Бензаміди як засіб для лікування нейродегенеративного стану, спосіб їх одержання (варіанти), фармацевтична композиція для лікування нейродегенеративних станів та спосіб лікування

Опис Галузь винаходу Цей винахід стосується похідних бензаміду, що містять їх фармацевтичні композиції, способів одержання цих похідних і їх застосування для лікування і попередження нейродегенеративних станів. Передумови створення винаходу Нейродегенеративні стани охоплюють цілий ряд серйозних порушень, до яких віднесено хворобу Паркінсона, аміотрофічний боковий склероз (ALS, хвороба Лу Гехрига) (Lou Gehrig), розсіяний склероз, хворобу Хантінгтона, хворобу Альцгеймера, діабетичну ретинопатію, мультиінфарктну деменцію, дегенерацію жовтої плями сітківки й інші. Ці порушення характеризуються поступовим, але неослабним погіршенням стану здоров'я пацієнта протягом певного періоду часу. Механізми і причини цих захворювань поступово вивчалися, і на цій основі пропонувалися різноманітні методи лікування. Одне з таких нейродегенеративних порушень, хвороба Паркінсона, пов'язана з аномальним вичерпанням допаміну в окремих ділянках головного мозку. Недавні огляди літератури в області вивчення хвороби Паркінсона зроблені Марсденом (Marsden С.D.) у статті "Хвороба Паркінсона (Parkinson's Disease), опублікованої В Lancet (April 21, 1990), 948-952, і Кальне (Calne D.В.) у статті "Лікування хвороби Паркінсона" (Treatment of Parkinson's Disease), опублікованої в NEJM (Sept. 30, 1993), 329. 1021-1027. Показано, що дефіцит допаміну ідентифіковано як ключову характеристику хвороби Паркінсона, а деструкція допамінергійного нігростріального метаболічного шляху йде паралельно з вичерпанням допаміну у пацієнтів з хворобою Паркінсона. Швидкий розвиток симптомів, подібних до хвороби Паркінсона, у невеликої групи хворих - споживачів незаконних лікарських препаратів у м.Сан-Хосе, шт.Каліфорнія, пов'язано із слідами токсичних домішок, присутніх в ліках, отриманих в домашніх умовах. Наступні дослідження, проведені Паркінсоном на моделях тварин, що включають мавп, показали, що причиною захворювання із симптомами, подібними хвороби Паркінсона, що розвивалися у споживачів незаконних ліків, є 1-метил-4-феніл-1,2,5,6-тетрагідропіридин (МФТГП) (Langston et a1., "Chronic Parkinson'ism in Humans Due to a Product of Mependi'ne-Analog Synthesis", Science, February 25,1983, 219. 979-980). Ці ранні відкриття і стимульовані ними численні дослідження призвели до створення надійних моделей хвороби Паркінсона (Heikkila R. Ε. et al., "Dopaminergic Neurotoxicity of 1-Methyl-4-Phenyl-1,2,5,6-Tetrahydropyridine in Mice", Science, June 29, 1984, 224. 1451-1453; Burns R. S. et al., "A Primate Model of Parkinsonism", Proc. Nail. Acad. Sci. USA, 1983, 80., 4546-4550; Singer T. P. et al., "Biochemical Events in the Development of Parkinsonism... ", J. Neurochem., 1987, 1-8; Gerlach M. et al., "MPTP Mechanisms of Neurotoxicity and Implications for Parkinson's Disease", European Journal of Pharmacology, 1991, 208, 273-286). Ці й інші роботи описують результати досліджень для того, щоб допомогти в поясненні механізму порушення рухової активності при хворобі Паркінсона, викликаної введенням МФТГП. Вони ясно вказують на той факт, що МФТГП є причиною появи паркинсоно-подібних симптомів у людей, що приймають забруднені домішками незаконні лікарські препарати, і що подібні рухові порушення були установлені в інших приматів і піддослідних тварин, котрим безпосередньо вводили МФТГП. Результати робіт додатково вказують, що введення МФТГП викликає помітне зменшення в них концентрації допаміну. Зроблені відкриття привели до розробки біологічного випробування для агентів, ефективних при лікуванні нейродегенеративних порушень, пов'язаних із допаміном, таких як хвороба Паркінсона. У цьому випробуванні піддослідним тваринам дають певну кількість МФТГП, адекватну тій кількості, що викликає сильне зниження рівня допаміну. Далі вводять досліджувані сполуки для того, щоб визначити, чи спроможні вони попередити втрати допаміну у піддослідних тварин. У тому ступені, в якому зберігається концентрація допаміну, досліджувану сполуку можна розглядати у якості ефективного агента для уповільнення або припинення розвитку нейродегенеративного захворювання, наприклад, хвороби Паркінсона. Була також розроблена й інша методика біологічного випробування для агентів, ефективних при лікуванні нейродегенеративних порушень, пов'язаних із допаміном. У цьому випробуванні в "смугасте тіло" піддослідних тварин уводять нейротоксикант, 6-гідроксидопамін. Ця сполука справляє дію, спрямовану на зниження концентрації допаміну, і широко застосовується для моделювання такого стану. "Досліджувані сполуки вводять для того, щоб визначити, чи спроможні вони попередити або знизити втрати допаміну у піддослідних тварин. Як і в попередньому випадку, у тому ступені, у якому зберігається концентрація допаміну, досліджувану сполуку можна розглядати у якості ефективного терапевтичного агента. Мітохондріальна функція пов'язана з багатьма нейродегенеративними порушеннями, такими як аміотрофічний бічний склероз (ALS), хвороба Хантингтона, хвороба Альцгеймера, мозочкова дегенерація і власне старіння організму (Beal M. F., "Mitochondrial Dysfunction and Oxidative Damage in Neurodegenerative Diseases", R. G. Landes Publications Austin, TX, 1995, наприклад на сторінках 53-61 і 73-99). Мітохондріальні порушення представляє собою механізм, за яким МФТГП виснажує вміст допаміну в неостріатумі (Mizuno Υ., Mori Η., Kondo Т. у статті "Potential of Neuroprotective Therapy in Parkinson's Disease", CNS Drugs, 1994,1, 4546). У такий спосіб агент, що захищає від мітохондріальної дисфункциї, викликаної МФТГП, може бути корисним при лікуванні захворювань центральної нервової системи, коли причина, що лежить в основі захворювання, представляє собою мітохондріальну дисфункцію. Крім того, є моделі для визначення ефективності лікарських засобів при лікуванні інших нейродегенеративних станів. Наприклад, ефективність проти хвороби Альцгеймера можна визначити в випробуваннях на клітинних культурах. У двох таких випробуваннях сполуки оцінюють на їхню спроможність здійснювати захист проти амілоїду β (25-35) або втрати нервових клітин, що викликаються глутаматом, в культурах астроцитів або гіпокампа