиногенним, однак розробка або модифікація штаму може використовуватися таким чином, щоб змінити тип ліпіду, що накопичується та/або змінити тип каротиноїду, що продукується. При виборі певного дріжджового або грибкового штаму для використання відповідно до даного винаходу, зазвичай буде бажано вибрати той, особливості культивування якого підходять для комерційного масштабного виробництва. Наприклад, зазвичай (хоча не обов'язково завжди) буде бажано уникати волокнистих організмів або організмів з особливо незвичними або строгими вимогами до умов росту. Однак, у разі, якщо можуть бути застосовані умови для комерційного масштабного виробництва, які дозволяють використання волокнистих організмів, вони можуть бути обрані як клітини-хазяїни. У деяких варіантах втілення винаходу буде бажаним використовувати їстівні організми як клітини-хазяїни, оскільки вони можуть довільно бути безпосередньо введені в склад харчових або кормових добавок або в харчові добавки, за бажанням. Для простоти виробництва деякі варіанти втілення винаходу застосовують клітинихазяїни, які є генетично лабільними, схильними до молекулярно-генетичних модифікацій (наприклад, можуть бути ефективно трансформовані, особливо за допомогою встановлених або доступних векторів; довільно можуть включати та/або інтегрувати множинні гени, наприклад, послідовно, та/або містять відому генетичну послідовність; і т.д), позбавлені складних вимог до росту (наприклад, потреба у світлі), мезофільні (наприклад, надають перевагу температурам росту у діапазоні приблизно 25-32 °C), здатні асимілювати різні джерела вуглецю й азоту та/або здатні рости до високої щільності клітини. Альтернативно або додатково, різні варіанти втілення винаходу використовують клітини-хазяїни, які ростуть як окремі клітини, а не багатоклітинні організми (наприклад, у вигляді міцелію). Зазвичай, у випадку, коли бажано використовувати природно оліїстий організм у відповідності з даним винаходом, можна застосовувати будьякий оліїстий організм, що підлягає модифікаціям й культивуванню. У певних варіантах втілення винаходу, використовуються дріжджі або гриби родів, включаючи, крім інших, Blakeslea, Candida, Cryptococcus, Cunninghamella, Lipomyces, Mortierella, Mucor, Phycomyces, Pythium, Rhodosporidium, Rhodotorula, Trichosporon і Yarrowia. У певних конкретних варіантах втілення застосовуються види організмів, які включають, крім інших, Blakeslea trispora, Candida pulcherrima, С revkaufi, С tropicalis, Cryptococcus curvatus, Cunninghamella echinulata, C. elegans, C. japonica, 94038 18 Lipomyces starkeyi, L. lipoferus, Mortierella alpina, M. isabellina, M. ramanniana, M. vinacea, Mucor circinelloides, Phycomyces blakesleanus, Pythium irregulare, Rhodosporidium toruloides, Bhodotorula glutinis, R. gracilis, R. graminis, R. mucilaginosa, R. pinicola, Trichosporon pullans, Т. cutaneum і Yarrowia lipolytica. Із цих природно оліїстих штамів деякі також природно продукують каротиноїди, а деякі ні. У більшості випадків тільки низькі рівні (менше ніж приблизно 0,05 % сухої клітинної маси) каротиноїдів продукуються каротиногенними, оліїстими дріжджами або грибами, що зустрічаються в природі. Іноді продукуються більш високі рівні -каротину, але високі рівні інших каротиноїдів зазвичай не спостерігаються. Зазвичай, як клітина-хазяїн відповідно до даного винаходу може використовуватися будь-який організм, що є природно оліїстим і не продукуючим каротиноїди (наприклад, виробляє менше ніж приблизно 0,05 % сухої клітинної маси, не продукує каротиноїд, що розглядається). У деяких варіантах втілення, організм представляє собою дріжджі або гриб з такого роду, як, крім інших, Candida, Cryptococcus, Cunninghamella, Lipomyces, Mortierella, Pythium, Trichosporon і Yarrowia; у деяких варіантах втілення, організм виду, включаючи, крім інших, Mortierella alpina й Yarrowia lipolytica. Порівняно, даний винахід може використовувати у якості клітини-хазяїна будь-який природно оліїстий, виробляючий каротиноїд організм. В цілому, даний винахід може використовуватися для збільшення потоку вуглецю в ізопреноїдному шляху в природно продукуючих каротиноїд організмах (особливо для організмів, відмінних від Blakeslea і Phycomyces), і/або для переходу від виробництва одного каротиноїда (наприклад, β-каротину) на інший (наприклад, aстaксaнтин). Введення однієї або кількох каротиногенних модифікацій (наприклад, збільшення експресії одного або кількох ендогенних або гетерологічних каротиногенних поліпептидів), відповідно до даного винаходу, може дозволити досягти цих цілей. У певних варіантах втілення винаходу, оліїстий, продукуючий каротиноїд організм, що застосовується, представляє собою дріжджі або гриб, наприклад такого роду як, крім інших, Blakeslea, Mucor, Phycomyces, Rhodosporidium і Rhodotorula; у деяких варіантах втілення, організм виду, такого як, Mucor circinelloides і Rhodotorula glutinis. У разі, коли бажано використовувати штами, які є природно не оліїстими як клітини-хазяїни відповідно до даного винаходу, роди не оліїстих дріжджів або грибів включають, крім інших, Aspergillus, Botrytis, Cercospora, Fusarium (Gibberella), Kluyveromyces, Neurospora, Penicillium, Pichia (Hansenula), Puccinia, Saccharomyces, Sclerotium, Trichoderma і Xantophyllomyces (Phaffia); у деяких варіантах втілення, організм виду, включаючи, крім інших, Aspergillus nidulans, A. niger, A. terreus, Botrytis cinerea, Cercospora nicotianae, Fusarium fujikuroi (Gibberella zeae), Kluyveromyces lactis, K. lactis, Neurospora crassa, Pichia pastoris, Puccinia 19 distincta, Saccharomyces cerevisiae, Sclerotium rolfsii, Trichoderma reese, і Xantophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma). Буде оцінено, що вжитий авторами термін «не оліїстий» охоплює як штами, які природно мають деяку здатність накопичувати ліпід, особливо цитоплазматично, але не роблять цього до рівня, достатнього для того, щоб розцінюватися як «оліїстий» за визначенням авторів, так і штами, які природно не мають жодної здатності до накопичення надлишкового ліпіду, наприклад, позамембранного ліпіду. Буде додатково оцінено що, у деяких варіантах втілення винаходу, буде достатнім збільшити природний рівень олеагенності певної клітини-хазяїна, навіть якщо модифікована клітина не розцінюється як оліїста за визначенням авторів. Як і у випадку природно оліїстих організмів, частина природно не оліїстих грибів природно продукують каротиноїди, тоді як інші – ні. Можуть за бажанням використовуватися роди природно не оліїстих грибів, які природно не продукують каротиноїди (наприклад, виробляють менше ніж приблизно 0,05 % сухої клітинної маси, не продукують каротиноїд, що розглядається), оскільки клітинихазяїни відповідно до даного винаходу включають, крім інших, Aspergillus, Kluyveromyces, Penicillium, Saccharotnyces і Pichia; види включають, крім інших, Aspergillus niger і Saccharomyces cerevisiae. Роди природно не оліїстих гриби, які дійсно природно продукують каротиноїди й що можуть за бажанням використовуватися, оскільки клітинихазяїни відповідно до даного винаходу включають, крім інших, Botrytis, Cercospora, Fusarium (Gibberella), Neurospora, Puccinia, Sclerotium, Trichoderma і Xantophyllomyces (Phaffia); види включають, крім інших, Xantophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma). Як обговорюється вище, будь-який з цілої низки організмів може використовуватися як клітинихазяїни відповідно до даного винаходу. У певних варіантах втілення винаходу, клітини-хазяїни будуть представляти собою клітини Yarrowia lipolytica. Переваги Y. lipolytica включають, наприклад, лабільну генетику й молекулярну біологію, наявність геномної послідовності (див., наприклад. Sherman et al. Nucleic Acids Res. 32 (Database issue):D315-8, 2004), придатність для різних рентабельних умов росту і здатність рости до високої щільності клітини. Крім того, Y.lipolytica представляє собою природно оліїстий організм, таким чином менше маніпуляцій може потребуватися для отримання оліїстого, продукуючого каротиноїд штаму Y. lipolytica ніж могло б бути необхідним для інших організмів. Крім того, вже наявний великий комерційний досвід з Y. Lipolytica. Saccharomyces cerevisiae також представляє собою корисну клітину-хазяїна відповідно до даного винаходу, особливо завдяки її зручності для експериментальної маніпуляції і великому досвіду, що дослідники нагромадили з даним організмом. Хоча культивування Saccharomyces при умовах високого рівня вуглецю може призвести до збільшення виробництва етанолу, цей фактор можна зазвичай контролювати за допомогою змін у процесі та/або генетичних змін. 94038 20 До додаткових корисних хазяїв належать Xantophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma), яка зручна для експериментальних маніпуляцій і природно каротиногенна. Штами Xantophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma) можуть продукувати кілька каротиноїдів, включаючи aстaксaнтин. Aspergillus niger й Mortierella alpina накопичують великі кількості лимонної кислоти й жирних кислот, відповідно; Mortierella alpina - також оліїста. Також корисні Neurospora або Gibberella. Вони не є природно оліїстими організмами і схильні до продукування дуже низьких рівнів каротиноїдів, отже, відповідно до даного винаходу може потребуватися велика модифікація. Neurospora й Gibberella вважаються відносно зручними для маніпуляцій з експериментальної точки зору. Обидва ці організми представляють собою волокнисті гриби, таким чином, виробництво в комерційних масштабах може бути складним завданням, що полягає в необхідності вирішити проблему утилізації таких штамів. Mucor circinelloides представляє собою інший доступний корисний вид. У той час як його молекулярна генетика в цілому менш доступна ніж у випадку деяких інших організмів, він природно продукує -каротин, і у такий спосіб може потребувати меншої модифікації ніж інші доступні види. Молекулярно-генетичні маніпуляції можуть бути виконані у випадку Blakeslea, хоча для цього може бути необхідним прикласти значних зусиль. Крім того, можуть представляти складнощі рентабельні умови ферментації, як, наприклад, може бути необхідним змішувати два спряжених типи. Гриби роду Phycomyces також є можливими джерелами, які представляють потенційну можливість створювати складнощі для процесу ферментації, і ці гриби також може бути менш зручними для маніпуляцій ніж кілька інших потенційних організмівхазяїв. Спеціалісти зі звичайними навичками в даній галузі оцінять, що вибір конкретної клітини-хазяїна для використання відповідно до даного винаходу буде також впливати на, наприклад, вибір послідовностей експресії, які використовуються з будьяким гетерологічним поліпептидом, що буде введений у клітину, і буде також впливати на різні аспекти умов культури, і т.