Спосіб одержання клавуланової кислоти або її фармацевтично прийнятих солей або ефірів, сіль клавуланової кислоти з алкіламіном як проміжна сполука для одержання клавуланової кислоти

1 Способ получения клавулановой кислоты или ее фармацевтически приемлемых солей или эфиров, включающий контактирование неочищенной клавулановой кислоты в органическом растворителе с алкиламином выделение полученной соли клавулановой кислоты с алкиламином и превращение ее в клавулановую кислоту или ее фармацевтически приемлемую соль или эфир, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве алкиламина используют трет-октиламин или амин общей формулы N-R3 где R является группой общей формулы 4 Ы~(-СН2-СН2-1ЧН-)гтгСН2-СН2R5 гдеЯ . R R и R независимо представляют собой водород или незамещенный или аминозамещенный Cj-Сб-алкил, a m равно0 или целому числу от 1 до 5, который контактируют с неочищенной клавулановой кислотой или ее лабильным производным 2, Способ п о п 1 о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в амине формулы (II) одна из групп R4 и R5 представляет собой водород, другая *? * Я - C^Cg-алкил, a R и R представляют собой водород или Cj-Cg-алкил 3 Способ по п 1 или 2, о т л и ч а ю щ и й с я тем что используют по существу осушенный органический растворитель А Способ п о п 3, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что органический растворитель содержит воду в количестве менее 6 г/л 5 Способ п о п 3, о т л и ч а ю щ и й с я тем что органический растворитель содержит воду в количестве 0,25-0 6 г/л 6 Способ по любому из пп. 3-5 о т л и ч а ю щ и й с я тем, что органический растворитель сушат цетрифугированием. 7 Способ по любому из пп 1~б, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что неочищенную клавулановую кислоту получают ферментацией микроорганизмов, образующих клавулановую кислоту. 8 Способ п о п 7, о т л и ч а ю щ и й с я тем что некоторые суспендированные в растворе неочищенной клавулановой кислоты твердые вещества удаляют 9 Способ п о п 8, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что твердые вещества удаляют фильтрацией 10 Способ по любому из пп 1 - Э . о т л и ч а ю щ и й с я тем, что водный раствор клавулановой кислоты, полученный ферментацией предварительно подвергают концентрации с последующей экстракцией 11 Способ п о п 10, о т л и ч а ю щ и й с я тем что процесс предварительного концентрирования осуществляют абсорбцией клавулановой кислоты на ионообменную смолу с последующим элюированием клавулановой кислоты водным раствором электролита 12 Способ по п. 10 или 11, о т л и ч а ющ и й с я тем, что полученный концентрат обессоливают. ел о 22115 13. Способ по любому из пп. 7-12, отлич а ю щ и й с я тем, что водный раствор клавулановой кислоты подкисляют перед экстракцией 14 Способ по п. 13, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что водный раствор клавулановой кислоты подкисляют до рН 1-3 15. Способ по п. 13, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что водный раствор клааулановой кислоты подкисляют до рН 1,5-2,5. І 6. Способ по любому из пп. 1-15, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что экстракцию неочищенной клавулановой кислоты или ее лабильного производного проводят органическим растворителем при температуре от 5 до 15°С 17. Способ по п. 16, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве органического растворителя используют растворитель, выбранный из группы, состоящей из углеводородных, эфирных, галогенированных и кетонных растворителей 18. Способ по п. 17, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что растворитель выбирают из группы, состоящей из гексана, тетрагидрофурана, диэтилового эфира, хлороформа, ацетона и этилцетата. 19. Способ по любому из пп. 1-18,отлич а ю щ и й с я тем, что соль клавулановой кислоты и алкиламинэ получают обработкой 1 моля клавулановой кислоты или ее лабильного производного в органическом растворителе одним эквивалентом алкиламина или его небольшим избытком. 20. Способ поп 19, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что соль клавулановой кислоты и алкил Настоящее изобретение относится к новому способу получения клавулановой кислоты (I) О О' СН20Н N согн и ее фармацевтически приемлемых солей и эфиров. Клавулановую кислоту обычно получают ферментацией микроорганизма, выделяющего клавулановую кислоту, например, различных микроорганизмов, принадлежащих амина получают при температуре от 0 до 15°С. 21. Способ по любому из пл. 1 ~ 20, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что соль клавулановой кислоты с алкиламином превращают в фармацевтически приемлемую соль ионным замещением 22. Способно п. 2 1 , о т л и ч а ю щ и й с я тем, что ионное замещение осуществляют, пропуская раствор соли клавулановой кислоты с элкиламином через слой катионообменной смолы в натриевой, калиевой или кальциевой форме. 23. Способ по п. 21. о т л и ч а ю щ и й с я тем, что ионное замещение осуществляют реакцией протонированного акиламинного катиона с соединением - предшественником соли. 24. Способ по п. 23, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве соединения - предшественника соли используют этилгексаноат калия. 25. Соль клавулановой кислоты с алкиламином общей формулы II N-R3 № где R является группой общей формулы N-(-CH2-CH2-NH-)m-CH2-CH2где R , R , R и R независимо представляют собой водород или замещенный или аминозамещенный Cj-Cg-алкил, a m равно 0 или целому числу от 1 до 5, в качестве промежуточного соединения дпя получения клавулановой кислоты. к различным разновидностям Streptomyces. например, S clavuhgerus NRRL 3585, S. jumoninensis NRRL 5741, S Katsurahamanus lFO 13716 и Streptomyces P 6621 FERM 5 P2804 и т д Получающийся водный бульон может быть подвергнут стандартным процессам очистки и концентрирования, включая, например, фильтрование и хроматографическую очистку. 