1- або 3-тіабензонафтоазулени як інгібітори продукування фактора некрозу пухлини і проміжні продукти для їх одержання

1. Сполука формули І 2 A X B Y z (I) (11) 1 78297 (54) 1- АБО 3-ТІАБЕНЗОНАФТОАЗУЛЕНИ ЯК ІНГІБІТОРИ ПРОДУКУВАННЯ ФАКТОРА НЕКРОЗУ ПУХЛИНИ І ПРОМІЖНІ ПРОДУКТИ ДЛЯ ЇХ ОД ЕРЖАННЯ (13) C2 ОПИС S R1 де Х може бути СН2 або гетероатомом, таким як О, S, S(=О), S(=О) 2 або NRа, де Rа є воднем або захисною групою; Y та Z незалежно один від одного означають один чи кілька однакових чи різних замісників, зв'язаних з будь-яким з наявних атомів вуглецю, і можуть являти собою водень, галоген, С1-С4алкіл, С2С4алкеніл, С2-С4алкініл, трифторметил, гало-С1С4алкіл, гідрокси, С1-С4алкокси, трифторметокси, С1-С4алканоїл, аміно, аміно-С1-С4алкіл, С1 UA ДЕРЖАВНИЙ Д ЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛ ЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ (19) МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ 3 78297 4 С4алкіламіно, -N-(С1-С4-алкіл)аміно, N,N-ді(С1-С4y1 та у2 незалежно один від одного можуть являти алкіл)аміно, тіол, С1-С4алкілтіо, сульфоніл, С1собою водень, галоген, необов'язково заміщений С4алкілсульфоніл, сульфініл, С1-С4алкілсульфініл, С1-С4алкіл або арил, гідрокси, С1-С4алкокси, С1карбокси, С1-С4алкоксикарбоніл, нітро; С4алканоїл, тіол, С1-С4алкілтіо, сульфоніл, С1GA або GB : С4алкілсульфоніл, сульфініл, С1-С4алкілсульфініл, нітро або разом утворюють карбонільну чи іміногрупу; A а також її фармацевтично прийнятні солі та сольGA вати, , де для всіх названих вище замісників необов'язково заміщена алкільна група є алкільною групою з B одним, двома, трьома чи більше замісниками, що GB являють собою атом галогену, гідрокси, С1, С4алкокси, тіол, С1-С4алкілтіо, аміно, N-(С1-С4де GA або GB відповідають формулам алкіл)аміно, N,N-ді(С1-С4-алкіл)аміно, сульфоніл, С1-С4алкілсульфоніл, сульфініл, С1С4алкілсульфініл, де гетероарил є ароматичною чи частково ароматичною групою з моноциклічним або біциклічним кільцем із 4 - 12 атомами, причому , принаймні один з них є гетероатомом, таким як О, S чи N, і наявний атом азоту або атом вуглецю є OM e місцем зв'язування групи із рештою молекули, прямо чи через С 1-С4алкіленову груп у, де гетероцикл є п'ятичленною або шестичленною, повністю , насиченою або частково ненасиченою гетероциклічною групою, що містить принаймні один гетероатом, такий як О, S чи N, і наявний атом азоту або атом вуглецю є місцем зв'язування групи із реш, тою молекули, прямо чи через С1-С4алкіленову груп у, і де необов'язково заміщений арил, гетероR1 може являти собою необов'язково заміщений арил або гетероцикл є арильною, гетероарильною С1-С7алкіл, С1-С7алкілоксикарбоніл або замісник або гетероциклічною групою, яка може бути заміформули II щена одним чи двома замісниками, що являють собою галоген, С1-С4алкіл, ціано, нітро, гідрокси, R2 С1-С4алкокси, тіол, С1-С4алкілтіо, аміно, N-(С1-С4(CH2 )m (CH2 )n Q1 Q2 N (II) алкіл)аміно, N,N-ді(С1-С4-алкіл)аміно, сульфоніл, R3 С1-С4алкілсульфоніл, сульфініл, С1де С4алкілсульфініл. R2 і R3 водночас або незалежно один від одного 2. Сполука за п. 1, яка відрізняє ться тим, що Х можуть являти собою водень, С1-С4алкіл, арил або означає S або О. разом з N означати необов'язково заміщений ге3. Сполука за п. 2, яка відрізняється тим, що Y і Z тероцикл або гетероарил; означають Н. n означає ціле число від 0 до 3; 4. Сполука за п. 3, яка відрізняється тим, що R1 m означає ціле число від 1 до 3; означає CO2Et, СH2ОН. Q1 і Q2 являють собою, незалежно один від одно5. Сполука за п. 3, яка відрізняється тим, що R1 го, кисень, сірку чи групи: відповідає формулі II. 6. Сполука за п. 5, яка відрізняється тим, що m y1 y2 означає 1, n означає 1 чи 2, Q1 означає О, і Q2 означає СН2. 7. Сполука за п. 6, яка відрізняється тим, що R2 C , і/або R3 означають Н, СН3 або разом з N означають морфолін-4-іл, піперидин-1-іл або піролідин-1y1 іл. 8. Сполуки за п. 4, вибрані з групи: 8-окса-1-тіабензо[е]нафто[3,2-h]азулен-2N , карбонової кислоти етиловий складний ефір; 1,8-дитіабензо[е]нафто[3,2-h]азулен-2-карбонової y1 кислоти етиловий складний ефір; 3,10-дитіабензо[е]нафто[1,2-h]азулен-2-карбонової кислоти етиловий складний ефір; C CH , 10-окса-3-тіабензо[е]нафто[1,2-h]азулен-2карбонової кислоти етиловий складний ефір; C C , 11-метокси-8-окса-1-тіабензо[е]нафто[3,2h]азулен-2-карбонової кислоти етиловий складний ефір; де замісники 5 78297 6 6,7,8,9-тетрагідро-10-окса-3-тіабензо[е]нафто[1,2диметил[2-(10,11,12,13-тeтpaгiдpo-8-oкca-1h]азулен-2-карбонової кислоти етиловий складний тiaбeнзo[e]нaфтo[3,2-h]aзyлeн-2ефір; ілметокси)пропіл]амін; 10,11,12,13-тетрагідро-8-окса-1диметил[1-мeтил-(10,11,12,13-тетрагідро-8-oкca-1тіабензо[е]нафто[3,2-h]азулен-2-карбонової кислотiaбeнзo[e]нaфтo[3,2-h]азулен-2ти етиловий складний ефір; ілметоксі)етил]амін. (8-окса-1-тіабензо[е]нафто[3,2-h]азулен-210. Спосіб одержання сполук формули І A іл)метанол; X (1,8-дитіабензо[е]нафто[3,2-h]азулен-2-іл)метанол; B (3,10-дитіабензо[е]нафто[1,2-h]азулен-2іл)метанол; Y z (I) (10-окса-3-тіабензо[е]нафто[1,2-h]азулен-2Sіл)метанол; (11-метокси-8-окса-1-тіабензо[е]нафто[3,2h]азулен-2-іл)метанол; R1 (6,7,8,9-тетрагідро-10-окса-3-тіабензо[е]нафто[1,2де X може бути СН2 або гетероатомом, таким як О, S, h]азулен-2-іл)метанол; S(=O), S(=O) 2 або NRa, де Ra є воднем або захис(10,11,12,13-тетрагідро-8-окса-1тіабензо[е]нафто[3,2-h]азулен-2-іл)метанол. ною групою; 9. Сполуки і солі за п. 7, вибрані з групи: Y та Z