д. Багато відомо про різні регулюючі вимоги щодо генів, вимоги до спрямовуючих білок послідовностей і вимоги до культивування різних клітин-хазяїв, які використовуються відповідно до даного винаходу [див., наприклад, відносно Yarrowia, Barth et al. FEMS MicrobiolRev. 19:219,1997; Madzak et al. J Biotechnol. 109:63, 2004; див., наприклад, відносно Xantophyllomyces, Verdoes et al. Appl Environ Microbiol 69: 3728-38, 2003; Visser et al. FEMS Yeast Res 4:221-31, 2003; Martinez et al. Antonie Van Leeuwenhoek. 73(2):14753, 1998; Kim et al. Appl Environ Microbiol. 64(5):1947-9, 1998; Wery et al. Gene. 184(l):8997,1997; див., наприклад, відносно Saccharomyces, Guthrie and Fink Methods in Enzymology 194:1933,1991]. У певних аспектах, наприклад, спрямовуючі послідовності клітини-хазяїна (або близько споріднені аналоги) можуть бути корисними для включення з метою направлення гетерологічних 21 білків у субклітинну локалізацію. Таким чином, такі корисні спрямовуючі послідовності можуть бути додані до гетерологічної послідовності для належної внутрішньоклітинної локалізації активності. В інших аспектах (наприклад, додавання мітохондріальних спрямовуючих послідовностей), гетерологічні спрямовуючі послідовності можуть бути вилучені або змінені в обраній гетерологічній послідовності (наприклад, зміна або видалення спрямовуючих рослинні хлоропласти послідовностей вихідного організму). Розробка олеагенності Всі живі організми синтезують ліпіди для використання в своїх мембранах і різних інших структурах. Однак, більшість організмів не накопичує понад приблизно 10 % їхньої сухої клітинної маси у вигляді загального ліпіду, і більшість цих ліпідів зазвичай розташовується в клітинних мембранах. Була проведена значна біохімічна робота для визначення метаболічних ферментів, необхідних для надання мікроорганізмам олеагенності (насамперед, заради розробки окремих клітинних олій у якості комерційних джерел арахідонової кислоти й дoкoзaгексаенової кислоти; див. наприклад Ratledge Biochimie 86:807, 2004, зміст якої у повному обсязі включено авторами шляхом посилання). Хоча ця біохімічна робота переконлива, до даного винаходу не було жодних повідомлень про олеагенність de novo, що встановлюється шляхом генної інженерії з генами, які кодують ключові метаболічні ферменти. Необхідно відзначити, що оліїсті організми, як правило, тільки накопичують ліпід при вирощуванні за умов надлишку вуглецю й обмеження азоту або інших поживних речовин. За цих умов організм легко вичерпує поживну речовину, яка обмежена, але продовжує асимілювати джерело вуглецю. «Надлишковий» вуглець спрямовується на біосинтез ліпідів таким чином, щоб ліпіди (зазвичай триацилгліцерини) накопичувалися в цитозолі, як правило, у вигляді тілець. В цілому, здається, що, щоб бути оліїстим, організм повинен продукувати й ацетил-CoА й NADPH у цитозолі, які можуть після цього використовуватися системою синтази жирних кислот для створення ліпідів. Принаймні в деяких оліїстих організмах, ацетил-CoА утворюється у цитозолі через дію ATP-цитрат ліази, що каталізує реакцію: цитрат+CoА+ATРацетил-CoА+ (1) +oксaлoaцетат+АDP+Pі. Звичайно, для того, щоб ATФ-цитрат ліаза створила відповідні рівні ацетил-CoА у цитозолі, вона повинна спочатку мати наявний пул її субстрату лимонної кислоти. Лимонна кислота утворюється в мітохондріях всіх еукаріотичних клітин через цикл трикарбонових кислот (TКК), і може бути переміщена в цитозоль (в обмін на малат) за допомогою цитрат/малат транслокази. У більшості оліїстий організмів і в деяких не оліїстих організмах фермент ізоцитратдегідрогеназа, що функціонує як частина циклу TКК в мітохондріях, є значною мірою АМP-залежним. Таким чином, коли у мітохондріях вичерпується АМP, цей фермент інактивований. Коли ізоцитратдегидрогеназа неактивна, ізоцитрат накопичується в мітохо 94038 22 ндріях. Цей накопичений ізоцитрат після цього знаходиться в рівновазі з лимонною кислотою, очевидно через дію акoнiтази. Тому, при умовах низького рівня АМP, цитрат накопичується в мітохондріях. Як відзначено вище, мітохондріальний цитрат легко транспортується в цитозоль. Вичерпання АМP, що, як вважається, ініціює в оліїстих організмах каскад, що призводить до накопичення цитрату (і, отже, ацетил-CoА) у цитоплазмі, відбувається внаслідок вичерпання поживних речовин, як вказано вище. При вирощуванні оліїстих клітин в присутності джерела надлишкового вуглецю, але за умов обмеження азоту або певної іншої поживної(их) речовини (речовин), сильно індукується активність АМР деамінази, що каталізує реакцію: АМP  iнoзин 5'-монофосфат + NH3 (2) Збільшення активності цього ферменту вичерпує клітинний АМP як у цитозолі, так і в мітохондріях. Вичерпання АМP у мітохондріях, як вважається, інактивує АМP-залежну ізоцитратдегідрогеназу, призводячи до накопичення цитрату в мітохондріях й, зважаючи на, цитозолі. Ця низка подій зображена схематично на Фігурі 2. Як відзначено вище, олеагенність потребує, як цитозольного ацетил-CoА, так і цитозольного NADPH. Вважається, що у багатьох оліїстих організмах відповідні рівні цитозольного NADPH забезпечуються завдяки дії яблучного ферменту (Фермент 3 на Фігурі 2). Деякі оліїсті організми (наприклад, Lipomyces і деякі Candida), як здається, не мають яблучних ферментів, однак, очевидно, інші ферменти можуть забезпечити порівнянну активність, хоча очікується, що для синтезу жирних кислот імовірно потрібне виділене джерело NADPH [див., наприклад, Wynn et al., Microbiol 145:1911, 1999; Ratledge Adv. Appl. Microbiol. 51:1, 2002, кожний з яких включений акторами шляхом посилання у повному обсязі]. Таким чином, відповідно до даного винаходу, олеагенність організмухазяїна може бути збільшена шляхом модифікації експресії або активності одного або кількох поліпептидів, що приймають участь у виробництві цитозольного ацетил-CoА та/або NADPH. Наприклад, модифікація експресії або активності одного або кількох з ацетил-CoА кaрбoксилази, піруватдекарбоксилази, ізоцитратдегідрогенази, ATP-цитрат ліази, яблучного ферменту і АМP-деамінази може збільшити олеагенність відповідно до даного винаходу. Приклади поліпептидів, які можуть бути використані або отримані для збільшення олеагенності відповідно до даного винаходу включають, крім інших, поліпептиди ацетил-CoА кaрбoксилази, піруватдекарбоксилази, ізоцитратдегідрогенази, ATP-цитрат ліази, яблучного ферменту і АМP-деамінази, які представлені в Таблиці 1, Таблиці 2, Таблиці 3, Таблиці 4, Таблиці 5 і Таблиці 6, відповідно. У деяких варіантах втілення винаходу, у яких застосовується оліїста клітина-хазяїн, ферменти й регулюючі компоненти, що стосуються олеагенності, уже наявні, проте можуть бути модифіковані, якщо це бажано, наприклад, шляхом зміни експресії або активності одного або кількох олеагенних 23 поліпептидів та/або шляхом введення одного або кількох гетерологічних олеагенних поліпептидів. У тих варіантах втілення винаходу, у яких застосовується не оліїста клітина-хазяїн, зазвичай очікується, що буде введений принаймні один або кілька гетерологічних олеагенних поліпептидів. Даний винахід розглядає не тільки введення гетерологічних олеагенних поліпептидів, але також і регулювання рівнів експресії або активності гетерологічних або ендогенних олеагенних поліпептидів, включаючи, наприклад, зміну конститутивних або індуцибeльних характерів експресії. У деяких варіантах втілення винаходу характер експресії коригується таким чином, що для індукції олеагенності не потрібен ріст в обмежуючих поживні речовини умовах. Наприклад, для здійснення певного конкретного регулювання характеру експресії можуть використовуватися генетичні модифікації, що включають зміну та/або додавання регулюючих послідовностей (наприклад, елементів промотера, елементів термінатора). Такі генетичні модифікації можуть використовуватися в поєднанні з ендогенними генами (наприклад, для регулювання ендогенного олеагенного поліпептиду (ів)); альтернативно, такі генетичні модифікації можуть бути включені у такий спосіб, щоб здіснювати регулювання експресії принаймні одного гетерологічного поліпептиду (наприклад, олеагенного поліпептиду (ів)). Наприклад, промотери включаючи, крім інших, промотери Tefl, Gpdl, можуть використовуватися у поєднанні з ендогенними генами та/або гетерологічними генами для модифікації характеру експресії ендогенних олеагенних поліпептидів та/або гетерологічних олеагенних поліпептидів. Подібним чином, приклади послідовностей термінаторів включають, крім інших, використання послідовностей термінаторів XPR2 Y. lipolytica. У деяких варіантах втілення, принаймні один олеагенний поліпептид вводиться в клітинухазяїна. У деяких варіантах втілення винаходу ціла низка (наприклад, два або більше) різних олеагенних поліпептидів вводиться в ту ж саму клітину-хазяїна. У деяких варіантах втілення ціла низка олеагенних поліпептидів містить поліпептиди із того ж самого вихідного організму; в інших варіантах втілення ця низка включає поліпептиди, незалежно відібрані з різних вихідних організмів. Характерні приклади цілої низки олеагенних поліпептидів, які можуть бути введені в або модифіковані у межах клітин-хазяїв відповідно до даного винаходу, включають, крім інших, поліпептиди, представлені в Таблицях 1-6. Як відзначено вище, очікується, що принаймні деякі із цих поліпептидів (наприклад, яблучного ферменту й ATPцитратліази) повинні за бажанням функціонувати узгоджено, і можливо разом з одним або кількома компонентами синтази жирних кислот, таким чином, що, у деяких варіантах втілення винаходу, буде бажано використовувати два або більше олеагенних поліпептидів від того ж самого вихідного організму. В цілому, вихідні організми для олеагенних поліпептидів, які використовуються у відповідності з даним винаходом, включають, крім інших, Blakeslea, Candida, Cryptococcus, Cunninghamella, 94038 24 Lipomyces, Mortierella, Mucor, Phycomyces, Pythium, Rhodosporidium, Rfiodotorula, Trichosporon, Yarrowia, Aspergillus, Botrytis, Cercospora, Fusarium (Gibberella), Kluyveromyces, Neurospora, Penicillium, Pichia (Hansenula), Puccinia, Saccharomyces, Sclerotium, Trichoderma і Xantophyllomyces (Phaffia). У деяких варіантах втілення вихідні види для поліпептидів ацетил CoА кaрбoксилази, ATФ-цитрат ліази, яблучного ферменту та/або АМР деамінази включають, крім інших, Aspergillus nidulans, Cryptococcus neoformans, Fusarium fujikuroi, Kluyveromyces lactis, Neurospora crassa, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Ustilago