10 Наиболее близким по технической сути и достигаемому результату является способ получения клавулзновой кислоты, включающий контактирование неочищенной клаву15 лановой кислоты в о р г а н и ч е с к о м растворителе с трет-бутиламином. выделение полученной соли и превращение ее в 22115 клавулановую кислоту или ее фармацевтически приемлемые соли или эфиры. Однако, этот способ не обеспечивает высоких выходов и достаточной чистоты получаемого продукта. В основу изобретения поставлена задача разработать такой способ получения клавулановой кислоты, в котором, путем замены используемого амина, достигалось бы повышение выхода и чистоты получаемой клавулановой кислоты. Поставленная задача решается в способе получения клавулановой кислоты, включающем включающий контактирование неочищенной клавулановой кислоты в органическом растворителе с алкиламином, выделение полученной соли и превращение ее в клавулановую кислоту или ее фармацевтически приемлемые соли или эфиры, в котором, согласно изобретению, в качестве алкиламина используют трет-октиламин или амин общей формулы ляя соль в виде отдельной фазы, например, в виде твердого осадка, из раствора, содержащего остаточные примеси, затем повторно образовывая клавулановую кислоту или 5 образовывая ее фармацевтически приемлемые соль или эфир Приемлемые лабильные производные клавулановой кислоты включают соли, например, соли щелочных металлов, такие как 10 клавуланаты лития или натрия, или эфиры, например силилэфиры. Приемлемые лабильные производные амина (II) включают соли, например, фосфат, борат, хлорид, хлорат, перхлорат, бромид, толуолсульфонат 15 или элканоаты, такие как ацетат или этилгексаноат. Вышеописанный способ в соответствии с изобретением осуществляют в органическом растворителе, растворяющем клавула20 новую кислоту и амин (И). Этот растворитель предпочтительно по существу сухой, например, содержащий менее 6 г/л, например, 0,26-0,6 г/л воды, может содержать некоторое количество воды. Приемлемая степень N-R3 25 сухости может быть достигнута посредством стандартных способов обезвоживания, например, центрифугированием, Вода, пригде R является группой общей формулы сутствующая в растворителе, может быть растворена или находиться в виде капель 30 отдельной фазы. •R Раствор клавулановой кислоты в оргаN-C-CH2-CH2-NH-)m-CH2-CH2ническом растворителе может быть получен посредством экстракции подкисленного где R , R , R и R независимо представляют водного раствора клавулановой кислоты, собой водород или незамещенный или ами- 35 например, ферментационной жидкости. нозамещенный Cj-Cg-алкил, a m равно О Если начальным источником клавуланоили целому числу от 1 до 5, который контаквой кислоты является бульон, получающийтируют с неочищенной клавулановой кислося при ферментации микроорганизмов, той или ее лабильным производным. образующих клавулановую кислоту, то для Примерами таких аминов могут служить 40 получения экстракта с приемлемой, концентрацией клавулановой кислоты желательно этилендиамин, Ы,!Ч'-диэтилэтилендиамин, удалить некоторые суспендированные в Ы.Ы'-диизопролилэтилендиамин, N.N.N'бульоне твердые вещества, например, потриэтилэтилендиамин, N.N.N'.N'-TeTpawieсредством фильтрования, предшествующетилэтилендиамин, диэтилентриамин, 1М,М,М\1Ч"М"-лентаметилдиэтилентриамин, 45 го экстракции. N'-метилдиэтилентриамин, триэтилентетПриемлемые способы предварительнорамин, 1,1,4,7,10,1О-гексаметилтриэтиленго концентрирования включают абсорбцию тетрамин, тетраэтиленпентамин и др. клавулановой кислоты на анионообменную смолу, с последующим элюированием клаКогда амин (И) содержит бол$е одного атома азота, клавулановая кислота может 50 вулановой кислоты со смолы водным раствором электролита, например, хлорида образовывать соль с одним или более атонатрия, и необязательным обессиливанием. мами азота, например, как в Ы,Ы'-диизопроТакже предпочтительно доэкстракции распилэтилендиаминдиклавуланате. творителем подкислить водный раствор до Согласно настоящему изобретению соль клавулановой кислоты и амина (II) мож- 55 рН от 1 до 3, например, рН около от 1,5 до 2,5. Предпочтительно экстракцию осущестно использовать для очистки неочищенной влять при температуре от 5 до 15°С. клавулановой кислоты во время ее получений. Поэтому соль можно получить в раствоПриемлемые органические растворитере клавулановой кислоты или ее лабильного ли, в которых неочищенная клавулановая киспроизводного, содержащем примеси, выдепота может контактировать с амином (II); 22115 8 включают углеводородные растворители, растворе клавулановой кислоты в органичетакие как гексан, эфиры, такие как тетраском растворителе остается в органическом гидрофуран, диэтиловый эфир, галогенирорастворителе, тогда как клавулановую кисванные растворители, например, лоту в виде соли с амином (І І) в относительно хлороформ, кетоны, такие как ацетон и 5 чистом состоянии получают в водном рассложные эфиры, например, этилацетат. Натворе. Полученный таким образом водный стоящее изобретение также предполагает раствор клавулановой кислоты можно подиспользование смесей таких растворитевергнуть дальнейшей стандартной обработлей. ке, например, очистке или превращению в По-видимому, особенно желательно 10 клавулановую кислоту или в фармацевтичевключить в систему растворителя кетоски приемлемые соль или эфир в соответстны, например, ацетон, поскольку они, вевии с нижеописанным роятно, ингибируют образование соли В другой альтернативной или дополниклавулановой кислоты и амина (II) в виде тельной методике клавулановую кислоту и масла. 15 амин можно смешивать в растворе в перКак правило, для получения соли клавом' органическом растворителе, а затем вулановой кислоты используют один эквисоль можно отделить от раствора посредвалент амина (II) на моль клавулановой ством добавления второго органического кислоты или его небольшой избыток. Расрастворителя. В соответствии с изобрететворы клавулановой кислоты и амина (II) 20 нием первый органический растворитель можно вводить в реакцию при перемешиможет представлять собой органический вании и перемешивать смесь в течение сложный эфир, например, этилацетат, а некоторого времени после того, как законвторой растворитель может, например, чено добавление. Реакцию между клзвулабыть галогенированным растворителем, новой кислотой или ее лабильным 25 таким как хлороформ, простым эфиром, производным и амином в соответствии с например, диэтиловым эфиром, углеводоизобретением осуществляют при темперародом, например, толуолом, спиртом, натуре ниже температуры окружающей срепример, этанолом, или кетоном, ды, например 0 до 15°С, например, 0 до например, ацетоном или метилизобутил10°СилиотО до5°С. 30 кетоном. Например, в другой методике амин (II) Еще одним объектом изобретения являможно вводить, примешивая его к потоку ется соль клавулановой кислоты с алкиламираствора клавулановой кислоты в растворином формулы (II), которая может быть теле, таким образом, что соль образуется в использована в качестве промежуточного потоке, или в растворе или в виде частиц или 35 соединения для получения клавулановой суспендированных капель растворенной сокислоты. ли в суспензии Амин (II), вводимый этим В одном предпочтительном варианте способом, можно вводить индивидуально осуществления настоящего изобретения или можно вводить в виде раствора в рассоль клавулановой кислоты и амина (II) творителе, например, в том же самом орга- 40 можно использовать в виде ацетонного ническом растворителе, в котором сольвата. Ацетонные сольваты в некоторастворяют клавулановую кислоту, рых случаях обладают преимущественной устойчивостью