ембріона пацюка. У іншому випробуванні сполуки оцінюють на їхню спроможність втручатися в утворення амілоїдного β(1-40) β-складчастого листа. Сполуки, що забезпечують цей ефект, можна розглядати як можливі агенти для лікування хвороби Альцгеймера. Хоча бензамідні похідні відомі, їхнє призначення було в головному пов'язано з застосуванням у якості проміжних сполук для хімічного синтезу або в області, не пов'язаній з цим винаходом. Незначні структурні зміни призводять до великих відмінностей у їх ефективності і токсичності. Скринінг значної більшості похідних бензаміду показав незначну активність або її повну відсутність у цих сполук. Проте, у літературі є повідомлення щодо біологічної активності інших бензамідів, що відрізняються за структурою. Цих повідомлень стосуються такі роботи: El Tayar et al., "Interaction of neurolepric drugs with rat striatil D-1 and D-2 dopamine recepiors: a quantitative structure - affinity relationship study" Fur. J. Med. Chem. (1988) 21:173-182; Monkovic et al., "Potential non-dopaminergic gastrointestinal prokinetic agents in the series of substituted benzamides" Eur. J. Med. Chem. (1989) 24:233-240; Banasik et al., "Specific inhibitors of poly(ADP-Ribose) synthetase and mono(ADP-ribosyl)transferase" J. Biol. Chem. (1992) 261:1569-1575; Bishop et. a. "Synthesis and in vitro evaluation of2. 3-dimethoxy-5-(fluoroalkyl)-substituted benzamides: highaffinity ligands for CNS dopamine D: receptors" J. Med. Chem. (1991) 11:1612-1624; Hogberg et al., "Potential antipsychotic agents. 9. Synthesis and srereoselective dopamine D-2 receptor blockade of a potent class of substituted (R)-N-[benzyl-2-pyrrolidinyl)methyl]benzamides. Relations to other side chain congeners" J. Med. Chem. (1991) 34:948-955; Katopodis et al., "Novel substrates and inhibitors of peptidyiglycine oc-amidating monooxygenase" Biochemistry (1990) 29:4541-4548; і Rainnie et al.. "Adenosine inhibition of mesopontine cholinergic neurons: implications for EEG arousal" Science (1994) 261:689-690. Інші фармацевтичні композиції, які містять бензамід , і їхнє застосування для лікування або попередження нейродегенеративних станів, розкриті в спільному патенті США 5 472 983. Виклад суті винаходу Розкриваються фармацевтичні композиції на основі бензаміду, що мають активність проти нейродегенеративних захворювань. В ці композиції входять одна і більше сполук із числа похідних ацетамідобензаміду, амінобензаміду або нітробензаміду формули 1 у якості активного агента в фармацевтично прийнятному носії. де R' являє собою насичений алкіл, що містить від 3 до 5 атомів вуглецю, кожен R незалежно представляє собою -NH-CO-СНз, -NO2 або -NH2, і n=1 або 2, при наступних умовах: 1) коли n=1 і R являє собою -NO2 у положенні 4 кільця, R' не є трет-бутилом, ізобутилом або пропілом; 2) коли n=1 і R представляє собою -ΝΟ2 в положенні 2 кільця, R' не є ізобутилом або пропілом; і 3) коли n=2 і R' представляє собою трет-бутил і обидва R представляють собою -ΝΟ2, ці групи R не знаходяться в положеннях 3 і 5 кілець. Носій переважно є речовиною для прийому усередину, проте може також представляти собою і носій, застосовуваний для ін'єкцій. Ці фармацевтичні композиції можуть бути в нерозфасованому вигляді "ангро" або подані у вигляді одиничної дози. У кращому варіанті в склад фармацевтичних композицій входять одна і більше похідних ацетамідобензаміду формули II у якості активного агента. Ці композиції виявляють активність проти хвороби Паркінсона, яка вимірюється їхньою спроможністю попереджати зниження рівня допаміну, що викликається МФГТП і 6-гідроксидопаміном. R' у формулі II представляє собою прямий, розгалужений або циклічний насичений алкіл, що містить від 3 до 5 атомів вуглецю, і n=1 або 2. Деякі з бензамідних похідних, застосовуваних у цих композиціях, є відомими сполуками, у той час як інші є новими. Ці нові сполуки, а також деякі інші нові нітробензаміди й амінобензаміди, що можуть використовуватися в якості проміжних хімічних сполук для одержання активних речовин, складають додаткові аспекти цього винаходу. Таким чином, предметом винаходу є ацетамідо-бензаміди формули II, де R' представляє собою прямий, розгалужений або циклічний насичений алкіл, що містить від З до 5 атомів вуглецю, і n=1 або 2, за умови, що, якщо коли n=1 і R' представляє собою або н-бутил або н-пропіл, ацетамідогрупа не знаходиться в положенні 2 кільця; коли n=1, ацетамідогрупа не знаходиться в положенні 3 кільця; і коли n=2, ацетамідогрупи не знаходяться в положеннях 3 і 5 кільця. Ще один аспект винаходу становлять такі нітро- і амінобензаміди: N-трет-аміл-4-нітробензамід (СРІ1033), N-1,2-диметил-пропіл-4-нітробензамід (СРІ1085), N-н-бутил-3-нітробензамід (CPI1135), N-н-пентил-4нітробензамід (CPI1140), N-2-метилбутил-4-нітробензамід (CPI1146), N-н-бутил-3,5-динітробензамід (CPI1147), Ν- метилциклопропіл-4-нітробензамід (CPI1164), N-н-бутил-2-нітро-бензамід (CPI1173), N-н-пентил2-нітробензамід (CPI1174), і N-метилциклопропіл-4-амінобензамід (СРІ1240). Цифрові позначення СРІ, які показані для кожної з цих сполук і використовуються по всьому описі, є їх внутрішніми ідентифікаційними номерами і застосовуються для того, щоб спростити представлення даних у Прикладах. Іншим аспектом цього винаходу є спосіб лікування пацієнта, що страждає від нейродегенеративного захворювання і, зокрема, від захворювання, пов'язаного з допаміном. Спосіб включає уведення відповідної ефективної терапевтичної кількості однієї і більше вищеописаних фармацевтичних композицій. Ще одним аспектом цього винаходу є спосіб лікування пацієнта, що страждає від порушення, що характеризується поступовою утратою функцій центральної нервової системи (ЦНС). Спосіб включає введення такому пацієнту ефективної кількості однієї і більш вищеописаних фармацевтичних композицій. Найважливішим аспектом цього винаходу є спосіб лікування пацієнта, що страждає поступовою утратою функції ЦНС, пов'язаної з хворобою Паркінсона. Спосіб включає введення такому пацієнту (переважно внутрішньо) ефективної кількості однієї і більше вищеописаних фармацевтичних композицій. Іншим аспектом цього винаходу є спосіб лікування пацієнта, що страждає поступовою утратою функції ЦНС, яка обумовлена мітохондріальною дисфункцією. Спосіб включає введення такому пацієнту ефективної