maydis і Yarrowia lipolytica; у деяких варіантах втілення вихідні види для поліпептидів піруватдекарбоксилази або ізоцитратдегідрогенази включають, крім інших, Neurospora crassa, Xantophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma), Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae, Mucor circinelloides, Rhodotorula glutinis, Candida utilis, Mortierella alpina й Yarrowia lipolytica. Розробка виробництва каротиноїдів Каротиноїди синтезуються із ізопреноїдних попередників, деякі з яких також залучені у виробництво стероїдів і стеринів. Самий загальний шлях біосинтезу ізопреноїдів, що іноді згадується як «мевалонатний шлях», зображений в загальному на Фігурі 3. Як показано, ацетил-CoА перетворюється, через гідроксиметилглутарил-CoА (HMGCoА), в мевалонат. Після цього мевалонат фосфорилюється і перетворюється у п'ятивуглецеву сполуку iзoпeнтeнілпірофосфат (IРР). Після ізомеризації IПФ у диметилалілпірофосфат (DMAPP), внаслідок трьох послідовних реакцій конденсації з додатковими молекулами IPP отримують десятивуглецеву молекулу гeранілпірофосфат (GPP), після неї п'ятнадцятивуглецеву молекулу фарнезилпірофосфат (FPP) і нарешті двадцятивуглецеву сполуку геранілгеранілпірофосфат (GGPP). Альтернативний шлях біосинтезу ізопреноїдів, що використовується деякими організмами (особливо бактеріями) і іноді називається «мевалонатнезалежним шляхом», зображений на Фігурі 4. Цей шлях починається синтезом 1-дeoкси-Dксилoглюкозо-5-фосфат (DOXP) із пірувату й гліцеральдегід-3-фосфату. Після цього DOXP перетворюється, через низку реакцій, показану на Фігурі 4, в IPP, який ізомеризується в DMAPP і після цього перетворюється, через GPP й FPP, в GGPP, як показано на Фігурі 3 й описано вище. У низки організмів були ідентифіковані й охарактеризовані різні білки, залучені в біосинтез ізопреноїдів. Крім того, різні аспекти шляху біосинтезу ізопреноїдів ідентичні у царствах грибів, бактерій, рослин й тварин. Наприклад, поліпептиди, що відповідають ацетоацетил-CoА тіолазі, HMG-CoА синтазі, HMG-CoА редуктазі, мевалонаткіназі, фосфомевалонаткіназі, мевалонатпірофосфатдекарбоксилазі, IPP ізомеразі, FPP синтазі і GGPP синтазі, показані на Фігурі 3 були ідентифіковані у цілої низки організмів і клітин й виділені від них. Характерні приклади різних поліпептидів такого типу наведені в Таблицях 7-15. Один або кілька поліпептидів, відібраних із наданих у будь 25 якій із Таблиць 7-15, можуть використовуватися або бути отримані для використання в способах і композиціях відповідно до даного винаходу. Відповідно до даного винаходу виробництво каротиноїда в організмі-хазяїні може бути пристосоване шляхом модифікації експресії або активності одного або кількох білків, залучених в біосинтез ізопреноїдів. У деяких варіантах втілення така модифікація включає введення одного або кількох гетерологічних поліпептидів біосинтезу ізопреноїдів в клітину-хазяїна; альтернативно або додатково, можуть бути здійснені модифікації експресії або активності одного або кількох ендогенних або гетерологічних поліпептидів біосинтезу ізопреноїдів. З огляду на значну ідентичність компонентів поліпептидів біосинтезу ізопреноїдів, очікується, що гетерологічні поліпептиди біосинтезу ізопреноїдів будуть часто функціонувати навіть у організмах, які значно відрізняються. Крім того, якщо буде бажаним ввести більш ніж один гетерологічний поліпептид біосинтезу ізопреноїдів, у багатьох випадках поліпептиди від різних вихідних організмів будуть функціонувати разом. У деяких варіантах втілення винаходу ціла низка різних гетерологічних поліпептидів біосинтезу ізопреноїдів вводиться в ту ж саму клітину-хазяїна. У деяких варіантах втілення ця низка містить тільки поліпептиди від того ж самого вихідного організму (наприклад, дві або більше послідовностей, або послідовності, отримані з, того ж самого вихідного організму); в інших варіантах втілення низка включає поліпептиди, незалежно відібрані з різних вихідних організмів (наприклад, дві або більше послідовностей, або послідовності, отримані з принаймні двох незалежних вихідних організмів). У деяких варіантах втілення даного винаходу, у яких використовуються гетерологічні поліпептиди біосинтезу ізопреноїдів, вихідні організми включають, крім інших, гриби родів Blakeslea, Candida, Cryptococcus, Cunninghamella, Lipomyces, Mortierella, Mucor, Phycomyces, Pythium, Rhodosporidium, Rhodotorula, Trichosporon, Yarrowia, Aspergillus, Botrytis, Cercospora, Fusarium (Gibberella), Kluyveromyces, Neurospora, Penicillium, Pichia (Hansenula), Puccinia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Sclerotium, Trichoderms, Ustilago і Xantophyllomyces (Phaffia). У певних варіантах втілення вихідні організми представляють собою види, що включають, крім інших, Cryptococcus neoformans, Fusarium fujikuroi, Kluyverimyces lactis, Neurospora crassa, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Ustilago maydis і Yarrowia lipolytica. Як відзначено вище, шлях біосинтезу ізопреноїдів також залучений у виробництво не каротиноїдних сполук, таких як стерини, стероїди і вітаміни, типу вітаміну Е або вітаміну K. Зважаючи на це, білки, які діють на проміжні ланки шляху біосинтезу ізопреноїдів і направляють їх на біосинтез не каротиноїдних сполук, є непрямими інгібіторами біосинтезу каротиноїдів (див., наприклад, Фігуру 5, яка ілюструє точки, в яких проміжні продукти біосинтезу ізопреноїдів спрямовуються в інші шляхи біосинтезу). Отже, такі білки вважаються конкурентними поліпептидами біосинтезу ізопреноїдів. 94038 26 Зниження рівня або активності таких конкурентних поліпептидів біосинтезу ізопреноїдів, як очікується, дозволяє збільшити продукування каротиноїдів в клітинах-хазяєвах відповідно до даного винаходу. У деяких варіантах втілення даного винаходу, виробництво або активність ендогенних конкурентних поліпептидів біосинтезу ізопреноїдів в клітинах-хазяєвах можна знизити або нівелювати. У деяких варіантах втілення це зниження або нівелювання активності конкурентних поліпептидів біосинтезу ізопреноїдів можна досягти обробкою організму-хазяїна низькомолекулярними інгібіторами ферментів шляху біосинтезу ергостерину. Ферменти шляху біосинтезу ергостерину включають, наприклад, скваленсинтазу, скваленепоксидазу, 2,3-oксидoсквален-ланостеролциклазу, цитохром P450 ланостерол 14-деметилазу, C-14 стеринредуктазу, C-4 стеринметилоксидазу, SAM:C-24 стеринметилтрансферазу, C-8 стеринізомеразу, C-5 стериндесатуразу, C-22 стериндесатуразу і C-24 стеринредуктазу. Кожний із цих ферментів вважається конкурентним поліпептидом біосинтезу ізопреноїдів. Регулятори цих ферментів можна також розглядати як конкурентні поліпептиди біосинтезу ізопреноїдів (наприклад, білки дріжджів Sutl (Genbank Accession JC4374 GI:2133159) і Mot3 (Genbank Accession NP_013786 GІ:6323715), що можуть мати або ні гомологів в інших організмах. В інших варіантах втілення зниження або нівелювання активності конкурентних поліпептидів біосинтезу ізопреноїдів можна досягти зменшенням активності шляху біосинтезу убіхінону. Обов'язковою стадією в біосинтезі убіхінону є утворення пaрa-гідроксибензоату (PHB) із тирозину або фенілаланіну у ссавців або хоризмату у бактеріях, що супроводжується конденсацією ПГБ й ізопренового попередника, що призводить до додавання пренільної групи. Ця реакція каталізується PHB-поліпренілтрансферазою. Ізопреноїдний бічний ланцюг убіхінону визначається ферментом пренілдифосфатсинтазою. 3-декапреніл-4гідроксибензойна кислота, отримана шляхом реакції конденсації PHB й декапренілдифосфату, підлягає подальшим модифікаціям, які включають гидроксилювання, метилювання й декарбоксилювання, для утворення убіхінону (CoQ10). Таким чином, інгібування пренілдифосфатсинтази, що призводить від фарнезилдифосфату до подовжених ізопреноїдів, або інгібування PHBполіпренілтрансферази може бути корисним для збільшення кількості ізопреноїду, доступного для біосинтезу каротиноїдів. (Приклади ферментів пренілдифосфатсинтази і PHBполіпренілтрансферази зображені у Таблицях 29 й 30, відповідно). Відомі низькомолекулярні інгібітори конкурентних ферментів біосинтезу ізопреноїдів включають, крім інших, сарагосову кислоту (включаючи її аналоги, такі як TAN1607A (Biochem Biophys Res Commun 1996 Feb 15;219(2):515-520)), RPR 107393 (3-гідрокси-3-[4-(хінолін-6-іл)феніл]-1азабіцикло[2-2-2]октану дигідрохлорид; J Pharmacol Exp Ther. 1997 May;281(2):746-52), ER 27 28448 тринатрієва сіль (5-(N-[2-бутеніл-3-(2метоксифеніл)]-N-метиламіно)-1,1пентиліденбіс(фосфонової кислоти); Journal of Lipid Research, Vol. 41, 1136-1144, July 2000), BMS188494 (The Journal of Clinical Pharmacology, 1998; 38:1116-1121), TAK-475 (1-[2-[(3R,5S)-1-(3ацетокси-2,2-диметилпропіл)-7-хлорo-1,2,3,5тетрагідро-2-oксo-5-(2,3-диметоксифеніл)-4,1бензoксaзепін-3-іл]ацетил]піперидин-4-оцтова кислота; Eur J Pharmacol. 2003 Apr 11;466 (1-2):15561), YM-53601 ((E)-2-[2-фторo-2-(хінуклідин-3іліден)етокси]-9Н-карбазолу моногідрохлорид; Br J Pharmacol. 2000 Sep; 131(1):63-70) або сквалестатин І, що інгібує скваленсинтазу; тербінафін, що інгібує скваленепоксидазу; різні азоли, що інгібують цитохром P450 ланостерол 14-деметилазу; і фeнпрoпіморф, що інгібує C-14 стеринредуктазу й C-8 стеринізомеразу. В інших варіантах втілення можуть використовуватися гетерологічні конкурентні поліпептиди біосинтезу ізопреноїдів (функціональні чи нефункціональні; у деяких варіантах втілення застосовуються домінантні негативні мутанти). Один певний конкурентний поліпептид біосинтезу ізопреноїдів, корисний відповідно до даного винаходу, представляє собою скваленсинтазу, що була ідентифікована і охарактеризована у різних організмів; характерні приклади поліпептидних послідовностей скваленсинтази включені в Таблицю 16. У деяких варіантах втілення винаходу, що використовують скваленсинтазу (або модифікації скваленсинтази), вихідні організми включають, крім інших, Neurospora crassa, Xantophyllomyces dendrorhous (Phaffla rhodozyma), Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae, Mucor circinelloides, Rhotorula glutinis, Candida utilis, Mortierella alpina і Yarrowia lipolytica. Шлях біосинтезу каротиноїдів відхиляється від шляху біосинтезу ізопреноїдів в точці, де утворюється GGPP. Обов'язкова стадія біосинтезу каротиноїдів полягає в утворенні фітоену шляхом конденсації «голова до голови» двох молекул GGPP, що каталізується фітоенсинтазою (часто називається crtВ; див. Фігуру 6). Низка реакцій дегідрогенізації, кожна з яких збільшує число кон’югованих подвійних зв’язків на два, перетворює фітоен в лікопін через нейроспорин. Шлях відгалужується в різних