и показателями чистоты, по В альтернативной методике выделесравнению с солями клавулановой кислония соль клавулановой кислоты и амина 45 ты с аминами как таковыми. Такие сольва(II) можно выделить из органического ты особенно полезны, поскольку часто их растворителя, который полностью или можно выделить в виде стабильного кричастично не смешивается с водой, посталлического соединения с высокой чиссредством контактирования растворитетотой. ля с водой с тем, чтобы экстрагировать 50 Соответственно настоящее изобретесоль, которая может находиться в раствоние также предусматривает соль клавуларе или в суспензии, из органического новой кислоты с амином (I!) в виде растворителя и получить водный раствор ацетонного сольвата. Во время выделения соли. Поскольку сопи клавулановой киси/или сушки некоторое количество ацетолоты с амином (I!) прекрасно растворимы 55 на может быть потеряно, поскольку прочв воде, такой водный раствор можно хоность сольватации может не быть высокой, рошо сконцентрировать, например, до но количество ацетона в продукте не являоколо 20-30% (вес). ется определяющим. Ацетонный сольват может быть образоПри использовании этого способа очень ван при контактировании клавулановой кисбольшая часть органических примесей а 22115 10 лоты с амином (II) в присутствии ацетона кислоту или ее фармацевтически приемлеКак правило, когда соль осаждается, расмые соль или эфир посредством, например, твор, содержащий клавулановую кислоту, ионного замещения в случае свободной кисможно смешать с, по крайней мере, таким лоты или солей, или посредством этерифиже объемом ацетона, содержащим амин. 5 кации Амин (II) может быть растворен а ацетоИонное замещение можно осуществне и смешан с раствором клавулановой кислять, используя ионообменные смолы, налоты в органическом растворителе. пример, пропуская раствор соли через Предпочтительные растворители органичеслой катионообменной смолы в натрие^ ские включают этилцетат, тетрагидрофуран, 10 вой, калиевой или кальциевой форме. метил эти л кетон, метилизобутилкетон и смеПригодные катионообменные смолы си таких растворителей, среди этих раствовключают Amberlite IR 120 и равноценные рителей предпочтителен этилацетат. Или смолы же водный раствор соли клавулановой кисИли же ионное замещение можно осулоты и амина (II), получаемый посредством 15 ществлять посредством реакции протониэкстракции водой, в соответствии с вышерованного аминного катиона с описанным, может быть смешан с ацетоном сольобразующим соединением, которое модля образования сольвата. В соответствии с жет быть основанием, например, карбонаизобретением концентрированный водный том, бикарбонатом или гидроксидом раствор соли может быть смешан с избыт- 20 фармацевтически приемлемого щелочного ком ацетона для образования сольвата. или щелочноземельного металла или солью Перекристаллизация соли клавуланоорганической карбоновой кислоты с фармавой кислоты или ацетонного сольвата моцевтически приемлемым катионом, таким жет быть полезной для дополнительного как щелочной или щелочноземельный меуменьшения содержания примесей. Обыч- 25 талл. ный растворитель для перекристаллизации Примеры приемлемых солей включают представляет собой водный ацетон. Подоацетаты, пропионаты или этилгексаноаты, бную перекристаллизацию осуществляют причем 2-этилгексаноат калия и 2-этилгекстандартным образом, например, соль или саноат натрия являются предпочтительнысольват растворяют в воде, обрабатывают 30 ми. Обычно соль клавулановой кислоты и небольшим количеством ацетона, фильтруамина (II) в растворе может быть приведена ют и затем обрабатывают большими объево взаимодействие с солью щелочного мемами ацетона с необязательным талла и кислоты (IV) в растворе или суспенперемешиванием и/или охлаждением с зии в приемлемом растворителе, который тем, чтобы получить перекристаллизован- 35 может, например, представлять собой органый продукт. нический растворитель, воду или смесь воЕще в одном аспекте настоящее изоды и органического растворителя, бретение предлагает способ получения кланапример, изопропанола. В соответствии вулановой кислоты или ее фармацевтически с изобретением растворы соли клавуланоприемлемых соли или эфира, причем этот 40 вой кислоты и амина (И) и сольобразующеспособ включает превращение соли клавуго соединения можно смешать и позволить лановой кислоты и амина формулы (II) в ее кристаллизоваться фармацевтически прифармацевтически приемлемые соль кпи емлемой соли эфир. В соответствии с изобретением реакНаиболее пригодные фармацевтически 45 цию можно осуществлять при температуре приемлемые соли включают фармацевтичениже температуры окружающей среды, наски приемлемые соли щелочных и щелочнопример, от 0° до 15°С, например, от 0° до земельных металлов, например, соли 10°С, приемлемо от 0° до 0,5°С. В соответнатрия, калия, кальция и магния. Среди ствии с изобретением, если соль клавуланоэтих солей предпочтительны соли натрия 50 вой кислоты с амином (II) образуется в* и калия, наиболее предпочтительны соли водном растворе, ее можно высадить, смекалия. шивая водный раствор с избытком ацетона. Далее изобретение иллюстрируется ряПриемлемые эфиры включают эфиры, дом примеров, расщепляемые с образованием клавулановой кислоты или ее соли посредством хими- 55 П р и м е р і . В каждом из нижеперечисческих методов например, гидрогенолиза ленных примеров использовали одну и ту же или биологических методов. методику, а именно амин смешивали с клавулановой кислотой в растворе ТГФ, и наСоль клавулановой кислоты и амина (II) блюдали быструю кристаллизацию с необязательно в виде ацетонного сольвата образованием твердой соли. может быть превращена в клавулановую 11 Амин 22115 Примечания 0-(+У ог-фенилзтиламин кристаллическое твердое вещество трет-октиламин кристаллическое твердое вещество 1 -гидрокси-2-метил-2пролиламин циклопентиламин кристаллическая соль 1 -а да м а нтил амин кристаллическая соль N-этил пи перидии кристаллическая соль Ы,Г\1-диметилциклогексиламин кристаллическая соль аммиак кристаллическая соль Стабильность соли кристаллическая соль циклогептиламин 12 • ксантинол триэтилентетрамин п-метоксибензил-а аминофенилацетат кристаллическая соль белое твердое вещество бледножелтое твердое вещество твердая соль н-бутил- а-аминофенилацетат твердая соль метиларгинат твердая соль • П р и м е р 2. В нижеследующем примере соль клавулановой кислоты и амина получали в растворе в первом органическом растворителе, 'а затем посредством смешивания со вторым* органическим растворителем выса- 55 живали из раствора в виде твердого осадка. 