кількості однієї і більше вищеописаних фармацевтичних композицій. Додатковим аспектом цього винаходу є способи одержання сполук формул 1 і II. Ці способи включають конденсацію алкіламіну, що містить від 3 до 5 атомів вуглецю, з моно-або динітробензоїлгалогенідом, що має нітро-конфігурацію, яка відповідає бажаному нітро-, аміно- або ацетамідозаміщенню в цільовій сполуці, необов'язкове відновлення нітрогруп, і необов'язкове перетворення амінобензамідів в ацетамідобензаміди шляхом взаємодії з ацетилгалогенідом. Докладний опис винаходу Бензаміди Цей винахід передбачає застосування деяких ацетамідобензамідів, амінобензамідів і нітробензамідів у якості активних фармацевтичних агентів. Ацетамідобензаміди описуються формулою 1, коли R представляє собою ацетамідогрупу, і формулою II. У цих формулах R1 представляє собою насичений алкіл, який містить від 3 до 5 атомів вуглецю, і n=1 або 2. Ацетамідогрупа (або групи) можуть бути присутньою у будь-якому місці кільця. Кращі приклади включають випадок, коли n=1 і ацетамідогрупа знаходиться в положенні 2, 3 або 4 кільця, і коли n=2 і ацетамідогрупи знаходяться в положеннях 2 і 3, 2 і 4, 2 і 5, 2 і 6, 3 і 4 або 3 і 5 кільця. Що стосується алкілзамісників R', то кращими є сполуки, де R' представляє собою алкіл, що не включає водень у альфа-вуглецевого атому, тобто атому вуглецю, який зв'язаний з атомом азоту кільця. Прикладами кращих R'-груп є трет-бутил і трет-аміл. Особливий інтерес викликають такі ацетамідобензаміди формули 1: N-трет-бутил-4-ацетамідобензамід (CPI1189), N-ізопропіл-4-ацетамідобензамід (CPI1232), N-трет-аміл-4-ацетамідобензамід (СРІ1233), N-трет-бутил-3-ацетамідобензамід (CPI1234) і N-метилциклопропіл-4-ацетамідобензамід (СРІ1241). Найбільшу перевагу з похідних бензаміду надають N-трет-бутил-4-ацетамідобензамід (CPI1189). В сімействі ацетамідобензамідів є численні нові сполуки. Зокрема, це ацетамідобензаміди формули 1, коли R представляє собою ацетамідогрупу, і формули II, де n=1 або 2 і R' представляє собою насичений алкіл, що містить від 3 до 5 атомів вуглецю, за умови, що коли n=1 і R' представляє собою або н-бутил або н-пропіл, ацетамідогрупа не знаходиться в положенні 2 кільця; коли n=1, ацетамідогрупа не знаходиться в положенні 3 кільця; і коли n=2, ацетамідогрупи не знаходяться в положеннях 3 і 5 кільця. П'ять вищевказаних ацетамідобензамідів, використовуваних у якості кращих активних агентів, представляють собою кращі нові сполуки, причому найкращою є сполука CPI1189. Амінобензаміди і нітробензаміди, застосовувані в якості активних агентів, описуються формулою 1, де R аміно- або нітрогрупа. У цих формулах R' представляє собою насичений алкіл, що містить від 3 до 5 атомів вуглецю, і n=1 або 2, із тими ж кращими значеннями заступників і їхніх становищ, вказаними для ацетамідобензамідів, і, крім того, за умови, що 1) коли n=1 і R представляє собою -ΝΟ2 у положенні 4 кільця, R' не є трет-бутилом, ізобутилом або пропілом; 2) коли n=1 і R представляє собою -ΝΟ2 у положенні 2 кільця, R' не є ізобутилом або пропілом; і 3) коли n=2 і R' представляє собою трет-бутил, і обидва R представляють собою -ΝΟ2, ці групи R не знаходяться в положеннях 3 і 5 кільця. Особливу цікавість викликають такі амінобензаміди і нітробензамщи формули 1: N-ізопропіл-4-нітробензамід (СР11026), N-трет-бутил-3-нітробензамід (CPI1034), N-трет-бутил-2-нітробензамід (СР11035), N-н-бутил-4-нітробензамід (СРІ1045), N-н-пропіл-4-нітробензамід (CPI1047), Ν-трет-бутил-3,5-динітробензамід (CPI1049), N-1-метилпропіл-4-нітробензамід (CPI1084), N-трет-бутил-4-амінобензамід (CPI1160) і N-трет-бутил-3-амінобензамід (CPI1248). У сімействі амінобензамідів і нітробензамідів є численні нові сполуки; крім того, є і додаткові нові сполуки, що служать проміжними продуктами в синтезі вказаних сполук і описаних вище похідних ацетамідобензамідів. Зокрема, до цих нових аміно- і нітробензамідів входять такі сполуки: N-трет-аміл-4-нітробензамід (CPI1033), N-1,2-диметилпропіл-4-нітробензамід (CPI1085), N-н-бутил-3-нітробензамід (CPI1135), N-н-пентил-4-нітробензамід (CPI1140), N-2-метилбутил-4-нітро6ензамід (CPI1146), N-н-бутил-3,5-динітробензамід (CPI1147), N-метилциклопропіл-4-нітробензамід (CPI1164), N-н-бутил-2-нітробензамід (CPI1173), N-н-пентил-2-нітробензамід (CPI1174) і N-метилциклопропіл-4-амінобензамід (CPI1240). Якщо похідна бензаміду містить аміногрупу, як у випадку сполуки CPI1240, даний амінний замісник може бути присутнім як самий по собі, так і у вигляді солі. У сольовій формі аміногрупа протонується в катіонну форму в сполученні з фармацевтично прийнятним аніоном, таким, як хлорид, бромід, иодід, гідроксил, нітрат, сульфонат, метансульфонат, ацетат, тартрат, оксапат, сукцинат або пальмоат. Якщо в описі роблять посилання на амінобензаміди, то слід розуміти, що сюди включені також і згадані солі. Спільний патент США 5 472 983, на який вище було зроблено посилання, розкриває кілька бензамідів, корисних при лікуванні нейродегенеративних захворювань, що ґрунтується на їхній захисній дії (вивчення на моделі хвороби Паркінсона, що ініціюється МФТГП, на мишах). N-трет-бутил-4-ацетамідобензамід (CPI1189) представляє собою продукт біоперетворення in vivo одного з цих бензамідів (N-трет-бутил-4-нітробензаміду (CPI1020)), знайдений у крові пацюків і мишей, котрим сполуку CPI1020 вводили усередину. Ця речовина, очевидно, утворюється в організмі завдяки відновленню кільцевої нітрогрупи сполуки CPI1020 в аміногрупу (CPI1160) із наступним ацетилюванням аміно-функціональності. Сполуки, заявлені в цьому винаході, експериментально проілюстровані продуктом CPI1189, мають набагато більшу активність, ніж CPI1020 (приблизно в 10 разів) для захисту мишей від зниження концентрації допаміну в смугастому тілі, викликаного підшкірним уведенням МФТГП. На підставі структуро-подібних молекул, таких, як ацетамінофен, які містять ацетамідогрупу, ці сполуки повинні бути більш безпечні, ніж CPI1020, оскільки вони не повинні трансформуватися в ході обміну речовин в організмі, приводячи до утворення метаболітів, що містять гідроксиламіни (позитивний результат тесту Еймса) і, мабуть, не призводить до появи аміно-метаболітів, спроможних справляти серцево-судинний і/або анорексичний ефект. Фармацевтичні композиції На основі похідних бензамідів формули 1 і II можна