точках, перед і після виробництво лікопіну, таким чином, щоб можна було отримати широкий спектр каротиноїдів. Наприклад, внаслідок дії ферменту циклази на лікопін отримують γ-каротин; замість цього дія десатурази дозволяє отримати 3,4-дидегідролікопін. -каротин перетворюється у -каротин завдяки дії циклази. -каротин може бути перероблений у будь-який з низки продуктів (див., наприклад, Фігуру 6C), включаючи aстaксaнтин (через eхінон, гідроксиехінон і френікоксантин). Відповідно до даного винаходу виробництво каротиноїда в організмі-хазяїні може бути пристосоване шляхом модифікації експресії або активності одного або кількох білків, залучених в біосинтез каротиноїдів. Як відзначено, у деяких варіантах втілення буде бажаним використовувати у якості організмів клітин хазяїнів, які природно продукують 94038 28 один або кілька каротиноїдів. У деяких таких випадках будуть зосереджуватися на збільшенні виробництва каротиноїду, що природно продукується, наприклад, шляхом збільшення рівня та/або активності одного або кількох білків, залучених у синтез цього каротиноїда та/або шляхом зменшення рівня або активності одного або кількох білків, залучених у конкуруючий шлях біосинтезу. Альтернативно або додатково, у деяких варіантах втілення буде бажаним створити виробництво одного або кількох каротиноїдів, що природно не продукуються клітиною-хазяїном. Відповідно до деяких варіантів втілення винаходу буде бажаним ввести один або кілька гетерологічних каротиногенних поліпептидів в клітинухазяїна. Як буде очевидним спеціалісту зі звичайними навичками в даній галузі, може використовуватися будь-який з цілої низки гетерологічних поліпептидів; при виборі враховують, наприклад, конкретний каротиноїд, виробництво якого повинне бути збільшене. Даний винахід розглядає не тільки введення гетерологічних каротиногенних поліпептидів, але також і регулювання рівнів експресії або активності гетерологічних або ендогенних каротиногенних поліпептидів, включаючи, наприклад, зміну конститутивних або індуцибeльних характерів експресії. У деяких варіантах втілення винаходу характер експресії коригується таким чином, що для індукції олеагенності не потрібен ріст в обмежуючих поживні речовини умовах. Наприклад, для здійснення певного конкретного регулювання характеру експресії можуть використовуватися генетичні модифікації, що включають зміну та/або додавання регулюючих послідовностей (наприклад, елементів промотера, елементів термінатора). Такі генетичні модифікації можуть використовуватися в поєднанні з ендогенними генами (наприклад, для регулювання ендогенного каротиногенного поліпептиду); альтернативно, такі генетичні модифікації можуть бути включені у такий спосіб, щоб здійснювати регулювання експресії принаймні одного гетерологічного поліпептиду (наприклад, каротиногенного(их) поліпептиду (ів)). Наприклад, промотери, включаючи, крім інших, промотери Tefl, Gpdl, можуть використовуватися у поєднанні з ендогенними генами та/або гетерологічними генами для модифікації характеру експресії ендогенного(их) каротиногенного(их) поліпептиду(ів) та/або гетерологічного(их) каротиногенного(их) поліпептиду(ів). Подібним чином, приклади послідовностей термінаторів включають, крім інших, використання послідовностей термінаторів XPR2 Y. lipolytica. Як позначено на Фігурі 6 й у літературі, білки, залучені в біосинтез каротиноїдів включають, крім інших, фітоенсинтазу, фітоендегідрогеназу, лікопінциклазу, каротиноїдкетолазу, каротиноїдгідроксилазу, aстaксaнтинсинтазу (єдиний багатофункціональний фермент, виявлений у деяких вихідних організмах, що, як правило, має активність як кетолази, так і гідроксилази), каротиноїдепсилонгідроксилазу, лікопінциклазу (бета й епсилон субодиниці), каротиноїдглюкозилтрансферазу і ацилCoА:діацигліцеринацилтрансферазу. Характерні приклади послідовностей для цих поліпепти 29 дів біосинтезу каротиноїдів представлені в Таблицях 17-25. Ксантофіли можна вирізнити із інших каротиноїдів завдяки присутності кисневмісних функціональних груп на їхніх циклічних кінцевих групах. Наприклад, лютеїн й зеаксантин містять єдину гідроксильну групу на кожній з термінальних кільцевих структур, у той час як астаксантин містить й кетогрупу й гідроксил на кожному термінальному кільці. Ця властивість робить ксантофіли більш полярними ніж такі каротини, як бета-каротин й лікопін, і у такий спосіб значно знижує їх розчинність у жирах і ліпідах. Ксантофіли, які зустрічаються в природі, часто перебувають у вигляді естерів термінальних гідроксильних груп, як моно-, так і диестерів жирних кислот. Вони також зустрічаються у вигляді глюкозидів у певних видах бактерій. Розчинність й дисперсність ксантофілів можуть бути значною мірою модифіковані шляхом додавання ефірних залишків, і відомо, що етерифікація може також вплинути на адсорбційну здатність та/або біодоступність даного каротиноїду. Ціль даного винаходу полягає в максимальному збільшенні кількості певного ксантофілу, що накопичується в межах внутрішньоклітинної триацилгліцеридної фракції оліїстих дріжджів, і один механізм для досягнення цієї мети полягає в збільшенні гідрофобного характеру ксантофільного продукту, що накопичується. Один спосіб досягти цього полягає в тому, щоб розробити виробництво ацилмоно- і/або диестерів жирних кислот цільової ксантофільної сполуки. Для етерифікації каротиноїдів може функціонувати ціла низка ферментів. Наприклад, каротиноїдглюкозилтрансферази були ідентифіковані у декількох видах бактерій (див., наприклад, Таблицю 24). Крім того, ацил CoА:діацилгліцерин ацилтрансфераза (DGAT) і ацилCoА:моноацилгліцерин ацилтрансферази (MGAT), які функціонують на заключних стадіях біосинтезу триацилгліцерину, імовірно, будуть грати додаткову роль в етерифікації ксантофілів. Характерні DGAT поліпептиди показані у Таблиці 25. Крім того, інші ферменти можуть специфічно модифікувати каротиноїди й молекули подібної структури (наприклад, стерини) і бути доступними для модифікації і виробництва естерів. У деяких варіантах втілення винаходу, потенційні вихідні організми для поліпептидів біосинтезу каротиноїдів включають, крім інших, роди природно оліїстих або не оліїстих грибів, які природно продукують каротиноїди. До них належать, крім інших, Botrytis, Cercospora, Fusarium (Gibberella), Mucor, Neurospora, Phycomyces, Puccina, PJwdotorula, Sclerothim, Trichoderma і Xanthophylomyces. До характерних видів належать, крім інших, Neurospora crassa, Xanthophylomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma), Mucor circinelloides і Rhodotorula glutinis. Звичайно, каротиноїди продукуються цілою низкою різних організмів, таких як рослини, морські водорості, дріжджі, гриби, бактерії, ціанобактерії і т.д. Будьякі такі організми можуть бути вихідними організмами для поліпептидів біосинтезу каротиноїдів відповідно до даного винаходу. 94038 30 Буде оцінено, що на певну каротиногенну модифікацію, яка застосовується до клітини-хазяїна відповідно до даного винаходу, буде впливати вибір каротиноїду (ів), який (які) бажано продукувати. Наприклад, поліпептиди біосинтезу ізопреноїдів мають відношення до виробництва більшості каротиноїдів. Поліпептиди біосинтезу каротиноїдів також широко застосовні. Кетолаза має особливе значення для виробництва кaнтaксaнтину, а гідроксилаза - для виробництва лютеїну й зeaксaнтину, серед інших. І гідроксилаза, й кетолаза (або астаксантинсинтаза) особливо корисні для виробництва астаксантину. Виробництво й виділення каротиноїдів Як обговорювалось вище, накопичення ліпідних тілець в оліїстих організмах зазвичай індукується шляхом вирощування відповідного організму у присутності джерела надлишкового вуглецю й обмеження азоту. Для низки різних оліїстих організмів були попередньо встановлені певні умови для індукування такого накопичення [див., наприклад, Wolf (ed.) Nonconventionalyeasts in biotechnology Vol. 1, Springer-Verlag, Berlin, Germany, pp. 313338;Lipids 18(9):623,1983;Indian! Exp. Biol. 35(3):313, 1997; J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 30(1):75, 2003; Bioresour Technol. 95(3):287, 2004, кожний з яких включений авторами шляхом посилання у повному обсязі]. В цілому, буде бажаним культивувати модифіковані клітини-хазяїни відповідно до винаходу за умов, які дозволяють накопичувати принаймні приблизно 20 % їхньої сухої клітинної маси у вигляді ліпіду. В інших варіантах втілення модифіковані клітини-хазяїни відповідно до винаходу вирощують за умов, які дозволяють накопичувати принаймні приблизно 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % або навіть 80 % чи більше їхньої сухої клітинної маси у вигляді ліпіду. У певних варіантах втілення клітини-хазяїни, що використовуються, представляють собою клітини, які є природно оліїстими, й індуковані для продукування ліпіду до бажаних рівнів. В інших варіантах втілення клітини-хазяїни представляють собою клітини, які природно продукують ліпід, але були перетворені для збільшення виробництва ліпіду у такий спосіб, що досягаються бажані рівні виробництва й накопичення ліпіду. У певних варіантах втілення клітини-хазяїни відповідно до винаходу не є природно оліїстими, але були перетворені для продукування ліпіду у такий спосіб, що досягаються бажані рівні виробництва ліпіду. Спеціалісти зі звичайними навичками в даній галузі оцінять, що, в цілому, умови росту, які є ефективними для індукування накопичення ліпіду у вихідному організмі, можуть цілком бути також корисними для індукції накопичення ліпіду в клітині-хазяїні, у яку були введені олеагенні поліпептиди вихідного організму. Звичайно, можуть потребуватися модифікації з точки зору особливостей клітини-хазяїна, модифікації яких перебувають в межах навичок звичайних спеціалістів в даній галузі. 31 Звичайні спеціалісти в даній галузі також оцінять, що, зазвичай, буде бажаним забезпечити, щоб виробництво бажаного каротиноїду модифікованою клітиною-хазяїном відповідно до винаходу відбувалося у відповідний час щодо індукції олеагенності таким чином, щоб каротиноїд (и) накопичувався (накопичувалися) у ліпідних тільцях. У деяких варіантах втілення буде бажаним викликати виробництво каротиноїда (ів) у клітині-хазяїні, яка природно не продукує каротиноїд (и), таким чином, щоб продукувались рівні каротиноїда (ів), які можна виявити. У певних аспектах клітинихазяїни, які природно не продукують певний каротиноїд (и), здатні до виробництва іншого (інших) каротиноїду (ів) (наприклад, певні клітини-хазяїни можуть, наприклад, природно продукувати каротин, але природно не можуть продукувати астаксантин); в інших аспектах клітини-хазяїни природно не продукують жодного каротиноїду (ів). В інших варіантах втілення буде бажаним збільшити рівні виробництва каротиноїду (ів) у клітиніхазяїні, яка дійсно природно продукує низькі рівні каротиноїду (ів) таким чином, що продукуються збільшені рівні каротиноїду (ів), які можна виявити. У певних аспектах клітини-хазяїни, які дійсно природно продукують каротиноїд (и) (наприклад, каротин), також виробляють додатковий(і) каротиноїд (и) (наприклад, астаксантин, і т.