незалежно один від одного означають один диметил[2-(8-окса-1-тіабензо[е]нафто[3,2чи кілька однакових чи різних замісників, зв'язаних з будь-яким з наявних атомів вуглецю, і можуть h]азулен-2-ілметоксі)етил]амін; являти собою водень, галоген, С1-С4алкіл, C2диметил[3-(8-окса-1-тіабензо[е]нафто[3,2h]азулен-2-ілметокси)пропіл]амін; C4алкеніл, C2-C4алкініл, трифторметил, гало-С13-(8-окса-1-тіабензо[е]нафто[3,2-h]азулен-2С4алкіл, гідрокси, С1-С4алкокси, трифторметокси, ілметокси)пропіламін; С1-С4алканоїл, аміно, аміно-С1-С4алкіл, С1-С4алкіламіно, N-(С1-С4-алкіл)аміно, N,N-ді(С1-С4диметил[3-(1,8-дитіабензо[е]нафто[3,2-h]азулен-2алкіл)аміно, тіол, С1-С4алкілтіо, сульфоніл, С1ілметокси)пропіл]амін; диметил[2-(3,10-дитіабензо[е]нафто[1,2-h]азуленС4алкілсульфоніл, сульфініл, С1-С4алкілсульфініл, 2-ілметоксі)етил]амін; карбокси, С1-С4алкоксикарбоніл, нітро; диметил[3-(3,10-дитіабензо[е]нафто[1,2-h]азуленGA або GB : 2-ілметокси)пропіл]амін; диметил[2-(10-окса-3-тіабензо[е]нафто[1,2A h]азулен-2-ілметоксі)етил]амін; диметил[3-(10-окса-3-тіабензо[е]нафто[1,2GA h]азулен-2-ілметокси)пропіл]амін; , диметил[3-(11-метоксі-8-окса-1тіабензо[е]нафто[3,2-h]азулен-2ілметокси)пропіл]амін; B диметил[2-(6,7,8,9-тетрагідро-10-окса-3GB тіабензо[е]нафто[1,2-h]азулен-2, ілметоксі)етил]амін; диметил[3-(6,7,8,9-тeтpaгiдpo-10-oкca-3де GA або GB відповідають формулам тiaбeнзo[e]нaфтo[l,2-h]aзyлeн-2ілметокси)пропіл]амін; 3-(6,7,8,9-тетрагідро-10-окса-3тіабензо[е]нафто[1,2-h]азулен-2, ілметокси)пропіламін; метил[3-(6,7,8,9-тетрагідро-10-окса-3тіабензо[е]нафто[1,2-h]азулен-2OMe ілметокси)пропіл]амін; диметил[2-(10,11,12,13-тетрагідро-8-окса-1тіабензо[е]нафто[3,2-h]азулен-2, ілметоксі)етил]амін; діметил[3-(10,11,12,13-тетрагідро-8-окса-1тіабензо[е]нафто[3,2-h]азулен-2ілметокси)пропіл]амін; , 4-[2-(10,11,12,13-тетрагідро-8-окса-1тіабензо[е]нафто[3,2-h]азулен-2R1 може являти собою необов'язково заміщений ілметоксі)етил]морфолін; С1-С7алкіл, С1-С7алкілоксикарбоніл або замісник 1-[2-(10,11,12,13-тетрагідро-8-окса-1формули II тіабензо[е]нафто[3,2-h]азулен-2ілметоксі)етил]піперидин; 1-[2-(10,11,12,13-тетрагідро-8-окса-1тіабензо[е]нафто[3,2-h]азулен-2ілметоксі)етил]піролідин; 7 78297 8 алкіл)аміно, N,N-ді(С1-С4-алкіл)аміно, сульфоніл, С1-С4алкілсульфоніл, сульфініл, С1(CH2 )m (CH2 )n Q1 Q2 N (II) С4алкілсульфініл, R3 який відрізняється тим, що здійснюють: де а) для сполук формули І, де R1 є алкілоксикарбо2 3 R і R водночас або незалежно один від одного нілом, циклізацію сполуки формули III можуть являти собою водень, С1-С4алкіл, арил або A разом з N означати необов'язково заміщений геX B тероцикл або гетероарил; (III) n означає ціле число від 0 до 3; Y z m означає ціле число від 1 до 3; Cl O Q1 і Q2 являють собою, незалежно один від одного, кисень, сірку чи групи: з складними ефірами меркаптооцтової кислоти; y1 y2 b) для сполук формули І, де Q 1 означає -O-, реакцію спиртів формули V C , A R2 X y1 B Y N C (V) S y1 C z , (CH 2)mOH з сполуками формули IV CH C R2 , R4 (CH2)n Q2 N , де замісники y1 та у2 незалежно один від одного можуть являти собою водень, галоген, необов'язково заміщений С1-С4алкіл або арил, гідрокси, С1-С4алкокси, С1С4алканоїл, тіол, С1-С4алкілтіо, сульфоніл, С1С4алкілсульфоніл, сульфініл, С1-С4алкілсульфініл, нітро або разом утворюють карбонільну чи іміногрупу; а також їх фармацевтично прийнятних солей та сольватів, де для всіх названих вище замісників необов'язково заміщена алкільна група є алкільною групою з одним, двома, трьома чи більше замісниками, що являють собою атом галогену, гідрокси, С1С4алкокси, тіол, С1-С4алкілтіо, аміно, N-(С1-С4алкіл)аміно, N,N-ді(С1-С4-алкіл)аміно, сульфоніл, С1-С4алкілсульфоніл, сульфініл, С1С4алкілсульфініл, де гетероарил є ароматичною чи частково ароматичною групою з моноциклічним або біциклічним кільцем із 4-12 атомами, причому принаймні один з них є гетероатомом, таким як О, S чи N, і наявний атом азоту або атом вуглецю є місцем зв'язування групи із рештою молекули, прямо чи через С 1-С4алкіленову груп у, де гетероцикл є п'ятичленною або шестичленною, повністю насиченою або частково ненасиченою гетероциклічною групою, що містить принаймні один гетероатом, такий як О, S чи N, і наявний атом азоту або атом вуглецю є місцем зв'язування групи із рештою молекули, прямо чи через С1-С4алкіленову груп у, і де необов'язково заміщений арил, гетероарил або гетероцикл є арильною, гетероарильною або гетероциклічною групою, яка може бути заміщена одним чи двома замісниками, що являють собою галоген, С1-С4алкіл, ціано, нітро, гідрокси, С1-С4алкокси, тіол, С1-С4алкілтіо, аміно, N-(С1-С4 (IV) R3 де R4 означає відщеплювану гр упу; с) для сполук формули І, де Q1 означає -O-, -NH-, C C S- або , реакцію сполук формули Va A X B Y z (Va) S (CH2)m -L де L означає відщеплювану гр уп у, з сполуками формули IVа R2 (CH2)n HQ1 Q2 N (Iva) R3 , d) для сполук формули І, де Q1 означає гетероатом -O-, -NH- або -S-, реакцію сполук формули Vb A X B Y z (Vb) S (CH2)m Q1H з сполуками формули IV, де R4 означає відщеплювану гр уп у; е) для сполук формули І, де Q1 означає -С=С-, реакцію з сполуками формули Vb, де Q1 означає карбоніл, з фосфористими ілідами. 