2а Трет-октиламин. Сырьевой раствор клавулановой кислоты в этилацетзте, содержз стабильно более 70 20°С, относительная ность 50% стабильно более 70 20°С, относительная ность 50% часов, влажчасов, влаж относительная влажность 50%, 20°С, темнеет через 72 часа относительная влажность 50%, 20°С, темнеет через 72 часа относительная влажность 50%, 20°С, стабильна более 70 часов относительная влажность 50%, 20°С, стабильна более 70 часов относительная влажность 50%, 20°С, стабильна более 90 часов более 70 часов, относительная влажность 50%, некоторое изменение цвета гигроскопично малая проба белая после 16 часов в сухой атмосфере при комнатной температуре, желтая после 16 часов при о т н о с и т е л ь н о й влажности 50% и комнатной температуре желтая после 16 часов в сухой атмосфере при комнатной температуре оранжевая после 16 часов при относительной влажности 5 0 % и комнатной температуре белая после 16 часов в сухой атмосфере и при комнатной температуре оранжевая после 16 часов при относительной влажности 50% и комнатной температуре щий приблизительно 28 г/л клавулановой кислоты s неочищенном виде, получали посредством экстракции неочищенного ферментационного бульона S clavullgerus этилацетатом К 46 мл сырьевого раствора добавляли трет-октиламин (0,84 г) Через 10 минут смесь становилась мутной и выкристаллизовывались мелкие кристаллы соли. К аликвоте раствора добавляли хлороформ, 13 22115 14 что приводило к образованию игл большего представлял 77% извлечение клавулэновой размера. К следующей аликвоте добавляли кислоты из раствора, ацетон, что снова приводило к образованию 2f игольчатых кристаллов, но меньшего размеБензэтин, Бензятин диацетат (9,16 г) пера и медленнее, чем с хлороформом. К ос- 5 ремешивали с водным гидроксидом натрия т а в ш е й с я части раствора добавляли (5Н, 10.15 мл). Водный раствор экстрагироприблизительно 20 мл хлороформа, затем вали этила^етатом (55 мл) и экстракт добавобъем толуола, приблизительно равный наляли к сырьевому раствору клавулановой чальному объему раствора, что приводило к кислоты, полученному как в примере 2а, (1 л). о с а ж д е н и ю значительного количества 10 Сначала образовывалось масло. Добавляли игольчатых кристаллов. ацетон (600 мл) и образовывались кристал2Ь лы (Добавляли около 10мл диэтилового эфиДициклогексиламин. К 46 мл сырьевого ра, представляющего собой остаток от раствора, полученного как и для вышеприопыта с испытательной трубкой). Затем доведенного 2а, добавляли дициклогексила- 15 бавляли метилизобутилкетон (200 мл) и мин (1,18 г). Это приводило к прозрачному смесь доводили до 2 л ацетоном. Полученраствору. Ацетон добавляли к одной аликвоные кристаллы отфильтровывали и промыте, получая мелкий аморфный осадок. вали ацетоном. Выход составлял 11,5 г, 2с представляя 59,1% извлечение клавуланоАммиак. К 500 мл сырьевого раствора, 20 вой кислоты. полученного как и для вышеприведенного П р и м е р З . Раствор клавулановой 2а, добавляли аммиак (21,1 мл 2.5 М 2-этилкислоты в этилацетате (приблизительно 20 • гексаноата аммония в этилацетате, т.е. примг/мл) разбавляли равным объемом ацетоблизительно 1 эквивалент). Добавление 50 на. Затем при 10°С в течение 1/2 часа по мл промышленного метилированного спир- 25 каплям добавляли раствор трет-октиламин а та (IMS) приводило к быстрому образованию в ацетоне (1.25 моль - эквивалента). После осадка из мелких игл. Отмечалось, что, когда дальнейшего перемешивания в течение 1 использовали неочищенный раствор клавучаса осажденные кристаллы собирали, пролановой кислоты, как ясно показывал цвет мывали ацетоном и сушили в вакууме. раствора значительное количество окра- 30 Осадок образовывался довольно быстшенных примесей оставалось в растворе. рио и был белого цвета. Выход (скорректиВыход 75%. рованн ый в зависимости от чистоты) = 76%. 2d П р и м е р 4. 0,012 М р аствор бензилN.N-диметилциклогексилзмин. К500 мл клавуланата в ТГФ каталитически гидриросырьевого раствора, полученного, как в при- 35 вали, получая раствор клавулановой мере 2а, добавляли N.N-диметилциклогеккислоты в ТГФ. К этому раствору (1О0 мл) силзмин (6,7 мл). В начале добавления при температуре окружающей среды добавобразовывалось масло. Постепенно добавляли 1-аминоадамантан (25 мл 0,012 М в ляли ацетон (150 мл), что приводило к мутноТГФ). Происходила быстрая кристаллизаму раствору. Отбирали аликвоту этого 40 ция. Раствор перемешивали при температумутного раствора и к ней добавляли дизтире окружающей среды в течение 30 минут, ловый эфир, что приводило к кристаллизазатем при 5°С в течение 2 часов. Раствор ции. Диэтиловый эфир (100 мл) добавляли к затем фильтровали, а кристаллы промывали основной массе раствора, что приводило к и сушили. Выход * 83%. Температура плавнемедленной кристаллизации. Кристаллы 45 ления соли составляла 190-192°С (d). (13,4 г) отфильтровывали и промывали ацеП р и м е р 5 . Бензил клавуламат (очищентоном. ный посредством Sephadex хроматографии, 2е 20 г, 0.07 моля) растворяли в тетрагидрофуТрет-октиламин. К 500 мл сырьевого ране (отогнан с гидрида кальция, 400 мл) и раствора, полученного как в примере 2а. 50 добавляли катализатор (10%) палладия на добавляли трет-октиламин (6,7 г). Раствор древесном угле (5,7 г). Смесь гидрировали с становился слегка мутным. Добавляли ацеперемешиванием при температуре окрутон (20 мл), что проясняло раствор. К аликжающей среды и около 15 psi в течение воте раствора добавляли диэтиловый эфир, 20-30 минут. Состояние реакции контрочто приводило к немедленной кристаллиза- 55 лировали посредством тонкослойной хроции. Диэтиловый эфир (55 мл) добавляли к м а т о г р а ф и и , используя п л а с т и н ы из основной массе раствора, что приводило к диоксида кремния, проявленные этилацекристаллизации. Кристаллы отфильтровытатом и визуализированные с использовавали и промывали ацетоном. Выход (12,9 г) нием трифенилтетразолийхлоридного 15 22115 распылительного средства. Р^клзвулановой кислоты 0,0, бензилового эфира 0,4. Реакционную смесь фильтровали и набивку фильтра хорошо промывали. Смешанные фильтраты (500 мл), содержащие 5 клавулановую кислоту, обрабатывали при перемешивании 2-амино-2,4,4-триметилпентаном (9,0 г, 0,07 моля) в сухом тетрагидрофуране (50 мл). Кристаллизация наблюдалась в течение одной минуты. 