д.); в усіх інших аспектах клітини, які природно продукують каротиноїд (и) (наприклад, -каротин) не продукують додатковий каротиноїд (и). У певних варіантах втілення винаходу буде бажаним накопичувати каротиноїди до рівнів (тобто, враховуючи загальну суму всіх каротиноїдів, що продукуються, разом), які становлять більш ніж принаймні приблизно 1 % сухої маси клітин. У деяких варіантах втілення сумарне накопичення каротиноїду в ліпідних тільцях буде до рівня, що становить принаймні приблизно 2 %, принаймні приблизно 3 %, принаймні приблизно 4 %, принаймні приблизно 5 %, принаймні приблизно 6 %, принаймні приблизно 7 %, принаймні приблизно 8 %, принаймні приблизно 9 %, принаймні приблизно 10 %, принаймні приблизно 11 %, принаймні приблизно 12 %, принаймні приблизно 13 %, принаймні приблизно 14 %, принаймні приблизно 15 %, принаймні приблизно 16 %, принаймні приблизно 17 %, принаймні приблизно 18 %, принаймні приблизно 19 %, принаймні приблизно 20 % або більше сумарної сухої маси клітин. У певних варіантах втілення винаходу буде бажаним досягти сумарних рівнів накопичення каротиноїду в ліпідних тільцях (тобто, враховуючи загальну суму всіх каротиноїдів, що продукуються, разом), які становлять більш ніж принаймні приблизно 1 % сухої маси клітин. У деяких варіантах втілення сумарне накопичення каротиноїду в ліпідних тільцях буде до рівня, що становить принаймні приблизно 2 %, принаймні приблизно 3 %, принаймні приблизно 4 %, принаймні приблизно 5 %, принаймні приблизно 6 %, принаймні приблизно 7 %, принаймні приблизно 8 %, принаймні приблизно 9 %, принаймні приблизно 10 %, принаймні приблизно 11 %, принаймні приблизно 12 %, принаймні приблизно 13 %, принаймні приблизно 14 %, принаймні прибли 94038 32 зно 15 %, принаймні приблизно 16 %, принаймні приблизно 17 %, принаймні приблизно 18 %, принаймні приблизно 19 %, принаймні приблизно 20 % або більше сумарної сухої маси клітин. Вже було продемонстровано, що бактеріальні каротиногенні гени можна переносити в інші організми, і тому вони особливо корисні по відношенню до даного винаходу [див., наприклад, Miura et al., Appl. Environ. Microbiol. 64:1226, 1998]. В інших варіантах втілення може бути бажаним використовувати гени від інших вихідних організмів, таких як рослина, водорості або мікроводорості; ці організми забезпечують розмаїтість потенційних джерел для поліпептидів кетолази і гідроксилази. Інші додаткові корисні вихідні організми включають грибкові, дріжджові, комашині, протозойні і ссавцеві джерела поліпептидів. У певних варіантах втілення гени багатофункціональної фітоенсинтази/лікопінциклази Mucor circinelloides й фітоендегідрогенази Neurospora crassa можуть бути експресовані в Yarrowia lipolytica. Наступна зверхекспресія каталітичного домену із гідроксиметилглутарил-CoА редуктази N. crassa та/або обробка модифікованих штамів Y. lipolytica інгібітором скваленсинтази сарагосовою кислотою додатково збільшує виробництво каротиноїду. Нарешті, гени Paracoccus marcusii, що кодують ферменти каротиноїдгідроксилазу й каротиноїдкетолазу експресуються в продукуючих каротин штамах Y. lipolytica, і ця модифікація призводить до накопичення астаксантину. Можна застосувати подібні підходи для збільшення виробництва каротиноїду, які можуть використовуватися в інших оліїстих або не оліїстих організмаххазяєвах, використовуючи ті ж саме, гомологічні або функціонально подібні каротиногенні поліпептиди. Необхідно відзначити, що для організмів відповідно до винаходу, які продукують більш ніж один каротиноїд, іноді буде можливо скоригувати відносні кількості індивідуальних каротиноїдів, що продукуються, регулюючи умови росту. Наприклад, повідомлялось, що контроль концентрації розчиненого кисню в культурі протягом культивування може регулювати відносні рівні виробництва певних каротиноїдів, таких як -каротин, ехіненон, -криптоксантин, 3-гідроксиехіненон, астероїденон, кантаксантин, зеаксантин, aдонірубін, адоніксантин й астаксантин [див., наприклад, Патент США номер 6 825 002 до Tsubokura et al., зміст яких у повному обсязі включений авторами шляхом посилання]. Особливо для варіантів втілення даного винаходу, спрямованих на виробництво астаксантину, часто буде бажаним використовувати один або кілька генів із природного продукуючого астаксантин організму. У разі, коли необхідно експресувати множинні гетерологічні поліпептиди, може бути бажаним використовувати той же самий вихідний організм для всіх або застосовувати близько споріднені вихідні організми. Одна перевага, надана даним винаходом, полягає в тому, що, крім надання можливості продукувати високі рівні каротиноїдів, даний винахід дозволяє легко виділяти ці вироблені сполуки, 33 тому що вони накопичуються в ліпідних тільцях в оліїстих організмах. Для цілої низки оліїстих організмів були встановлені методи й системи для виділення ліпідних тілець [див., наприклад, Патенти США 5 164 308; 5 374 657; 5 422 247; 5 550 156; 5 583 019; 6 166 231; 6 541 049; 6 727 373; 6 750 048 і 6 812 001, кожний з яких включений авторами шляхом посилання у повному обсязі]. Стисло, клітини, як правило, вилучають із культури, часто шляхом розпилювального висушування, фільтрування або центрифугування. У деяких випадках клітини гомогенізуються, а потім підлягають суперкритичній рідкій екстракції або екстракції розчинником (наприклад, за допомогою таких розчинників, як хлороформ, гексан, метиленхлорид, метанол, ізопропанол, етилацетат і т.д.), внаслідок чого отримують неочищену оліїсту суспензію. Цю оліїсту суспензію можна, довільно, очистити у спосіб, відомий в даній галузі. Очищені олії можуть безпосередньо використовуватися у якості кормових або харчових добавок. Альтернативно або додатково, каротиноїди можна виділити із олії, застосовуючи стандартні методи. З огляду на звичайну чутливість каротиноїдів до окиснення, у багатьох варіантах втілення винаходу упродовж та/або після виділення каротиноїду використовуються окисні стабілізатори (наприклад, токофероли, вітамін C; етоксихін; вітамін Е, ВНТ, ВНА, TBHQ, і т.д, або їх комбінації). Альтернативно або додатково, може використовуватися мікроінкапсуляція, наприклад білками, з метою додавання фізичного бар'єру по відношенню до окиснення та/або для поліпшення маніпуляцій [див., наприклад, Патентну заявку США 2004/0191365]. Використання Каротиноїди, вироблені відповідно до даного винаходу, можуть використовуватися в будь-якому з цілої низки видів застосування, наприклад, тих, які використовують їх біологічні або харчові властивості (наприклад, антиоксидантні, антипроліферативні і т.д.) і/або їх пігментні властивості. Наприклад, відповідно до даного винаходу, каротиноїди можуть використовуватися у фармацевтичних препаратах [див., наприклад, Bertram, Nutr. Rev. 57:182, 1999; Singh et al., Oncology 12:1643, 1998; Rock, Pharmacol. Tlier. 75:185,1997; Edge et al, J. Photochem Photobiol 41:189, 1997; Патентну заявку США 2004/0116514; Патентну заявку США 2004/0259959], у харчових добавках [див., наприклад, Koyama et al, J. Photochem Photobiol 9:265, 1991; Bauernfeind, Carotenoids as colorants and vitamin A precursors, Academic Press, NY, 1981; Патентну заявку США 2004/0115309; Патентну заявку США 2004/0234579], в електрооптичній галузі, кормових добавках для тварин [див., наприклад, Krinski, PureAppl. Chem. 66:1003, 1994; Polazza et al., Meth. Enzymol. 213:403, 1992], косметичних засобах (як антиоксиданти та/або як косметика, включаючи аромати; [див. наприклад, Патентну заявку США 2004/0127554]), і т.д. Каротиноїди, вироблені відповідно до даного винаходу можуть також використовуватися як проміжні продукти у виробництві інших сполук (наприклад, стероїдів, і т.д.). 94038 34 Наприклад, астаксантин та/або його естери можуть бути корисними в низці видів застосування в фармацевтичній галузі й корисних для здоров’я продуктах харчування, включаючи лікування запальних захворювань, астми, атопічного дерматиту, алергій, множинної мієломи, артеріосклерозу, серцево-судинних захворювань, хвороб печінки, церебрально-васкулярних захворювань, тромбозу, пов'язаних з неоангіогенезом хвороб, включаючи рак, ревматизму, діабетичної ретинопатії; дегенерації сітківки і порушень, пов'язаних з головним мозком, гіперліпідемії, ішемії нирок, діабету, гіпертонії, проліферації пухлини й метастазів; і метаболічних порушень. Додатково, каротиноїди й астаксантин можуть бути корисними для профілактики й боротьби з втомою, для поліпшення ниркової функції при нефропaтії внаслідок запальних захворювань, а також для профілактики й лікування інших пов'язаних зі стилем життя хвороб. Крім того, як було виявлено, астаксантин грає роль інгібіторів різних біологічних процесів, включаючи інгібітори інтерлeйкіну, інгібітори інгібіторів фосфодіестерази, інгібітори фосфоліпази A2, інгібітори циклооксигенази-2, інгібітори матриксної металопротеїнази, інгібітори проліферації клітин капілярного ендотелію, інгібітори ліпоксигенази. [Див., наприклад, японську публікацію номер 2006022121, опубліковану 20060126 (JP заявка номер 2005301156, подана 20051017); японську публікацію номер 2006016408, опубліковану 20060119 (JP заявка номер 2005-301155, подана 20051017); японську публікацію номер 2006016409, опубліковану 20060119 (JP заявка номер 2005-301157, подана 20051017); японську публікацію номер 2006016407, опубліковану 20060119 (JP заявка номер 2005-301153, подана 20051017); японську публікацію номер 2006008717, опубліковану 20060112 (JP заявка номер 2005-301151, подана 20051017); японську публікацію номер 2006008716, опубліковану 20060112 (JP заявка номер 2005-301150, подана 20051017); японську публікацію номер 2006008720, опубліковану 20060112 (JP заявка номер 2005-301158, подана 20051017); японську публікацію номер 2006008719, опубліковану 20060112 (JP заявка номер 2005-301154, подана 20051017); японську публікацію номер 2006008718, опубліковану 20060112 (JP заявка номер 2005-301152, подана 20051017); японська публікацію номер 2006008713, опубліковану 20060112 (JP заявка номер 2005-301147, подана 20051017); японську публікацію номер 2006008715, опубліковану 20060112 (JP заявка номер 2005-301149, подана 20051017); японську публікацію номер 2006008714, опубліковану 20060112 (JP заявка номер 2005-301148, подана 20051017) і японську публікацію номер 2006008712, опубліковану 20060112 (JP заявка номер 2005-301146, подана 20051017)]. Буде оцінене, що у деяких варіантах втілення винаходу, каротиноїди, продуковані клітинамихазяїнами, над якими здійснили певні маніпуляції, як описано авторами, включають в кінцевий продукт (наприклад, харчові або кормові добавки, фармацевтичний, косметичний засіб, засіб, що міс 35 тить барвник, і т.