приготувати фармацевтичні композиції, придатні як для внутрішнього прийому, так і для введення іншими шляхами, зокрема, парентерально шляхом ін'єкцій або внутрішньовенного вливання. Фармацевтичні композиції, що використовують N-трет-бутил-4-ацетамідобензамід (CPI1189), N-третбутил-3-ацетамідобензамід (СРІ1234), N-трет-аміл-4-ацетамідобензамід (СРІ1233), N-трет-бутил-4амінобензамід (CPI1160), N-трет-бутил-3-нітробензамід (СРІ1034) і N-трет-бутил-3-амінобензамід (CPU248), є кращими, причому композиції на основі N-трет-бутил-4-ацетамідобензаміду (CPI1189) у даний час є такими, яким слід надати найбільшу перевагу. Композиції для внутрішнього введення можуть бути присутнім в нерозфасованих рідких розчинах, суспензіях або порошках. Проте, більш поширеними є композиції у вигляді одиниць, що дозуються, що полегшує досягнення точності введення. Типові одиничні форми, що дозуються, включають попередньо заповнені і градуйовані ампули та шприци для рідких композицій і таблетки, коржі, капсули та ін. у випадку твердих композицій. В таких композиціях бензамідна похідна складає невеличку частину від загальної ваги (від 0,1 до 50% ваг., переважно від 1 до 40% ваг.), причому частина, що залишилася, припадає на різні носії і допоміжні додатки, корисні для готування дозованої форми. Рідкі композиції включають підходящі водні і неводні розчинники разом з агентами, які буферують, суспендують і диспергують, барвниками, ароматизаторами й іншими додатками. До твердих форм відносять, наприклад, будь-який із таких інгредієнтів або сполук аналогічної природи: зв'язуюче, таке, як мікрокристалічна целюлоза, трагакант або желатин; нейтральний додаток, такий, як крохмаль або лактоза, що дезінтегруючий агент, такий, як альгінінова кислота, примогель (Primogel) або кукурудзяний крохмаль; мастило, таке як стеарат магнію; додаток для надання ковзких властивостей (глайдент), таку, як колоїдальний двоокис кремнію; додаток, що підсолоджує, такий, як сахароза або сахарин; або смаковий додаток, такий, як м'ята перцева, метилсалицилат або речовина з апельсиновим присмаком. Основою для ін'єкцій, як правило, є стерильні фізіологічні або фосфатно-буферні розчини та інші відомі носії. І тут бензамідна похідна складає невеличку частину від загальної ваги, часто від 0,05 до 10% ваг., причому частина, що залишилася, припадає на ін'єкційний носій і інші допоміжні додатки. Рідкі форми можуть бути розчинами або суспензіями. Вказані компоненти для композицій для внутрішнього всередину або для ін'єкцій є виключно ілюстративними. Інші матеріали, а також методики готування препаративних форм описані в зб. Remington's Pharmaceutical Sciences. 17th edition, part 8, 1985, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, який наводиться в цьому описі як посилання. Сполуки, заявлені в цьому винаході, призначають також у вигляді форм із пролонгованим вивільненням або доставляють з систем постачання з пролонгованим вивільненням. Опис типових представників таких систем можна знайти в Remington's Pharmaceutical Sciences. Стани, що піддають лікуванню, й опис курсу лікування Стани, що піддають лікуванню фармацевтичними композиціями, які містять бензаміди, можна класифікувати як нейродегенеративні порушення. До них віднесено порушення, що характеризуються тривалим низьким навантаженням на центральну нервову систему (ЦНС) і поступовим зниженням функції ЦНС. До таких порушень відносять хворобу Паркінсона, аміотрофічний боковий склероз (ALS, хвороба Лу Гехрига) (Lou Gehrig), розсіяний склероз, хвороба Хантингтона, хвороба Альцгеймера, діабетична ретинопатія, мультиінфарктна деменція, дегенерація жовтої плями сітківки й інші. Кожен з цих станів відрізняється поступовим зниженням функції ЦНС. Фармацевтичні композиції, що містять похідні бензамідів, при введенні їх усередину або у вигляді ін'єкцій внутрішньовенно, можуть уповільнити і, можливо, навіть до деякої міри відновити утрачену функцію. Розмір доз, які вводяться для лікування цих станів, коливається від 0,1 до принаймні 10мг/кг/год, усі дози вводять приблизно за період від 1 до 120год., і особливо від 24 до 96год. Можна призначити попередній болюс приблизно від 0,1 до 10мг/кг для досягнення адекватної сталої концентрації ліків в організмі. Передбачається, що максимальна загальна доза збільшується приблизно до 2г/добу на 40-80кг ваги тіла пацієнта. Для вказаних нейродегенеративних порушень курс лікування звичайно розтягується на багато місяців або років, тому прийом усередину кращий для пацієнта з погляду зручності і характеру засвоєння прийнятих ліків. При введенні усередину характерний курс розрахований на 1-5, часто 2-4, і, як правило 3 дози на добу. Використовуючи таку схему, кожна доза забезпечує приблизно від 1 до 20мг/кг бензаміду, причому кращою є доза приблизно від 1 до 10мг/кг, а найкращою - від 1 до 5мг/кг ваги тіла. Звичайно, бензамідну похідну можна вводити у вигляді тільки одного активного агента або в сполученні з іншими агентами, включаючи й інші активні похідні бензамідів. Способи одержання сполук Похідні бензамідів, заявлені в цьому винаході, одержують із звичайних вихідних сполук і реакцій, які легко здійснюються. До однієї з представницьких реакційних схем, що протікає за участю трет-бутиламіну, але яку можна здійснити з будь-яким алкіламіном, входять такі реакції. де X представляє собою галоген, такий як І, Br, F або СІ. На стадії (А) утворюються N-трет-бутилнітробензаміди (III). Цю реакцію здійснюють при температурі нижче 10°С. Стадія (А) у якості бензамідів формули (III) дає сполуки, де R представляє собою -NO2. На стадії (В) нітрогрупи в моно- і динітробензаміді III піддають відновленню. Його звичайно проводять в присутності відновника, такого як гідразин, і підходящого каталізатора, такого як гетерогенна платина, гідроокис заліза (III), паладієвий або нікелевий каталізатор (як правило, на носії) або в присутності газоподібного водню і каталізатора. Стадія (В) у якості бензамідів формули (IV) дає сполуки, де R представляє собою -NH2. На стадії (С) амінобензаміди формули (IV) перетворюють в ацетамідобензаміди формули (V) шляхом взаємодії з ацетил-галогенідом, таким, як ацетилхлорид. Реакцію здійснюють в присутності м'якої основи і в інтервалі температур від низьких до температури навколишнього середовища, наприклад, в