9 78297 10 11. Використання сполук формули І, вказаних в п. будь-якого патологічного стану або захворювання, 4, як проміжних сполук для отримання сполук бенвикликаного надлишковим нерегульованим продузонафтоазуленів формули І, що мають протизапакуванням цитокінів або посередників запалення, льну дію. шляхом перорального, парентерального або ло12. Використання сполук формули І, вказаних в п. кального введення нетоксичних доз підхожих фа5, як інгібіторів продукування цитокінів або посермацевтичних препаратів. редників запалення при лікуванні чи профілактиці Даний винахід стосується бензонафтоазуленових похідних класу тіофенів, їх фармацевтично прийнятних солей і сольватів, способів їх одержання та проміжних речовин для їх одержання, а також їх протизапальної дії, зокрема інгібування продукування фактора-a некрозу пухлини (TNF-a) та інгібування продукування інтерлейкіну-1 (IL-1), а ще їх анальгетичної дії. Деякі похідні 1,3-діаза-дибензоазулену та їх солі добре відомі як новий клас сполук із протизапальною дією [US 3,711,489, US 4,198,421 та СА 967,573]. У літературі з класу 1-тіадибензоазуленів описані похідні, заміщені в 2положенні метильною, метил-кетоновою, нітро групою або похідними карбоксильних груп [Cagniant PG, С. R. Hebd. Sceances Acad. Sci., 1976, 283:683-686], та 1-тіа-дибензоазуленові, що мають алкілокси замісники у 2-положенні [WO 01/878990], котрі також справляють сильну протизапальну дію. Добре відомі також деякі бензонафтоазулени класу тіофенів, такі як 9,14-дигідро-9,14-ДІоксо-8окса-1-тіа-бензо[е]нафто[3,2-b]азулени, де 3позиція заміщена ціано групою, а у 2-позиції може бути в якості замісника амін, сечовина або ацетамід [Nyiondi-Bonguen Ε et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1994, 15:2191-2195]. Проте, наскільки нам відомо і наскільки відомо з літератури, бензонафтоазулени з класу тіофенів, що відповідають даному винаходу, досі не відомі. Також не було відомо, що ці сполуки можуть мати протизапальну дію як інгібітори секреції TNF-a та інгібітори секреції IL-1, а також анальгетичну дію. У 1975p. TNF-a було визначено як фактор сироватки, що індукується ендотоксином та викликає некроз пухлини in vitro та in vivo [Carswell EA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.SA., 1975, 72:3666-3670]. Окрім протипухлинної дії TNF-a справляє також іншу різноманітну біологічну дію, важливу для гомеостазу організму та при патофізіологічних станах. Основними джерелами TNF-a є моноцити-макрофаги, Тлімфоцити і мастоцити. Відкриття того, що анти-TNF-a антитіла (СА2) справляють дію при лікуванні пацієнтів із ревматоїдним артритом (PA) [Elliott Μ et al., Lancet, 1994, 344:1105-1110], привело до підвищення зацікавленості у пошуках нових інгібіторів TNF-a як можливих сильних ліків проти РА. Ревматоїдний артрит це автоімунне хронічне запальне захворювання, яке характеризується необоротними патологічними змінами в суглобах. Окрім випадків РА антагоністи TNF-a можуть також використовуватись при багатьох патологічних станах і захворюванням, таких як спондиліт, остеоартрит, подагра та інші артричні стани, сепсис, септичний шок, синдром токсичного шоку, атопічний дерматит, контактний дерматит, псоріаз, гломерулонефрит, червоний вовчак, склеродерма, астма, кахексія, хронічні обструктивні хвороби легень, припинення серцевої діяльності через закупорювання, резистентність до інсуліну, фіброз легень, розсіяний склероз, хвороба Крона, виразкові коліти, вірусні інфекції та СНІД. Підтвердження біологічної важливості TNF-a були отримані в експериментах in vivo на мишах, в яких позбавляли активності гени миші, що відповідають за TNF-a, або його рецептор. Ці тварини є стійкими до викликаного колагеном артриту [Mori L et аl., J. Immunol, 1996, 157:3178-3182] та спричиненого ендотоксином шоку [Pfeffer К et аl., Cell, 1993, 73:457-467]. У тих дослідах на тваринах, де рівень TNF-a був підвищеним, наставав хронічний запальний поліартрит [Georgopoulos S et аl., J.Jnflamm., 1996, 46:86-97; Keffer J et аl., EMBO J., 1991, 20:4025-4031], а патологічну картину вдавалось покращити інгібіторами продукування TNF-a. Лікування таких запальних і патологічних станів, як правило, включає застосування нестероїдних протизапальних ліків, а у більш важких випадках вводять солі золота, D-пеніцилінамін або метотрексат. Ці ліки діють симптоматично, але не зупинять патологічний процес. Нові підходи у лікуванні ревматоїдного артриту ґр унтуються на таких ліках, як tenidap (тенідап), leflunomide (лефлуномід), циклоспорин, FK-506 та на біомолекулах, що нейтралізують дію TNF-a. Зараз комерційно доступними є etanercept (етанерцепт) (Enbrel, Immunex/Wyeth) злитий білок з розчинного рецептора TNF-a та infliximab (інфліксімаб) (Remicade, Centocor) - химерне моноклональне людське та мишаче антитіло. Окрім лікування РА етанерцепт та інфліксімаб зареєстровані як засоби для лікування хвороби Крона [Ехр. Оріn. In vest. Drugs, 2000, 9:103]. При лікуванні РА, окрім інгібування секреції TNF-a, також дуже важливим є інгібування секреції IL-1, оскільки IL-1 - важливий цитокін у регуляції клітин та імунорегуляції, а також при патофізіологічних станах, таких як запалення [Dinarello CA et al., Rev. Infect. Disease, 1984, 6:51]. Добре відомі такі види біологічної активності IL-1: активація Тклітин, індукування підвищення температури, стимуляція секреції простагландину або колагенази, хемотаксія нейтрофілів та зменшення рівня заліза у плазмі [Dinarello CA, J. Clinical Immunology, 1985, 5:287] Добре відомі два рецептори, з якими може зв'язуватись IL-1: IL-1RI та IL-1RII. У той час, як IL 11 78297 12 1RI здійснює внутрішньоклітинну передачу сигнаС1-С4 алкілтіо, сульфоніл, С1-С4 алкілсульфоніл, лу, IL-1RII розташовується на поверхні клітин і