Композиція, що містить моногліцериди органічних кислот c1-c7 та гліцерин, та її застосування як протибактеріального та протипліснявого засобу

Реферат: Винахід належить до композицій з протибактеріальною або протипліснявою активністю, що застосовують для зменшення або знищення бактерій та плісняви у кормі тварин, які містять моногліцериди органічних кислот С1-С7 у кількості від 41 мас. % до 50 мас. % та гліцерин у кількості від 28 мас. % до 50 мас. %. UA 111464 C2 (12) UA 111464 C2 UA 111464 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Галузь техніки Цей винахід стосується композицій, які застосовують до кормів для тварин. Рівень техніки Однією з найпоширеніших проблем, що впливають на стан свійських і домашніх тварин, є, як відомо, шкода від інфекцій бактеріального походження і мікотоксинів, що продукуються пліснявою, вжитою разом із кормом. Стосовно бактеріальних інфекцій і, зокрема, інфекцій кишкового тракту, відомо, що вони нерідко супроводжуються діареєю тяжкого ступеня, яка здатна негативно позначатися на здоров'ї тварини аж до настання серйозних наслідків, і відтак зменшувати прибутковість фермерського господарства в цілому. Щодо мікотоксинів, які продукуються пліснявою, то вже протягом декількох років відомо про їхній токсичний вплив на певні органи та фізіологічні функції тварин, а також про їхню здатність спричиняти захворювання (такі як токсикоз). Відомо також, що мікотоксини з канцерогенними властивостями (такі як афлатоксини, які продукує пліснява штаму Aspergillus) можуть надходити до організму людини шляхом вживання коров'ячого або козячого молока через те, що вони є стійкими і не знешкоджуються звичайною тепловою обробкою. Сполука Ocratoxin A продукується пліснявою штамів Aspergillus та Penicillium; якщо ця речовина наявна у їжі, вона здатна спричиняти серйозні захворювання нирок у свиней та в деяких видів птахів. Токсин Т-2, що продукується пліснявою штаму Fusarium, здатний викликати некроз травного шляху у тварин. Зазвичай намагаються подолати цю проблему шляхом застосування органічних кислот із коротким ланцюгом (поодинці або у вигляді суміші), а саме мурашиної кислоти (С1Н2О2), оцтової кислоти (С2Н4О2), пропіонової кислоти (С3Н5О2), молочної кислоти (С3Н6О2), фумарової кислоти (С4Н4О4), масляної кислоти (С4Н8О2), цитринової (лимонної) кислоти (C6H8O7), а також бензойної кислоти (С7Н6О2). Серед обмежень, пов'язаних із використанням зазначених органічних кислот, слід згадати їхню сильну корозійну дію, що здатна завдавати ушкодження будь-якому обладнанню, із яким контактує кислота. Ті самі кислоти у вигляді солей амонію, кальцію, натрію або калію також виявляють корозійну дію, хоча і в обмеженій мірі. Існують також певні фізіологічні обмеження стосовно дії органічних кислот (як таких або у вигляді солей) при їх застосуванні як протибактеріальні засоби у раціонах харчування тварин. Відомо, що органічні кислоти в цій ролі потребують кислотного середовища задля здійснення ними протибактеріальної дії, оскільки за цих умов вони існують у вигляді недисоційованої форми RCOOH. Недисоційована форма, тобто RCOOH, мігрує крізь стінки клітини мікроорганізма і, опинившись всередині, дисоціює відповідно до внутрішньоклітинного рН. + Задля підтримання рН всередині клітини мікроорганізм продукує іон H ; рівень концентрації дисоційованої форми органічної кислоти при цьому зростає і, оскільки ця форма не виходить за межі мікроорганізму, вона вбиває його. Водночас величина рН у кишковому тракті (близько 7) відповідає трохи лужному середовищу; отже, органічна кислота у вигляді недисоційованої форми присутня у вельми обмеженій кількості, отже