інтервалі від 20°С до +20°С. Реакція приводить до одержання сполук, заявлених у цьому винаході, де R представляє собою ацетамідо. Для одержання заявлених сполук можна використовувати й альтернативні схеми синтезу. Нижче приклади таких схем дані для сполуки CPI1189, яка використовується в якості ілюстративної. Використовуючи альтернативні схеми синтезу, можна одержати інші сполуки шляхом введення в реакцію відповідних вихідних продуктів, таких як 2- або 3-аміно- або нітро-бензонітрил, або 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- або 3,5-діаміно- або динітро-бензо-нітрил і відповідний спирт (альтернативний шлях 1), або аналогічно заміщені похідні толуолу і відповідний алкіламін (альтернативний шлях 3). Альтернативний шлях 1 Цей маршрут починають з ацетилювання, наприклад, 4-аміно-бензонітрилу (А), переводячи його в сполуку (В) стандартними методами. Кислий гідроліз трет-бутанолу в присутності 4-ацетамідо-бензонітрилу (В) забезпечує на практиці синтез, що приводить до одержання сполуки CPI1189. Альтернативний шлях 2 Ацетилювання за стандартною методикою недорогого вихідного продукту у вигляді пара-амінобензойної кислоти (ПАБК) (С) забезпечує дешевий спосіб одержання 4-ацетамідобензойної кислоти (D). Перетворення (D) у хлорангідрид (Е) за стандартною методикою (наприклад, з використанням SOCI2) із наступним амідуванням також стандартними методами, вже описаним вище, забезпечує одержання сполуки CPI1189 із недорогої сировини. Альтернативний шлях 3 Інший спосіб одержання заявлених сполук починають з ацетилування, проведеного за стандартною методикою, наприклад, паратолуїдину (F) у 4-ацетамідотолуол (G). Синтетичну проміжну сполуку (G) можна перетворити в 4-ацетамідо-бензойную кислоту (D) за допомогою відомих окисників (наприклад, KMnN4) і потім перевести його в сполуку CPI1189, як описано в альтернативній реакції 2. Приклади Винахід додатково описаний в наступних Прикладах, що ілюструють кілька кращих варіантів здійснення винаходу, не обмежуючи при цьому його обсяг, визначений формулою винаходу. Приклади 1-19 ілюструють одержання ацетамідобензамідів, а також нітро- і амінобензамідів. Вони є представниками бензамідних похідних, які використовуються в композиціях і способах цього винаходу. Приклади 20-24 ілюструють одержання фармацевтичних композицій, в яких за основу взято ці сполуки. В кінці наведено результати біологічних випробувань, що підтверджують активність заявлених композицій. Позначення сигналів у спектрах ЯМР: д - дуплет; с - синглет; шс - широкий синглет; Гц - частота (Гц). Приклад 1 Одержання N-трет-бутил-4-амінобензаміду (CPI1160) Трет-бутиламін (14,6г, 0,200моль) перемішують в етилацетаті (150мл, очищений промиванням за допомогою 5% розчину карбонату натрію, насиченим розчином хлориду натрію, висушений над сульфатом магнію і відфільтрований через рифлений паперовий фільтр) і охолоджують до 5°С на льодяній бані. До суміші краплями додають 4-нітробензоїлхлорид (18,6г, 0,100моль) в очищеному етилацетаті (75мл) з такою швидкістю, щоб підтримувати температуру нижче 10°С. Після закінчення прикапування розчину бензоїлхлориду льодяну баню видаляють, і реакційну суміш перемішують протягом 4 годин, а потім фільтрують через воронку Бюхнера. Фільтрат тричі промивають 5% НСІ, один раз -розчином хлориду натрію, сушать над сульфатом магнію і фільтрують через рифлений паперовий фільтр. Розчинник упарюють, одержуючи в залишку кристалічний продукт білого кольору, який сушать у печі в вакуумі при 24мм і температурі 45°С протягом 14 годин. За описаною методикою одержують 17,13г кристалів N-трет-бутил-4нітробензаміду (CPI1020) з виходом 77% і т.пл.162-163°С. Спектр протонного магнітногорезонансу (ПМР) (89,55МГц у CDCI3) показав поглинання при 8,257м.ч. (д, 8,8Гц, 2Н; 3,5-арил Н); 7,878м.ч. (д, 8,8Гц, 2Н; 2,6 арил Н); 6,097м.ч. (шс, 1Н; N-H); 1,500м.д. (с, 9Н; трет-бутил Н). До сполуки CPI1020 (5г, 22,5ммопь) в 95% етанолі при 55°С додають каталізатор (Pd/C) (5%, 75мг). Краплями протягом 30 хвилин додають розчин гідразину (1,2мл) в 95% етанолі (10мл) і додаткову кількість Pd/C (75мг). Суміш кип'ятять із зворотнім холодильником протягом 3 годин, додають гідразин (0,5г) у 95% етанолі (5мл) і кип'ятять із зворотнім холодильником ще протягом години. Отриману реакційну суміш фільтрують через воронку Бюхнера, зменшують обсяг розчинника шляхом випарювання під вакуумом і екстрагують дихлорметаном. Об'єднаний екстракт сушать над сульфатом магнію, розчинник упарюють, одержуючи в залишку 3,90г N-трет-бутил-4-амінобензаміду (CPI1160) із виходом 90% і т.пл.125-127°С. Спектр (ПМР) (90МГц у CDCI3) показав поглинання при 7,290м.д. (2Н, д, 8,8Гц; 2,6 арил Н); 6,368м.ч. (2Н, д, 8,8Гц; 3,5 арил Н); 5,45м.ч. (1 Н, шс; NHC=O); 3,27м.ч. (2Н, шс; арил-NH2); 1,186м.ч. (9Н, с; трет-бутил Н). Приклад 2 Одержання N-трет-бутил-4-ацетамідобензаміду (CPI1189) До сполуки CPI1160 (1,0г, 5,2ммоль) і триетиламіну (0,58г, 5,7ммоль) у етилацетаті додають краплями ацетилхпорид (0,45г, 5,7ммопь) у етилацетаті (25мл) при температурі 3°С із такою швидкістю, щоб підтримувати температуру в суміші нижче 10°С. Суміші дають нагрітися до кімнатної температури, перемішують протягом години і промивають 5% розчином НСІ. Перекристалізація з ацетону дає 1,08г N-трет-бутил-4-ацетамідобензаміду (CPI1189) із виходом 89% і т.пл.119-121°С. Спектр (ПМР) (90МГц у ДМСО-d6) показав поглинання при 9,726м.ч. (1Н, шс, N-H), 7,715м.ч. (4Н, дд, 4,4Гц; арил Н); 7,295м.ч. (1Н, шс; NH); 2,844м.ч. (3Н, с; СН3СО), 1,448м.ч. (9 Н, с; трет-бутил Н). Приклад 3 Одержання N-трет-бутил-3-нітробензаміду (СРІ1034), N-трет-бутил-3-амінобензаміду (CPI1248) і N-трет-бутил-3-ацетамідобензаміду (СР11234) Дотримуються методик амідування з Прикладу 1, використовуючи 3-нітробензоїлхлорид замість 4нітробензоїлхлориду. Методика дає N-трет-бутил-3-нітробензамід (СРІ1034) з виходом 92% і т.пл. 123-125°С. Спектр (ПМР) (в CDCI3) показав поглинання при 8,517м.ч. (2-арил Н, с, 1Н); 8,337м.ч. (4-арил Н, д, 8,8Гц, 1Н); 8,121м.ч. (6-арил Н, d, 6,4 Hz, 1Н); 7,618м.ч. (5-арил Н, м, 1Н); 6,032м.ч. (N-H, шс, 1Н); 1,484м.ч. (т-бутил Н, с, 9 Н). Відновлення гідразином каталізоване гідроксидом заліза (III) дає N-трет-бутил-3-амінобензамід (СРІ1248) з виходом 53% і т.пл. 118-120°С. Спектр (ПМР) (в CDCI3) показав поглинання при 7,088м.