не сульфініл, С1-С4 алкілсульфініл, карбокси, С1-С4 передає сигнал всередину клітини. Оскільки IL1алкоксикарбоніл, нітро; RII зв'язує IL-1 так само, як і IL1-RI, він може слуR1 може являти собою галоген, необов'язково жити негативним регулятором активності IL-1. заміщений С 1-С7 алкіл або С2-С7 алкеніл, С2-С7 Окрім названого механізму регулювання передачі алкініл, необов'язково заміщений арил або гетесигналу, у клітинах є ще один природний антагороарил і гетероцикл, гідрокси, гідрокси-С2-С7 алкеніст рецептора IL-1 (IL-1ra). Цей білок зв'язується з ніл, гідрокси-С 2-С7 алкініл, С1-С7 алкокси, тіол, тіоIL-1RI, але не передає сигнал. Проте, його можлиС2-С7 алкеніл, тіо-С 2-С7 алкініл, С1-С7 алкілтіо, амівості у припиненні передачі сигналу не є значнино-С 1-С7 алкіл, аміно-С2-С7 алкеніл, аміно-С 2-С7 ми, а його концентрація повинна перевищува ти алкініл, аміно-С1-С7 алкокси, С1-С7 алканоїл, ароїл, концентрацію IL-1 у 500 разів, щоб повністю приоксо-С1-С7 алкіл, С1-С7 алканоїлокси, карбокси, пинити передачу сигналу. Рекомбінантний людсьнеобов'язково заміщений С 1-С7 алкілоксикарбоніл кий IL-1ra (Amgen) пройшов клінічні випробування або арилоксикарбоніл, карбамоїл, N-(С1-С7[Bresnihan В et al., Arthrit. Rheum., 1996, 39:73], і алкіл)карбамоїл, N,N-ді(С1-С7-алкіл)карбамоїл, отримані результати свідчать про покращення ціано-С1-С7 алкіл, сульфоніл, С1-С7 алкілсульфоклінічної картини у 472 пацієнтів з РА у порівнянні ніл, сульфініл, С1-С7 алкілсульфініл, нітро, з плацебо. Ці результати показують важливість або замісник формули II інгібування дії IL-1 при лікуванні таких захворювань, як РА, при яких продукування IL-1 порушене. Через існування синергічної дії TNF-a та IL-1 бензонафтоазулени можуть використовуватись при лікуванні станів та захворювань, пов'язаних із збільшеною секрецією TNF-a та IL-1. де Даний винахід стосується бензонафтоазуленів R2 і R3 водночас або незалежно один від одноформули І го можуть являти собою водень, С1-С4 алкіл, арил або разом з N означати необов'язково заміщений гетероцикл або гетероарил; n означає ціле число від 0 до 3; m означає ціле число від 1 до 3; Q1 і Q2 являють собою, незалежно один від одного, кисень, сірку чи групи: де X може бути СН2 або гетероатомом, таким як О, S, S(=O), S(=O) 2 або NRa, де Ra є воднем або захисною групою; Υ та Ζ незалежно один від одного означають один чи кілька однакових чи різних замісників, зв'язаних з будь-яким з наявних атомів вуглецю, і можуть являти собою водень, галоген, С1-С4 алкіл, С2-С4 алкеніл, С2-С4 алкініл, трифторметил, галоС1-С4 алкіл, гідрокси, С1-С4 алкокси, трифторметокси, С1-С4 алканоїл, аміно, аміно-С1-С4 алкіл, С1-С4 алкіламіно, N-(С1-С4-алкіл)аміно, N,N-ді(С1-С4алкіл)аміно, тіол, С1-С4 алкілтіо, сульфоніл, С1-С4 алкілсульфоніл, сульфініл, С1-С4 алкілсульфініл, карбокси, С1-С4 алкоксикарбоніл, нітро; GA або GB : незалежно один від одного означають один чи кілька однакових чи різних замісників, зв'язаних з будь-яким з наявних атомів вуглецю, і можуть являти собою галоген, С1-С4 алкіл, С2-С4 алкеніл, С2С4 алкініл, трифторметил, гало-С1-С4 алкіл, гідрокси, С1-С4 алкокси, трифторметокси, С1-С4 алканоїл, аміно, аміно-С1-С4 алкіл, С1-С4-алкіламіно, N(С1-С4-алкіл)аміно, N,N-ді(С1-С4-алкіл)амшо, тіол, де замісники у1 та у2 незалежно один від одного можуть являти собою водень, галоген, необов'язково заміщений С1-С4 алкіл або арил, гідрокси, С1-С4 алкокси, С1-С4 алканоїл, тіол, С1-С4 алкілтіо, сульфоніл, С1-С4 алкілсульфоніл, сульфініл, С1-С4 алкілсульфініл, нітро або разом утворюють карбонільну чи іміно групу; а також їх фармацевтично прийнятних солей та сольватів. Більш прийнятними є сполуки, де X означає S або O; Υ і Ζ означають Н; R1 означає CO2Et, CH2OH; R1 відповідає формулі II; символ m означає 1, n означає 1 чи 2, Q1 означає О, і Q2 означає СН2; R2 та/або R3 означають Н, СН3 або разом з N означають морфолін-4-іл, піперидин-1-іл або піролідин-1-іл; GA або GB відповідають формулам Термін "гало", "гал" чи "галоген" означає атом галогену, який може бути фтором, хлором, бромом 13 78297 14 чи йодом. чено вище. Найбільш частими прикладами є морТермін "алкіл" стосується алкільних груп, що фолініл, піперидиніл, піперазиніл, піролідиніл, піозначають алкани, з яких походять радикали, і ці разиніл або імідазоліл. радикали можуть бути нерозгалуженими, розгалуТермін "алканоїлова" група означає нерозгаженими або циклічними або поєднанням нерозгалужені ланцюжки ацильної групи, такі як форміл, лужених і циклічних та розгалужених і циклічних. ацетил чи пропаноїл. Більш прийнятними нерозгалуженими або розгаТермін "ароїльна" група означає ароматичні луженими алкілами є, наприклад, метил, етил, ацильні групи, такі як бензоїл. пропіл, ізопропіл, бутил, втор-бутил і трет-бутил. Термін "необов'язково заміщений алкіл" ознаБільш прийнятними циклічними алкілами є, напричає алкільні групи, які можуть необов'язково додаклад, циклопентил або циклогексил. тково заміщеними одним, двома, трьома чи більТермін "гало алкіл" означає алкільні групи, шою кількістю замісників. Такі замісники можуть обов'язково заміщені, принаймні, одним атомом являти собою атом галогену (більш прийнятно, галогену. Найбільш поширеними галоалкілами є, фтор або хлор), гідрокси, С1-С4 алкокси (більш наприклад, хлорметил, дихлорметил, трифтормеприйнятно, метокси чи етокси), тіол, С1-С4 алкілтіо тил або 1,2-дихлорпропіл. (більш прийнятно, метилтіо чи етилтіо), аміно, NТермін "алкеніл" стосується алкенільних