протибактеріальна дія так само обмежена. Таким чином, згідно зазначеного вище, існує очевидна потреба у розробці нових композицій, які здатні протидіяти впливу плісняви і бактерій, які наявні у кормі для тварин, і водночас не виявляють вищезгаданих недоліків. Метод мікрокапсулювання органічних кислот із використанням речовин класу ліпідів був створений як засіб, що забезпечує надходження органічних кислот до кишкового тракту і зниження рН у місці надходження. Втім, одержані результати не є надто задовільними через буферну дію бікарбонату натрію, який продукується підшлунковою залозою і відіграє роль регулятора рН всередині кишкового тракту. До того ж, окрім невисокої ефективності технології як такої, вона є ще й надзвичайно дорогою. Протибактеріальну дію моногліцеридів певних жирних кислот вивчали в ході багатьох досліджень, наприклад: 1. J. Kabara, Dennis M. Swieczkowski, Anthony J., Conley, Joseph P. Truant 1972 FATTY ACIDS AND DERIVATES AS ANTIMICROBIAL AGENTS (КИСЛОТИ АЛІФАТИЧНОГО РЯДУ ТА ЇХ ПОХІДНІ ЯК ПРОТИМІКРОБНІ ЗАСОБИ). 2. G. Bergsson, J. Arnfinnsson, S. Karlsson, O. Steingrimsson, H. Thormar 1998. IN VITRO INACTIVATION OF CHLAMYDIA TRACHOMATIS BY FATTY ACIDS AND MONOGLYCERIDES (IN VITRO ІНАКТИВАЦІЯ БАКТЕРІЙ CHLAMYDIA TRACHOMATIS ДІЄЮ ЖИРНИХ КИСЛОТ ТА ЇХ МОНОГЛІЦЕРИДІВ). 1 UA 111464 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 3. G. Bergsson, J. Arnfinnsson, O. Steingrimsson, H. Thormar 2001. IN VITRO KILLING OF CANDIDA ALBICANS BY FATTY ACIDS AND MONOGLYCERIDES (ЗНИЩЕННЯ IN VITRO ДРІЖДЖІВ CANDIDA ALBICANS ДІЄЮ ЖИРНИХ КИСЛОТ ТА ЇХ МОНОГЛІЦЕРИДІВ). 4. H. Thormar, H. Hilmarsson, G. Bergsson 2005. STABLE CONCENTRATED EMULSIONS OF THE 1-MONOGLYCERIDE OF CAPRIC ACID (MONOCAPRIN) WITH MICROBICIDAL ACTIVITIES AGAINST THE FOOD-BORNE BACTERIA CAMPYLOBACTER JEJUNI, SALMONELLA SPP AND ESHERICHIA COLI (СТІЙКІ КОНЦЕНТРОВАНІ ЕМУЛЬСІЇ 1-МОНОГЛІЦЕРИДУ ДЕКАНОВОЇ КИСЛОТИ (МОНОКАПРИНУ), ЩО СПРАВЛЯЮТЬ БАКТЕРИЦИДНИЙ ЕФЕКТ НА ХАРЧОВІ БАКТЕРІЇ CAMPYLOBACTER JEJUNI, ШТАМИ SALMONELLA TA ESHERICHIA COLI); PCT/IS2005/000026 "STABLE CONCENTRATED ANTI-BACTERIAL EMULSIONS OF MONOCAPRIN IN WATER" («СТІЙКІ КОНЦЕНТРОВАНІ ВОДНІ ЕМУЛЬСІЇ МОНОКАПРИНУ ІЗ БАКТЕРИЦИДНОЮ ДІЄЮ»). 5. Hilmarsson, H. Thormar, J.H. Thrainsson, E. Gunnarsson 2006 EFFECT OF GLYCEROL MONOCAPRATE (MONOCAPRIN) ON BROILER CHICKENS: AN ATTEMPT AT REDUCING INTESTINAL CAMPYLOBACTER INFECTION (ВПЛИВ ГЛІЦЕРИНУ МОНОДЕКАНОАТУ (МОНОКАПРИНУ) НА КУРЧАТ БРОЙЛЕРІВ: СПРОБА ЛІКУВАННЯ ІНФЕКЦІЙНОГО КИШКОВОГО РОЗЛАДУ, СПРИЧИНЕНОГО БАКТЕРІЯМИ РОДУ CAMPYLOBACTER) Зазначеними дослідженнями було окреслено перспективний, але аж ніяк не вичерпний науковий напрямок, та, наскільки дозволяють судити наявні відомості, наразі бракує досліджень, які підтверджували б саме специфічну протибактеріальну та протиплісняву активність композицій, які містять моногліцериди жирних кислот із коротким ланцюгом та гліцерин. Короткий опис фігур На Фіг. 1 показаний вигляд водної суспензії композиції за цим винаходом в полі зору електронного мікроскопа. На Фіг. 2 показаний вигляд необробленого продукту харчування, інокульованого пліснявою Fusarium. На Фіг. 3 показаний вигляд продукту харчування, інокульваного пліснявою Fusarium, і обробленого композицією Monopropionin 43 (0,7%). Стислий опис винаходу Цей винахід стосується композицій для застосування щодо фуражного зерна, кормів, продуктів харчування та питва для тварин, які мають протибактеріальну або протиплісняву активність, які містять моногліцериди жирних кислот С 1-С7 у кількості від 10% до 90% та гліцерин у кількості від 10% до 90% від загальної маси композиції. Детальний