ч. (4-6-арил Н, м, 3Н); 6,794м.д. (2-арил Н, с, 1Н); 5,902м.ч. (N-H, шс, 1Н); 3,145м.ч. (арил N-H, шс, 2Н); 1, 458м.ч. (т-бутил Н, с, 9Н). Ацетилювання СРI1248, описане в Прикладі 2, дає N-трет-бутил-3-ацетамідобензамід (CPI1234) із виходом 75% і т.пл. 194-195°С. Спектр (ПМР) (в CDCI3) показав поглинання при 7,778м.ч. (4-6-арил Н, м, 3Н): 7,392м.ч. (2-арил Н, с, 1Н); 6,08м.ч. (N-H, шс, 1Н); 2,174 м.ч. (ацетил СН3, с, 9Н); 1,500м.ч. (т-бутил Н, с, 9Н). Приклад 4 Одержання N-трет-бутил-2-нітробензаміду (CPI1035) і N-трет-бутил-2-ацетамідобензаміду Повторюють методику Прикладу 3, використовуючи на стадії амідування 2-нітробензоїлхлорид. Реакція дає N-трет-бутил-2-нітробензамід (CPI1035). Відновлення нітробензаміду гідразином дає N-трет-бутил-2-амінобензамід. Ацетилювання амінобензаміду дає N-трет-бутил-2-ацетамідо-бензамід. Приклад 5 Одержання N-ізопропіл-4-нітробензаміду (CPI1026) і N-ізопропіл-4-ацетамідобензаміду (СРI1232) Повторюють методику Прикладу 3, використовуючи на стадії амідування 4-нітробензоїлхлорид і ізопропіламін. Реакція дає N-ізопропіл-4-нітробензамід (CPI1026). Відновлення нітробензаміду гідразином дає N-ізопропіл-4-амінобензамід. Ацетилювання амінобензаміду дає N-ізопропіл-4-ацетамідо-бензамід (CPI1232). Приклад 6 Одержання N-трет-аміл-4-нітробензаміду (CРI1033) і N-трет-аміл-4-ацетамідобензаміду (CPI1233) Повторюють методику Прикладу 3, використовуючи на стадії амідування 4-нітробензоїлхлорид і третаміламін. Реакція дає N-трет-аміл-4-нітробензамід (CPI1033). Відновлення нітробензаміду гідразином дає Nтрет-аміл-4-амінобензамід. Ацетилювання амінобензаміду дає N-трет-аміл-4-ацетамідобензамід (СРІ1233). Приклад 7 Одержання N-ізобутил-4-ацетамідобензаміду Повторюють методику Прикладу 3, використовуючи на стадії амідування 4-нітробензоїлхлорид і ізобутиламін. Реакція дає N-ізобутил-4-нітробензамід (CPI1044). Відновлення нітробензаміду гідразином дає N-ізобутил-4-амінобензамід. Ацетилювання амінобензаміду дає N-ізобутил-4-ацетамідо-бензамід. Приклад 8 Одержання N-н-бутил-4-нітробензаміду (CPI1045) і N-н-бутил-4-аиетамідобензаміду Повторюють методику Прикладу 3, використовуючи на стадії амідування 4-нітробензоїлхпорид і нбутиламін. Реакція дає N-н-бутил-4-нітробензамід (CPI1045). Відновлення нітробензаміду гідразином дає N-н-бутил-4-амінобензамід. Ацетилювання амінобензаміду дає N-н-бутил-4-ацетамідо-бензамід. Приклад 9 Одержання N-н-пропіл-4-нітро6ензаміду (CI1047) і N-н-пропіл-4-ацетамідобензаміду Повторюють методику Прикладу 3, використовуючи на стадії амідування 4-нітробензоїлхлорид і нпропіламін. Реакція дає N-н-пропіл-4-нітробензамід (CPI147). Відновлення нітробензаміду гідразином дає N-н-пропіл-4-амінобензамід. Ацетилювання амінобензаміду дає N-н-пропіл-4-ацетамідо-бензамід. Приклад 10 Одержання N-1,2-диметилпропіл-4-нітробензаміду (СРІ1085) і N-1,2-диметилпропіл-4-ацетамідобензаміду Повторюють методику Прикладу 3, використовуючи на стадії амідування 4-нітробензоїлхлорид і 1,2диметилпропіламін. Реакція дає N-1,2-диметилпропіл-4-нітробензамід (СРІ1085). Відновлення нітробензаміду гідразином дає N-1,2-диметилпропіл-4-амінобензамід. Ацетилювання амінобензаміду дає N-1,2-диметилпропіл-4-ацетамідобензамід. Приклад 11 Одержання N-н-пентил-4-нітробензаміду (CPI1140) і N-н-пентил-4-ацетамідобензаміду Повторюють методику Прикладу 3, використовуючи на стадії амідування 4-нітробензоїлхлорид і нпентиламін. Реакція дає N-н-пентил-4-нітробензамід (СРІ1140). Відновлення нітробензаміду гідразином дає Nн-пентил-4-амінобензамід. Ацетилювання амінобензаміду дає N-н-пентил-4-ацетамідо-бензамід. Приклад 12 Одержання N-2-метилбутил-4-нітробензаміду (CPI1146) і N-2-метилбутил-4-ацетамідобензаміду Повторюють методику Прикладу 3, використовуючи на стадії амідування 4-нітробензоїлхлорид і 2метилбутиламін. Реакція дає N-2-метилбутил-4-нітробензамід (CPI1146). Відновлення нітробензаміду гідразином дає N-2-метилбутил-4-амінобензамід. Ацетилювання амінобензаміду дає N-2-метилбутил-4-ацетамідобензамід. Приклад 13 Одержання N-н-пентил-2-нітробензаміду (CPI1174) і N-н-пентил-2-ацетамідобензаміду Повторюють методику Прикладу 3, використовуючи на стадії амідування 2-нітробензоїлхлорид і нпентиламін. Реакція дає N-н-пентил-2-нітробензамід (CPI1174). Відновлення нітробензаміду гідразином дає Nн-пентил-2-амінобензамід. Ацетилювання амінобензаміду дає N-н-пентил-2-ацетамідо-бензамід. Приклад 14 Одержання N-трет-бутил-2,3-діацетамідобензаміду Повторюють методику Прикладу 3, використовуючи на стадії амідування 2,3-динітробензоїлхлорид. Реакція дає N-трет-бутил-2,3-динітробензамід. Відновлення нітробензаміду гідразином дає N-трет-бутил-2,3-діамінобензамід. Ацетилювання амінобензаміду дає N-трет-бутил-2,3-діацетамідобензамід. Приклад 15 Одержання N-трет-аміл-2,4-діацетамідобензаміду Повторюють методику Прикладу 3, використовуючи на стадії амідування 2,4-динітробензоїлхлорид і третаміламін. Реакція дає N-трет-аміл-2,4-динітробензамід. Відновлення нітробензаміду гідразином дає N-третаміл-2,4-діамінобензамід. Ацетилювання амінобензаміду дає N-трет-аміл-2,4-діацетамідобензамід. Приклад 16 Одержання N-трет-бутил-2,5-діацетамідобензаміду Повторюють методику Прикладу 3, використовуючи на стадії амідування 2,5-динітробензоїлхлорид. Реакція дає N-тpeт-бyтил-2,5-динiтpoбeнзaмiд. Відновлення нітробензаміду гідразином дає N-трет-бутил-2,5-діамінобензамід. Ацетилювання амінобензаміду дає N-трет-бутил-2,5-діацетамідобензамід. Приклад 17 Одержання N-трет-бутил-2,6-діаиетамідобензаміду Повторюють методику Прикладу 3, використовуючи на стадії амідування 2,6-динітробензоїлхлорид. Реакція дає N-трет-бутил-2,6-динітробензамід. Відновлення нітробензаміду гідразином дає N-трет-бутил-2,6-діамінобензамід. Ацетилювання амінобензаміду дає N-трет-бутил-2,6-діацетамідобензамід. Приклад 18 Одержання N-трет-бутил-3,4-діацетамілобензаміду Повторюють методику Прикладу 3, використовуючи на стадії амідування 3,4-динітробензоїлхлорид. Реакція дає N-трет-бутил-3,4-динітробензамід. Відновлення нітробензаміду гідразином дає N-трет-бутил-3,4-діамінобензамід. Ацетилювання амінобензаміду дає M-трет-бутил-3,4-діацетамідобензамід. Приклад 19 Одержання N-трет- бутил-3.5-діацетамідобензаміду Повторюють методику Прикладу 3, використовуючи на стадії амідування 3,5-динітробензоїлхлорид. Реакція дає