Амідометилзаміщені похідні 1-(карбоксіалкіл)-циклопентилкарбоніламінобензазепін-n-оцтової кислоти, спосіб їх одержання, проміжна сполука та фармацевтична композиції на їх основі

; алкіламіно-С1-С6-алкіл" і "(С1-С4)2-алкіламіно-С 12-{[1-({[1-(карбоксиметил)-2-оксо-2,3,4,5С6-алкіл". "(С0)2-алкіламіно-С 1-С6-алкіл" означає тетрагідро-1H-1-бензазепін-3незаміщену первинну (=-NH2) аміногрупу, зв'язану іл]аміно}карбоніл)циклопентил]метил}-оксо-4-[4-(Lз С1-С6-алкіл(еном); "(С0)(С1-С4)-алкіламіно-С 1-С6валілокси)піперидин-1-іл]бутанову кислоту (68); алкіл" означає вторинну аміногрупу, монозаміщену 2-{[1-({[1-(карбоксиметил)-2-оксо-2,3,4,5(С1-С4)-алкілом і зв'язану з С 1-С6-алкіл(еном); "(С1тетрагідро-1H-1-бензазепін-3С4)2-алкіламіно-С 1-С6-алкіл" означає третинну амііл]аміно}карбоніл)циклопентил]метил}-4-морфолінногрупу, дизаміщену (С1-С4)-алкілом і зв'язану з 4-іл-4-оксобутанову кислоту (66); С1-С6-алкіл(еном). R3 Бажано означає ізопропіл; 2-{[1-({[1-(карбоксиметил)-2-оксо-2,3,4,5метоксіетил; 2-гідроксіетил або 3-гідроксипропіл, тетрагідро-1H-1-бензазепін-3кожна гідроксигрупа необов'язково етерифікована іл]аміно}карбоніл)циклопентил]метил}-4-оксо-4-(4С2-С4-алканоїльним або амінокислотним залишоксопіперидин-1-іл)бутанову кислоту (45); ком; 3-ацетилокси-н-пропіл; циклопропілметил; 24-[біс(2-гідроксіетил)аміно]-2-{[1-({[1метоксибензил, 4-метоксибензил; 4(карбоксиметил)-2-оксо-2,3,4,5-тетрагідро-1H-1метоксифенілетил; 2,4-диметоксибензил; 1бензазепін-3нафтилметил; 3-оксо-1,1-диметилбутил; феніл-2іл]аміно}карбоніл)циклопентил]метил}-4оксоетил; 2-(4-метоксифеніл)-2-оксоетил; 3-(2оксобутанову кислоту (58); оксоазепаніл); (С0-С4-алкіл)2аміно-С 1-С6-алкіл, 2-{[1-({[1-(карбоксиметил)-2-оксо-2,3,4,5краще - диметиламіно-н-пропіл, (метил)аміноетил, тетрагідро-1H-1-бензазепін-3аміно-н-пропіл, аміно-н-бутил або аміно-н-пентил. іл]аміно}карбоніл)циклопентил]метил}-4-{етил[3Якщо R2 і R3 спільно означають С 4-С7-алкілен, (етиламіно)пропіл]аміно}-4-оксобутанову кислоту то його метиленові групи необов'язково замінені (52); або необов'язково заміщені в кожному випадку 2-{[1-({[1-(карбоксиметил)-2-оксо-2,3,4,5морфоліном; піперидином; 4-кетопіперидином; 4тетрагідро-1H-1-бензазепін-3гідроксипіперидином, необов'язково етерифіковаіл]аміно}карбоніл)циклопентил]метил}-4-[[2ним С2-С4-алканоїльним або амінокислотним за(диметиламіно)етил](метил)аміно]-4-оксобутанову лишком за гідроксигрупою; піперазин і піролідин є кислоту (59); кращими. 4-[(3-амінопропіл)(етил)аміно]-2-{[1-({[1R4 бажано означає водень, С1-С4-алкіл, п(карбоксиметил)-2-оксо-2,3,4,5-тетрагідро-1H-1метоксибензил, N,N-дi-(C0-C4-алкіл)аміно-С 1-С6бензазепін-3алкіл, (RS)-1-[[(ізопропіл)карбоніл]оксі]етил, (RS)іл]аміно}карбоніл)циклопентил]метил}-41-[[(етил)карбоніл]окси]-2-метилпропіл, (RS)-1оксобутанову кислоту (67), [[(циклогексилокси)карбоніл]оксі]етил, 5-мeтил-22-{[1-({[1-(карбоксиметил)-2-оксо-2,3,4,5оксо-1,3-діоксолен-4-ілметил, 2-оксо-1,3тетрагідро-1H-1-бензазепін-3 17 85195 18 іл]аміно}карбоніл)циклопентил]метил}-4-{метил[2обхідній послідовності та за потреби кислотну гру(метиламіно)етил]аміно}-4-оксобутанову кислоту пу, що утворилася, у кожному випадку (68); перетворюють у біологічно лабільні складноефірні 4-[(4-амінобутил)(метил)аміно]-2-{[1-({[1групи, (карбоксиметил)-2-оксо-2,3,4,5-тетрагідро-1H-1і за потреби кислоти, що утворилися, формули бензазепін-3І перетворюють у їх фізіологічно сумісні солі, або іл]аміно}карбоніл)циклопентил]метил}-4солі кислот формули І перетворюють у вільні кисоксобутанову кислоту (75); лоти, і/або основи формули І перетворюють у їх 4-[(4-амінобутил)(етил)аміно]-2-{[1-({[1молекулярні солі з кислотами, або молекулярні (карбоксиметил)-2-оксо-2,3,4,5-тетрагідро-1H-1солі з кислотами перетворюють у вільні основи бензазепін-3формули І. іл]аміно}карбоніл)циклопентил]метил}-4Придатні фізіологічно сумісні солі кислот фороксобутанову кислоту (76); мули І у кожному випадку являють собою їх солі 2-{[1-({[1-(карбоксиметил)-2-оксо-2,3,4,5лужного металу, лужноземельного металу або тетрагідро-1Н-1-бензазепін-3амонію, наприклад, їх натрієві, калієві або кальцієіл]аміно}карбоніл)циклопентил]метил}-4-{метил[3ві солі, їх фізіологічно сумісні, фармакологічно (метиламіно)пропіл]аміно}-4-оксобутанову кислоту нейтральні органічні солі з амінами, такими як, (77) і наприклад, аміак, діетиламін, трет-бутиламін, N4-[(5-амінопентил)(метил)аміно]-2-{[1-({[1метилглюкамін, холін, або з амінокислотами, та(карбоксиметил)-2-оксо-2,3,4,5-тетрагідро-1H-1кими як, наприклад, аргінін. Якщо в сполуках форбензазепін-3мули І замісники R2 і/або R3 містять основні групи, іл]аміно}карбоніл)циклопентил]метил}-4переважно азотовмісні, то сполуки формули І таоксобутанову кислоту (78), кож можуть знаходитися у вигляді молекулярних разом з їх біологічно лабільними складними солей з кислотами. Фізіологічно сумісні молекуляефірами та фізіологічно сумісними солями кислот рні солі кислот сполук формули І є їх звичайними цих сполук формули І і/або фізіологічно сумісними солями з неорганічними кислотами, наприклад, молекулярними солями кислот цих сполук формусірчаною кислотою, фосфорною кислотою або ли І. галогенводневою кислотою, краще - хлористоводУ контексті даного винаходу нові сполуки фоневою кислотою, або з органічними кислотами, рмули І і їх солі одержують за реакцією сполуки наприклад, нижчими аліфатичними монокарбонозагальної формули II вими, дикарбоновими або трикарбоновими кислотами, такими як малеїнова кислота, фумарова кислота, винокам'яна кислота, лимонна кислота, або із сульфоновими кислотами, наприклад, нижчими алкансульфоновими кислотами, такими як метансульфонова кислота. Як захисні групи кислот R101 та R401 можуть бути вибрані звичайні захисні групи карбкосигруп, які потім можна повторно відщепити за відомими методиками. Придатні захисні групи карбкосигруп описані, наприклад, у публікаціях [McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum 101 401 у якій R і R незалежно один від одного Press (на яку нижче приводиться посилання у виозначають захисну гр уп у кислоти, зі сполуками гляді "McOmie"), та Greene, Wuts, "Protective загальної формули III Groups in Organic Synthesis", Wiley Interscience Publication (на яку нижче приводиться посилання у вигляді "Greene")], які є самими останніми виданнями. Групи, які утворюють біологічно лабільний складний ефір, також можна використовува ти як захисні групи кислот. Сполуки, одержані за реакціу якій R2 і R3 мають зазначені вище значення, єю сполук формули II зі сполуками формули III, у де R2 і/або R3 містять вільні гідроксигрупи, за цих випадках завжди являють собою складні ефіри потреби їх вводять у реакцію зі сполукою загальної формули І, пропоновані в даному винаході. формули IV Придатними захисними групами кислот R101 і 401 R є, зокрема, такі групи, які можна селективно C1-C3-C(O)-X IV відщепити або селективно ввести незалежно один від одного. Прикладами захисних груп кислот, які у якій X означає групу, що відщеплюється, або здатні до відщіплення при різних умовах, які також з похідною амінокислоти, яка містить придатну можуть являти собою групи, які утворюють біологізахисну гр упу, чно лабільні складні ефіри, є: нерозгалужені нижчі у якій R101 і/або R401 не означають необхідні алкільні групи, такі як трет-бутильна, яку можна групи, які утворюють біологічно лабільний складлегко відщепити за допомогою кислот, таких як ний ефір, і/або в якій R2 і/або R3 означають захисні трифтороцтова кислота; фенілметильні групи, негрупи в будь-якому амінокислотному залишку, що обов'язково заміщені у фенільном кільці, такі як міститься, їх послідовно відщеплюють від одержабензильна, яку можна легко відщепити за допомоних сполук одночасно або окремо в будь-якій негою гідрогенолізу або, альтернативно, у лужному 19 85195 20 середовищі; фенілметильні групи, один або декіють кислоту