10 Смесь перемешивали в течение 0,5 часа при температуре окружающей среды и затем 2 часа при 5°С. Продукт отфильтровывали, промывали сухим тетрагидрофураном (100 мл) и сушили в вакууме в течение 12 часов, 15 получая 23,0 г 100% названной соли, имеющей температуру плавления 160-170°С. П р и м е р б . Приготовление осуществляли как в примере 5, используя бензилклавуланат (0,9 г, 0,003 моля) и обрабатывая 20 получающийся раствор клавулановой кислоты 2-амино-2-метилпропаном (0,22 г, 0,003 моля) в сухом тетрагидрофуране (10 мл). Названную соль получаем в количестве 0,6 г, 73% выход, с температурой плавления 25 15СЫ52°С. . П р и м е р 7. Приготовление осуществляли как и в примере 5, используя бензилклавуланат(0,9 г, 0,003 моля) и обрабатывая получающийся раствор клавулановой кис- 30 лотыО(+) 1-метилбензиламином в сухом тетрагидрофуране (10 мл). Смесь хранили при 5°С в течение двух дней, в течение этого времени протекала медленная кристаллизация. Фильтрование давало названную соль 35 0,6 г, 62% выход, имеющую температуру плавления 125°C(d). П р и м е р е . Водный раствор клавуланата лития смешивали с водным раствором алкиламмоний фосфата. Осажденный фос- 40 фат лития отфильтровывали и аминоклавуланатную соль осаждали путем добавления ацетона. Было обнаружено, что можно использовать также клавуланат натрия, но в этом случае имелась необходимость добав- 45 ления этанола, чтобы поддержать выделение фосфата н а т р и я . Т а к ж е м о ж н о использовать гидрохлориды аминов. Таким же образом клавуланат лития использовали для получения N-этияпипери- 50 динклавуланата, и клавуланат натрия использовали для получения N-этилпиперидин- клавуланата, П р и м е р 9. Неочищенный экстракт клавулановой кислоты, представляющий со- 55 бой сырой экстракт из ферментационного бупьона S.clavultgerus после некоторой предварительной очистки при помощи ионообмена (500 мл. 21 мг/мл в этилацетате) смешивали с ацетоном (150 мл) и посте 16 пенно обрабатывали раствором N.N-диметилциклогексиламина (6,7 мл) в ацетоне (25 мл). Аликвоту удаляли и обрабатывали диэтиловым эфиром, происходила немедленная кристаллизация. Затравка кристаллами основной массы раствора приводила к быстрой кристаллизации белых пластинок, эта кристаллизация становилась более полной при добавлении простого эфира (110 мл). Аминную соль отфильтровывали, промывали ацетоном (3x100 мл) и сушили на воздухе. Выход 13,4 г, 82% выделение, 64,9 pfa (теоретическое 61,0%). П р и м е р 10. К неочищенному раствору клавулановой кислоты использованному в примере 9 (500 мл, 21 мг/мл), дополнительно содержащему ацетон (20 мл), добавляли трет-октиламин (7,7 г, 1,0 экв.), что давало небольшую туманность. Добавление диэтилового эфира (55 мл) вызывало выделение аминной соли в виде мелких белых игл. которые отфильтровывали и промывали ацетоном. Выход 12,9 г, 77,2% выделение, 62,8 pfa (теоретическое = 60,6%). П р и м е р 11. Неочищенный раствор клавулановой кислоты в этилацетате (1 л, 10.14 мг/мл), полученный экстракцией ферментационного бульона S.clsvuUgerus этилацетатом и некоторой предварительной очисткой путем ионообмена, смешивали с ацетоном (600 мл) и затем обрабатывали бензатином (6,15 г) в этилацетате (55 мл). Смесь начинала кристаллизоваться по мере того, как добавление бензатина близилось к завершению. Затем для того, чтобы сделать осаждение более полным, добавляли метилизобутилкетон (200 мл). Кристаллы отфильтровывали и промывали ацетоном (3x100 мл). Выход = 11,5 г, 67,0% выделение. П р и м е р 12. Повторяли методику примера 11, используя неочищенный влажный (приблизительно 1% воды) раствор клавулановой кислоты в этилацетате. К отдельным 1 л порциям этого раствора добавляли при перемешивании избыток чистого этилендиамина, N ,1М'-диэтил этилен диамина и N.N-диизопропилэтилендиамина, причем количество каждого амина было в избытке по отношению к количеству, необходимому для образования диаммониеаой соли с кяавуланоаой кислотой, После непрерывного перемешивания образовывался осадок соли. Дополнительное количество кристаллов получали добавлением избытка ацетона. Осажденную диаммониевую соль отфильтровывали и промывали ацетоном, Сформированные таким образом кристаллы каждой из диаммониевых солей превращали в клавуланат калия посредством растворения соли в минимальном количест 17 22115 ве воды с последующим добавлением раствора избыточного количества 2-этилгексаноата калия в изопропиловом спирте. После непрерывного перемешивания осадок клавуланата калия образовывался, его фильт- 5 ров ы вали, промывали изопропиловым спиртом и сушили. П р и м е р і З . Раствор клавулановои кислоты (0,0046 моля) в тетрагидрофуране (30 мл) обрабатывали раствором триметила- 10 мина в метаноле (1,0 мл 25 вес. %) раствора, приблизительно 0,0042 моля, получая бледножелтый раствор. Кристаллизацию вызывали, затравливая раствор кристаллами и выдерживая его при комнатной температу- 15 ре. Кристаллизация была быстрой, дающей мелкие иглы, и завершалась при выстаивани в течение ночи при+4°С. Продукт отфильтровывали, промывали небольшим обьемом свежего растворителя (приблизительно 5 20 мл) и сушили в вакууме. Выход 0,9 г (75%), температура плавления более 310°С, медленно становящийся коричневым при температуре выше приблизительно 130°С. Проба В 24641: найдено С51,32; Н 7,15; N10.68% 25 С ц Н ^ О д т р е б у е т С 5 1 , 1 6 ; Н 7,02; N 10,84%. Проба А 15230. Имидазол 77,2; 76,4% (рассчитано 77,1 %, приблизительно 99,5% чистота). Вода 1,18; 1,34%. 30 Качество соединения (в виде кремовоокрашенных мелких иголок) ухудшается при стоянии на воздухе в течение нескольких дней. Соединение поглощает воду и медленно становится желтым. 35 П р и м е р 14, Ниже приведены способы 'получения вышеупомянутого вещества, поскольку каждый дает несколько отличающийся результат. Первый дает умеренный выход продукта, содержащего воду до сте- 40 пени, соответствующей полугидрату, тогда как второй дает по существу безводное вещество, хотя и с низким выходом. . 14А. 45 Клавулановую кислоту (0,00346 моля) в тетрагидрофуране (25 мл) обрабатывали триэтиламином (0,4 г, 0,00346 моля) и смешивали, получая гомогенный прозрачный раствор. Кристаллизацию инициирова- 50 ли посредством затравливания раствора кристаллами и завершали, выдерживая в течние ночи при +4°С Продукт отфильтровывали и сушили в вакууме. Выход 0,7 г (63%) в виде больших белых 55 игл. Проба В 24639: найдено: С 54,74: Н 7,95; N 8,94%. C M H 2 4 N 2 O 5 требует С 56,05; Н 8.00; N 9,33%. C 1 4 H 2 4 N 2 O 5 х1 /2 Н2О требует С 54,36; Н 8,14; N9,05%. 