N-трет-бутил-3,5-динітробензамід. Відновлення нітробензаміду гідразином дає N-трет-бутил-3,5-діамінобензамід. Ацетилювання амінобензаміду дає N-трет-бутил-3,5-діацетамідобензамід. Одержання фармацевтичних композицій Приклад 20 Сполуки Прикладу 1 змішують у вигляді сухого порошку із сухим желатиновим зв'язувальним приблизно у ваговому співвідношенні 1:2. У якості мастила додають незначну кількість стеарату магнію. Суміш пресують в таблетки вагою 240-270 мг (80-90мг активного бензаміду) на спеціальному пресі. Якщо ці таблетки призначають хворому, який страждає від дегенеративного порушення, пов'язаного з допаміном, один, два або три рази на добу, то такий курс лікування уповільнює перебіг хвороби. Приклад 21 Сполуку Прикладу 2 змішують у вигляді сухого порошку з крохмалем, застосовуваним у якості розріджувача, приблизно у ваговому співвідношенні 1:1. Отриманою сумішшю заповнюють капсули місткістю 250мг (125мг активного бензаміду). Якщо ці капсули призначають хворому, який страждає від дегенеративного порушення, пов'язаного з допаміном, один, два або три рази на добу, то такий курс лікування уповільнює перебіг хвороби. Приклад 22 Сполуку Прикладу 3 суспендують у підсолодженому водяному середовищі до концентрації біля 50мг/мол. Якщо 5мл цього рідкого продукту призначають хворому, який страждає від дегенеративного порушення, пов'язаного з допаміном, один, два або три рази на добу, то такий курс лікування уповільнює перебіг хвороби. Приклад 23 Сполуку Прикладу 4 змішують у вигляді сухого порошку із сухим желатиновим зв'язувальним приблизно у ваговому співвідношенні 1:2. У якості мастила додають незначну кількість стеарату магнію. Суміш пресують у таблетки вагою 450-900мг (150-300мг активного бензаміду) на спеціальному пресі. Якщо ці таблетки призначають хворому, який страждає від дегенеративного порушення, пов'язаного з допаміном, один, два або три рази на добу, то такий курс лікування уповільнює перебіг хвороби.. Приклад 24 Сполуку Прикладу 14 розчиняють у стерильному буферному сольовому розчині для ін'єкцій до концентрації біля 5мг/мл. Якщо 5мл цього рідкого продукту призначають хворому, який страждає від дегенеративного порушення, пов'язаного з допаміном, такого, як хвороба Паркінсона, один, два або три рази на добу, то такий курс лікування уповільнює перебіг хвороби. Варто очікувати, що будь-яка із сполук формули 1 може використовуватись в будь-якій з описаних лікарських форм, і що будь-яку з цих композицій можна вводити будь-яким способом таким чином, щоб можна було лікувати будь-який із вказаних в описі дегенеративних станів. Методики скринінгу при захворюванні Паркінсона Вивчення зниження вмісту допаміну (МФТГП-модель) Мишей C57BL/6J попередньо обробляють або носієм (1% метилцелюлоза) або ліками (перорально) за 30 хвилин до введення МФТГП. МФТГП розчиняють в ізотонічному розчині (0,9%) і вводять підшкірно одиничну дозу з розрахунку 15мг вільної основи на кг ваги тіла для того, щоб досягти зниження рівня допаміну до 0,5 наномолів на мг білка. Групи мишей (у кількості 8-10 у групі) одержують або носій і ізотонічний розчин, або носій і МФТГП, або ліки і МФТГП. Через 72 години після введення МФТГП мишей умертвляють шляхом зміщення шийного відділу хребта і вирізують неостріатум. Тканину гомогенізують в 0,4н розчині хлорної кислоти, центрифугують, верхній шар аналізують методом високоефективної рідинної хроматографії з електрохімічним детектором (ВЕРХ-ЕХД) на вміст допаміну. У проміжку між збором і аналізом верхні шари після центрифугування зберігають в морозильнику при -90°С. Ліки поєднують з метилцелюлозою і гомогенізують в воді для введення у відповідних дозах, рівних 1050мг/кг для сполук CPI1160, CPI1189 і СРІ1234, і 50-100мг/кг для сполуки СРІ1020. Результати представницьких експериментів наведені в Таблицях 1 і 2. Результати Таблиці 1 показують, що композиції, заявлені в цьому винаході і в склад яких входять сполуки CPI1160, CPI1189 і CPI1234, ефективні для попередження зниження вмісту допаміну, що викликається МФТГП. Таблиця 1 Ефективність сполук CPI1160, CPI1189 і СРІ1234 у кількості 30мг/кг на моделі з використанням 15мг/кг МФТГП Сполука Допамін/мг білка ±СКО метилцелюлоза CPI1160 СР 11234 метилцелюлоза СР 11189 0,72±0,05 1,25±0,05 1,02±0,05 0,56±0,07 1,37+0,14 Захист від нейротокс. дії за відсутності МФТГП, % (контрольні проби) 54,1 93,9 76,7 36,4 89,7 Для порівняння ті ж досліди проводять на композиціях, що містять сполуку CPI1020 - споріднену похідну бензаміду, продуктом біоперетворення якого є CPI1189. Результати наведено в Таблиці 2. При дозі 50мг/кг CPI1189 здійснює повний захист від нейротоксичного впливу МФТГП (105%), тоді як CPI1020 не є настільки ж ефективним (56%). Таблиця 2 Порівняння ефективності сполук CPI1189 і СРІ1020 у кількості 50мг/кг на моделі з використанням 15мг/кг МФТГП Сполука CPI1020 CPI1189 Допамін, нмоль/мг ±СКО Сполука, що випробовується Стандарт 0,58±0,14 1,035 ±0,099 1,57±0,11 1,536 ±0,178 Захист, % 56 105 * метилцелюлоза (контрольний дослід) Методику повторюють на ряді інших сполук, заявлених у цьому винаході. Результати, наведені в Таблиці 3, показують, що й інші бензаміди виявляють захисні властивості. Таблиця 3 Захисні властивості бензамідів в випробуванні на вичерпання вмісту допаміну в присутності МФТГП Сполука, яка випробовується 1160 1232 1233 1234 1241 Ступінь захисту, % 94 70 40 77 40 Випробування на тривалий захисний ефект Додаткові дослідження проводять для того, щоб визначити тривалий захисний ефект з боку заявлених сполук на процес виснаження вмісту допаміну. Використовуючи вищеописану загальну методику "дослідженнь, мишей 57BL/6J попередньо обробляють або носієм, або сполукою і МФТГП, а потім умертвляють через 3 і через 14 діб після введення дози. Результати наведені в Таблиці 4. Таблиця 4 Ефективність сполуки CPI11189 в випробуванні на моделі в присутності МФТГП. Вплив часу пост-дозування на стріарні концентрації допа міну Лікування Метилцелюлоза/МФТГП (умертв. через 3 доби) CPI1189/МФТГП (умертв. Процентне співвідношення метилцелюлоза/ізотонічний контрольний розчин 67,5 100 через 3 доби) Метилцелюлоза/МФТГП (умертв. через 14 діб) CPI1189/МФТГП (умертв. через 14 діб) 75,8 96,7 Результати эксперимента показують, що сполука CPI1189 здатна здійснювати захист від зниження рівня допаміну, індукованого