груп, (C1-C4) алкіламіно (більш прийнятно, N-метиламіно що означають вуглеводневі радикали, котрі моабо N-етиламіно), N,N-ді(С1-С4-алкіл)-аміно (більш жуть бути нерозгалуженими, розгалуженими або прийнятно, диметиламіно або діетиламіно), сульциклічними або поєднанням нерозгалужених і цикфоніл, С1-С4 алкілсульфоніл (більш прийнятно, лічних чи розгалужених і циклічних, але мають, метилсульфоніл або етилсульфоніл), сульфініл, принаймні, один подвійний вуглець-вуглецевий С1-С4 алкілсульфініл (більш прийнятно, метилсузв'язок. Найбільш часто застосовуваними алкенільфініл). лами є етеніл, пропеніл, бутеніл або циклогексеТермін "необов'язково заміщений алкеніл" ніл. означає алкенільні групи, необов'язково додатково Термін "алкініл" стосується алкінільних груп, заміщені одним, двома чи трьома атомами галогещо означають вуглеводневі радикали, що можуть ну. Такими замісниками можуть бути, наприклад, бути нерозгалуженими або розгалуженими та міс2-хлоретеніл, 1,2-дихлоретеніл або 2-бромтять, принаймні, один і, максимум, два потрійні пропен-1-іл. вуглець-вуглецеві зв'язки. Найбільш часто застоТермін "необов'язково заміщений арил, гетесовуваними алкінілами є етиніл, пропініл або буроарил чи гетероцикл" означає арильні, гетеротиніл. арильні чи гетероциклічні групи, які можуть необоТермін "алкокси" означає нерозгалужені чи в'язково додатково заміщеними одним чи двома розгалужені ланцюжки алкокси групи. Прикладами замісниками. Такі замісники можуть являти собою таких гр уп є метокси, пропокси, проп-2-окси, бутогалоген (більш прийнятно, хлор чи фтор), С1-С4 кси, бут-2-окси чи метилпроп-2-окси. алкіл (більш прийнятно, метил, етил чи ізопропіл), Термін "арил" стосується груп, що означають ціано, нітро, гідрокси, С1-С4 алкокси (більш прийнароматичне кільце, наприклад, фенільне, а також ятно, метокси чи етокси), тіол, С1-С4 алкілтіо злиті ароматичні кільця. Арил містить одне кільце (більш прийнятно, метилтіо чи етилтіо), аміно, Nз, принаймні, 6 атомами вуглецю або два кільця, (C1-C4) алкіламіно (більш прийнятно, N-метиламіно які разом містять 10 атомів вуглецю, що мають або N-етиламіно), N,N-дi(C1-C4-алкіл)-аміно (більш переміжні подвійні (резонансні) зв'язки між атомаприйнятно, N,N-диметиламіно або N,Nми вуглецю. Найбільш часто застосовуваними діетиламіно), сульфоніл, С1-С4 алкілсульфоніл арилами є, наприклад, феніл чи нафтил. Загалом, (більш прийнятно, метилсульфоніл або етилсульарильні групи можуть бути приєднані до решти фоніл), сульфініл, С1-С4 алкілсульфініл (більш частини молекули у будь-якого наявного атому прийнятно, метил сульфініл). вуглецю, прямо чи через С1-С4 алкіленову гр упу, Якщо X означає NRa, і Ra означає захисну гр утаку як метиленова чи етиленова. пу, то Ra означає такі групи, як алкіл (більш прийнТермін "гетероарил" стосується груп, що є ятно, метил чи етил), алканоїл (більш прийнятно, ароматичними чи частково ароматичними групами ацетил), алкоксикарбоніл (більш прийнятно, метоз моноциклічним або біциклічним кільцем із 4-12 ксикарбоніл або трет-бутоксикарбоніл), арилметоатомами вуглецю, що містять, принаймні, один ксикарбоніл (більш прийнятно, бензилоксикарбогетероатом, такий як О, S чи N, а наявний атом ніл), ароїл (більш прийнятно, бензоїл), арилалкіл азоту або вуглецю є місцем зв'язування групи до (більш прийнятно, бензил), алкілсиліл (більш прирешти частини молекули, прямо чи через С1-С4 йнятно, триметилсиліл) або алкілсилілалкоксіалкіл алкіленову груп у, як визначено вище. Прикладами (більш прийнятно, триметилсилілетоксиметил). є тіофеніл, піроліл, імідазоліл, піридиніл, оксазоЯкщо R2 і R3 разом з N означають гетероарил ліл, тіазоліл, піразоліл, тетразоліл, піримідиніл, або гетероцикл, це означає, що такі гетероарили піразиніл, хінолініл або триазиніл. чи гетероцикли мають, принаймні, один атом вугТермін "гетероцикл" стосується п'ятичленних лецю, заміщений атомом азоту, через який групи або шестичленних, повністю насичених або частприєднані до решти частини молекули. Прикладаково ненасичених гетероциклічних груп, що місми таких груп є морфолін-4-іл, піперидин-1-іл, пітять, принаймні, один гетероатом, такий як О, S чи ролідин-1-іл, імідазол-1-іл або піперазин-1-іл. N, а наявний атом азоту або вуглецю є місцем Термін "фармацевтично прийнятні солі" стосузв'язування групи до решти частини молекули, ється солей сполук формули І та включає, наприпрямо чи через С 1-С4 алкіленову гр упу, як визнаклад, солі з С 1-С4 алкілгалідами (більш прийнятно, 15 78297 16 метилбромід, метилхлорид) (четвертинні солі амонію), неорганічними кислотами (соляна, бромисто-воднева, фосфорна, метафосфорна, азотна чи сірчана кислоти) або органічними кислотами (винна, оцтова, лимонна, малеїнова, молочна, фумарова, бензойна, бурштинова, метансульфонова або р-толуолсульфонова кислоти). Деякі сполуки формули І можуть утворювати солі із органічними чи неорганічними кислотами чи основами, і всі вони включені до цього винаходу. Сольвати (найбільш часто - гідрати), які моде L означає відщеплювану гр уп у, жуть утворювати сполуки формули І чи їх солі, з сполуками формули IVa також є предметом цього винаходу. Залежно від природи конкретних замісників, сполуки формули І можуть мати геометричні ізомери та один чи кілька хіральних центрів так, що можуть існувати енантіомери чи діастереоізомери. Даний винахід також стосується таких ізомерів та їх сумішей, включаючи рацемати. d) для сполук формули І, де Q1 означає гетеДаний винахід також стосується