є, наприклад, органічні основи, які лька разів заміщені у фенільном кільці нижчою розчинні в реакційній суміші, такі як третинні азоалкоксигрупою, такі як п-метоксибензильна, яку тисті основи, наприклад, третинні нижчі алкіламіни можна відносно легко відщепити в окисних умовах, та піридини, такі як триетиламін, трипропіламін, Nнаприклад, під впливом 2,3-дихлор-5,6-диціанометилморфолін, піридин, 4-диметиламінопіридин, 1,4-бензохінону (=ДДХ) або нітрату амонію-церію; 4-діетиламінопіридин і 4-піролідинопіридин. При або відомі кремнієвмісні захисні групи, які можна використанні в надлишку органічні основи можуть легко відщепити за допомогою фторид-іонів. Спевиступати і як розчинники. ціалісту в даній галузі те хніки відомо, як вибрати Якщо самі кислоти формули II використовупридатні захисні групи для одержання необхідного ються як ацилювальні реагенти, то реакцію аміношляху заміщення. сполуки формули III з карбоновими кислотами фоСполуки формули І містять два хіральні атоми рмули II також можна з успіхом провести в вуглецю, а саме, атом вуглецю, що містить амідприсутності реагенту реакції сполучення, відомого, ний бічний ланцюг у положенні 3 бензазепінового наприклад, з хімії пептидів як такий, що придатний каркасу (=Сb*), і атом вуглецю, що містить радикал для одержання амідів. Прикладами реагентів реа"-COOR1" (=Са*). Таким чином, ці сполуки можуть кції сполучення, які стимулюють утворення аміду знаходитися усього в 4 стереізомерних формах. вільних кислот за реакцією з кислотою in situ з Даний винахід стосується сумішей стереоізомерів і утворенням реакційноздатної похідної кислоти, енантіомерів, а також ізомерно чистих сполук фозокрема, є: етилхлорформіат, алкілкарбодііміди, рмули І. Ізомерно чисті сполуки формули І є кранаприклад, циклоалкілкарбодііміди, такі як дицикщими. Особливо кращими є сполуки формули І, у логексилкарбодіімід або N-(3якій атом вуглецю, що містить амідний бічний ландиметиламінопропіл)-N'-етилкарбодіімід (=ЕКД), цюг у положенні 3 бензазепінового каркасу, знахокарбонілдіімідазол і N-(низч. алкіл)-2диться в конфігурації "S". У відношенні до хіральгалогенпіридинієві солі, зокрема, галогениди або ного атома вуглецю "*Са", який містить радикал "толуолсульфонати. Реакцію в присутності реагенCOOR1", конфігурація сполук формули І, які кращі ту реакції сполучення можна успішно провести при в контексті даного винаходу, умовно позначається температурах від -30° до +50°C у розчинниках, за допомогою "rel1" (див. експериментальну частаких як галогеновані вуглеводні і/або ароматичні тину). Шляхом аналогічного розгляду придатних розчинники, і необов'язково в присутності описаносполук відомої конфігурації можна прийти до виго вище аміну, що зв'язує кислоту. сновку, що краща конфігурація "rel1" для хіральноУ сполуках, одержаних за реакцією сполук го центра "*Са", ймовірно, подібна з конфігурацією формули II зі сполуками формули III, у якій R2 і/або "S". R3 містять вільні гідроксигрупи, їх за потреби можРеакцію кислот формули II з амінами формули на відомим чином ввести в реакцію зі сполукою III можна провести відповідно до звичайних метоформули IV. У сполуках формули IV гр упа X, що дик утворення амідних груп шляхом аміноацилювідщеплюється, означає, наприклад, галоген, певання. Карбонові кислоти формули II або їх реакреважно - хлор. ційноздатні похідні можна використовувати як У сполуках, одержаних за реакцією сполук ацилювальні реагенти. Зокрема, придатними реаформули II зі сполуками формули III, у якій R2 і/або кційноздатними похідними є змішані ангідриди R3 містять вільні гідроксигрупи, їх за потреби можкислот і галогенангідриди кислот. Так, наприклад, на відомим чином ввести в реакцію з похідною можна використовувати хлорангідриди кислот або амінокислоти, яка містить придатну захисну гр упу. бромангідриди кислот формули II або змішані Придатні захисні групи для амінокислот і способи складні ефіри кислот формули II з органічними їх введення і їх селективного відщіплення відомі в сульфоновими кислотами, наприклад, з нижчими даній галузі техніки, наприклад, з публікацій алкансульфоновими кислотами, необов'язково McOmie і Greene. Придатні похідні амінокислот, що заміщеними галогеном, такими як метансульфомістять захисні групи, або є у продажу, або можуть нова кислота або трифторметансульфонова кисбути одержані за відомими методиками. лота, або з ароматичними сульфоновими кислоЗахисні групи R101 та R401 за умови, що вони не тами, такими як бензолсульфонова кислота або означають необхідні групи, які утворюють біологічбензолсульфонова кислота, що заміщена нижчим но лабільний складний ефір, і/або захисні групи, алкілом або галогеном, наприклад, толуолсульякі можуть міститися в будь-якому амінокислотнофонова кислота або бромбензолсульфонова кисму фрагменті, пропонованого в даному винаході, у лота. Ацилювання може відбуватися в органічним R2 і/або R3, за відомою методикою та за потреби розчиннику, що є інертним в умовах проведення селективно можна відщепити від сполук, одержареакції при температурах від -20°C до кімнатної них за реакцією сполук формули II зі сполуками температури. Придатними розчинниками є галогеформули III. новані вуглеводні, такі як дихлорметан, і ароматиСполуки формули І можна виділити з реакційчні вуглеводні, такі як бензол і толуол, і циклічні ної суміші та за потреби очистити за відомою мепрості ефіри, такі як тетрагідрофуран (=ТГФ) або тодикою, наприклад, за допомогою високоефектидіоксан, і суміші цих розчинників. вної рідинної хроматографії (=ВЕРХ). Ацилювання, зокрема, якщо як ацилювальний Вихідні сполуки формули II є новими сполукареагент застосовують змішані ангідриди кислот ми, які придатні для використання як проміжні формули II із сульфоновими кислотами, можна з продукти для одержання нових активних сполук, успіхом провести в присутності реагенту, що зв'янаприклад, для одержання сполук формули І. зує кислоту. Придатними реагентами, що зв'язу 21 85195 22 Сполуки формули II можна одержати за реакцією органічні аміди лужних металів або нижчі алкілпосполуки загальної формули V хідні лужних металів, такі як діізопропіламід літію або н-бутиллітій. Циклопентанкарбонову кислоту доцільно вводити в реакцію в ТГФ із двома еквівалентами н-бутиллітію та потім реакційну суміш вводити в реакцію зі сполукою формули VII. Температура реакції може становити від -80до 0°C. Сполуки формули VI відомі, наприклад, із заявки [EP 0733642 A1] і їх можна одержати у вигляді рацематів або, альтернативно, в ізомерно чистому вигляді відповідно до методик, що описані у даному винаході, або за методиками, які аналогіч5 101 у якій R означає захисну груп у кислоти та R ні їм. має зазначене вище значення, зі сполуками загаСполуки формули VII можна одержати шляхом льної формули VI етерифікації сполук загальної формули VIII у якій R401 має зазначене вище значення, з наступним відщіпленням захисних груп кислоти R5 також за відомою методикою. Реакцію можна провести за методикою, відомою для аміноацилювання, наприклад, за методикою, яка описана вище для реакції сполук формули II зі сполуками формули III. Для виключення небажаних вторинних реакцій може виявитися доцільним відщіплення захисних гр уп кислоти R5 за відомою методикою, що проводиться не в лужному середовищі та відповідно вибрати придатні захисні групи кислоти R5. Аміни формули III самі по собі відомі або їх можна одержати за відомою методикою з відомих сполук. Реакційноздатні похідні кислот формули IV самі по собі відомі або їх можна одержати за відомою методикою з відомих сполук. Вони являють собою похідні С 1-С4-карбонових кислот, які мають лінійний або розгалужений ланцюг. Сполуки формули V можна одержати за реакцією похідних акрилових ефірів загальної формули VII у якій R101 і R5 мають зазначені вище значення, з циклопентанкарбоновою кислотою. Реакцію можна проводити за відомою методикою за умов конденсації