МФТГП, у тварин, умертвлених як через 3 доби, так і через 14 діб після введення МФТГП. Це свідчить про те, що ефект сполуки CPI1189 обумовлений нейрозахистом, а не скороминущим впливом на метаболізм допаміну. Вивчення зниження вмісту допаміну (6-гідроксидопамінова модель) Випробування проводять для того, щоб оцінити здатність CPI1189 здійснювати захист від ушкоджень, викликаних 6-гідроксидопаміном. Це загальноприйнята модель для вивчення хвороби Паркінсона, у якій, як думають, 6-гідроксидопамін продукує токсичні ефекти шляхом виклику оксидативного стресу. Таку сполуку, як 6-гідроксидопамін широко використовують з 60-х років у якості нейротоксиканта. Оскільки він головним чином діє на катехоламінергічні нейрони, його використовують в основному для експериментального вивчення хвороби Паркінсона. Сполука знайшла всесвітнє застосування як засіб для створення одностороннього (локального) ураження в ніграстріарній системі. Тварини, оброблені цим токсином, виявляють біохімічні зміни та зміни в поведінці, які можна виміряти і фармакологічно випробувати для того, щоб оцінити силу ураження і визначити ефект від можливого терапевтичного втручання. Визначають захисний відгук від уведення дози сполуки CPI1189 на ураження ніграстріарної системи, викликане 6-гідроксидопаміном. Ступінь ураження вимірюють, виходячи зі стріарних концентрацій допаміну. Для випробувань використовують акліматизованих самців пацюків Sprague Dawley, віком 55-120 днів. 6гідроксидопамін фірми Рісерч Біокемикалз Інк. (Research Biochemicals Incorporated) готують у 0,9% розчині NaCI, що містить 0,1мг/мл аскорбінової кислоти вранці перед дослідом. Подрібнену сполуку CPI1189 (розміром часток меншим або рівним 106мкм) готують у 1%-ой суспензії метилцелюлози також вранці перед дослідом і вводять усередину дозований обсяг 0,0005мл/г, використовуючи калібровану інтубаційну голку розміром 3"х18. Тварин анестезують і хірургічно роблять інтрастріарну (тільки правобічну) ін'єкцію 6-пдроксидопаміну або сольового розчину. Тварин умертвляють через тиждень після введення 6-пдроксидопаміну. Негайно після цього препаровану стріарну тканину збирають і аналізують методом ВЕРХ-ЕХД на вміст білка, використовуючи аналіз із біцинхоніновою кислотою. Результати наведені в Таблиці 5. Таблиця 5 Тестований (правий) бік (півкулі головного мозку) у процентному вираженні від контрольного (лівого) боку, за умови, що ін'єкцію 6гідроксидопаміну роблять тільки в правий неостріатум Лікування Метилцелюлоза/6гідроксидопамін 100мг/кг CPI1189/6гідроксидопамін 50мг/кг CPI1189/6гідроксидопамін Частка від контрольного боку, % 69,67±7,65 77,61±13,5 72,82±8,32 Результати експериментів показують, що сполука CPI1189 здатна здійснювати захист від зниження рівня допаміну, викликаного 6-гідроксидопаміном. Випробування на активність проти хвороби Альцгеймера Дія бензамідів на утворення β-складчастих листів Аβ(1-40): Визначення агрегації амілоїдів у розчині методом спектрів флуоресценції Тіофлавіну Τ Було розроблено кілька методик для оцінки активності заявлених сполук у якості засобів для лікування хвороби Альцгеймера. Одна з таких методик побудована на спостереженні, що в таких хворих виявлено незвичайний рівень агрегації амілоїдів. Тіофлавін Т (ThT) пов'язаний із бета-складчастими листами, зокрема, з агрегованими фібрілами синтетичного Αβ(1-40), викликаючи новий пік збудження при 440нм і посилену емісію при 490нм. Відповідно до цього принципу, агенти, спроможні затримувати або зворотньо впливати на утворення такої асоціації, можуть справляти сприятливий терапевтичний вплив. Експерименти проводять на 96 пластинах із лунками, і флуоресцентні зміни оцінюють за допомогою флуоресцентного планшет-рідера Цитофлуор II (CytoFluor II). У кожну лунку вносять аліквоту в 95мкл Тіофлавіну Τ (3мк), приготовленого у фосфатному буфері (рН 6,0), 2мкл NRT (10мкМ), приготовленого у фосфатному буфері (рН 6,0) при 0,05% метилцелюлози і 3мкл Αβ(1-40) (3мкг) у dH2O. Вимірювання флуоресценції починають після додавання Αβ(1-40) і продовжують протягом 4 годин, за які утворення βскладчастих листів досягає свого плато. Ступінь захисту цього утворення в % розраховують із різниці, вираженої в одиницях відносної флуоресценції, між агрегацією за присутності й за відсутності випробуваних сполук. Результати наведені в Таблиці 6. Таблиця 6 Активність бензамідів в скринінгу проти захворювання Альцгеймера Сполука CPI1189 CPI1033 CPI1026 Ступінь захисту, % 48,3±10,1 31±3,5 14,4+14,4 Захисна дія бензамідів проти Амілоїду β(25-35) або виснаження нервових клітин, що викликаються глутаматом, ν культурах астроцитів або нейронів ппокампу ембріона пацюка Проводять ще один тест на активність проти хвороби Альцгеймера. Вирізують гіпокамп 18-денного ембріона пацюка Sprague Dawley, а потім розкладають його шляхом стирання з одержанням первинних нейронних/астроцитарних культур. Клітини (3x10N-) наносять на пластинки розміром 35мм, покриті полі-Р-лізином, що містять мінімальну кількість основного живильного середовища Ігла (Eagle) із додаванням 10% фетальної коров'ячої сироватки. Через 3-5 годин початкове середовище видаляють і заміняють 1мл свіжого живильного середовища. Культури зберігають при температурі 37°С у зволоженому інкубаторі, що містить 5% СO2 і 95% повітря. Експеримент на нейронну токсичність, викликану Αβ(25-35): 30мкМ Αβ(25-35), розчиненого в dH2O, добавляють до клітин (7DIV) за присутності або відсутності 100мкМ бензаміду, приготовленого в 1% метилцелюлозі, протягом 96 годин. Експеримент на нейронну токсичність, викликану глутаматом: 30мкМ глутамату додають до клітин (9DIV) за присутності або у відсутність бензаміду протягом 48 годин. Життєздатність нейронів виражають у вигляді процентного співвідношення між числом морфологічно життєздатних нейронів після 48 або 96 годин лікування ι числом нейронів до лікування в тих самих попередньо маркованих зонах культури (три зони/культуру, n=6). Результати наведено в Таблиці 7, що містить дані, виражені у вигляді середнього значення зі стандартним відхиленням (СКО), у порівнянні з результатами контрольного досліду. Таблиця 7 Активність бензаміду в скринінгу проти виснаження нервових клітин Сполука 1233 1234 1241 1135 1140 1146 1173 1240 1026 Ступінь захисту, % Ступінь захисту, % Αβ(25-35) Глутамат 23 9 10 16 8 17 50 36 23 8