опис винаходу Несподівано з'ясувалося, що композиції, які містять моногліцериди органічних кислот C1-C7 у поєднанні з гліцерином, виявляють сильну протибактеріальну активність як у кислому (рН 4,5), так і в нейтральному середовищі, яке властиве кишковому тракту тварин (тобто рН 7). Композиції за цим винаходом містять моногліцериди органічних кислот, як зазначено вище, у кількості від 10% до 90% та гліцерин у кількості від 90% до 10% від загальної маси композиції; за варіантом, якому віддають перевагу, вміст моногліцеридів органічних кислот та гліцерину становить відповідно 40-90% та 60-10%. Термін "органічні кислоти С1-С7" в контексті цього винаходу означає за варіантом, якому віддається перевага, такі кислоти: мурашину, оцтову, пропіонову, молочну, масляну, цитринову (лимонну), фумарову та бензойну. Особлива перевага віддається масляній та пропіоновій кислотам. Прикладами композицій згідно цього винаходу є композиції, які містять: (а) моногліцериди масляної кислоти 42-47% дигліцериди масляної кислоти 5-8% тригліцерид масляної кислоти 0,5-2% гліцерин 45-50% (b) моногліцериди пропіонової кислоти 45-50% дигліцериди пропіонової кислоти 8-12% тригліцерид пропіонової кислоти 1-3% 2 UA 111464 C2 5 гліцерин 36-40%. Конкретними прикладами композицій за цим винаходом є композиції, які містять: (с) моногліцериди масляної кислоти 45% дигліцериди масляної кислоти 6% тригліцерид масляної кислоти 1% гліцерин 48% (d) моногліцериди масляної кислоти 43% дигліцериди масляної кислоти 6% тригліцерид масляної кислоти 1% гліцерин 50% (e) моногліцериди пропіонової кислоти 49% дигліцериди пропіонової кислоти 10% тригліцерид пропіонової кислоти 2% гліцерин 39% (f) моногліцериди пропіонової кислоти 43% дигліцериди пропіонової кислоти 6% тригліцерид пропіонової кислоти 1% гліцерин 50%. Протибактеріальна активність самих лише органічних кислот у порівнянні з такою самою активністю композицій, що є об'єктами цього винаходу, наведена нижче у таблиці 1. Таблиця 1 Продукт Позитивний контроль Позитивний контроль Пропіонова кислота Пропіонова кислота Масляна кислота Масляна кислота Monopropionin 43 Monobutyrin 43 Monobutyrin 43 Розведення рН Е.соlі (КУО/мл) 1:909 1:909 1:1000 1:1000 1:109 1:100 1:100 7 4,5 7 4,5 7 4,5 7 7 4,5 10810 5 8410 4 5410 4 1310 4 10610 4 7810 4 11010 4 7510 4 4710 5 Salmonella typhimurium (КУО/мл) 5 12010 5 9610 4 1110 3 4210 4 6510 3 2510 3 1210 3 3510 2 810 Campylobacter jejuni (КУО/мл) 5 43110 5 20110 3 3310 1 1410 3 1810 1 210 5 7910 4 4810 3 8710 КУО - колонієутворювальна одиниця 10 15 Примітка: Композиція Monopropionin 43 містить: моногліцериди пропіонової кислоти 43% дигліцериди пропіонової кислоти 6% тригліцерид пропіонової кислоти 1% гліцерин 50%. Примітка: Композиція Monobutyrin 43 містить: моногліцериди масляної кислоти 43% дигліцериди масляної кислоти 6% тригліцерид масляної кислоти 1% гліцерин 50%. В таблиці 2 наведено порівняння бактерицидної дії in vitro масляної кислоти в чистому вигляді, моногліцеридів масляної кислоти, що не містять гліцерину, та суміші моногліцеридів масляної кислоти з гліцерином по відношенню до бактерій Clostridium perfringens (паличка газової гангрени). В той час як моногліцериди масляної кислоти не виявляють жодної гальмівної активності по відношенню до розвитку бактерій, а масляна кислота чинить гальмівну дію лише у 3 UA 111464 C2 -1 концентрації, вищій за 3000 млн , суміш моногліцеридів масляної кислоти з гліцерином виявляє гальмівну активність (тобто забезпечує відсутність проліферації) в усіх трьох спробах при -1 концентрації 1000 млн . Таблиця 2 Бактерія: Clostridium perfringens (паличка газової гангрени) СР27. 