за Міхаелем в органічному розчиннику, який інертний за умов проведення реакції, за реакцією циклопентанкарбонової кислоти з сильною основою, здатною привести до утворення діаніону циклопентанкарбонової кислоти, і з наступною реакцією з похідною акрилового ефіру формули VII. Придатними розчинниками є прості ефіри, зокрема, циклічні прості ефіри, такі як ТГФ. Придатними сильними основами є ненуклеофільні у якій R5 означає захисну груп у кислоти, відповідним спиртом за відомою методикою. Сполуки формули VIII можна, наприклад, одержати за реакцією ангідриду ітаконової кислоти за відомих умов, при яких розкривається ангідридна група, з реагентом, здатним утворити захисну групу кислоти R5, таким як відповідним чином заміщений спирт. При описаних вище реакціях хіральні центри вихідних сполук формули V і формули VI не змінюються, так що залежно від типу вихідних сполук наприкінці можна одержати ізомерно чисті сполуки формули І або суміш ізомерів. Для одержання стереохімічно однорідних сполук формули І однорідні сполуки формули V вводять у реакцію зі стереохімічно однорідними сполуками формули VI. Якщо енантіомерно чисту сполуку формули V вводять у реакцію з рацемічною сполукою формули VI або рацемічну сполуку формули V з енантіомерно чистою сполукою формули VI, то в обох випадках одержують суміш двох стереоізомерів, яку за потреби за відомою методикою можна розділити на стадії сполук формули II або на стадії сполук формули І. Реакція рацемічних сполук формули V з рацемічними сполуками формули VI дає відповідні суміші чотирьох ізомерів, які за потреби можна розділити за відомою методикою, наприклад, шляхом розділення за допомогою ВЕРХ на можливо хіральних розділяючих речовинах. Сполуки формули V мають хіральний центр по атому вуглецю, що містить радикал "-COOR101", і їх одержують при синтезі з похідних акрилових складних ефірів формули VII у вигляді рацематів. Оптично активні сполуки в принципі можна одержати з рацемічних сумішей за методикою, що сама по собі відома, наприклад, за допомогою хроматографічного розділення на хіральних розділяючих речовинах або за реакцією з придатними оптично активними основами, наприклад, aметилбензиламіном, цинхонідином або псевдоефедрином з наступним розділенням на оптичні антиподи шляхом фракціонованої кристалізації одержаних солей. 23 85195 24 Сполуки формули І і їх фармакологічно сумісні викликуваної ПНП діуретичної/натрієуретчної аксолі відрізняються корисними фармакологічними тивності. характеристиками. Зокрема, сполуки інгібують НЕП бере участь не тільки в руйнуванні ПНП, фермент НЕП. НЕП є ферментом, що руйн ує енале й у руйнуванні ендотеліну. Звідси випливає, догенні натрієуретичні пептиди, наприклад, предщо інгібування тільки НЕП на додаток до необхідсердний натрієуретичний пептид (=ПНП). Внасліного збільшення рівнів ПНП також приводить до док інгібуючого впливу на активність НЕП сполуки несприятливого підвищення рівнів ендотеліну. Із можуть поліпшува ти біологічну активність і час цієї причини комбінований вплив НЕП, лРЕП і інгіжиття натрієуретичних пептидів, на які може вплибування ЕКФ, що відбувається в певному ступені, вати НЕП, зокрема, ПНП, і тому вони придатні для повинен(-но) розглядатися як особливо сприятлилікування патологічних станів, на які такі гормони вий(-е), оскільки він(воно) і запобігає руйнуванню впливають сприятливо, насамперед - серцевонатрієуретичного/діуретичного ПНП (шляхом блосудинних захворювань, зокрема серцевої недостакування НЕП), і одночасно інгібує утворення ендотності, переважно - застійної серцевої недостатнотеліну (шля хом інгібування лРЕП та ЕКФ). У ресті. зультаті можна здійснити позитивний вплив При застійній серцевій недостатності опір пешляхом усунення несприятливої побічної дії спориферичних судин, що підсилюється рефлекторлук, які є тільки інгібіторами НЕП (а саме, небажано, виникає внаслідок викликуваного захворюванного підвищення рівнів ендотеліну). ням зменшення фракції викиду серця. Це означає, Комбінований вплив сполук формули І, як інгіщо міокард повинен почати відкачування при підбіторів НЕП, лРЕП і, у меншому ступені, також вищеному постнавантаженні. У свою чергу це у ЕКФ, вірогідно, здійснюють сполуки, пропоновані в вигляді порочного кола приводить до збільшення даному винаході, що особливо придатні для пронавантаження на серце й ще більше погіршує пофілактики і/або лікування патологічних станів або ложення. Посилення периферичного опору, зокзахворювань, таких як серцево-судинні патологічні рема, опосередкується вазоактивним пептидом стани або захворювання, зокрема серцевої недоендотеліном (=ET-1). Ендотелій є найсильнішою статності, включаючи гостру серцеву недостатвідомою у цей час ендогенною судинозвужувальність і хронічну серцеву недостатність, і переважно ною сполукою і утворюється з попередника big- застійної серцевої недостатності; а також гіперендотеліну (=Big-ET-1). За наявною у цей час інтензії, включаючи вторинні форми гіпертензії, такі формацією в перетворенні Big-ET-1 в ET-1 прияк есенційна гіпертензія, ниркова гіпертензія і/або ймають участь різні ферменти, зокрема, ферменти легенева гіпертензія; паралічу серця, стенокардії, ЕКФ та лРЕП [з цього питання див., наприклад, аритмії серця, інфаркту міокарда, періопераційноWO 02/094176]. го інфаркту міокарда, інфаркту міокарда з поганим При застійній серцевій недостатності внасліпрогнозом, гіпертрофії серця, застійної кардіоміодок зменшеного серцевого викиду та збільшеного патії, гіпертрофічної обструктивної кардіоміопатії, периферичного опору в легеневому колі кровообігіпертрофічної необструктивної кардіоміопатії, гу та у самому серці виникає протитиск. Внаслідок ідіопатичної кардіоміопатії, міокардиту, перикардицього виникає підвищене напруження стінки серту і/або ендокардиту у великих ссавців, зокрема цевого м'яза в ділянці передсердь і порожнини людини. Сполуки формули І також з успіхом можна серця. У такій ситуації серце функціонує, як ендозастосовувати для профілактики або лікування кринний орган, і, зокрема, виділяє ПНП у кровотік. уражень серця, зокрема, міокарда, викликаного Внаслідок своєї помітної судинорозширювальної кардіотоксичними дозами лікарських препаратів, та натрієуретчної/ді уретичної активності ПНП призокрема, цитостатичних препаратів, переважно водить і до зниження периферичного опору, і до цитостатичних антибіотиків і хімічних препаратів; зменшення об'єму циркулюючої крові. Наслідком субдіафрагмальної стенокардії, різних типів ішемії цього є помітне зменшення перед- і постнавантаголовного мозку, захворювання периферичних ження. Це є ендогенним кардіозахисним механізсудин, субарахноїдальної кровотечі, хронічного мом. Цей позитивний ендогенний механізм обмеобструктивного захворювання легенів (ХОЗЛ), асжується тим, що ПНП має дуже короткий час життя тми, захворювання нирок (ниркової недостатності), в плазмі. Причиною цього є дуже швидке руйнуатеросклерозу та болю у випадку колоректального вання гормону за допомогою НЕП. раку і раку передміхурової залози у великих ссавСполуки, пропоновані в даному винаході, змеців, зокрема людини. ншують вироблення ендотеліну шляхом інгібуванПримітна несподівано висока ефективність ня активності ЕКФ і додаткового інгібування активсполук формули І після BB введення для регулюності лРЕП і тим самим протидії збільшенню вання артеріального тиску, особливо їх гіпотензипериферичного опору, що, у свою чергу, привовний вплив. дить до зменшення міокардіального навантаженОпис методик фармакологічних досліджень ня. Отримані раніше результати також показують, Зазначені номери прикладів є номерами прищо сполуки, пропоновані в даному винаході, шлякладів синтезу, описаних нижче. хом інгібування активності НЕП приводять до 1. In-vitro дослідження інгібуючого впливу спобільш значних рівнів ПНП і збільшення тривалості лук на НЕП впливу ПНП. Це повинно привести