18 ПробаА 15220: Имидазол 61,0; 61.1% (рассчитано 64,4%, приблизительно 95,0% чистота). Вода 2,64% (полугидрат требует 12,91%). Клавулановую кислоту (0,021 моля) в тетрагидрофуране (60 мл) обрабатывали триэт и л а м и н о м (2,1 г, 0,021 моля) и перемешивали получающийся прозрачный раствор, затравленный истинной солью. Продукт начинал кристаллизоваться при комнатной температуре в виде длинных игл, причем процесс завершался в течение ночи при +4°С. Продукт собирали фильтрованием, промывали на фильтре свежим растворителем ( п р и б л и з и т е л ь н о 10 мл) и диэтиловым эфиром (приблизительно 20 мл) и, наконец, сушили в вакууме, получая белый кристаллический продукт. Выход 1,7 г (27%). Проба В 24676: найдено: С56.07; Н 7,83; N 9,32 %. C 1 4 H 2 4 N 2 O 5 требует С 56.05; Н 8,00; N 9,33%. C M H 2 4 N 2 O 5 х 1 /2 Н2О требует С 54,36; Н 8,14; N9,05%. ПробаА 15268: Имидазол 65,1; 65,1% (рассчитано 66,3%, приблизительно 98,2% чистота). Вода 0.9% [а] 24=47,0° (с-0,2% вводе) Аналогично соли триметиламина качество продукта ухудшается при стоянии на воздухе в течение нескольких дней. Эти два примера иллюстрируют получение солей клавулановои кислоты высокой чистоты из растворов клавулановои кислоты в органических растворителях. П р и м е р 15. Отдельные образцы триметиламинклавуланата и триэтиламинклавуланата из примеров 13 и 14 растворяют в минимальном количестве холодной воды. К этим растворам при перемешивании добавляют концентрированный раствор 2-этилгексаноата калия в изопропаноле. После непрерывного перемешивания кристаллы клавуланата калия выделяются и могут быть отфильтрованы, промыты холодным изопропаноломи высушены. П р и м е р 16. Неочищенный водный раствор клавулановои кислоты, получаемый из ферментационного бульона S.clavuligerus предварительной очисткой, включающей ионообменную хроматографию или в основном вышеописанную, сод е р ж а щ и й п р и б л и з и т е л ь н о 17,1 г / л , подкисляли 25% (объемн.) серной кислотой до рН 2,0 и затем непрерывно экстрагировали в этилацетат. Этилацетатный эктсракт охлаждали до 2°С, обезвоживали центрифугированием, затем сушили MgSO 4 , затем пропускали через CPG угольную колонку. 19 На этой стадии этилацетатный экстракт содержал 6,02 г/л клавулановой кислоты и затем его концентрировали посредством выпаривания до концентрации 25,7 г/л клавулановой кислоты и использовали при этой 5 концентрации. Содержание влаги в концентрате составляло приблизительно 0,26% (объем н.). 7,8 мл трет-октиламина смешивали с 25 мл свежего этилацетата. Эту смесь медлен- 10 но добавляли к 2 л обогащенного клавуланатом этилацетатного экстракта, снова разбавляли свежим этилацетатом при быстром перемешивании до титра 23,0 г/л. Суспензию перемешивали при 5°С еще час. 15 Трет-октиламинклавуланат впоследствие отделяли фильтрованием и промывали этилацетатом. Заключительную сушку осуществляли в течение нрчи в вакуумной печи при 20°С с отводом азота. Вес продукта - 6,13 г. 20 П р и м е р 1 7 . 5 г аминной соли, полученной в примере 16, растворяли в 97 мл изопропанола. Продукт не растворялся легко и было найдено необходимым применить мягкое нагревание до 24°С с тем, чтобы осу- 25 ществить полное растворение. 14 мл 1,5 Н 2-этилгексаноата калия в изопропаноле добавляли в течение 10 минут. Суспензию непрерывно перемешивали в течение 1,5 часов при 5°С. Продукт клавуланат калия 30 затем отфильтровывали, промывали небольшим количеством изопропанола, затем ацетона и сушили в вакууме в течение ночи, с отводом азота при 20°С. Вес продукта 3,16 г. 35 П р и м е р 18. Отфильтрованный (RVF) ферментационный бульон S.clavullgerus, содержащий 2 г/л клавулановой кислоты, подкисляли 25% (объемн.) серной кислотой до рН 1,6 и непрерывно экстрагировали в 40 этилацетат. Экстракт в растворителе охлаждали до 3°С, затем обезвоживали центрифугированием, затем сушили MgSO 4 , затем пропускали через CPG угольную колонку. Обработанный углем экстракт затем кон- 45 центрировали выпариванием до концентрации клавулановой кислоты приблизительно 20 г/л с содержанием влаги приблизительно 0,06% (объемн.). 13,5 мл трет-октиламина смешивали с 43 мл свежего этилацетатэ. Эту смесь медленно добавляли к 400 мл обогащенного клавуланатом экстракта в этилацетате при титре клавулановой кислоты 20 г/л и быстром перемешивании. Суспензию перемешивали при 5°С еще час. Затем трет-октиламинклавуланат отделяли фильтрованием и промывали этилацетатом. Заключительную сушку осуществляли в течение ночи в вакуумной печи при 20°С с отводом азота. Вес продукта 12,44 г. П р и м е р 19. 11 г соли амина, полученной в примере 18, растворяли в 213 мл изопропанола. Продукт не растворялся легко даже после применения мягкого нагревания до 24°С. Для того, чтобы обеспечить растворение, добавляли воду (3,75 мл). Как только получали раствор, добавляли дополнительный изопропанол (100 мл) для того, чтобы перед кристаллизацией снизить содержание воды. Чреез 15 минут добавляли 30 мл 1.5Н 2-этилгексаноата калия в изопропаноле. Суспензию непрерывно перемешивали в течение 1,5 часов при 5°С. Продукт клавуланат калия затем отфильтровывали, промывали небольшими количествами изопропанола, затем ацетона и сушили в вакууме в течение ночи при 20°С с отводом азота. Вес продукта 7,29 г. П р и м е р 20. Приготовление диклавулановых солей этилендиаминов и их преобразование в клавуланат калия. а) Образование соли. Экстракт клавулановой кислоты в зтилзцетате (концентрация около 23 мг/мл) обрабатывали серией этилендиаминов с охлаждением в ледяной бане. В основном получали кристаллическое твердое вещество, но в некоторых случаях исходным продуктом было масло, которое кристаллизовали посредством добавления ацетона. Соли отделяли фильтрацией, вымывали ацетоном и высушивали в вакууме, затем анализировали ЯМР- или ИК-спектроскопией. Во всех случаях ЯМР-спектры подтверждали образование диклавулановых солей. Характеристические полосы ИК-излучения для каждой соли представлены ниже. Полосы ИК-излучения (Nujol mull), см' 1 Амин эти лен диамин N.N'-диэтилэтилендиамина N.N'-диизопропилэтилендиамина N-изопропилэтилендиаминз N.N'-диметилэтилендиамина М.Ы.М'-триэтилэтилендиамина М.М.ІМ'-триметилзтилендиамина М.М-диметил-ГМ'-этилэтилендиамина 20 22115 1787, 3390, 3359, 1784, 3342, 3346, 3301, 3323. 1695, 1777, 1788, 1683, 1784. 1770, 1788, 1789, 1596, 1688, 1725, 1312, 1602, 1684, 1690, 1684, 1684, 1303, 1313, 1310, 1310, 1311 1198 1290 21 22115 б) Преобразование в клавуланат калия. Несколько из указанных выше солей преобразовали в клавуланат калия, используя следующий общий метод. Диклавулзновую соль (3,0-4,0 г) перемешивали в изопропаноле (25 мл) при охлаждении в ледяной бане. Осторожно добавляли воду до получения прозрачного раствора. Смесь разбавляли изопропанолом (25 мл), добавляли 2,16 - мольный раствор 2-этилгексаноата калия в и з о п р о п а н о л е (7,0 мл) и полученную суспензию перемешивали в холоде в течение 15-30 минут. Белый кристаллический продукт выделяли фильтрацией, вымывали ацетоном и высушивали в вакууме. Чистоту устанавливали посредством анализа жидкостной хроматографией высокого давления. Результаты Амин Чистота клавуланата. калия М.КГ-диэтилэтилендиамина * 91,9% л ІМ.М'-диизопропил" этилендиамина * • "' 96,8% N.N'-диметилэтилендиамина 94,7% !\1,М,ЬГ-триэтил этилендиамина 95,2% Ы.