5 Концентрація посіву (інокуляції): 10 . Живильне середовище: серцево-мізковий екстракт. Час інкубації та зовнішній вигляд проліферуючої культури: "+" відповідає інкубації протягом 24 год; "++" - протягом 37 год та "+++" - протягом 96 год. Для кожної концентрації здійснено 3 спроби посіву. Негативний контроль Позитивний контроль (ПК) + + ++ млн -1 500 Масляна кислота + + + Monobutyrin 43 + + + Моногліцериди масляної кислоти + + + в середньому + + проліферація відсутня (п. в.) п. в. п. в. + + + п. в. п. в. п. в. + + + ++ ++ ++ п. в. п. в. п. в. + + + ++ ++ ++ п. в. п. в. п. в. + + + п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. + + + п. в. п. в. п. в. 1000 п. в. п. в. п. в. + + + + в середньому 1500 в середньому 2000 в середньому 2500 в середньому 3000 в середньому 4000 + + + в середньому 5 10 В таблиці 3 наведено порівняння бактерицидної дії in vitro оцтової кислоти в чистому вигляді, моногліцеридів оцтової кислоти, що не містять гліцерину, та суміші моногліцеридів оцтової кислоти з гліцерином по відношенню до бактерій Salmonella typhimurium свиней. Суміш моногліцеридів оцтової кислоти з гліцерином (Monoacetin 42) виявляє гальмівну активність -1 (тобто забезпечує відсутність проліферації) в усіх трьох спробах при концентрації 10 000 млн , в той час як моногліцериди оцтової кислоти виявляють гальмівну активність починаючи з 4 UA 111464 C2 -1 концентрації 25 000 млн , а оцтова кислота чинить гальмівну дію починаючи з концентрації 20 -1 000 млн . Таблиця 3 Бактерія: Salmonella typhimurium свиней. 5 Концентрація посіву (інокуляції): 10 . Живильне середовище: серцево-мізковий екстракт. Час інкубації та зовнішній вигляд проліферуючої культури: "+" відповідає інкубації протягом 24 год; "++" - протягом 37 год та "+++" - протягом 96 год. Для кожної концентрації здійснено 3 спроби посіву. рН6 Негативний контроль Позитивний контроль (ПС) + + ++ млн -1 5000 Оцтова кислота + + + Monoacetin 42 + + + Моногліцериди оцтової кислоти + + + в середньому + + проліферація відсутня (п. в.) п. в. п. в. + + + п. в. п. в. п. в. + + + п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. + + + п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. 10000 п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. + в середньому 15000 в середньому 20000 в середньому 25000 в середньому 30000 в середньому 40000 + + + в середньому 5 10 Примітка: Композиція Monoacetin 42 містить: моногліцериди оцтової кислоти 42% дигліцериди оцтової кислоти 7% тригліцерид оцтової кислоти 1% гліцерин 50%. В таблиці 4 наведено порівняння бактерицидної дії in vitro мурашиної кислоти в чистому вигляді, моногліцеридів мурашиної кислоти, що не містять гліцерину, та суміші моногліцеридів мурашиної кислоти з гліцерином по відношенню до бактерій Salmonella typhimurium свиней. Суміш моногліцеридів мурашиної кислоти з гліцерином (Monoformin 42) виявляє гальмівну активність (тобто забезпечує відсутність проліферації) в усіх трьох спробах при концентрації -1 5000 млн , в той час як моногліцериди мурашиної кислоти виявляють гальмівну активність -1 починаючи з концентрації 25000 млн , а мурашина кислота чинить гальмівну дію починаючи з -1 концентрації 15000 млн . 5 UA 111464 C2 Таблиця 4 Бактерія: Salmonella typhimurium свиней. 