Спосіб визначення глюкозинолатів

Корисна модель - відноситься до аналітичної біохімії і конкретно стосується визначення вмісту глюкозинолатів в рапсі, гірчиці, та продуктах їх переробки (шроті, макусі). Глюкозинолати (тіоглюкозиди) - не природні сполуки, які відповідають за будовою загальній формулі При гідролізі глюкозинолатів, особливо, під дією ферменту мірозинази, утворюється ряд токсичних продуктів (ізотіоціанати, нітріли, гойтрини та інші). Тому визначення вмісту глюкозинолатів в насінні хрестоцвітних культур є важливою проблемою для галузі кормовиробництва. Існуючі методи визначення глюкозинолатів можна поділити на прямі, в основі яких лежить застосовування дорогих і складних приладів для ВЕРХ [Srensen H. New methods of quantitative analises glucosinolates. -In: Production and utilisation of prothein in oilbeed groups. Ed. by E.S. Bunting. - Nagne, Boston, London, Martinus Nijholl Publishers, 1981] і гідролітичні, в яких відбувається попередній ферментативний гідроліз з наступним визначенням продуктів гідролізу [Кононова Р.В., Левицкий А.П., Чайка И.К., Лукашенюк Е.В. Турбодиметрический способ определения суммарного содержания глюкозинолатов в рапсе. - Завод, лаборатория, 1985. -С.15-16]. Найближчим аналогом (прототипом) заявляемого винаходу є метод Левицького і інших [Левицький А.П., Кононова Р.В., Чайка І.Л. Определение глюкозинолатов и нитрилов в семенах рапса и продуктах их переработки. Метод, рекомендации. - Одесса, ВСТИ, -1986. -19с.] в основі якого лежить ферментативний гідроліз глюкозинолатів, з наступним визначенням турбідометричним методом кількості сульфату. Недоліком прототипу є: 1. необхідність попереднього екстрагування глюкозинолатів киплячим спиртом; 2. використання дороговартісного ферменту мирозинази; 3. тривалість визначення (понад 20 годин). В основу корисної моделі поставлена задача удосконалення способу "определения глюкозинолатов и нитрилов в семенах рапса и продуктах их переработки" шляхом заміни ферментативного гідролізу на кислотний, використання детергенту Бридж-35, що дозволить значно знизити вартість способу і скоротити тривалість визначення глюкозинолатів. Поставлене завдання вирішується тим, що у способі визначення глюкозинолатів і нітрилів у семенах рапса і продуктах їх переробки за яким здійснюють гідроліз, згідно винаходу здійснюють кислотний гідроліз глюкозинолатів, без попереднього їх виділення, в присутності 0,8-1,8М НСl з наступним гідролізом азотною кислотою (3-8%), визначають сульфат в присутності детергенту Бридж -35. Причинно-наслідкові зв’язки: 1. Проведення кислотного гідролізу замість ферментативного - не вимагає попередньої підготовки сировини (таким чином не проводиться екстрагування глюкозинолатів киплячим спиртом). 2. Використання детергенту Бридж-35, який стійкий до дії кислот і лугів, дозволяє визначати сульфат, але вартість способу при цьому значно знижується. 3. Проведення такого виду гідролізу і використання детергенту Бридж-35 дозволяє проводити визначення глюкозинолатів за значно менший час, але з більшою вірогідністю. В насінні хрестоцветних культур (рапс, гірчиця, суріпка) та в продуктах їх переробки немає ніяких, крім глюкозинолатів, речовин при гідролізі яких міг би утворюватися неорганічній сульфат. Тому замість багатовартісного ферментативного гідролізу можна використовувати кислотний ( в присутності соляної кислоти). Як виявили наші досліди, в насінні рапсу присутні речовини, що можуть зв'язувати іони сульфату. Ці речовини (найбільш вірогідно аміни) руйнуються за допомогою азотної кислоти. Для визначення сульфату в присутності іонів барію і для стабілізації колоїдів BaSO4 ми пропонуємо використовувати детергент Brig-35 (трикозаетиленгліколь додециловий простий ефір), який стійкий до дії кислот і лугів. Опис способу: Заявляємий спосіб складається з наступних етапів: 1. Гідроліз наважки сировини (0,5-2г) в присутності 1М НСl на киплячій водяній бані протягом 2 годин. Після чого доводять суміш до об'єму 20-25мл за допомогою дистильованої води. 2. Знешкодження сульфат-зв'язуючих речовин за допомогою НNO3. Для цього відбирають 2-5мл розведеного гідролізату, добавляють 0,15-0,3мл НNO3 (50%) і нагрівають на киплячої водяній бані протягом 40-60 хвилин. 3. Визначення вмісту сульфату. Відбирають після гідролізу HNO3 1,0-2,5мл гідролізату, добавляють 1,5мл розчину BaCL2 за детергентом Brig-35 (26,7г×ВаСl2·2Н2О+136г Brig-35 до 1л води) i доводять дистильованою водою до 4мл. 4. Визначають екстинкцію при 420нм на фотоколориметрі проти контролю на реактиви. 5. Розрахунок вмісту глюкозинолатів ведуть за формулою: x × 25 C= ; 15 × m , де С - вміст глюкозинолатів в ммолях на 1кг зрарку, х - концентрація глюкозинолатів в пробі зразка в ммолях (знаходять за допомогою калібровочної кривої, використовуючи стандартний розчин сульфату натрію), 25 агальний об'єм гідролізату, 1,5 -об'єм проби і m - наважка в кг. На Фіг.1 показано залежність визначення глюкозинолатів від часу їх гідролізу в присутності 1М НСl. З цих даних видно, що 2 години цілком достатньо для здійснення повного гідролізу глікозинолатів. На Фіг.2 показано залежність визначення глюкозинолатів від концентрації НСl. Як видно, 1М концентрація НСl забезпечує за 2 години повний гідроліз. На Фіг.3 показано пряму залежність між кількістю визначених глюкозинолатів і їх фактичним вмістом в рапсовому шроті. В таблиці 1 дано в порівнянні вміст глюкозинолатів в насінні рапсу, визначений за допомогою двох методів прототипу і заявляємого способу. З цих даних видно високу кореляцію показника вмісту глюкозинолатів в шротах рапсу різних сортів. Таблиця 1 Вираження вмісту глюкозинолатів в насінні рапсу двома методами № п/п 1 2 3 4 5 Сорт рапсу Тисменецький Іванна Агат ЖЛТ-Неф Немерчанський Вміст глюкозинолатів, ммоль/кг Прототип Заявляємий спосіб 20,8 21,4 31,7 32,1 64,2 63,8 100,9 101,6 134,7 136,4