до інтенсифікаЩоб продемонструвати інгібуючий вплив споції опосередковуваного ПНП ендогенного кардіолук, пропонованих у даному винаході, на НЕП, за захисного механізму та забезпечує високу ефекдопомогою стандартного дослідження in vitro противність сполук формули І для інтенсифікації ведено вивчення інгібуючого впливу сполук на гідролітичне розкладання поліпептиду MКК-Asp-Ile 25 85195 26 Ala-Trp-Phe-ДФA-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val-Pro-Tyrнює 328нм, і при довжині хвилі випромінювання, Gly-Leu-Gly-COOH, що відбувається внаслідок що дорівнює 393нм. ферментативної активності НЕП. У цьому досліПри ферментативному розкладанні пептиду дженні як міру інгібуючого впливу сполук визначафлуорофор (=МКК) і гаситель закінчуються на різли їх значення IC50. Значение IC50 досліджуваної них фрагментах пептиду, що знижує ефективність сполуки, яка здійснює інгібуючий вплив на фергасіння. Це приводить до посилення флуоресценмент, являє собою концентрацію досліджуваної ції. Посилений сигнал флуоресценції (що відповісполуки, при якій блокується 50% ферментативної дає поверхні, А) піка пептиду у ВЕРХ з непогашеактивності НЕП. ним флуорофором МКК використовується для Буфер для дослідження: 100мМ Tris наступних розрахунків. Проводять зіставлення цих [Tris=трис(гідроксиметиламінометан)] рН 7,0, сигналів для зразків, що містять (=Ainhib) і не міс250мМ NaCl тять (=Acontrol) досліджувану сполук у формули І, і Фермент: розчинний рекомбинантний НЕП значення "інгібування у %" розраховують за плолюдини, одержаний у проф. Crine, University of щами відповідних піків за наступною формулою: Montreal, Canada. Інгібування у %=100*(1-Ainhib /Acontrol). Вихідний розчин: 100мкг/мл в 20мМ Tris рН Всі зразки досліджували двічі та розраховува7,0. ли середні значення. У кожному експерименті як Робочий розчин: Вихідний розчин з буфером контроль для кожного зразка проведено дослідля дослідження, розведений до 2мкг/мл. дження стандартного інгібітору (10нМ триптофан) і Субстрат: МКК*-Asp-Ile-Ala-Trp-Phe-ДФA**-Thrрозчинника-контролю (0,1% ДМСО). Pro-Glu-His-Val-Val-Pro-Tyr-Gly-Leu-Gly-COOH; У цій моделі дослідження досліджувані сполуаналог Big-ET-1 з погашеною флуоресценцією, ки формули І, перераховані в представленій нижче тобто субстрат металопротеаз, що детектується за таблиці 1, мали наведені нижче значення ІС50: сигналом флуоресценції, зокрема, НЕП та ЕКФ-1. Флуоресценція флуорофора МКК вже спочатку Таблиця 1 погашена внаслідок присутності "гасителя" - ДФА. *МКК=(7-метоксикумарин-4-іл). Інгібуючий вплив на НЕП **ДФА=(3-[2,4-динітрофеніл]-L-2,3досліджуваних сполук in vitro діамінопропіоніл), одержані від фірми Polypeptide Laboratories, Приклад № IC50 (НЕП) Wolfenbuttel, Germany. 3 17,9 Вихідний розчин: 100мкм у буфері для дослі10 37 дження. 16 20,0 Досліджувані речовини: Всі сполуки розчиняли 17 99%. є ендогенною сполукою, що має сильну судиноРобочий розчин: вихідний розчин, розведений розширювальну дію. Збільшення рівня ET-1 прибуфером для дослідження до 10мг/мл. водить до підвищення артеріального тиску. При Субстрат: МКК-Asp-Ile-Ala-Trp-Phe-ДФA-Thrвливанні Big-ET-1 підвищення артеріального тиску Pro-Glu-His-Val-Val-Pro-Tyr-Gly-Leu-Gly-COOH; відбувається в ступені, що залежить від кількості аналог Big-ET-1 з погашеною флуоресценцією. ET-1, яка утворилася при каталізованому ферменВихідний розчин: 100мкм у буфері для дослітом розкладанні Big-ET-1. Як міру інгібуючого федження рмент впливу сполук визначали їх інгібуючий одержані від фірми Polypeptide Laboratories, вплив на підвищення артеріального тиску, що виWolfenbuttel, Germany кликане вливанням Big-ET-1. Досліджувані речовини: Всі сполуки розчиняли Щурів (Sprague-Dawley, CRLD=Charles River) в ДМСО (10мм) і розбавляли до необхідної для анестезували за допомогою 1мл/кг суміші дослідження концентрації буфером для досліRompun/Ketavet 1:1. Для вимірювання артеріальдження. ного тиску в сонну артерію вставляли датчик тиску Дослідження та методика аналізу за допомо(Statham). У яремну вену вставляли катетер для гою ВЕРХ були аналогічні описаними вище для введення сполуки та ще один для введення Bigвизначення інгібуючої активності досліджуваних ET-1. Після 20-хвилинної стадії спокою щурам сполук відносно до НЕП in vitro. Як стандартний вводили відповідну досліджувану сполуку формуінгібітор при аналізі за допомогою ВЕРХ викорисли І у концентрації, як правило 10мкмоль/кг, або товували 10нМ фосфорамідон. розчинник. Через 5хв протягом 1хв проводили У цій моделі дослідження досліджувані сполувливання 0,5нмоль/кг Big-ET-1. Систолічний ки формули І, перераховані в представленій нижче (САД=систолічний артеріальний тиск ) і діастолічтаблиці 1, мали наведене нижче значення ІС50: ний (ДАД=діастолічний артеріальний тиск ) артеріальний тиск і частоту серцевих скорочень із викоТаблиця 2 ристанням датчика тиску за відомими методиками вимірювали до введення сполуки або до введення Інгібуючий вплив на лРЕП Big-ET і в кожному випадку з 5-хвилинними інтердосліджуваних сполук in vitro валами протягом 30хв після введення Big-ET. Максимальне викликане Big-ET підвищення артеріального тиску та максимальне зниження частоти Приклад № IC50 (лРЕП) серцевих скорочень розраховували як різницю 2 21,4 значень, виміряних у момент максимального 3 7,8 впливу Big-ET (звичайно через 5хв) і значень, ви10 25,3 міряних до вливання Big-ET. Крім того, вимірюва16 15,0 ли площу під кривою артеріального тиску внаслі17 24,0 док впливу Big-ET-1 протягом 30хв (ППК=площа 19 9,5 під кривою). Значення ППК подає інформацію про 20 36,3 повний ступінь і тривалість впливу Big-ET або про 23 17,3 його зменшення під дією сполук; тому значення 24 27,0 ППК може - на доповнення до інформації про мак25 3,4 симальний вплив Big-ET - надати додаткову інфо27 26,8 рмацію про вплив сполук, наприклад, у випадку, 28 11,9 коли сполуки, наприклад, не впливають або дуже 31 12,3 мало впливають на максимальний вплив Big-ET, 43 2,9 але значно прискорюють зменшення цього впливу. Виражене у відсотках інгібування максималь56 2,5 ного впливу Big-ET-1 на систолічний артеріальний 59 4,0 тиск (САД) після BB введення досліджуваних спо76 4,0 лук у порівнянні з розчинником представлено в наведеній нижче таблиці 3: 3. In vivo дослідження інгібуючого впливу сполук на утворення ET-1 з Big-ET-1 у щурів 29 85195 30 Impotence (1993). NIH Consensus Conference Таблиця 3 Impotence. JA. M. A. 270: 83]...". Було встановлено що поширеність еректильної дисфункції (=ЕД) всіх In vi vo дослідження гіпотензивних ступенів (мінімальної, помірної та повної імпотенхарактеристик досліджуваних сполук ції) у чоловіків у віці від 40 до 70 років становить 52%, і найчастіше вона проявляється в чоловіків старше 70 років [Melman et al. 1999]. Цей патологіВиражене в % інгібування максимальПриклад чний стан значно негативно впливає на якість житного впливу Big-ET на САД у порівнянні № тя пацієнта і його партнера та часто приводить до з контролем посилення тривоги й напруженості, що приводить 2 -53 до депресії та погіршення самоповаги. У той час як 3 -94 два десятиліття назад ЧЕД вважали переважно 4 -95 психологічним порушенням [Benet et al. 1994], у 8 -113 цей час відомо, що в більшості пацієнтів є в основі 14 - 59 (3мкмоль) органічна причина. Внаслідок цього досягнутий 16 -45 значний прогрес у встановленні механізму норма17 -46 льної ерекції статевого члена й патофізіології ЧЕД. 20 -67 Якщо сполуки подвійної дії, здатні інгібувати 21 -43 НЕП і лРЕП, пропоновані в даному винаході, зок23 -40 рема, сполуки формули І, застосовують для ліку24 -54 вання ЖСД, то краще проводити лікування пору26 -53 шення жіночого статевого збудження (=ПЖПЗ). 29 -49 ЖСД найкраще визначити, як утруднення або нездатність жінки одержати задоволення при сек32 -52 суальному прояві. ЖСД є збірним терміном для 34 -78 позначення декількох різних статевих порушень у 35 -63 жінок [Leiblum, S. R. (1998). Definition and 38 - 48 (3мкмоль) classification of female sexual disorders. Int. J. 44 -75 Impotence Res., 10, S104-S106; Berman, J. R., 59 -98 Berman, L.