5 Концентрація посіву (інокуляції): 10 . Живильне середовище: серцево-мізковий екстракт. Час інкубації та зовнішній вигляд проліферуючої культури: "+" відповідає інкубації протягом 24 год; "++" - протягом 37 год та "+++" - протягом 96 год. Для кожної концентрації здійснено 3 спроби посіву. рН6 Негативн Позитивний ий контроль контроль (ПС) + млн -1 Мурашина кислота Monoformin 42 Моно-гліцериди мурашиної кислоти + + 5000 + ++ в середньому 10000 в середньому 15000 в середньому 20000 в середньому 25000 в середньому 30000 в середньому 40000 проліферація відсутня (п. в.) п. в. п. в. + + + п. в. п. в. п. в. + + + п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. + + + п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. + + + п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. + + + + в середньому 5 Примітка: Композиція Monoformin 42 містить: моногліцериди мурашиної кислоти 42% дигліцериди мурашиної кислоти 7% тригліцерид мурашиної кислоти 1% гліцерин 50%. В таблиці 5 наведено порівняння бактерицидної активності in vitro фумарової кислоти в чистому вигляді, моногліцеридів фумарової кислоти, що не містять гліцерину, та суміші моногліцеридів фумарової кислоти з гліцерином (композиції Monofumarin 41) по відношенню до 6 UA 111464 C2 5 бактерій E. соli (кишкової палички). Суміш моногліцеридів фумарової кислоти з гліцерином (Monofumarin 41) виявляє гальмівну активність (тобто забезпечує відсутність проліферації) в -1 усіх трьох спробах при концентрації 20000 млн , в той час як моногліцериди фумарової кислоти -1 виявляють гальмівну активність починаючи з концентрації 60000 млн , а фумарова кислота -1 чинить гальмівну дію починаючи з концентрації 90000 млн . Таблиця 5 Бактерія: E. соlі (кишкова паличка). 5 Концентрація посіву (інокуляції): 10 . Живильне середовище: серцево-мізковий екстракт. Час інкубації та зовнішній вигляд проліферуючої культури: "+" відповідає інкубації протягом 24 год; "++" - протягом 37 год та "+++" - протягом 96 год. Для кожної концентрації здійснено 3 спроби посіву. рН5 Негативн Позитивний ий контроль контроль (ПС) + + ++ млн -1 10000 Фумарова кислота + + + Monofumarin 41 + + + Моногліцериди фумарової кислоти + + + в середньому + + 20000 в середньому 40000 в середньому 60000 в середньому 80000 в середньому 90000 в середньому 100000 проліферація відсутня (п. в.) п. в. п. в. + + + п. в. п. в. п. в. + + + ++ ++ ++ п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. ++ ++ ++ п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. п. в. + в середньому Примітка: Композиція Monofumarin 41 містить: моногліцериди фумарової кислоти 41% 7 + + + UA 111464 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 дигліцериди фумарової кислоти 8% тригліцерид фумарової кислоти 1% гліцерин 50% При бажанні композиції за винаходом можуть містити також діючі складові ефірних олій (коричний альдегід, тимол, карвакрол) у кількості від 1% до 20% (яка обчислена як маса, що припадає на одиницю маси сукупності інших компонентів). Це звичайний прийом, який застосовують у приготуванні корму для тварин, оскільки такі діючі складові розчинні у ліпідах, але нерозчинні в гліцерині. Слід зазначити, що при утворенні водної дисперсії композиції розподілені моногліцериди оточені оболонкою з гліцерину; останній утворює краплі, що містять моногліцериди і перебувають у вигляді водної суспензії (якщо у моногліцеридах розчинені інші діючі складові, вони так само потрапляють всередину краплі гліцерину) (див. Фіг. 1). Композиції за цим винаходом можна одержувати шляхом естерифікації жирних кислот звичайними способами, які детально описані в літературі, але з використанням значного надлишку гліцерину (не менш ніж 200% від маси жирних кислот, що використовуються), що дає змогу одержувати високі виходи моногліцеридів разом із гліцерином, який не взяв участі в реакції. Композиції за цим винаходом можна додавати до складу корму для тварин та (або) у питво у кількості від 0,1% до 1,5%, за варіантом, якому віддають