д.) у контексті клітини-хазяїна. Наприклад, клітини-хазяїни можуть бути ліофілізовані, висушені сублімацією, заморожені або іншим чином інактивовані, і потім цілі клітини можуть бути включені в кінцевий продукт або використані як кінцевий продукт. Клітина-хазяїн може також бути оброблена до включення в продукт для збільшення біодоступності (наприклад, через лізис). Альтернативно або додатково, кінцевий продукт може включати тільки частину клітини-хазяїна (наприклад, фракціоновану за розміром, розчинністю), відділену від цілого. Наприклад, у деяких варіантах втілення винаходу ліпідні краплі виділяють із клітин-хазяїв й включають в кінцевий продукт або використовують як кінцевий продукт. В інших варіантах втілення безпосередньо каротиноїди або індивідуальні каротиноїдні сполуки виділяють й включають в кінцевий продукт. Як зазначено вище, естери жирних кислот й глюкозидні естери представляють собою переважаючі каротиноїдні естери, виявлені у природі, тоді як додаткові естери (наприклад з органічними кислотами або неорганічним фосфатом) можуть бути синтезовані, щоб отримати корисні форми продукту. Для доставки, каротиноїдні естери можуть також бути приготовані у вигляді солі естеру [див., наприклад, патентну публікацію США номер 20050096477]. Кількість каротиноїду, включеного в даний продукт, може значно змінюватися залежно від продукту і конкретного каротиноїду (ів), що розглядається. Кількості можуть коливатися, наприклад, від менш ніж 0,01 % від маси продукту, до більш ніж 1 %, 10 %, 20 %, 30 % або більше; у деяких випадках каротиноїд може включати 100 % продукту. У деяких варіантах втілення винаходу, один або кілька продукованих каротиноїдів включаються у компонент продукту харчування або корму (наприклад, харчову добавку). Типи продуктів харчування, у які можуть бути включені каротиноїди відповідно до даного винаходу, практично не обмежені, і включають напої, такі як чаї, соки і лікери; кондитерські вироби, такі як желе й бісквіти; жировмісні харчові продукти й напої, такі як молочні продукти; оброблені продукти харчування, такі як рис й м'який рис (або вівсянка); дитяче харчування; або подібне. У деяких варіантах втілення цього аспекту винаходу, може бути корисним включити каротиноїди в тільця харчових ліпідів, оскільки це може полегшити включення в певні жировмісні продукти харчування. Приклади кормів, у які можуть бути включені каротиноїди, вироблені відповідно до даного винаходу, включають, наприклад, корми для домашніх тварин, такі як корм для кішок, корм для собак й 94038 36 т.п., корм для акваріумних риб, культивованої риби або ракоподібних, і т.д., корм для сільськогосподарських тварин (включаючи домашню худобу й додатково включаючи рибу, або ракоподібних, яких розводять в аквакультурі). Матеріал продуктів харчування або кормів, у який включений каротиноїд (и), вироблений відповідно до даного винаходу, переважно прийнятний для організму, для якого він призначається. Цей матеріал продуктів хархарчування або кормів може мати будь-які фізичні властивості, на цей час відомі для харчового матеріалу (наприклад, твердий, рідкий, м'який). У деяких варіантах втілення винаходу, один або кілька вироблених каротиноїдів включають у косметичний продукт. Приклади такої косметики включають, наприклад, косметику для догляду за шкірою (наприклад, лосьйони, емульсії, креми й т.п.), помади, косметичні засоби для захисту від сонця, декоративну косметику, аромати, продукти для щоденного використання (наприклад, зубні пасти, рідини для полоскання рота, освіжаючі засоби для роту, тверде мило, рідке мило, шампуні, кондиціонери), і т.д. У деяких варіантах втілення один або кілька вироблених каротиноїдів включають у фармацевтичні засоби. Приклади таких фармацевтичних препаратів включають, наприклад, різні типи таблеток, капсул, питних засобів, пастилок, засобів для полоскання, і т.д. У деяких варіантах втілення фармацевтичний засіб підходить для місцевого застосування. Лікарські форми практично не обмежені, і включають капсули, олії, гранули, кишковорозчинні гранули, порошки, таблетки, пілюлі, пастилки або подібне. Олії й заповнені олією капсули можуть забезпечити додаткові переваги як завдяки відсутності розкладання компоненту протягом виробництва, так і завдяки тому, що каротиноїд-вмісні ліпідні краплі відповідно до винаходу можуть бути легко включені у препарати на основі олії. Фармацевтичні препарати відповідно до даного винаходу можуть бути приготовлені відповідно до методів, встановлених в даній галузі, включаючи, наприклад, загальну процедуру, описану, наприклад, у Фармакопеї Сполучених Штатів. Каротиноїди, продуковані відповідно до даного винаходу, можуть бути включені в будь-який продукт, що містить пігмент, включаючи, наприклад, тканину, фарбу, і т.д. Вони можуть також бути включені в продукт, що є екологічним індикатором або інструментом, таким як біодатчик для використання у якості агенту для виявлення. Приклади Таблиця 26 нижче описує певні штами Yarrowia lipolytica, що використовуються в наступних прикладах: 37 94038 38 Таблиця 26 Штами Yarrowia lipolytica (Генотипи в LYC1, LYS1, XPR2, і PEX17 не були визначені в перехрещеннях, ні перевірені для штамів ATCC). Всі основні процедури молекулярної біології й маніпуляції з ДНК, описані авторами, зазвичай, виконуються згідно Sambrook et al. or Ausubel et al. (Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (eds). 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York; Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl К (eds). 1998. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley: New York). Приклад 1: Виробництво плазмід для створення каротиноїдного штаму. Для конструкції продукуючих каротиноїд штамів були зроблені плазміди. Наступні підрозділи описують виробництво плазмід, що кодують каротиногенні поліпептиди. Плазміди, що використо вуються в цих дослідженнях, і деталі їх конструкції описані в Таблиці 27. Додаткові деталі конструкції плазмід й описи їхнього використання знаходяться в тексті відповідного підрозділу. Всі PCR ампліфікації використовували NRRL Y-1095 геномну ДНК як шаблон, якщо не визначено інакше. Ген URA5, описаний нижче є алельним з ura2-21 ауксотрофією, як зазначено вище. Промотери GPD1 і TEF1 - із Y. lipolytica, як і термінатор XPR2. GGS1 - ген, який кодує ген Y.lipolytica, який кодує геранілгеранілпірофосфатсинтазу. Нуклеїнова кислота, що кодує послідовність, і закодований Ggs1 білок pMB4591 й pMB4683 наступні: 39 94038 40 Таблиця 27 Плазміни 41 Певні олігонуклеотиди, зазначені вище в Таб 94038 42 лиці 27, є наступними: 1A: Виробництво pMB4628 (teflp-carRP LEU2) що кодує фітоенсинтазу/лікопінциклазу: carRP, що містить інтрон, була ампліфікована від геномної ДНК M. сircinelloides (ATCC 90680), використовуючи MO4525 й MO4541: і отриманий 1.9 кб фрагмент був фосфорильований за допомогою T4 полінуклеотидкінази. Отриманий фрагмент був тупим кінцем лігований в pBluescriptSKII- розщеплену за допомогою EcoRV, внаслідок чого отримали pMB4599. 1.9 кб фраг мент XbaІ-MluІ від pMB4599 був вставлений в NheІ- і MluI-розщеплену pMB4603, внаслідок чого отримали pMB4628. Інтрон-вмісна нуклеїнова кислота, що кодує послідовність, і закодований білок CarRP pMB4628 є наступними: 43 94038 44 Альтернативно, pMB4599 також використовувалася як шаблон для PCR ампліфікації з використанням MO4318, MO4643, MO4644, і MO4639 й завдяки чому отримали фрагменти 0.5 й 0.95 кб, які були згодом розщеплені за допомогою Acc651 й Bsa1, і Bsa1 й PpuM1, відповідно. Ці фрагменти були ліговані у pMB4599, що була розщеплена за допомогою Аcc651 й PpuM1, внаслідок чого отримали pMB4613, заякорюючи carRP без інтрону. 1.85 кб фрагмент XbaІ-MluІ від pMB4613 може бути вставлений в Nhel- і МluI-розщеплену pMB4603 для отримання pCarRPdelІ. 1B: Виробництво pMB4638 (teflp-carB ADE1), що кодує фітоендегідрогеназу: Інтрон-вмісний carB був ампліфікований від геномної ДНК М. circinelloides (ATCC 90680), використовуючи MO4530 й MO4542: і отриманий 1.9 кб фрагмент був фосфорильований T4 полінуклеотидкіназою і лігований тупим кінцем у pBS-SKII-розщеплену з EcoKV, внаслідок чого отримали pMB4606. Після цього pMB4606 використовували як шаблон для для PCR ампліфікації, використовуючи MO4318 й MO4648, і MO4646 й MO4647, і MO4343 й MO4645: завдяки чому отримали фрагменти 0.4 й 0.85 та 0.7 кб, які були згодом розщеплені за допомогою Асс651 й BsaІ, і BsaІ, і Bsal та ВаmHI, відповідно. Ці фрагменти були ліговані у pBS-SKII-, що була розщеплена за допомогою Acc65l і ВаmHI, внаслідок чого отримали pMB4619, заякорюючу carB без інтрона. 