усіх можливих роатом -О-, -NH- або -S-, реакцію сполук формули таутомерних форм конкретних сполук формули І. Vb Ще один предмет цього винаходу стосується отримання сполук формули І у способи, що включають a) для сполук формули І, де R1 є алкілоксикарбонілом, циклізацію сполук формули III з складними ефірами маркаптооцтової кислоти; b) для сполук формули І, де Q1 означає -О-, реакцію спиртів формули V з сполуками формули IV, де R4 означає відщеплювану гр упу; е) для сполук формули І, де Q1 означає -С=С-, реакцію з сполуками формули Vb, де Q1 означає карбоніл, з фосфористими ілідами. Способи приготування: а) Циклізацію сполук формули III з етилмеркаптоацетатом проводять із використанням методів, розкритих для отримання аналогічних сполук. Реакцію проводять у присутності органічних основ (більш прийнятно, піридину) при температурі кипіння протягом і - 5 годин. Отримані тетрациклічні продукти можуть бути виділені за допомогою хроматографії на колонці або шляхом перекристалізації з підхожого розчинника. Вихідні сполуки для отримання сполук формули III - кетони формули VI, з сполуками формули IV де R4 означає відщеплювану гр упу; с) для сполук формули І, де Q1 означає -О-, NH-, -S- або -СºС-, реакцію сполук формули Va вже відомі, або їх можна приготувати у способи, розкриті для отримання аналогічних сполук. Таким чином, наприклад, сполуки формули VI можуть бути отримані, виходячи з сполук формули VIII 17 78297 18 є реакції нуклеофільного заміщення по насиченому атому вуглецю, як це описано в літературі. Вихідні сполуки формули Va (частіше за все галіди) можна отримати шляхом галогенування (наприклад, бромування чи хлорування) спиртів формули V із звичайними агентами галогенування (наприклад, бромисто-водневою кислотою, PBr3, SOCk або РСI5) у способи, описані в літературі. Отримані сполуки можуть виділятись або викорисде R5 означає СО2Н групу, у такий спосіб, що товуватись без виділення в якості підхожих промішляхом підхожих хімічних перетворень отримують жних сполук для отримання сполук формули І. сполуку формули VIII, де R5 означає СН 2СО2Н. Під Вихідні сполуки формули IVa вже відомі, або їх дією поліфосфорної кислоти відбувається циклізаможна приготувати у способи, розкриті для отриція та утворення кетону формули VI. Аналогічна мання аналогічних сполук. послідовність реакцій була розкрита раніше у d) Сполуки формули І, де Q1 означає -О-, -NHProtiva Μ et al. [CS 163583, Collect. Czech. Chem. або -S-, можна отримати шляхом конденсування Commun., 1975,40:1960-1965 і Collect. Czech. сполук формули Vb та сполук формули IV, де R4 Chem. Commun., 1974, 39:3147-3152]. Або сполуку означає визначену вище відщеплювану груп у. Реформули VIII, де R5 означає СН 2СО2Н, можна акцію можна проводити в умовах, описаних для отримати шляхом проведення реакції сполуки фоспособу b), або як реакції нуклеофільного замі5 рмули VIII, де R є СОСН3, з сіркою та морфоліном щення, описані в літературі. Вихідні спирти, аміни і гідролізу отриманого таким чином тіоаміду [Ueda I та тіоли можна одержати шляхом проведення реаet al., Chem. Pharm. Bull, 1975, 23:2223-2231]. кції води, аміаку чи сірководню з сполуками Va у Шляхом дії реагенту Вілсмеєра-Хаака на відповідспособи, описані в літературі. ні кетони формули VI, отримують сполуки формуe) Спирти формули V можна окислити до відли III [Tsuji K et al., Chem. Pharm. Bull, 1998,46:279повідних сполук формули Vb, де Q1 означає кар286]. боніл, і які можуть далі, шляхом реакції із відповідb) Сполуки формули І відповідно до цього споними ілідними реагентами, забезпечувати собу можуть бути отримані шляхом проведення подовження ланцюжка та утворення алкенільного реакції спиртів формули V та сполук формули IV, замісника з карбонільними чи складноефірними де R4 означає відщеплювану групу, що може являгрупами, як описано у патентній заявці HR ти собою атом галогену (частіше за все - бром, №20000310. йод чи хлор) або сульфонілокси групу (частіше за Окрім зазначених вище реакцій сполуки форвсе трифторметилсульфонілокси чи рмули І можна отримати шляхом перетворення інтолуолсульфонілокси). Реакцію конденсації можна ших сполук формули І, і слід розуміти, що даний проводити відповідно до методів, розкритих для винахід також охоплює ці сполуки та способи. отримання аналогічних сполук [Menozzi G et al., J. Особливим прикладом зміни функціональної групи Heterocyclic Chem., 1997, 34:963-968 або WO є реакція альдегідної групи із вибраними фосфо01/87890]. Реакцію проводять при температурі від ристими ілідами, яка дає подовження ланцюжка та 20°С до 100°С протягом 1-24 годин у двофазній утворення алкенільного замісника з карбонільними системі (більш прийнятно, з 50% NaOH/толуол) у чи складноефірними групами, як описано у патенприсутності міжфазного каталізатора (більш притній заявці HR №20000310. Ці реакції проводять у йнятно, бензилтриетиламонійхлориду, бензилтрирозчинниках, таких як бензол, толуол чи гексан етиламонійброміду, цетилтриметилброміду). Після при підвищеній температурі (частіше за все - при обробки реакційної суміші утворені продукти видітемпературі кипіння). ляють шляхом перекристалізації або за допомоШляхом проведення реакції сполук формули гою хроматографії на силікагельній колонці. Va з 1-алкіном у лужному середовищі (такому як Вихідні сполуки - спирти формули V - можна амід натрію в аміаку) отримують сполуки формули отримати з сполук формули І, де R1 означає підІ, де Q 1 - це -СºС-. Умови реакцій цього