перевагу, від 0,3% до 0,6% (обчислена як маса, що припадає на одиницю маси корму або питва). Композиції за цим винаходом рекомендовані до застосування, зокрема, в раціонах харчування свиней, курей, риби, великої рогатої худоби, овець, а також домашніх тварин. Приклад 1 Реакцію естерифікації проводять на партії 10000 кг. У реактор при кімнатній температурі вводять 3000 кг масляної кислоти та 7000 кг гліцерину. Температуру підвищують до 140°C; масляну кислоту, що випаровується, повертають до реактора за допомогою зворотного холодильника. Подальше підвищення температури (від 140°C до 170°C) слід здійснювати дуже повільно (протягом близько 4 годин). При цьому температуру зворотного холодильника слід підтримувати на рівні 120°C, з метою випаровування води, що утворюється в процесі реакції естерифікації; водночас масляна кислота, як і раніше, повертатиметься до реактора. На цій стадії припустиме підвищення температури до 180°C (однак зберігаючи температуру зворотного холодильника на рівні 120°C); коли температура сягне вказаного значення, очікуваний вміст кислоти у суміші не має перевищувати 1%. Слідом за цим до реакційної маси застосовують вакуум з метою видалення шляхом дистиляції всієї масляної кислоти аж до досягнення остаточного вмісту кислоти (менш ніж 0,2%). Суміш вивантажують із реактора, проганяючи її через холодильник з метою охолодження до кімнатної температури. Таким чином одержують суміш, яка містить 43% моногліцериду, 6% дигліцериду, 1% тригліцериду та 50% гліцерину. По завершенні реакції естерифікації надлишок гліцерину можна відділити дистиляцією, якщо це бажано; таким чином одержують суміш моно-, ди- та тригліцеридів, у якій вміст моногліцериду сягає 90%. Приклад 2 Шістдесят поросят породи DanBred у віці 5 тижнів розподілили по двох групах з тридцяти поросят у кожній (А - контрольна група, В - група, що одержує досліджуваний препарат) і надалі розсадили у 6 загонів по десять тварин у кожному. Після перших 10 днів, протягом яких поросята адаптувалися до місця утримання, всіх тварин засіяли перорально бактеріями Salmonella typhimurium, культуру яких було виділено установою Istituto Zooprofilattico (м. Форлі, 7 Італія) зі зразків екскрементів інфікованих свиней; доза становила 710 КУО. Наступного дня у деяких із особин в кожному загоні виникла діарея. Надалі симптоми погіршувались і охопили всіх особин протягом трьох діб після інфікування. На третій день після інфікування брали зразки екскрементів. При підрахунку бактерій одержали величини 165000 КУО в контрольній групі (група А) та 160000 КУО в оброблюваній групі (група В). Група В, починаючи з третього дня після інфікування, одержувала суміш такого складу: - моногліцериди масляної кислоти 45% - дигліцериди масляної кислоти 6% - тригліцерид масляної кислоти 1% 8 UA 111464 C2 5 10 15 20 25 - гліцерин 48%, яку вводили разом із питною водою в концентрації 0,5% протягом трьох днів. На третій день після після оброблення знов брали зразки екскрементів для підрахунку бактерій. В контрольній групі (А) налічували в середньому 160000 КУО, в той час як у групі, що одержувала досліджуваний препарат, налічували 900 КУО. Застосування суміші "складних ефірів масляної кислоти і гліцерину" у зазначеній концентрації вело до зниження величини КУО бактерії сальмонели після триденного курсу мало не на 3 порядки (3log10). Цей факт підтверджує бактерицидну ефективність зазначеної суміші. Приклад 3 Ці випробування в польових умовах було здійснено у одному з фермерських господарств Італії, де мали місце проблеми дотримання належної гігієни - наприклад, очевидні прояви ілеїту (запалення клубової кишки), спричиненого бактеріями Lawsonia intracellularis, ентериту, спричиненого бактеріями роду Brachyspira, а також некротичного ентериту, спричиненого хвороботворними мікроорганізмами Treponema hyodysenteriae. 