1.75 кб фрагмент Xbal-MluI від pMB4619 був вставлений в NheI-и MluIрозщеплену pMB4629, внаслідок чого отримали pMB4638. Отримана кодуюча послідовність нуклеїнової кислоти і закодований CarB білок pMB4638 є наступними: 45 1С. Виробництво pMB4660 (teflр-carB URA3), кодуючої фітоендегідрогеназу: 4.3 кб фрагмент XhoІ-NotІ й 1.8 кб фрагмент NotI-SpeI від pMB4638 були ліговані у 1.9 кб BsaI- й SpeI-розщеплений Отримана кодуюча послідовність нуклеїнової кислоти і закодований CarB(i) білок pMB4660 є наступними: 94038 46 URA3 ген, отриманий PCR ампліфікацією геномної ДНК Y. lipolytica, використовуючи MO4684 й MO4685 для створення pMB4660: 47 94038 48 1D. Виробництво pMB4637 й pTef-HMG, що кодують зрізаний HMG1. Для виробництва зрізаного варіанта гену HMG-CoА редуктази, що також кодує 77 амінокислотну лідерну послідовність, отриману з S. cerevisiae, синтезовані наступні олігонуклеотиди: Праймери О и P використовуються для ампліфікації 0.23 кб фрагмента, що кодує Met-Ala, що супроводжується залишками 530 - 604 Hmgl білка S. cerevisiae, використовуючи геномну ДНК як шаблон. Праймери Q й MO4658 використовуються для ампліфікації 1.4 кб фрагмента, що кодує Cтермінальні 448 залишки Hmgl білка Y. lipolytica, використовуючи геномну ДНК як шаблон. Ці фрагменти ліговані у відповідний вектор клонування, і отримані плазміди, названі рОР й pQMO4658, пе ревіряють секвенуванням. Фрагмент OP вивільняється за допомогою XbaІ і AseІ, а фрагмент QMO4658 вивільняється за допомогою MaeІ й MluІ. Після цього ці фрагменти ліговані у ADE1 TEFlp вектор експресії pMB4629, розрізаний за допомогою XbaІ й MluІ до отримання pTefHMG. Альтернативно, нативний ген HMG1 від Y. lipolytica може бути модифікований без послідовностей S. сerevisiae, як описано в таблиці вище з використанням праймерів MO4658 (описаний вище) і MO4657 для створення pMB4637: Отримана кодуюча послідовність нуклеїнової кислоти і закодований Hmgltrunc білок pMB4637 є наступними: 49 94038 50 1Е. Виробництво pMB4692 (URA3 teflр-crtZ), що кодує каротингідроксилазу. Була синтезована наступна ORP послідовність каротингідроксилази (CrtZ); заснована на білковій послідовності Novosphingobium aromaticivorans, використовуючи зміщення кодону Y. lipolytica: Ця послідовність була розщеплена з використанням XbaІ й MluІ й лігована, разом з Acc65l-NheІ TEF1 фрагментом промотера від pMB4629, у pMB4662, розрізану за допомогою Acc65І й MluІ для отримання pMB4692. Кодуюча послідовність нуклеїнової кислоти зображена вище жирним і підкресленим шрифтом. Отриманий закодований crtZ білок pMB4692 є наступним: 1F. Виробництво pMB4698 (ADE1 teflp-crtW), що кодує каротинкетолазу. Нижченаведена ORP послідовність каротинкетолази (CrtW) була синтезована, базуючись на 51 94038 52 білковій послідовності природної послідовності, виділеної із Саргасового моря (ACCESSION в Genbank AACY01034193.1): Ця послідовність була розщеплена з використанням XbaІ й MluІ, і лігована у pMB4629, розрізану за допомогою Nhel й MluІ для отримання pMB4698. Кодуюча послідовність нуклеїнової кис лоти зображена вище жирним і підкресленим шрифтом. Отриманий закодований crtW білок pMB4698 є наступним: Приклад 2: Конструювання Yarrowia lipolytica для збільшення виробництва каротиноїдів. 2A. Виробництво Y. lipolytica, що експресує геранілгеранілпірофосфатсинтазу й фітоендегідрогеназу: MF350 (MATB ura2-21 leu2-35 ade1) був трансформований за допомогою pMB4591 (teflp-GGSl), що була розщеплена вище URA5 за допомогою Sspl; Ura+ трансформант, що містить плазміду в ura2 локусі був ідентифікований і названий MF364. Після цього він був трансформований за допомогою pMB4638 (teflp-carB), що була розщеплена при ADE1 за допомогою Sspl, і був обраний прототрофний трансформант, що заякорив плазміду в локусі ade1. Цей штам був названий MF502. 2B. Виробництво Y. lipolytica, що експресує геранілгеранілпірофосфатсинтазу, фітоендегідрогеназу й фітоенсинтазу/лікопінциклазу. MF502 був трансформований за допомогою pMB4628 (teflp-carRP), що була оброблена Sspl. Були обрані дев'ять прототрофних колоній, що були безбарвними, мали помаранчеве або дуже помаранчеве забарвлення на трансформаційному планшеті (Агар YNB з 1% глюкозою й 0,1 % глутаматом [YNBglut]) після двох – трьох днів росту. Дві, MF597 й MF600 (з дуже помаранчевим забарвленням), продукували більше ніж 4 мг каротину на г сухої клітинної маси (DCW – dry cell weight) після чотирьох днів росту в YPD при 30°C. Аналіз Саузерн показує різну окрему смугу Kpnl-HindIII у геномній ДНК від MF597 й MF600, жодна з яких не свідчить про те, що гомологічна інтеграція відбулася в leu2-270. 2C. Виробництво Y. lipolytica, що експресує фітоенсинтазу/лікопінциклазу й фітоендегідрогеназу: ATCC201249 (МАТА URA3-302 leu2-270 lys811) був трансформований за допомогою SspIрозщепленої pMB4628. Сотні Leu+ колонії були об'єднані, повторно вирощені і трансформовані за допомогою pMB4660 (teflp-carB), що була розщеплена вище URA3 за допомогою SalI. Була відібрана одна колонія, що була помітно жовта після 5 днів при 30°C на YNBglut плюс 0.6 мМ лізину, названа MF447 і, як виявилось, продукує 0,2 мг каротину на г сухої клітинної маси після 4 днів росту в YPD. В MF447 було введено розчин 1 г/л 5фторооротової кислоти й відібраних Ura- сегрегантів. Як не дивно, вони всі, як було виявлено, зберігали ідентичний жовтий зовнішній вигляд їхнього батька, підкреслюючи, що втрата функціонального гену URA3 не співпадає із втратою функціонального ферменту CarB. Аналіз Саузерн демонструє, що два фрагменти із KpnІ-HindІІІ-розщепленої MF447 ДНК, містять URA3p-гібридизуючі послідовності, тільки одна із яких також гібридизується з carB. Інший відсутній в MF578, Ura3- сегрегант обраний для подальших маніпуляцій. Залишок плазміди й аналіз послідовності ДНК, що охоплює carRP інтрон у штамах MF447, MF597 (приклад 2c) і MF600 (приклад 2c) виявив, що екзони 1 й 2 були суміжними й були кожний відділені інтронною послідовністю, що не містила оригінальний внутрішній сайт Sspl (присутній в pMB4628). 53 94038 2D. Виробництво Y. lipolytica, що експресує фітоенсинтазу/лікопінциклазуй фітоендегідрогеназу й геранілгеранілпірофосфатсинтазу: MF578 був трансформований за допомогою pMB4683 (teflp-GGSl), що була розщеплена за допомогою SalI (вище URA3) або за допомогою Stul (у межах GGSl ORF). Ura+ Leu+ колонії в обох випадках були забарвлені у яскравий помаранчевий колір на YNBglut+Lys і на YPD, і декілька продукувало більше ніж 4 мг каротину на г сухої клітинної маси при вирощуванні, як описано вище. Одна, MF633, містила єдину копію плазміди в локусі GGS1, як було зроблено висновок на підставі аналізу Саузерн. Інші виникли при негомологічних або більш складних інтеграціях. 2E. Виробництво Y. lipolytica, що експресує фітоенсинтазу/лікопінциклазу й фітоендегідрогеназу й геранілгеранілпірофосфатсинтазу: MF364 перехрещувалась з MF578, і спори від отриманого диплоїду посіяли на планшет на YPD на два – три дні при 30°C. проводився скринінг помаранчевих Leu+Ade-Ura- колоній на присутність tefp-carВ, tefp-carRP і tefp-GGSl шляхом PCR, і на високе виробництво каротиноїду (>4 мг/г сухої клітинної маси) після росту в рідкому середовищі YPD. Колонії, що відповідають цим критеріям, а також виявляють резистентність до 5фторооротової кислоти, як ознака, що вони заякорюють ura3-302 аллелі, обирають для подальших досліджень і після цього зазначаються як штами GBRPua. Такий штам відбирається для подальшого аналізу й модифікації. Приклад 3: Екстракція каротиноїдів із клітин Yarrowia liрolytica Випробування отриманих штамів у струшувальних колбах проводилося з використанням середовища YPD (1% дріжджового екстракту, 2 % пептону, 2% глюкози). 20 мл культур у 125-мл колбах вирощували при 30°C. Клітини Y. lipolytica були зібрані від 72-96-годинних культур, і були виконані екстракції для визначення форми й кількості каротиноїда. 1,8 мл культури помістили в епендорф. Клітини гранулювали й двічі промили 1 мл H2O. Після другого промивання, повторно суспендовані клітини перенесли у попередньо зважену пробірку з кришкою з отвором зверху, і клітини були ліофілізовані протягом ночі. Після висушування до кінця, пробірку зважили, щоб обчислити суху клітину масу. 0,25 мл із тієї ж культури у струшувальній колбі помістили в 2-мл пробірку із гвинтовою пробкою для екстракції каротиноїду. Клітини гранулювали, а супернатант був відібраний. Гранульовані клітини можуть бути заморожені при -80°C і зберігатись. Однаковий об’єм кубічних зерен двоокису 54 цирконію додали до клітинних гранул, разом із 1 мл крижаного розчиннику для екстракції (50/50 об/об суміш гексану й етилацетату, що містить 0,01 % бутилгідрокситолуолу (БГТ)). Після цього суміш була збовтана (Mini-BeadBeater-8, BioSpec Products, Inc) на максимальній швидкості протягом 5 хвилин при 4°C. Після цього суміш обертали на максимальній швидкості протягом 1 хвилини, і супернатант зібрали й осадили в охолодженому скляному 16-мл флаконі. Залишки клітин повторно екстрагували принаймні три рази, без додавання гранул двоокису цирконію; всі супернатанти були об'єднані в скляному16-мл флаконі. Після екстракції скляний флакон обертали протягом 5 хвилин при 2000 обертах на хвилину при 4°C у центрифузі Sorvall tabletop, і супернатант перенесли у новий охолоджений скляний 16-мл флакон. Для концентрації супернатанту використовувався Speed Vac (при кімнатній температурі в темному місці), і зразки зберігали при -20°C або -80°C безпосередньо до аналізу ВЕРХ. Перед аналізом ВЕРХ зразки повторно суспендували в 1 мл крижаного розчиннику на і потім перенесли в охолоджений флакон із темного скла. Згідно протоколу дослідження необхідно бути уважним, щоб уникати контакту з киснем, світлом, високою температурою і кислотами. Приклад 4: Визначення кількості виробництва каротиноїду за допомогою ВЕРХ Для аналізу каротиноїду зразки повторно суспендували в крижаному розчиннику для екстракції (50/50 об/об суміш гексану й етилацетату, що містить 0,01 % бутилгідрокситолуолу (БГТ)). Для розділення каротиноїду при 25°C використовувався пристрій Alliance 2795 ВЕРХ (Waters), обладнаний колонкою Waters XBridge C18 (3,5 мкм, 2,1 x 50 мм) і колонкою Thermo Basic & guard (2,1 x 10 мм); як стандарти використовувалися автентичні зразки каротиноїду. Рухомі фази й швидкості потоку показані нижче (Розчинник А = етилацетат; Розчинник B = Вода; Розчинник C = Метанол; Розчинник D = Ацетонітрил). Об’єм ін'єкції становив 10 мкл. Детектор - фотодіодний матричний детектор Waters 996. Часи утримування для ліпофільних молекул включають астаксантин (1,159 хвилини), зеаксантин (1,335), -aпo-8'-каротенал (2,86 хвилини), ергостерин (3,11 хвилини), лікопін (3,69 хвилини), -каротин (4,02 хвилини) і фітоен (4,13 хвилини). Aстаксантин, зеаксантин, -aпo-8'каротенал, лікопін й -каротин детектуються при 475 нм, тоді як ергостерин й фітоен були виявлені при 286 нм. Таблиця 28 Часи утримування для ліпофільних молекул Час (хв) 3.00 4.50 5.50 Потік (мл/хв) 0.50 1.00 1.00 1.00 %A 0.0 20.0 80.0 0.0 %B 20.0 0.0 0.0 0.0 %C 0.0 0.0 20.0 60.0 %D 80.0 80.0 0.0 40.0 Крива 6 6 6 55 94038 56 Продовження таблиці 28 6.50 7.50 8.50 9.50 10.50 1.00 1.00 1.00 1.00 0.50 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 20.0 20.0 80.0 100.0 100.0 0.0 0.0 20.0 0.0 0.0 80.0 80.0 6 6 6 6 6 Приклад 5: Експресія зрізаної форми HMGCoА редуктази призводить до збільшення виробництва каротиноїду Для збільшення виробництво каротиноїду підвищують потік вуглецю через ізопреноїдний шлях шляхом введення зрізаного варіанту гена HMGCoА редуктази. В одному підході, зрізаний варіант гена HMGCoА редуктази, що також кодує 77-амінокислотну лідерну послідовність, отриману від S. cerevisiae Hmgl, вводять у штам GRPBua (описаний у Прикладі 2E вище). Плазміда pTefHMG може бути розщеплена за допомогою SnaBІ, BbvCІ або Bsu36І, щоб спрямувати інтеграцію в локус ade1, або за допомогою BamHI, щоб спрямувати інтеграцію в локус HMG1, або за допомогою EcoKV, щоб сприяти довільній інтеграції у штамах GRPBua, відновлюючи їх до аденінової прототрофії. Проводиться скринінг отриманих Ade+ трансформантів на збільшення виробництва каротиноїду. Альтернативно, для створення pMB4637 нативний