М-диметил-Ы'-этилэтилендиамина 99,8% П р и м е р 21. Приготовление клавуланата калия через диклавулановую соль N,N'диизопропилэтилен диамина. a) Экстракт клавулановой кислоты в этилацетате (360 мл, концентрация около 12,8 мг/мл) перемешивали в ледяной бане и покапельно добавляли раствор N.N'-диизопропилэтилендиамина (3,6 мл) в этилацетате (50 мл) до получения белого твердого вещества. Смесь перемешивали в холоде в течение 40 м и н у т , п р о д у к т с о б и р а л и фильтрацией, вымывали дважды этилацетатом и высушивали в вакууме. Выход диклавулановой соли N.N'-диизопропилэтилендиамина составил 7.29 г. Анализ жидкостной хроматографией высокого давления показал, что содержание клавулановой кислоты составляет 63,5%. ЯМР-спектр показал, что продукт был сольватирован этилацетатом. b) Диклавулэновый этилацетатсольват N.N'-диизопропилэтилендиамина (2,0 г) суспендировали в изопропаноле (10 мл) и охлаждали в ледяной бане Воду добавляли осторожно до получения прозрачного раствора (требовалось 1,60 мл). Раствор разбавляли и з о п р о п а н о л о м (15 мл) и 2,16-мольным раствором 2-этилгексаноата калия (5,0 мл), которые медленно добавля 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 22 ли при хорошем перемешивании. Полученную суспензию кристаллов перемешивали в течение дальнейших 30 мин, затем отфильтровывали и продукт промывали изопропанолом, за^ем ацетоном и высушивали в вакууме. Выход клавуланата калия составил 1,20 г (79,5%). Анализ жидкостной хроматографией высокого давления показал, что содержание клавулановой соли составляет 99,4%. П р и м е р 22. Приготовление клавуланата калия через диклавулановую соль М,Ы,Ы'-триэтилэтилендиамина. а) Экстракт клавулановой кислоты в этилацетате (400 мл, концентрация около 23 мг/мл) разбавляли ацетоном (100 мл), затравляли полученной выше солью N.N.N'триэт'илэтилендиамина и перемешивали в ледяной бане, Ы.Ы.М'-триэтилэтилендиамин (3,0 мл), затем добавляли покапельно до получения белого твердого вещества. Смесь перемешивали в течение 1 часа, продукт отделяли фильтрацией, промывали ацетоном и высушивали в вакууме. Выход диклавулановой соли N,N,N'-TpHэтилендиамина составил 8,60 г (68,6%). б) Диклавулзновая соль Ы,Ы,1\Г-триэтилэтилендиамина (5.0 г) суспендировали в изопропаноле (25 мл) и охлаждали в ледяной бане Осторожно добавляли воду до получения прозрачного раствора (требовалось 3,0 мл) Раствор разбавляли изопропанолом (75 мл) и 2,16-мольный раствор 2-этилгексаноата калия (12,0 мл) медленно добавляли при хорошем перемешивании. Полученную суспензию кристаллов перемешивали в течение 10 мин, затем отфильтровывали, продукт вымывали ацетоном и затем высушивали в вакууме. Выход клавуланата калия составил 4,05 г (92,6%). Анализ жидкостной хроматографией высокого давления показал, что содержание калиевой соли составляет 99,8%. П р и м е р 23 Приготовление клавуланата калия через диклавулановую соль N.N.N'.N'-TeTpaMeTM этилендиамина. а) Экстракт клавулановой кислоты в этилацетате (280 мл, концентрация около 8,4 мг/мл) перемешивали при комнатной температуре и добавляли раствор N,N,N',N'т е т р а м е г и л э т и л е н д и а м и н а (3,5 мл) в этилацетате до получения прозрачного раствора, который быстро кристаллизовался. Смесь перемешивали в течение 1 часа, продукт собирали фильтрацией, промывали этилацетатом и высушивали. Выход диклавулановой соли N,N,N\N'тетраметилэтилендиамина составил 2,17 г (71,5%). 23 22115 б) Д и к л а в у л а н о в а я соль амина Г4,Г\],Ы',М'-тетраметилэтилендиамина (2,0 г) суспензировали в изопропаноле (20 мл) и охлаждали в ледяной бане. Осторожно добавляли воду до получения прозрачного 5 раствора (требовалось 2,2 мл). 2,16-мольный раствор 2-этилгексаноата калия (5,0 мл) медленно добавляли при хорошем перемешивании и полученную суспензию кристаллов далее разбавляли изопропанолом (40 мл). 10 Смесь перемешивали в течение дальнейших 30 мин, затем отфильтровывали, продукт промывали ацетоном и затем высушивали в вакууме. Выход клавуланата калия составил 15 1,60 г (87,0%). Анализ жидкостной хроматографией высокого давления показал, что содержание к/іавулановой соли составляет 99,8%. П р и м е р 24. Приготовление клавула- 20 ната калия из соли триэтилентетрамина. а) Экстракт клавулановой кислоты в этилацетате (100 мл, концентрация около 23 мг/мл) охлаждали до -10°С и хорошо перемешивали. Покапельно добавляли раствор 25 триэтилентетрамина (1,5 г) в дизтиловом эфире до получения прозрачного раствора, после чего быстро образовывался плотный белый осадок. Смесь перемешивали в течение Ічаса при повышении температуры до 30 комнатной температуры (приблизительно 22°С). Большую часть растворителя сцеживали, затем продукт промывали свежим этилацетатом (2x100 мл) и высушивали в вакууме до получения белого твердого ве- 35 щества. Выход составил 2,18 г. Соль показала характеристические ИКполосы 1789, 1598, 1306 и 1121 см" 1 . б) Соль тризтилентетрамина (1,0 г) пере- 40 мешивали в смеси этилацетата и насыщенного раствора хлорида натрия (10 мл) и охлаждали в ледяной бане. Смесь осторожно подкисляли до рН 1,5, используя 25% серную кислоту, и разделяли фазы. Фазу 45 этилацетата высушивали над сульфатом магния, фильтровали и обрабатывали 2,16мольным раствором 2-этил-гексаноата калия в изопропаноле (2 мл). Полученную суспензию помещали в холод на 30 мин и 50 белый кристаллический продукт собирали фильтрацией, промывали ацетоном и высушивали в вакууме. П р и м е р 25, Экстрагирование клавулановой кислоты тетрагидрофураном (ТГФ) 55 и последующая реакция с N.N'-диизопропилэтилендиамином или 1\1,М,ЫЧ\Г-тетраметилэтилендиамином. а) Ионообменный элюат (500 мл, титр 14700 мкг/мл) из рабочего ферментативно 24 го бульона смешивали с ТГФ (250 мл) при 5°С. Имелась монофазная система. Хлорид натрия (15 г) добавляли и перемешивали до завершения растворения. Фазу сольвента затем отделяли довольно легко, практически без эмульсионной фазы раздела. Раствор подкисляли 50% серной кислотой до рН 1,6 Немедленно после добавления кислоты две фазы разделяли центрифугированием для удаления имеющихся свободных капель воды. Верхняя фаза сольвента, содержащая клавулановую кислоту, перегоняли в вакууме и посредством этого этапа снижали содержание воды. Концентрат снова разбавляли до приблизительной концентрации 20000 мкг/мл сухим ТГФ. б) Первая аликвота экстракта ТГФ (75 мл) охлаждали в ледяной бане и аккуратно перемешивали. N.N'-диизопропилэтилендиамин (0,6 г) смешивали в ТГФ (20 мл) и эту смесь медленно добавляли к раствору сольвента клавулановой кислоты в течение 25 мин. Первоначально образовывалось масло от которое отбраковывали. Дальнейшее добавление амина привело к получению желто/грязно-белого кристаллического осадка. Через 1 час продукт отфильтровывали, промывали ацетоном и высушивали в вакууме. Продукт высушивали в течение ночи и анализ жидкостной хроматографией высокого давления показал, что содержание в нем клавулановой кислоты составляет 71,5%. в) Вторую аликвоту экстракта ТГФ (75 мл) обрабатывали подобным образом М,ГМ,М\Г\Г-тетраметилэти лен д и а м и н о м (0,75 г) в ТГФ (20 мл). Продукт первоначально снова образовал масло, которое удаляли, чтобы обеспечить прохождение хорошей кристаллизации в течение 1 часа. Продукт отфильтровали и высушили в течение ночи в вакууме, и анализ жидкостной хроматографией высокого давления показал, что содержание в нем клавулановой кислоты составляет 75,2%. П р и м е р 26. Диклавулановая соль №,Ы,Ы',Ы"г>Г-пентаметилдиэтилентриамина. а) Экстракт клавулановой кислоты в этилацетате (150 мл, содержание клавулаиовой кислоты прибл. 