способу хожу функціональну груп у. Таким чином, напринаведені в літературі. При аналогічний умовах клад, спирти формули V можна отримати шляхом реакції (нуклеофільне заміщення) можна отримати відновлення алкілоксикарбонільної групи (наприрізні простоефірні, тіоефірні чи амінові похідні. клад, етилоксикарбоніл) із використанням гідридів Формілування сполук формули І у такі спосометалів, таких як алюмогідрид літію або борогідби, як, наприклад, ацилування Вілсмеєра чи реакрид натрію. Далі, спирти формули V можна отриція n-BuLi та N,N-диметилформаміду є ще одним мати шляхом гідролізу відповідних складних ефірів загальним прикладом перетворення. Умови реакв лужному чи кислотному середовищі. цій цих способів добре відомі з літератури. Вихідні сполуки формули IV вже відомі, або їх Шляхом гідролізу сполук формули І, що мають можна приготувати у способи, розкриті для отринітрильні, амідні чи складноефірні групи, можна мання аналогічних сполук. одержати сполуки із карбоксильною групою, які є c) Сполуки формули І відповідно до цього спопридатними проміжними сполуками для отримансобу можуть бути отримані шляхом проведення ня інших сполук із новими функціональними груреакції сполук формули Va, де L означає відщеппами, як, наприклад, складні ефіри, аміди, галіди, 4 лювану груп у, визначену вище для R , та сполук ангідриди, спирти чи аміни. формули IVa, де Q1 означає кисень, азот, сірку чи Реакції окислення чи відновлення являють соСºС-. Найбільш підхожими реакціями конденсації бою ще одну можливість зміни замісників у сполу 19 78297 20 ках формули І. Найбільш часто використовуваниметилсиліл) можуть вилуча тись шляхом обробки ми окислювальними агентами є пероксиди (перепідхожою кислотою (соляною, сірчаною, фосфоркис водню, m-хлорпербензойна кислота або пероною чи трифтороцтовою кислотою), а арилметокксид бензоїлу) або іони перманганату, хромату чи сикарбонільну груп у (бензилоксикарбоніл) можна перхлорату. Таким чином, наприклад, шляхом вилучи ти шля хом гідрогенізації з використанням окислення спиртової групи піридинілдихроматом такого каталізатора, як паладій на вугіллі. чи піридинілхлорхроматом утворюється альдегідСолі сполук формули І можна приготувати у на група, яку шля хом подальшого окислення можзагально відомі способи, такі як, наприклад, шляна перетворити на карбоксильну. Шляхом окисхом проведення реакції сполук формули І з відполення сполук формули І, де R1 означає алкіл, відною основою чи кислотою у відповідному розтетраацетатом свинцю в оцтовій кислоті або Nчиннику чи суміші розчинників, наприклад, простих бромсукцинімідом з використанням каталітичної ефірах (діетиловий ефір) чи спиртах (етанол, прокількості пероксиду бензоїлу отримують відповідну панол або ізопропанол). карбонільну похідну. Іншим предмет даного винаходу стосується Шляхом селективного окислення алкілтіо грувикористання даних сполук у лікуванні запальних пи можна отримати алкілсульфініл чи алкілсульзахворювань та станів, особливо усіх захворювань фоніл групи. та станів, що викликаються надлишковою секреціШляхом відновлення сполук із нітро групою єю TNF-a та IL-1. можна приготувати аміно сполуки. Реакцію провоІнгібітори продукування цитокінів або посередять при стандартних умовах каталітичної гідрогедників запалення, що є предметом даного винахонізації або електрохімічно. Шляхом каталітичної ду, або їх фармацевтично прийнятні солі можуть гідрогенізації з використанням паладію на вугіллі застосовуватись для виготовлення ліків для лікуможна перетворити алкенільні замісники на алківання та профілактики будь-якого патологічного льні або нітрильні групи - на аміноалкільні. стану чи хвороби, що викликається надлишковим Різні замісники ароматичної структури в спонерегульованим продукуванням цитокінів або полуках формули І можна вводити шляхом провесередників запалення, причому ці ліки мають місдення стандартних реакцій заміщення або шляхом тить ефективну доз у зазначених інгібіторів. звичайних змін окремих функціональних груп. Даний винахід, зокрема, стосується ефективПрикладами таких реакцій є ароматичні заміщенної дози інгібітору TNF-a, яку можна визначити у ня, алкілування, галогенування, гідроксилування, а звичайні способи. також окислення чи відновлення замісників. РеаДалі, цей винахід стосується фармацевтичних генти та умови реакцій відомі з літератури. Так, композицій, що містять ефективну нетоксичну дозу наприклад, шляхом ароматичного заміщення вводаних сполук, а також фармацевтично прийнятні диться нітрогрупа у присутності концентрованої носії чи сольвенти. азотної кислоти і сірчаної кислоти. Шляхом викоПриготування фармацевтичних композицій ристання ацилгалідів або алкілгалідів можна ввоможе включати змішування, гранулювання, табледити ацильну групу чи алкільну групу. Реакцію тування та розчинення інгредієнтів. Хімічні носії проводять у присутності кислот Льюїса, таких як можуть бути твердими чи рідкими. Твердими носіалюмінію- чи заліза-трихлорид в умовах реакції ями може бути лактоза, сахароза, тальк, желатин, Фриделя-Крафтса. Шляхом відновлення нітрогруагар, пектин, стеарат магнію, жирні кислоти тощо. пи отримують аміногрупу, яку за допомогою реакРідкими носіями можуть бути сиропи, олії, такі як ції діазотування перетворюють на підхожу ви хідну оливкова олія, соняшникова олія чи соєва олія, груп у, котру можна замінити однією з таких груп: Н, вода тощо. Аналогічно, носій може включати комCN, OH, Hal. понент для уповільненого вивільнення активного