& Goldstein, I. (1999). Female sexual 67 -109 dysfunction: Incidence, pathophysiology, evaluations 68 -108 and treatment options. Urology, 54, 385-391]. У жінки 75 -52 (3мкмоль) може проявлятися відсутність бажання, утруднен76 -93 ня в збудженні або оргазмі, біль при статевих зносинах або сполучення цих утр уднень. Різні типи Сполуки формули І також мають здатність до захворювань, лікарських засобів, уражень і психодеякої міри інгібувати ЕКФ. Здатність сполук форфізіологічних утруднень можуть привести до промули І інгібувати ЕКФ можна продемонструвати за яву ЖСД. Лікування спрямоване на конкретні типи допомогою стандартних досліджень in vitro. ЖСД, переважно порушення бажання й збудженСполуки формули І є сполуками подвійної дії, ня. Категорії ЖСД найкраще визначити шляхом їх які здатні інгібувати НЕП і лРЕП і також застосовні протиставлення фазам нормальної статевої реакдля профілактики і/або лікування СД. ції: бажанню, порушенню та оргазму [Leiblum, S. R. У клініці СД підрозділяють на жіночу статеву (1998). Definition and classification of female sexual дисфункцію (ЖСД) і чоловічу статеву дисфункцію disorders. Int. J. Impotence Res., 10, S104-S106]. (ЧСД) [див. публікацію Melman, A. & Gingell, J. C. Бажання або лібідо є рушійною силою сексуа(1999). The epidemiology and pathophysiology of льного прояву. Його прояв звичайно включає секerectile dysfunction. J Urology 161: 5-11, на яку нижсуальні думки, що виникають у компанії із цікавим че приводиться посилання у вигляді "Melman et al. партнером або при впливі інших еротичних стиму1999"]. Сполуки подвійної дії, пропоновані в данолів. му винаході, які здатні інгібувати НЕП і лРЕП, зокЗбудження є судинною реакцією на сексуальрема, сполуки формули І, є особливо корисними не стимулювання, важливим компонентом якого є для профілактики і/або лікування ЧСД (наприклад, приплив крові до статевих органів, і включає збічоловічої еректильної дисфункції - ЧЕД). Ін шою льшення кількості змазки піхви, подовження піхви перевагою сполук формули І при цьому показанні й посилення відчуття/чутливості ста тевих органів. є те, що в їх профіль активності входить певне Оргазм є зняттям сексуальної напруги, що доінгібування ЕКФ. сягає кульмінації під час збудження. Отже, ЖСД ЧСД звичайно пов'язана з еректильної дисфувідбувається, коли в жінки спостерігається недонкцією, також відомою під назвою чоловічої ерекстатня або незадовільна реакція на кожній із цих тильної дисфункції (=ЧЕД) [див. публікацію Benet, фаз, звичайно бажання, збудження або оргазму. A. E. et al (1994), Male erectile dysfunction Категорії ЖСД включають гіпоактивне статеве assessment and treatment options. C07Sp. TheY. 20: бажання, порушення статевого збудження, пору669-673, на яку нижче приводиться посилання у шення оргазму та прояв болю при зносинах. вигляді "Benet et al. 1994"]. ЧЕД визначається, як: Хоча сполуки, пропоновані в даному винаході, "... нездатність забезпечення і/або підтримки ерекполіпшують реакцію статевих органів на сексуальції статевого члена для задовільних статеви х зноне стимулювання (як при порушенні статевого син [див. NIH Consensus Development Panel on збудження в жінок), їх застосування також може 31 85195 32 послабити супутній біль, незручності та дискомстатевому розладу в жінок. У цей час немає лікарфорт, пов'язані з статевими зносинами, і тим саських препаратів, затверджених до застосування мим вилікувати інші статеві порушення жінки. Тадля лікування ЖСД. Емпіричне медикаментозне ким чином, один конкретний варіант здійснення лікування включає введення естрогену (місцево даного винаходу стосується застосування сполуки, або у вигляді гормонозамісної терапії), андрогенів пропонованої в даному винаході, для приготуванабо нейролептичних лікарських препаратів, таких ня лікарського препарату, призначеного для лікуяк буспірон або тразодон. Ці режими лікування вання або профілактики гіпоактивного статевого часто виявляються незадовільними внаслідок нибажання, порушення статевого збудження, порузької ефективності або неприйнятних побічних шення оргазму та болю при статевих зносинах, ефектів. Внаслідок виниклого останнім часом інтебільш переважно - для лікування або профілактиресу до фармакологічного лікування ЖСД, терапія ки порушення статевого збудження, порушення включає наступне: фізіологічні рекомендації, заоргазму та болю при статеви х зносинах, і ще стосування безрецептурних засобів, що змащують більш переважно - для лікування або профілактистатеві органи, і дослідження можливих засобів, ки порушення статевого збудження. Гіпоактивне включаючи лікарські препарати, затверджені до статеве бажання проявляється, коли жінка не має застосування для лікування інших патологічних або майже не має бажання бути сексуальною й у станів. Ці лікарські препарати являють собою горнеї відсутні сексуальні думки або фантазії. Цей тип мональні препарати, тестостерон або комбінацію ЖСД може бути обумовлений низькими рівнями естрогену з тестостероном, і судинні препарати, тестостерону внаслідок природної менопаузи або що недавно знайшли застосування, які виявилися оперативної менопаузи. Інші причини включають ефективними при лікуванні ЧЕД. Дотепер не виявпоганий стан здоров'я, прийом лікарських препалено, щоб ці препарати були ефективними при ратів, втому, депресію та тривогу. лікуванні ЖСД. ПЖПЗ характеризується недостатньою реакціУ публікації [The Diagnostic and Statistical єю статеви х органів на сексуальне стимулювання. Manual (DSM) IV Американської психіатричної асоНе відбувається приплив крові до статевих оргаціації ПЖПЗ] визначається, як таке, що являє сонів, що характеризує нормальне статеве збудженбою: "... стійку або повторювану нездатність до ня. Стінки піхви погано змащені, так що статеві завершення статевих зносин забезпечити або підзносини є болісними. Оргазм може бути утр уднетримувати достатнє змащування або набухання у ний. Порушення бажання може бути обумовлено відповідь на сексуальне збудження. Це збудження зниженням вмісту естрогену при менопаузі або повинне викликати помітне пригнічення або утрудпісля пологів і під час годівлі, а також хворобливим нення у взаєминах...". Збудження полягає в пристаном, що включає судинний компонент, як при пливі крові до таза, виділенні змазки та розширендіабеті та атеросклерозі. Інші причини пов'язані з ні піхви й у набуханні зовнішніх статеви х органів. лікуванням діуретиками, антигістамінними препаПорушення приводять до помітного пригнічення ратами, антидепресантами, наприклад, селективабо утруднення у взаєминах. Дослідження статеними інгібіторами повторного всмоктування серової дисфункції подружжя показали, що до 76% тоніну (=СІПС), або гіпотензивними препаратами. жінок скаржаться на статеву дисфункцію й що в Порушення, пов'язані з болями при статевих США 30-50% жінок страждають від ЖСД [Berman, зносинах (включаючи диспареунію та вагінізм), J. R., Berman, L. A., Werbin, T. J. et al. (1999). характеризуються болями при введенні статевого Female sexual dysfunction: Anatomy, ph ysiology, члена та можуть бути викликані лікарськими преevaluation and treatment options, Curr Opin Urology, паратами, які зменшують виділення змазки, ендо9, 563-568]. ПЖПЗ є широко розповсюдженим стаметріозом, запаленням тазових органів, запальтевим порушенням, що проявляється в жінок у ним захворюванням кишечнику або порушеннями пре-, пери- і постменопаузі (гормонозамісна терасечових шляхі в. Встановити поширеність ЖСД пія (ГЗТ)). Вона пов'язана із супутніми порушенняважко, оскільки цей термін включає різні типи поми, такими як депресія, серцево-судинні захворюрушень, частину з яких важко оцінити кількісно, і вання, діабет і захворювання