19 мг/мл) охлаждали в ледяной бане и г\1.Г\1,ГМ',Ы",М"-пентаметилдиэтилентриамин (1,5 мл) медленно добавляли, пользуясь шприцем. После перемешивания в течение 15 мин белые кристаллы собирали фильтрацией, промывали этилацетатом и высушивали в вакууме. Выход составил 3,10 г (выход 75%). ЯМР-спектр (D20) показал, что соотношение клавулановой кислоты к амину со 25 22115 ставляет 2'1 ЯМР-спектр также ясно показал, что центральный атом азота не протонирован, так как метильная группа на этом азоте смещена существенно вверх относительно метильных групп на конечных атомах азота. ИК-спектр (nujoil mull) показал полосы Inter alia приблизительно 3340, 1787, 1694, 1620, 1305, 1017, 895 и 734 см" 1 . б) Преобразование в клавуланат калия. Экстракт клавулановой кислоты вэтилацетате {150 мл, содержание клавулановой кислоты прибл. 19 мг/мл) охлаждали в ледяной бане и N,N,N',N",N"- пентаметилдиэтилентриамин (1,5 мл) медленно добавляли, пользуясь шприцем. Белые кристаллы собирали фильтрацией, промывали этилацетатом (100 мл) и высушивали в вакууме Полученное белое твердое вещество добавляли порциями в смесь изопропанола (100 мл) и воды (2,0 мл) при перемешивании при комнатной температуре. Прозрачный бледно-желтый раствор затем охлаждали в ледяной бане и обрабатывали 2,16-мольным раствором 2-этил-гексоноата калия в изопропаноле (8 мл). Белый кристаллический продукт собирали фильтрацией, промывали изопропанолом, затем ацетоном и высушивали в вакууме. Выход составил 1,60 г (выход 47% из чистой кислоты) Анализ чистоты жидкостной хроматографией высокого давления показал, что содержание калиевой соли составляет 97,3%. П р и м е р 27. Диэтилентриамин моноклавуланат. Экстракт клавулановой кислоты в этилацетате (25 мл, содержание клавулановой кислоты прибл. 29 мг/мл) добавляли к перемешиваемому раствору диэтилентриамина (0,5 мл) при охлаждении ледяной бане. Белое твердое вещество собирали фильтрацией, тщательно промывали ацетоном и высушивали в вакууме. Выход составил 0,35 г. ЯМР-спектр (D20) показал, что соотношение клавулановой кислоты к амину составляет приблизительно 1:1. ИК-спектр (nujoll mull) показал карбонильную полосу бета-лактама 1783 см" 1 . П р и м е р 28. N'-метилдиэтилентриамин моно- и диклавуланаты. Экстракт клавулановой кислоты в этилацетате (50 мл, содержание клавулановой кислоты прибл. 29 мг/мл) разбавляли ацетоном (50 мл) и охлаждали в ледяной бане, N'-метилдиэтилентриамин добавляли при перемешивании и белое твердое вещество собирали фильтрацией, тщательно промывали ацетоном и высушивали в вакууме. 26 Выход составил 0,8 г. ЯМР-спектр (D20) показал, что соотношение клавулановой кислоты к амину составляет приблизительно 1,5.1. который соответствует смеси солей 2:1 и 1:1. ИКспектр (nujoll mull) показал карбонильную полосу бета-лактама 1789 см" 1 . П р и м е р 29. Моно- и диклавулановые соли Щ3-аминопропил)этилендиамина. Экстракт клавулановой кислоты вэтилацетате (25 мл, содержание клзвулановой кислоты прибл 29 мг/мл) добавляли к перемешиваемому раствору Ы-(3-аминопропил)этилендиамина (0,5 мл) в ацетоне (50 мл) при охлаждении в ледяной бане. Образец осажденноого бледно-желтого твердого вещества собирали фильтрацией, тщательно промывали ацетоном и высушивали в вакууме. ЯМР-спектр (D20) показал, что соотношение клавулановой кислоты камину составило приблизительно 1,4:1, что соответствует смеси солей 2:1 и 1.1. ИКспектр (nujoll mull) показал карбонильную полосу бета-лактама 1788 см" . П р и м е р 30 Моноклавулановая соль тетраэтиленпетамина. Экстракт клавулановой кислоты в этилацетате (25 мл, содержание клавулановой кислоты прибл. 29 мг/мл) добавляли к перемешиваемому раствору тетраэтиленпентамина (0,5 мл) в ацетоне (25 мл) при охлаждении в ледяной бане. Образец осажденного бледно-желтого твердого вещества собирали фильтрацией, тщательно промывали ацетоном и высушивали в вакууме. ЯМР-спектр (D20) показал, что соотношение клавулановой кислоты к амину составило 1:1. ИК-спектр (nujoll muil) показал карбонильную полосу бета-лактама 1786 см" . П р и м е рЗІ.Триклавулановаясоль 1,1, 4,7,10,10-гексаметилтриэтилентетрамина. Экстракт клавулановой кислоты в этилацетате (50 мл, содержание клавулановой кислоты прибл. 29 мг/мл) разбавляли этилацетатом (50 мл) и охлаждали в ледяной бане. 1, 1, 4, 7, 10, 10-гексаметилтриэтилентетрамин (0,7 мл) добавляли при перемешивании и немедленно получали белый осадок. Продукт собирали фильтрацией, промывали этилацетатом и высушивали в вакууме. Выход составил 0,65 г. ЯМР-спектр (D20) показал, что соотношение клавулановой кислоты к амину составло 3:1. Химическое смещение для метильных групп №4 и №7 соответствовало тому, что только одна из них протонирована. 27 22115 28 П р и м е р 32. Триклзвулановая соль П р и м е р 33. Моноклавулановая соль (^,Г\Г-бис-(3-ам|/1Нопрапил)этилендиамина. трис-(2-аминоэтил)змина. Экстракт клавулановой кислоты бутилаЭкстракт клавулановой кислоты в этилацетате (50 мл, содержание клавулановой цетате (50 мп, содержание клавуланоаой кислоты прибл. 29 мг/мп) разбавляли ацетокислоты прибп. 29 мг/мп) разбавляли ацетоном (50 мл) и охлаждали в ледяной бане. ном (50 мл) и охлаждали в ледяной бане.. Г\|,(\Г-бис-(3-аминопропил)-этилендиамин Трис-(2-аминоэтил)амин (0,5 мл) добавляли (0,5 мл) добавляли при перемешивании и при перемешивании и до получения белого немедленно получали белый осадок. Проосадка. Продукт собирали фильтрацией, дукт собирали фильтрацией, промывали 10 тщательно промывали ацетоном и высушиацетоном и высушивали в вакууме. вали в вакууме. Выход составил 2,5 г. ЯМР-спектр (D20) показал, что соотноВыход состаивл 2,30 г (выход 91,5%). шение клавулановой кислоты к амину состаЯМР-спектр (D20) показал, что соотновило 3:1. 15 шение клавулановой кислоты к амину составило 1:1. ИК-спектр (nujoll mull) показал ИК-спектр (nujoll muH) показал карбокарбонильную полосу бета-лактама 1789 см"1. нильную полосу бета-лактама 1785 см" . Упорядник Замовлення 4470 Техред М.Келемеш Коректор М. Самборская : Тираж Підписне Державне патентне відомство України, * 254655, ГСП, Київ-53, Львівська пл., 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м, Ужгород, вул.ГагарІна, 101