Для запобігання небажаній взаємодії у хімічкомпонента, такий як, наприклад, гліцерилмоносних реакціях часто виникає необхідність у захисті теарат або гліцерилдистеарат. Можуть використопевних груп, таких як гідрокси, аміно, тіо чи карбовуватись різні форми фармацевтичних композицій. кси. Для цього можуть використовуватись різноТак, у випадку використання твердого носія ці фоманітні захисні групи [Green TW, Wuts PGH, рми можуть бути таблетками, твердими желатиноProtective Groups in Organic Synthesis, John Wiley вими капсулами, порошком чи гранулами, що моand Sons, 1999], a вибір, використання та усунення жуть вводитись per os у капсулах. Кількість їх відповідають звичайним способам хімічного синтвердого носія може бути різною, але зазвичай тезу. вона становить від 25мг до 1г. Якщо використовуЗручними захисними групами для захисту аміється рідкий носій, композиція може бути у формі но чи алкіламіно груп є такі групи, як, наприклад, сиропу, емульсії, м'яких желатинових капсул, стеалканоїл (ацетил), алкоксикарбоніл (метоксикаррильних ін'єкційних рідин, таких як ампули чи небоніл, етоксикарбоніл або трет-бутоксикарбоніл); водні рідкі суспензії. арил метоксикарбоніл (бензилоксикарбоніл), ароїл Сполуки відповідно до цього винаходу можуть (бензоїл) або алкілсиліл (триметилсиліл або тривводитись per os, парентерально, локально, інтраметилсилілетоксиметил) групи. Умови вилучення назально, інтраректально і інтравагінально. Парезахисної групи залежать від вибору та характериснтеральний шлях введення означає тут вн утріштик цієї групи. Таким чином, наприклад, ацильні ньовенне, внутрішньом'язове та підшкірне групи, такі як алканоїл, алкоксикарбоніл або ароїл введення. Відповідні композиції даних сполук моможуть бути вилучені шляхом гідролізу у присутжуть використовуватись для профілактики, а також ності основи (гідроксиду натрію або гідроксиду лікування різних захворювань і патологічних запакалію), трет-бутоксикарбоніл або алкіл силіл (трильних станів, викликаних надлишковим нерегульо 21 78297 22 ваним продукуванням цитокінів або посередників додавали 10% FBS. Для визначення рівня секреції запалення, в основному TNF-a. Вони включають TNF-a, 5´104клітин/лунку культивували у загальревматоїдний артрит, ревматоїдний спондиліт, ному об'ємі 200мкл протягом 18-24 годин на плашостеоартрит та інші артричні патологічні стани та ках для титрування із плоским дном (96 лунок, захворювання, екземи, псоріаз та інші запальні Falcon) у середовищі RPMI 1640, в яке додавали стани шкіри, такі як опіки, викликані УФ променями 10% фетальної бичачої сироватки (FBS, (сонячні промені та випромінювання від інших таBiowhittaker), попередньо інактивованої нагріванких УФ джерел), запальні захворювання очей, хвоням, 100од/мл пеніциліну, 100мг/мл стрептоміцину, робу Крона, виразкові коліти та астму. 20мМ HEPES та 50мкМ 2-меркаптоетанолу (усі від Інгібіторну активність сполук цього винаходу GIBCO). Клі тини інкубували при 37°С в атмосфері з 5% СO2 і вологістю 90%. У негативному контролі на секрецію TNF-a та IL-1 визначали у таких ексклітини інкубували лише у середовищі (NC), а у периментах in vitro та in vivo: позитивному контролі секрецію TNF-a ініціювали Визначення секреції TNF-a та IL-i in vitro в мододаванням 10нг/мл ліпополісахаридів (LPS, Е. нонуклеарних клітинах периферичної крові люсоIі серотип 0111:В4, SIGMA) (PC). Ефект випродини Мононуклеари периферичної крові людини буваних сполук на секрецію TNF-a вивчали після (РВМС) готували з гепаринізованої суцільної крові, додавання їх у культури клітин, стимульовані LPS а потім відділяли РВМС на Ficoll-Paque™ Plus (TS). Рівень TNF-a у надосадовій рідині клітин ви(Amersham-Pharmacia). Для визначення рівня TNFмірювали за допомогою ELISA (R&D Systems, a, 3,5-5´104 клітин культивували у загальному об'Biosource). Рівень IL-1 визначали у випробуванні, ємі 200мкл протягом 18-24 годин на плашках для ідентичному випробуванню для TNF-a із використитрування із плоским дном (96 лунок, Falcon) у танням процедури ELISA (R&D Systems). Процент середовищі RPMI 1640, в яке додавали 10% FBS інгібування продукування TNF-a або IL-1 розрахо(фетальної бичачої сироватки, Biowhittaker), попевували за формулою: редньо інактивованої при 54°С/30хвил, 100од/мл %інгібування=[1-(TS-NC)/(PC-NQ]*100. пеніциліну, 100мг/мл стрептоміцину та 20мМ Значення ІС-50 визначали як концентрацію HEPES (GIBCO). Клітини інкубували при 37°С в речовини, при якій інгібування продукування TNFатмосфері з 5% СO2 і вологістю 90%. У негативa становило 50%. ному контролі клітини інкубували лише у середоАктивними вважаються сполуки із ІС-50 10мкМ вищі (NC), а у позитивному контролі секрецію TNFчи менше. a ініціювали додаванням 1нг/мл ліпополісахаридів Модель in vivoвикликаної LPS надлишкової (LPS, E. coli серотип 0111:В4, SIGMA) (PC). Ефект секреції TNF-a або IL-1 у миші випробуваних сполук на секрецію TNF-a вивчали Секрецію TNF-a або IL-1 у миші індукували після додавання їх у культури клітин, стимульовані відповідно до вже розкритого способу [Badger AM LPS (TS). Рівень TNF-a у надосадовій рідині клітин et al, J. Pharmac. Env. Therap., 1996, 279:1453вимірювали за допомогою ELISA (імуносорбентний 1461]. Для цього використовували самців Balb/C аналіз із застосуванням фіксованих ферментів) віком 8-12 тижнів у групах по 6-10 тварин. Тварин відповідно до рекомендацій виробника (R&D обробляли р.о. лише розчинником (у негативному Systems). Чутливість тесту становила