1027 поросят породи DanBred pigs у віці 71 день, які важили близько 25 кг кожне, розподілили по двох групах: А - контрольна група, В - оброблювана група, що одержує досліджуваний препарат; групи складалися відповідно з 511 тварин та 516 тварин. Зазначені дві групи одержували харчування, раціон якого було укладено в ідентичний спосіб, за винятком таких компонентів: у раціон контрольної групи протягом перших 14 днів -1 -1 випробування додавали Лінкоміцин (200 млн ) та Доксициклін (250 млн ), а решту відрізку часу самий лише Лінкоміцин. Досліджувана група (група В) не одержувала антибіотиків разом із кормом, натомість тварини одержували суміш "складних ефірів масляної кислоти і гліцерину" такого складу: - моногліцериди масляної кислоти 45% - дигліцериди масляної кислоти 6% - тригліцерид масляної кислоти 1% - гліцерин 48%, яку додавали в корм у кількості 0,5% замість 0,5% соєвої олії. Випробування тривало 63 дні. Результати, що стосуються приросту маси та ефективності вигодовування тварин, підсумовано нижче у таблиці 6. Таблиця 6 511 71 134 Група В - складні ефіри масляної кислоти та гліцерин 516 71 134 25 25 62,13 63,61 5 3 2 2 -3 -1 0,59 0,61 +0,02 53,570 19,340 2,76 53,250 20,200 2,64 -320 +860 -0,12 Група А контрольна Чисельність тварин Вік на початку випробування (дні) Вік наприкінці випробування (дні) Середня маса тіла на початку випробування (кг) Середня маса тіла наприкінці випробування (кг) Кількість померлих тварин Кількість тварин, яких відхилено Середньоденне зростання маси тіла (кг) Загальна кількість вжитого корму (кг) Вихід м'яса (кг) Коефіцієнт перетворення корму 30 35 Різниця На відміну від контрольної групи (група А), в якій аналізом фекалій було доведено присутність бактерій Lawsonia, у групі В, яка одержувала досліджуваний препарат, їх присутність не була виявлена. Випадки виникнення діареї у групі В були також значно рідшими. Параметри приросту маси, а також коефіцієнт перетворення корму у тварин з групи В були порівнянними з відповідними характеристиками у тварин з групи А, чий раціон харчування містив згадані вище антибіотики. Застосування суміші "складних ефірів масляної кислоти і гліцерину" дало змогу тримати під контролем зазначені захворювання без використання антибіотиків. Випробування засвідчило наявність протибактеріального ефекту в суміші 9 UA 111464 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 "складних ефірів масляної кислоти і гліцерину" і, як наслідок, поліпшення стану здоров'я шлунково-кишкового тракту. Приклад 4 Тест на ефективність по відношенню до бактерій Salmonella typhimurium на курях Штам бактерій Salmonella Для цілей цього тесту залучали штам Salmonella typhimurium, який було виділено та ідентифіковано установою Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia є dell'Emilia Romagna (IZSLER) у м. Форлі. Тварини До випробування залучали курчат лінії SPF (Specific Pathogen Free - вільних від специфічної патогенної мікрофлори), по 30 тварин на кожен тест. Інкубацію курчат було проведено установою IZSLER у м. Форлі. Піддослідних тварин одразу ж розсадили по ізольованих боксах. Раціон харчування Тварини одержували воду з водогону, а також стандартний раціон початкового вигодовування у достатній кількості (ad libitum). До складу корму додавали композицію Monobutyrin 43. Опис експерименту До експерименту готували 4 групи по 30 особин у кожній. Раціони їх харчування відрізнялися вмістом композиції Monobutyrin 43, яку додавали в корм з першого дня життя, та були визначені такими як наведено нижче: необроблювана контрольна група - 0% композиції в складі корму; група 1 - 1% композиції в складі корму; група 2 - 0,3% композиції в складі корму. Група 3 одержувала те саме харчування, що й контрольна група, аж до 14-ї доби життя, тобто до настання 7-ї доби після інфікування, і лише починаючи з цього дня одержували корм із вмістом 1,4%. 