ген HMG1 від Y. lipolytica може бути модифікований без послідовностей S. сerevisiae, як описано в Прикладі 1D вище. Ця плазміда може бути розщеплена як описано для pTefHMG і трансформована в штами GRPBua, і проводиться скринінг отриманих трансформантів на збільшення виробництва каротиноїду. В іншому підході може використовуватися зрізаний варіант гену HMG-CoА редуктази N. crassa й вводитися в штами Y. lipolytica. Для отримання плазміди, що підходить для експресії гетерологічної HMG-CoА редуктази, p641P (Yeast 2001; 18 (2001): 97-113) модифікують шляхом заміни промотера ICLl на промотер GDP і додаванням послідовностей, що надають резистентність до флеоміцину. Геномна ДНК Y. lipolytica ампліфікується з двома праймерами. і отриманий фрагмент (0.7 кб) розщеплюється за допомогою BamHI й KpnI, і лігований до BamHІі KpnI-розщепленої p641P, створюючи плазміду «p641Pgpd». Після цього ble ген під контролем промотера GDP A. nidulans вирізається із pBCphleo (Silar, Fungal Genetics Newsletter 42:73) як 3.2 кб ВсlI-ВатHI фрагмент і вставляється в унікальний ВатHI сайт «p641Pgpd», в напрямку, що зберігає ВатHI сайт проксимальним до промотера GDP, для створення «p641Pgpdble», Геномна ДНК N. crassа ампліфікується з двома праймерами: і отриманий фрагмент розщеплюється за допомогою BamHI і вставляється в BamHІрозщеплену «p641Pgpdble» у правильній орієнтації. Отримана плазміда, «pZg», містить послідовності, що кодують зрізаний цитозольний каталітичний домен гідроксиметилглутарил-CoА редуктази від N. crassa (ACCESSION в Genbank: XP_324892) під контролем конститутивного промотера GDP. Ця плазміда може бути введена в штам Y. lipolytica, створений в Прикладі 2E вище, і трансформанти обираються за їхньою резистентністю до флеоміцину (100 мкг/мл). Отримані трансформанти випробовують на виробництво -каротину, як описано вище. Приклад 6: Введення гетерологічних генів каротингідроксилази і каротинкетолази в штами Y. lipolytica, що продукують каротиноїд для виробництва астаксантину. Для введення каротингідроксилазы й каротинкетолази у продукуючу каротиноїд Y. lipolytica, pMB4692 й pMB4698, як описано у Прикладі 1Е і 1F вище, можуть бути послідовно введені у штам GRPBua (описаний у Прикладі 2E). Для введення pMB4692 плазміда може бути розщеплена за допомогою SalI або BsrGI, щоб спрямувати інтеграцію в ura3 локус, або за допомогою XbaІ, щоб сприяти довільній інтеграції, обирабчи на урацильну прототрофію. Проводиться скринінг GRPBua Ura+ трансформантів, що заякорюють pMB4692, на виробництво зеаксантину в YPD. Продукуючі зеаксантин клітини трансформуються за допомогою pMB4698 (яка може бути розщеплена за допомогою PpuMІ, SspІ або BbvCІ, щоб спрямувати інтеграцію в локус ade1, або за допомогою EcoKV, щоб сприяти довільній інтеграції, і проводиться скринінг прототрофних колоній на виробництво астаксантину. Альтернативно, порядок трансформації плазміди може бути зворотнім, при якому спочатку трансформується pMB4698, і трансформанти відбираються на аденінову прототрофію. Проводиться скринінг GRPBua Ade+ трансформантів, що зая 57 94038 58 корюють pMB4698, на виробництво кантаксантину. Продукуючі кантаксантин GRPBua [pMB4698] клітини трансформуються за допомогою pMB4692, і проводиться скринінг прототрофних колоній на виробництво астаксантину. В іншому підході, гени каротиноїдкетолази і каротиноїдгідроксилази від P. marcusii можуть бути введені в штами, описані в Прикладі 2 вище, для перетворення -каротину в астаксантин. Геномна ДНК P. marcusii ампліфікується з двома праймерами. і отриманий фрагмент розщеплюється за допомогою BsmBІ, модифікується фрагментом Klenow ДНК-полімерази, і розщеплюється за допомогою BglІІ. Цей фрагмент вставляється в PmlIі BamHI-розщеплену pINA1269 (J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2000): 207-216), що містить hp4d промотер, термінатор XPR2, селектабельний ген LEU2 і послідовності, необхідні для вибору й розмноження в E. coli. Отримана плазміда «рА» містить послідовності, що кодують каротингідроксилазу від P. marcusii (crtZ ген) (ACCESSION в Genbank: CAB56060.1) під контролем hp4d промотера. «pYEGlTEF» модифікується шляхом заміщення термінатора LIP2 на термінатор XPR2 наступним чином. pINA1291 розщеплюється за допомогою AvrІІ, модифікується фрагментом Klenow ДНКполімерази і розщеплюється за допомогою ЕсоRI, і маленький LIP2t-вмісний фрагмент лігується до «pYEGlTEF», що була розщеплена за допомогою SacІІ, модифікована T4 ДНК полімеразою у присутності dNTP і розщеплена за допомогою ЕсоRI. Отриману плазміду назвали «рYEGlTEF-LIP2t». Для ампліфікації гену каротиноїдкетолази, геномна ДНК P.marcusii ампліфікується з двома праймерами. і отриманий фрагмент розщеплюється за допомогою AvrІІ й HindІІІ, і вставляється в AvrІІ- й HindІІІ-розщеплену «pYEGlTEF-LIP2t». Отримана плазміда, «pBt», містить послідовності, що кодують каротинкетолазу (crtW ген) (ACCESSION до Genbank: CAB56059.1) під контролем конститутивного промотера TEF1. Для поєднання двох касет експресії в одній плазміді, «pBt» розщеплюється за допомогою СlaI, модифікується фрагментом Klenow ДНКполімерази і розщеплюється за допомогою ЕсоRI, і crtW-вмісний фрагмент видяляється, змішується з адаптерною парою фосфорильованих олігонуклеотидів: «pABt», містить і касету TEFlp/crtW/LIP2t й касету hp4d/crtZ/XPR2t, а також селектабельний ген LEU2. «pABt» може бути введена в штам Y. lipolytica, описаний вище в Прикладі 4 (TEFlp/al-l/XPR2t; hp4dlcarRPILIP2t; GPDp/HMGRtrunc), і трансформанти відбираються на лейцинову прототрофію. Приклад 7: Часткова інактивація ERG9 гену Y. lipolytica, що кодує скваленсинтазу, призводить до збільшення виробництва каротиноїду: 7A. Щоб частково інактивувати ген ERG9, що кодує скваленсинтазу, сусідній ген FOL3 руйнується, що призводить до потреби в фоліновій кислоті. Після цього цей штам трансформується за допомогою мутагенізованого фрагменту ДНК, що частково охоплює два гени, і проводиться скринінг Fol+ трансформантів на зменшення активності скваленсинтази. Синтезуються наступні олігонуклеотиди: розщеплюється за допомогою NotІ, і лігується в NotI-розщеплену «рА». Отримана плазміда, і використовується для ампліфікації 2.3 кб фрагмент із геномної ДНК Y. lipolytica, що охоплює більшість гену FOL3, використовуючи Pfu полімеразу. Отриманий фрагмент розщеплюється за допомогою XbaІ й фосфорилюється, після цього лігується в pBluescriptSK-, що була розщеплена за допомогою KpnІ, оброблена T4 ДНК-полімеразою (T4pol) у присутності dNTPs, і згодом розщеплена за допомогою XbaІ. Після цього отримана плазміда, названа pBS-fol3, розщеплюється за допомо гою Acc65І й EcoRІ, оброблюється за допомогою T4pol як зазначено вище, і лігована до 3.4 кб EcoRV-SpeI ADE1 фрагменту (обробленого за допомогою T4pol) від pMB4529. Отримана плазміда, pBSfol3Δade, може бути розщеплена за допомогою BsiWІ й XbaІ до вивільнення 5.5 кб фрагмента, що використовується для трансформації штамів GRBPua, описаних вище, для аденінової прототрофії. Проводиться скринінг отриманих Ade+ трансформантів на потребу в фо 59 94038 60 ліновій кислоті, і на гомологічну інтеграцію за допомогою PCR аналізу. Штами, які заякорюють отриманий fol3ΔADE1 алель, можуть бути трансформовані зa допомогою 3.5 кб ДНК-фрагмента, отриманого шляхом мутагенної PCR ампліфікації з використанням праймерів: і геномної ДНК Y. lipolytica у якості шаблону. Отриманий фрагмент, що містить N-термінальні три чверті FOL3 ORF і C-термінальні дев'ять десятих ERG9 ORF використовуються для трансформації штамів. Проводиться скринінг отриманих Fol+Ade- трансформантів на зменшення активності скваленсинтази за чутливістю агентів, таких як сарагосова кислота, ітраконазол або флуконазол. Додатково, проводиться скринінг отриманих трансформантів на збільшення виробництва каротиноїду. 7B. Альтернативно, PCR фрагмент, отриманий в 7A, міг бути клонований і змінений у такий спосіб, щоб видалити 3'-нетрансльовану ділянку гена ERG9. Заміна руйнування fol3ADE1 цим фрагментом приводить до зменшення експресії скваленсинтази [Schuldiner et al. (2005), Cell 123:507519][Muhlrad and Parker (1999), RNA 5:1299-1307], що може бути підтверджено як в 7A. Цей підхід може також застосовуватися в штамі Fol+Ade- з використанням маркера ADE1 для руйнування ERG9 3'-UTR. 7C. В ще іншому підході, в S. cerevisiae можуть бути ідентифіковані частково дефектні аллелі ERG9 з використанням техніки тасування плазмід [Boeke et al. (1987), Мethods Enzymol. 154:164175], і застосовуючи чутливість до препаратів як фенотип. Дефектні гени можуть бути перенесені в Y. lipolytica, використовуючи стандартні методи молекулярної генетики. Приклад 8: Обробка штамів Y. lipolytica, що продукують каротиноїд, інгібітором конкурентного поліпептиду біосинтезу ізопреноїдів призводить до збільшення виробництва каротиноїду Культури, отримані у Прикладі 2, оброблюють інгібітором скваленсинтази, сарагосовою кислотою (сарагосовою кислотою при 0,5 мкМ) і проводять моніторинг на виробництво β-каротину, як описано вище. Приклад 9: Конструювання оліїстого штаму Saccharomyces cerevisiae Гени, що кодують дві субодиниці ATPцитратліази від N. crassa, АМР деаміназу від Saccharomyces cerevisiae і цитозольний яблучний фермент від М.circinelloides зверхекспресуються в штамах S.cereviseae, щоб збільшити загальний вміст ліпідів. Подібні підходи до збільшення виробництва ліпідів могли використовуватися в іншому організмі-хазяїні, такому як Xanthophyllomyces dendrorhous (Phаffia rhodozyma) з використанням тих же самих гомологічних або функціонально подібних олеагенних поліпептидів. Для приготування матричної РНК із ліофілізованої біомаси, підготовленої із культур N.crassa, використовуються набори Qiagen RNAEasy (Qiagen, Валенсія, Каліфорнія). Після цього проводиться RT-PCR у дві реакції, що містять шаблон мРНК і будь-яку з наступних пар праймерів. Отриманий фрагмент від acll реакції розщеплюється за допомогою SpeІ і BamHI, а фрагмент від acl2 реакції розщеплюється за допомогою ВamHI й SphI, і обоє лігуються разом в YEp24, що була розщеплена за допомогою NheI й SphI, створюючи плазміду «pl2». Двонаправленний промотер GAL1-10 ампліфікується від геномної ДНК S. cerevisiae, використовуючи праймери. і отриманий 0.67 кб фрагмент розщеплюється за допомогою ВamHI й лігується у будь-якій орієнтації у ВamHI-розщеплену «p12» для створення «p1gal2» й «p2gal1», що містять GALl-acl1/GAL10acl2 й GAL10-acl1/GALl-acl2, відповідно (надхо ження у Genbank: acl1: CAB91740.2; acl2: CAB91741.2). Щоб ампліфікувати ген S. cereviseae, що кодує АМР деаміназу й промотер, який підходить для експресії цього гену, геномна ДНК S. cerevisiae