сечостатевої оскільки інтерес до лікування ЖСД виявився відсистеми. Основними наслідками ПЖПЗ є відсутносно недавно. ність припливу крові/набухання, відсутність змаБагато сексуальних утр уднень жінок пов'язані щення й відсутність приємного відчуття в ста тевих безпосередньо зі старінням жінки або із хронічниорганах. Вторинними наслідками ПЖПЗ є зменшеми захворюваннями, такими як діабет і гіпертензія. не статевого бажання, біль при статевих зносинах Оскільки ЖСД складається з декількох підтипів, і утр уднення в досягненні оргазму. Недавно була симптоми яких проявляються на різних фазах циквисловлена гіпотеза про те, що щонайменше в лу сексуальної реакції, для них немає єдиного частини пацієнтів, у яких проявляються симптоми способу лікування. ПЖПЗ, вони пов'язані із судинними порушеннями Сучасне лікування ЖСД в основному спрямо[Goldstein et al., Int. J. Impot. Res., 10, S84-S90, вано на психологічні та пов'язані із взаєминами 1998], і наведені одержані на піддослідних тварин аспекти. Лікування ЖСД поступово розвивається в дані, що підтримують цю точку зору [Park et al., Int. міру того, як для вивчення цієї медичної проблеми J. Impot. Res., 9, 27-37, 1997]. проводяться додаткові клінічні та загальнонаукові Відомо, що інгібітори PCE посилюють стимудослідження. Патофізіологія сексуальних розладів лювання тазових нервів і викликане вазоактивним жінки не є тільки психологічною, особливо для тих, інтестинальним поліпептидом (=ВІП) посилення у кого може бути присутня васкулогенна дисфунккровотоку в піхві та кліторі. Також відомо, що інгібіція (наприклад, ПЖПЗ), що сприяє загальному тори PCE підсилюють опосередковане ВІП і нер 33 85195 34 вами розслаблення ізольованої стінки піхви. Таким цього розслаблення, є NO, що синтезується з Lчином, даний винахід є корисним, оскільки він стоаргініну синтазою оксиду азоту (=NOS) [див. насується засобів відновлення реакції на нормальне приклад, Taub, H. C. et al (1993). Relationship статеве збудження, а саме, посилення припливу between contraction and relaxation in human and крові до статевих органів, що приводить до приrabbit corpus cavernosum. Urology 42: 698-704]. пливу крові до піхви, клітору та статевим губам. Це Передбачається, що зниження тонусу гладких м'яприводить до поліпшення змащування піхви шлязів тіла може сприяти тому, щоб NO викликав розхом транссудації плазми, поліпшення піддатливослаблення печеристого тіла. Під час статевого сті піхви та підвищення чутливості статеви х оргазбудження чоловіка NO виділяється з нейронів і нів. Тому даний винахід є корисним, оскільки ендотелію та зв'язується з розчинною гуанілатцикстосується засобів відновлення або посилення лазою (рГЦ), що знаходиться в гладких м'язах та реакції на нормальне статеве збудження. Під жіендотелії, і активує її, що приводить до підвищенночими статевими органами в даному винаході ня рівнів внутрішньоклітинного гуанозин-3',5'маються на увазі: "Статеві органи, що складаютьмонофосфату (цГМФ). Це підвищення рівнів цГМФ ся із внутрішньої та зовнішньої групи. Внутрішні приводить до розслаблення печеристого тіла внаоргани розташовані в ділянці таза та включають слідок зниження внутрішньоклітинної концентрації яєчники, маткові труби, матку та піхву. Зовнішні кальцію ([Ca2+] і), що протікає за невідомими мехаоргани розташовані зовні від сечостатевої діафранізмами, які приблизно включають активацію прогми та нижче тазового пояса. Вони включають лотеїнкінази G (можливо, внаслідок активації Са2+бок, великі та малі статеві губи, клітор, присінок помп і K+-каналів, активованих Ca2+). піхви, цибулину присінку піхви та великі вестибуНещодавно було показано, що натрієуретичлярні залози присінку піхви" [Gra y's Anatomy, C. D. ний пептид с-типу (=СНП) також може відігравати Clemente, 13th American Edition]. У публікації R. J. роль у ЧЕД, впливаючи на пов'язану з мембраною Levin зазначено, що, оскільки "... чоловічі та жіночі гуанілiлциклазу В (=ГЦ-В), яка експресується в статеві органи ембріонально розвиваються із затканині печеристого тіла чоловіка. Стимулювання гального тканинного зачатка, то структури чоловіГЦ-В приводить до підвищення вмісту внутрішньочих і жіночих статевих органів гомологічні одні відклітинного цГМФ і, внаслідок цього, до розслабносно одних. Так, клітор є гомологом пеніса та лення гладких м'язів. Інгібітори PDE5, наприклад, статеві губи гомологічні мошонковій сумці...." силденафіл, збільшують концентрацію внутріш[Levin, R. J. (1991), Exp. Clin. Efzdocrinol., 98, 6169]. ньоклітинного цГМФ у тканині печеристого тіла Стосовно ЧСД, зокрема, ЧЕД, ерекція пеніса є шляхом інгібування його розкладання. Інгібітори гемодинамічним проявом, що залежить від баланPDE5 неактивні за відсутності стимулятора утвосу скорочення та розслаблення гладких м'язів перення цГМФ, наприклад, за відсутності NO. Цей черистого тіла та м'язів пеніса [див. Lerner, S. E. et факт показує, що базова (при відсутності стимуляal (1993). A review of erectile dysfunction: new ції) швидкість утворення цГМФ у печеристому тілі insights and more questions. J. Urology 149: 1246є досить низькою, так що інгібування розкладання 1255]. Гладкі м'язи печеристого тіла в даному вицГМФ за допомогою інгібіторів PDE5 не є достатнаході називаються гладкими м'язами тіла або, у нім для еректильної реакції без одночасної стимумножині, печеристим тілом. Розслаблення гладких ляції гуанілілциклази. Підвищення концентрації м'язів печеристого тіла приводить до посилення СНП приводить до підвищення концентрації внуткровотоку в трабекулярні порожнини печеристого рішньоклітинного цГМФ шляхом посилення виробтіла, що приводить до його розширення щодо налення цГМФ. Тому підвищення концентрації СНП у вколишньої оболонки та стискуванню вен, через печеристому тілі, ймовірно, здійснює вплив, анаякі відбувається відтік крові. Це приводить до логічний інгібуванню PDE5. Внаслідок різних мехашвидкого підвищення артеріального тиску в печенізмів дії, тобто посилення вироблення цГМФ одристому тілі, що викликає ерекцію [див. публікацію ним і інгібування його руйнування іншим, Naylor, A. M. (1998). Endogenous neurotransmitters застосування інгібування PDE5 або розкладання mediating penile erection. Br.J.Urology 81: 424-431, СНП відповідно, ймовірно, є адитивними способана яку нижче приводиться посилання у вигляді ми й тому розумно припустити, що комбінація цих "Naylor, 1998"]. Зміни, що відбуваються під час двох механізмів дії буде особливо ефективною ерекції, є складними та вимагають ефективного для пацієнтів, на яких не впливає введення тільки координованого керування за участю периферичінгібіторів PDE5. ної та центральної нервової системи та ендокринУ трабекулярній комірковій структурі печерисної системи [Naylor, 1998]. Скорочення гладких того тіла виявлені нервові волокна з позитивною м'язів тіла модулюється симпатичною норадренереакцією на ВІП, що свідчить про участь виділення ргічною іннервацією шляхом активації постсинапВІП в ерекції пеніса. Вплив ВІП приблизно опосередкується збільшенням концентрації сАМР і це тичних a-адренорецепторів. ЧЕД може бути пов'язана з підвищенням тонусу ендогенних гладких комплементарно впливу агентів, які збільшують концентрацію цГМФ. Виявлено, що в пацієнтів, які м'язів печеристого тіла. Однак розслаблення гладстраждають ЕД, ін'єкції ВІП у печеристе тіло (раких м'язів печеристого тіла частково опосередкується неадренергічною нехолінергічною (=HAHX) зом з антагоністом a-адренорецептора фентоланейротрансмісією. У пенісі виявляється цілий ряд міном) є безпечним і ефективним лікуванням з інших нейротрансміттерів, крім оксиду азоту ефективністю, що дорівнює 67% (прояв ерекції, (=NO), такі як пептид, пов'язаний з геном кальцидостатньої для статевих зносин). тоніну (=ПСГК) і ВІП. Основним розслаблюючим Обидві ендопептидази НЕПИ та лРЕП руйнуфактором, відповідальним за опосередкування