7 У віці 7 діб всіх особин було інфіковано введенням у стравохід 10 КУО бактерії Salmonella typhimurium. Коли з моменту інфікування минуло 24 години, в усіх особин взяли мазок із клоаки на підтвердження того, що інфекція Salmonella typhimurium прийнялася. На 14-му, 24-му та 35му днях життя присипали по 10 особин з кожної групи. В кожної тварини брали вміст прямої кишки, і визначали засіяність бактеріями Salmonella typhimurium (в одиницях КУО/г). Лабораторні аналізи Відсутність антитіл до бактерій S. typhimurium було доведено методом твердофазного імуноферментного аналізу. Мазки, взяті з клоаки, висівали на живильне середовище Hektoen Enteric Agar (різновид селективного агару) і піддавали інкубації при температурі 37°C протягом 24 годин. Один грам вмісту шлунково-кишкового тракту розводили 9 мл лактату Рінгера і висівали на живильне середовище Hektoen Enteric Agar (об'єм висівного матеріалу становив 0,1 мл). Колонії підраховували після 24 годин інкубації при 37°C. Для кожної аналітичної проби обчислювали середнє геометричне з бактеріальних засіяностей 10 умертвлених особин. Всі особини після першої доби життя виявилися серонегативними до бактерій Salmonella typhimurium. По 24 годинах з моменту інфікування всі мазки, взяті з клоаки, виявилися позитивними до бактерій S. typhimurium. Результати визначення засіяності бактеріями вмісту прямої кишки подано у наведеній нижче таблиці 7. Таблиця 7 Бактеріальна засіяність вмісту прямої кишки курей, інфікованих бактеріями Salmonella 7 Typhimurium - 10 КУО Контроль На день інфікування (7-й день життя) На 7-й день після інфікування На 17-й день після інфікування На 28-й день після інфікування Група 1 (вміст у кормі 1%) Група 2 (вміст у кормі 0,3%) Група 3 (вміст у кормі 1,4%, починаючи з 14-ї доби життя) 0 0 0 0 6400000 770000 2226000 6302000 Початок лікування 25120000 213220 1242000 171120 (висока смертність) >100 300 1000 10 UA 111464 C2 5 10 15 Приклад 5 Тест на чутливість in vitro до міцеліальних грибів (плісняви) Матеріали і методи дослідження До цього тесту залучали штами грибів родів Aspergillus, Penicillium та Fusarium, які було виділено та ідентифіковані під час діагностики установою IZSLER у м. Форлі збалансованого комбікорму, який використовують у птахівництві. Для приготування висівного матеріалу використовували міцелій чистих культур досліджуваних штамів, який брали мазком. Збираний матеріал розчиняли у культуральному бульйоні (серцево-мізковий екстракт, CME). 5 мл суспензії культури грибів приводили в контакт із такою самою кількістю випробуваного продукту у пробірці. Пробірку піддавали інкубації при температурі 20±4°С протягом 24 годин. По завершенні цього відрізку часу суспензію культури грибів висівали і підраховували. Контрольну суспензію одержували, помішуючи в пробірку 5 мл суспензії культури грибів і додаючи для розведення 5 мл лактату Рінгера. Результати тестів зчитували по завершенні 5денного періоду інкубації при 20±4°С. Нижче у таблиці 8 наведено результати у одиницях КУО/мл Таблиця 8 Продукт Контроль Monopropionin 43 Monobutyrin 43 Пропіонова кислота Амонію пропіонат 20 25 30 Рід ASPERGILLUS 450000 20000 1000 300 1000 Рід PENICILLIUM 97000 1500 700