ють СНП і ВІП і тим самим обмежують вплив СНП і 35 85195 36 ВІП на гладкі м'язи печеристого тіла. Інгібування 80мкл Буфера для дослідження, 10мкл роборуйнування СНП і ВІП приведе до збільшення дочого розчину ферменту (НЕП або лРЕП) і 10мкл ступності цих судинорозслаблюючих факторів і вихідного розчину пептиду (ВІП або СНП) змішутим самим до збільшення кровотоку в печеристе вали в посудині Еппендорфа та інкубували протятіло, що в остаточному підсумку приведе до погом 120хв при 37°С. Потім ферментативну реакцію ліпшення ерекції. Свідчення на користь цього мозупиняли шляхом нагрівання при 95°С протягом жна одержати на підставі експериментальних да5хв. Після центрифугування (Heraeus Biofuge B, них для кроликів, які вказують на значне 3хв) надосадову рідину досліджували за допомопідвищення артеріального тиску у печеристому тілі гою ВЕРХ. та посилення кровотоку в статевих органах самок Методика дослідження інгібування після введення інгібітору НЕП [див. документ WO 70мкл Буфера для дослідження, 10мкл робо02/079143]. Крім того, при дослідженні нейрогенної чого розчину ферменту (НЕП або лРЕП) і 10мкл еректильної дисфункції на піддослідних щурах для вихідного розчину пептиду (ВІП або СНП) змішугена (SMR1), що кодує пропептид ендогенного вали в посудині Еппендорфа та попередньо інкуінгібітору НЕП сіалорфіну [див. User Н.М., Zelner бували при 37°С протягом 15хв. Потім додавали D.J., McKenna K.E., McVary K.T. (2003). Microarray 10мкл вихідного розчину пептиду (ВІП або СНП) і analysis and description of SMRl gene in rat penis in реакційну суміш інкубували при 37°С протягом a post-radical prostatectomy model of erectile 60хв для здійснення ферментативного гідролізу. dysfunction. J Urol.;170(1):298-301] виявлена негаПотім ферментативну реакцію зупиняли шляхом тивна регуляція (>80-кратної), що свідчить про те, нагрівання при 95°C протягом 5хв. Після центрищо при цьому захворюванні активність НЕП можна фугування (Heraeus Biofuge B, 3хв) надосадову підвищити та сприяти розвитку еректильної дисрідину досліджували за допомогою ВЕРХ. функції. Для відділення субстрату, що залишився, від Опис методики фармакологічного дослідження продуктів розкладання використовували методику Зазначені номери прикладів є номерами приВЕРХ з оберненою фазою із застосуванням колонкладів синтезу, описаних нижче. ки CC 125/4 Nucleosil 300/5 C18 RP і форколонки Інгібування ферментативного розкладання CC 8/4 Nucleosil 100/5 C18 (Macherey-Nagel, Diiren, СНП і ВІП сполуками, що застосовуються згідно із Germany). 60мкл Зразків реакційної суміші інжекданим винаходу, досліджують за допомогою фертували в прилад для ВЕРХ і колонку елююювали ментативного аналізу in vitro, що проводиться за при швидкості потоку, який дорівнює 1мл/хв, у занаступною методикою: значеному нижче градієнтному режимі: Ферменти: а) лРЕП (sol hu)(his)6; або: Мічений Розчин А: 100% H2O+0,5М H3PO4 рН 2,0 за His6 ектодомен лРЕП. Розчин В: 100% ацетонітрил+0,5M H3PO4 Вихідний розчин: 53мкг/мл в 20мМ HEPES рН 0-2хв: 5% В 8-10хв: 90% В 7,2, 5% гліцерину, 0,005% Tween20, 100мМ NaCl, 2-7хв: 5-50% В 10-12хв: 90-5% В чистота >99%. 7-8хв: 50-90% В Робочий розчин: вихідний розчин, розведений Всі пептиди детектували за поглинанням при буфером для дослідження до 5мкг/мл. довжині хвилі, що дорівнює 214нМ (УФПостачальник: Innogenetics, Ghent, Belgium. Спектроскопія). Одержання та очищення білка проведено за метоВиражену у відсотках (=%) ступінь гідролізу дикою, описаною в [WO 02/094176]. розраховували за площами піків пептиду, що не b) НЕП (одержаний з кори надниркових залоз розклався, в зразку Y, який містить фермент, при свині). зіставленні з даними для зразка, що містить пепВихідний розчин: 120мкг/мл в 20мМ bisTris, читид у такій же концентрації, але без ферменту (хостота >95% лостий зразок) за наступним рівнянням: Робочий розчин: вихідний розчин, розведений Гідроліз, %=100*(холостий зразок-Y). буфером для дослідження до 5мкг/мл. Основою для розрахунку інгібування у відсотПостачальник: Dr. Philippe Crine, Univ. of ках є площа піка пептиду, що не розклався (ВІП Montreal, Canada. або СНП) зразка X, який містить інгібітор, при зіСубстрати: ставленні з даними для зразка, який містить тільки a) ВІП пептид (холостий зразок) або пептид і фермент b) СНП (32-53) без інгібітору (контрольний зразок) за наступним Вихідний розчин: 100мкм у буфері для дослірівнянням: дження. Інгібування, %=100*(Х-контроль)/(холостий Постачальник: Bachem, Weil am Rhein, зразок-контроль). Germany. Всі зразки досліджували двічі та використовуБуфер для дослідження: 100мМ Tris рН 7,0, вали середні значення. У кожному експерименті як 250мМ NaCl. контроль досліджували розчинник (0,1% ДМСО). Всі досліджувані сполуки розчиняли в ДМСО в СНП і ВІП розкладали за допомогою НЕП та концентрації 10мМ і додатково розводили буфелРЕП in vitro. Розкладання обох пептидів при виром для дослідження. користанні лРЕП відбувалося швидше, ніж при Методика дослідження активності використанні НЕП, як це показано в наведеній нижче таблиці 4: 37 85195 38 тої кишки та запальні захворювання кишечнику, Таблиця 4 хвороба Крона та виразковий коліт, захворювання черевної порожнини, гастрит, що викликаний Швидкості розкладання Helicobacter pylori і інші інфекційні гастрити, некроВІП і СНП за допомогою НЕП або лРЕП тизуючий ентероколіт, псевдомембранозний ентероколіт, ентероколіт, що викликаний опроміненням, лімфоцитарний гастрит, реакція Розкладання СНП Розкладання ВІП "трансплантант проти хазяїна", гострий та хронічлРЕП НЕП лРЕП НЕП ний панкреатит; захворювання печінки, такі як, Розкладання наприклад, алкогольний гепатит, вірусний гепатит, 39% 36% 28% до моменту 46% метаболічний гепатит, аутоімунний гепатит, гепачасу t=2год тит, що викликаний опроміненням, цироз печінки, гемолітико-уремічний синдром, гломерулонефрит, Досліджувані сполуки, пропоновані в даному вовчаковий нефрит, вірусні захворювання, такі як винаході, мали здатність запобігати розкладання фульмінантний гепатит; захворювання суглобів, СНП і ВІП при впливі і НЕП, і PCE. У цій моделі такі як травма та остеоартрит; імунодепресія або дослідження досліджувані сполуки формули І, пеімунодефіцит, зокрема, аутоімунні захворювання, рераховані нижче в таблиці 5, мали наведене нитакі як ідіопатична запальна міопатія, хронічна жче значення IC50: нейтропенія, тромбоцитопенічна тромбогемолітична пурпура, ревматоїдний артрит, ідіопатична Таблиця 5 тромбоцитопенічна пурпура, аутоімунні гемолітичні синдроми, синдроми антифосфоліпідних антиЗапобігання розкладання тіл, міокардит, розсіяний склероз і його діагностиСНП та ВІП досліджуваними сполуками чний підклас рецидивний-ремісивний розсіяний склероз, вторинний прогресуючий розсіяний склеІнгібування Розкладання СНП Розкладання ВІП роз, первинний прогресуючий розсіяний склероз, розкладання лРЕП НЕП лРЕП НЕП прогресуючий рецидивний розсіяний склероз, госсполукою трий розсіяний склероз, доброякісний прогресуюприкладу № IC50 (н М) IC50 (н М) IC50(H M) IC50(H M) чий розсіяний склероз або безсимптомний розсія4 1,0 10,1 3,1 3,1 ний склероз, зоровий мієлоневрит (синдром Девіка), лімфоцитарний гіпофізит, хвороба ГрейвСполуки формули І також застосовні для проса, хвороба Аддисона, гіпопаратиреоз, діабет типу філактики і/або лікування патологічних станів, по1, системний червоний вовчак, звичайна пухирчатв'язаних з апоптозом. ка, бульозний пемфігоїд, псоріатичний артрит, Такими патологічними станами є, наприклад: ендометріоз, аутоімунний орхіт, а утоімунна ерекнейродегенеративні захворювання, такі як, напритильна дисфункція, саркоїдоз, гранулематоз Вегеклад, ішемічний удар, ішемія головного мозку, транера, аутоімунна туговухість, хвороба С'єргена, вматичне ушкодження головного мозку, гострий аутоімунний увеоретиніт, інтерстиціальний цістит, розсіяний енцефаломієліт, бічний аміотрофічний синдром Гудпасчера та фіброміалгія; мієлодиспсклероз (БАС), пігментна дегенерація сітківки, лазії, такі як апластична анемія; дерматологічні слабке порушення пізнавальної здатності, хвороба захворювання, включаючи звичайну пухирчатку, Альцгеймера, хвороба Піка, старече слабоумство, дерматоміозит, атопічний дерматит, пурпура Шенпрогресуючий супрануклеарний параліч, різні типи лейн-Геноха, акне, системний склероз, себорейпідкіркового слабоумства, хвороба Вільсона, баганий кератоз, шкірний мастоцитоз, хронічний проторазовий інфаркт, артеріосклеротичне слабоумсліферативний дерматит, дискератоз, тво, слабоумство, що пов'язане зі СНІД, мозочкова склеродермія, інтерстиціальний гранулематозний дегенерація, синдроми спинномозочкової дегенедерматит, псоріаз, бактеріальні інфекції шкіри, рації, атаксія Фридрейха, атаксія-телеангіектазія, дерматомікози, проказа, шкірний лейшманіоз, віушкодження головного мозку, що пов'язане з епітиліго, токсичний епідермальний некроліз, синдлепсією, ушкодження спинного мозку, синдром ром Стивенса-Джонсона, аденома сальних залоз, втомлених ніг, хвороба Гентингтона та хвороба алопеція, фотоушкодження шкіри, склеротичний Паркінсона, смугаста чорна дегенерація, васкуліт лишай, гострі рани шкіри, нетримання пігменту, головного мозку, різні типи мітохондріальної ентеплове ураження шкіри, екзантематозне пустуцефаломіопатії, неврональний цероїдльозне висипання, папульозний дерматоз, шкірний ліпофусціноз, атрофії м'язів хребта, лізосомні хвоалергійний васкуліт, цитотоксичний дерматит; зароби накопичення за участю центральної нервової хворювання внутрішнього вуха, такі як наприклад, системи, лейкодистрофії, порушення циклу утвообумовлена акустичною травмою загибель волосрення сечовини, різні типи печінкової енцефалокових сенсорних клітин і туговухість, обумовлена патії, різні типи ниркової енцефалопатії, різні типи аміноглікозидом загибель волоскових сенсорних метаболічної енцефалопатії, порфірія, бактеріальклітин і туговухість, обумовлена ототоксичним ліний або вірусний менінгіт і менінгоенцефаліт, прікарським препаратом туговухість, перилімфатична онні захворювання, отруєння нейротоксичними фістула, холестеатома, равликова або вестибулясполуками, синдром Гійєна-Барре, різні типи хрорна ішемія, хвороба Меньєра, туговухість, що винічної запальної невропатії, поліміозит, дерматокликана опроміненням, туговухість, що викликана міозит, ушкодження головного мозку, що викликабактеріальною або вірусною інфекцією, і ідіопатине опроміненням; шлунково-кишкові чна туго вухість; трансплантація: реакція "трансзахворювання, такі як синдром подразненої товс 39 85195 40 плантант проти хазяїна", гостре та хронічне відтоМорфометричний аналіз гіпокампа. Ушкоргнення трансплантатів нирки, шкіри, роговиці, дження підділянки CA3 гіпокампа визначали стекісткового мозку або печінки; загоєння рани та ререологічно на 5 різних рострокаудальних рівнях акція відторгнення тканини. від 10,21 до 11,21мм [Swanson, L. W. (1992) Brain Застосовність амідометилзаміщених похідних Maps: Structure of the Rat Brain, Elsevier, 1-(карбоксіалкіл)Amsterdam] та за її медіолатеральною віссю через циклопентилкарбоніламінобензазепін-N-оцтової 3 дні після травматичного ушкодження. Для кількікислоти формули І для профілактики та лікування сної оцінки втрати нейронів у гіпокампі за методизазначених патологічних станів, пов'язаних з апопкою стереологічного розсічення [Cruz-Orive, L. M. & тозом, можна продемонструвати на моделях з Weibel, E. R. (1990) Am. J. Physiol. 258, L148-L156] використанням піддослідних тварин, що прогнозуоцінювали чисельну густину (Nv) пірамідальних ють антиапоптозну активність. нейронів. Для відбору зразків використовували Опис методик фармакологічних досліджень незміщену рамку підрахунку (0,05мм´0,05мм; виЗазначені номери прикладів є номерами присота розрізу 0,01мм) та світлосильний об'єктив кладів синтезу, описаних нижче. (´40). Нормальні нейрони ідентифікувалися за 1. Травматичне ушкодження головного мозку: наявністю типових ядер з прозорою нуклеоплазЗатримана апопотична загибель нейронів мою і чіткими ядерцями, оточеними цитоплазмою, Пристрій для виконання контузії. Пристрій для що містить речовину Ніссля. Вважали, що границя виконання контузії складається із трубки довжиміж підділянками СА2 і СА3 розташовувалася в ною 40см, перфорованої з інтервалами в 1см для точці, у якій нещільне розташування більших піравиключення стискування повітря в трубці. Доросмідальних клітин переходило в щільноупаковані лих щурів Wistar, 230-270г, анестезували хлоралпірамідальні клітини підділянки СА3. Місцем з'єдгідратом, 400мг/кг ПР (парентерально), проводили нання підділянок СА2 і СА3 вважали довільну літрепанацію черепа через праву півкулю, пристрій, нію, що з'єдн ує бічні краї шарів пилчастих гепарищо направляє падаючий вантаж на опору, розтаноцитів. шовану на поверхні мозкової оболонки, розташоУ моделі дослідження досліджувана сполука вували перпендикулярно поверхні черепа й для прикладу 3 виявила залежний від дози нейрозахипроведення контузії мозку використовували силу в сний ефект. Нейрозахисний ефект виявлявся при 380г.см, створювану вантажем масою 20г. ДопусВЦВ введенні досліджуваної сполуки прикладу 3 калося поглиблення в поверхні мозку, що дорівнюнавіть через 8год після травми. вало 2,5мм, щоб уникнути механічного ушкодженВизначали залежність від дози для нейрозахиня мозкової оболонки. Центр опори сного ефекту досліджуваної сполуки прикладу 3 стереотаксично розташовувався на 1,5мм назад і при ВЦВ введенні через 15хв після травми доросна 2,5мм убік від брегми. Через 3 дні після ушколих щурів Wistar. Густини нейронів в підділянці дження мозку щурів піддавали перфузійній фіксаСА3 гіпокампа визначали відповідно до опису в ції розчином, який містить 4% параформальдегіду методиці. Вимірювали густини нейронів у фосфатному буфері. СА3±стандартна похибка вимірювання (=СПВ) для Внутрішньоцеребровентрикулярні ін'єкції: 6 рівнів стереотаксичності в лівій нетравмованій Сполуки вводили внутрішньоцеребровентрикулярчастині підданих впливу розчинника щурів і в трано (=ВЦВ) за допомогою шприца Гамільтона в ківмованій правій частині підданих впливу розчинлькості 5-15мкл. Ін'єкції проводили через 5хв, 15хв ника щурів і щурів, який лікували досліджуваною - 8год після травми при наступних стереотаксичсполукою прикладу 3 і результати наведені нижче них координатах: AP=-0,5мм, L=-2мм та V=-5,5 в таблиці 6. відносно брегми [Swanson, L. W. (1992) Brain У всіх представлені нижче таблицях числа Maps: Structure of the Rat Brain, Elsevier, ("n") означають кількості щурів у гр упі, якщо це Amsterdam]. застосовно. Таблиця 6 Густини нейронів у гіпокампі СА3, клітин´103/мм 3 Ступінь стереотак- Розчинник, ліва Розчинник, права Сполуки при- Сполуки прикла- Сполуки прикладу 3, 10мкг; ду 3, 30мкг сичності частина; (n=10) частина; (n=10) кладу 3, 3мкг; (n=10) (n=10) (n=10) 10,21 159,00±3,62 91,20±7,60 98,40±4,39 108,60±4,30 108,40±3,15 10,41 158,20±3,03 87,20±8,17 89,00±5,05 108,60±5,34 105,20±5,76 10,61 157,20±2,88 66,80±7,68 72,80±6,01 111,40±7,09 94,20±5,10 10,81 159,60±2,99 56,80±5,96 84,20±6,47 112,00±6,42 83,20±7,10 11,01 152,40±2,99 51,40±6,89 86,00±7,44 111,40±7,11 80,20±7,45 11,21 151,60±2,47 71,60±8,22 95,40±6,96 119,20±3,70 90,00±9,24 Ін'єкція розчинника приводила до зниження густини нейронів у підділянці CA3 гіпокампа, що досягає 35% від контрольних значень, а ін'єкція 3, 10 або 30мкг досліджуваної сполуки прикладу 3 част ково запобігала втраті нейронів у гіпокампі, причому доза, що становила 10мкг, була найбільш ефективною. Дисперсійний аналіз ("ANOVA") показав, що значний захисний ефект лікування втрати ней 41 85195 42 ронів у підділянці CA3 гіпокампа проявлявся при введенні через 2, 4 або 8год після травми доросвсіх використаних дозах досліджуваної сполуки лим щурам Wistar. Густини нейронів у підділянці прикладу 3 (Р