Спосіб одержання a-галактозидази

Спосіб одержання а — галактозидези шляхом культивування мікроорганізму, що продукує Винахід відноситься до мікробіологічної промисловості, а саме до способів одержання ферменту а-галактозид аз и Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб одержання а-галактозид аз и з використанням в якості продуцента ферменту мікром і цета Cladosponum cladosponoldes, який культивують на живильному середовищі, що містить як джерело індукторів біосинтезу агалактозидази соєву муку в КІЛЬКОСТІ 20 - 40г/л [Патент 10512 А Україна Спосіб одержання агалактозидази МПК6 С 12 N 9/00 Надр 25 12 96 Бюл № 4] Загальною суттєвою ознакою цього способу і способу, що заявляється, є використання, як індукторів біосинтезу а-галактозид аз и соєвих галактоол і госаха р и д і в Але галактоолігосахариди соєвого борошна у порівнянні з галактоолігосахаридами, які використовуються за способом, що заявляється, є більш слабими індукторами біосинтезу а-галактозидази, крім того, Cladosponum cladosponoldes є менш активним продуцентом ферменту, ніж бактерії, які використовуються за способом, що заявляється Тому а-галактозидаза, що отримується за способом-прототипом, має нищу активність порівняно з а-галактозидазою, яка одержується за способом, що заявляється В основу винаходу, що заявляється, поставлено задачу у способі одержання агалактозидази шляхом використання більш активних продуцента ферменту та індукторів його біосинтезу отримати фермент з підвищеною ак фермент, на живильному середовищі, що містить індуктори біосинтезу а - галактозидази - галактоолігосахариди, який відрізняється тим, що як мікроорганізм-продуцент використовують Bifidobactenum longum, який культивують на середовищі MRS, а як джерело галактоолігосахаридів ферментоване дріжджами Saccharomyces cerevisiae соєве молоко, яке додають в КІЛЬКОСТІ 5 % від об'єму живильного середовища тивністю Додатковий технічний результат полягає в скороченні технологічного циклу одержання ферменту Поставлена задача вирішується в способі одержання а-галактозидази шляхом культивування бактерій Bifidobactenum longum протягом 24 годин при температурі 38°С на середовищі MRS, до якого додають у КІЛЬКОСТІ 5% від об'єму живильного середовища ферментоване дріжджами Saccharomyces cerevisiae соєве молоко, з наступними центрифугуванням живильного середовища, яке містить бактерії, при 6000 об/хв протягом ЗО хвилин, суспендуванням бактеріальних клітин у нитратному буфері з рН 5,8, дезінтеграцією бактеріальних клітин при 9Гц протягом 10 хвилин, розфасовуванням одержаного ферментного препарату та його висушуванням Середовище MRS містить наступні компоненти (г/л) м'ясний екстракт 10, пептон - 10, дріжджовий екстракт - 5, а-глюкозу - 20, ацетат натрію - 5, цитрат амонію - 2, двузамінний фосфат калію - 2, сульфат магнію - 0,2, сульфат марганцю - 0,05, агар -12 Ферментоване соєве молоко використовують як джерело індукторів біосинтезу а-галактозидази - модифікованих галактоолігосахаридів Його одержують шляхом розведення водою сухого соєвого молока у співвідношенні 1 10, внесення до соєвого молока дріжджів Saccharomyces cerevisiae у КІЛЬКОСТІ 5 х 106 КУО/мл, культивації протягом 10 годин при температурі 37°С з наступним центрифугуванням при 6000об/хв протягом 40 ю C O Ю 54315 хвилин та стерилізацією фільтрату при 98°С протягом ЗО - 40 хвилин Одержаний препарат містить 0,4 - 0,5% модифікованих олигосахаридів мелібюзи, галактобюзи, маннинотрюзи Суттєвими ознаками способу, що заявляється, є використання як продуцента ферменту Bifidobacterium longum та ферментованого дріжджами Saccharomyces cerevisiae соєвого молока як джерела індукторів біосинтезу а-галактозид аз и Причинно-наслідковий зв'язок між цими ознаками та технічним результатом, що досягається, обумовлений наступним Бактерії роду Bifidobacterium - ПОСТІЙНІ представники кишкової мікрофлори організму людини Вони є одними з основних пробютичних культур, які використовуються в препаратах та продуктах функціонального призначення Експериментальні дослідження свідчать проте, що ці бактерії здатні продукувати фермент галактозидазу [Roy D, Blanchette L, Savoie L and Ward P a- at pGalactosidase properties of Bifidobacterium mfantis // Milk wissenschft -1992 -Vol 47 -P 18-21, Mansa S Garro, Graciela S de Gion, Graciela F de Valdez and G Oliver a-D-Galactosidase from Bifidobacterium longum // Letters in Appl Microbiol - 1994Vol 19-16-19] Галактозидаза є індуцибельним ферментом, синтез якого здійснюється мікроорганізмами при наявності в поживному середовищі ВІДПОВІДНОГО субстрату, а саме - галактоолігосахаридів Інтенсивність гідролітичних процесів розчеплення галактоолігосахаридів а-галактозидазами обумовлена природою субстрат) Галактоолігосахариди збудовані з залишків галактози На редукуючому КІНЦІ їх молекул знаходиться фруктоза, яка лімітує глибину та швидкість розчеплення галактоолігосахаридів а-галактозидазами, які не здатні розчеплювати а-(1,2)-глікозидний зв'язок між галактозою і фруктозою Соєве борошно містить 4,5%, а сухе соєве молоко 8,5% галактоолігосахаридів [Силенко Г П , Капрельянц Л В , Ахметов А С , Павленкова П П , Шерстобитов В В Лечебные и питательные свойства соевых продуктов -Москва СигналЪ, 2000 -С 28] При ферментації соевого молока дріжджами відбувається гідроліз а-(1,2)глікозидного зв'язку між галактозою і фруктозою фруктофуранозидазою (інвертазою), яка міститься в дріжджах Внаслідок цього такі галактоолігосахариди як рафіноза, стахюза та ІНШІ перетворюються на мелібюзу, галактобюзу, маннинотрюзу та ІНШІ галактоолігосахариди, які побудовані тільки з залишків a-D-галактопіраноз, що зв'язані а-(1,6)-глікозидними зв'язками, доступними для а-галактозид аз и Це підтверджує експеримент, в якому агалактозидазу одержували шляхом культивування Bifidobacterium longum на середовищі MRS без додавання до живильного середовища індукторів біосинтезу ферменту (варіант 1), з використанням як джерела індукторів соєвого борошна, яке додавали в КІЛЬКОСТІ 10% від маси живильного середовища (варіант 2), з використанням як джерела індукторів соєвого молока, яке додавали в КІЛЬКОСТІ 5% від маси живильного середовища (варіант 3), з використанням як джерела індукторів ферментованого дріжджами соєвого молока, яке додавали в КІЛЬКОСТІ 5% від маси живильного середовища (варіант 4) В експерименті був використаний штам Bifidobacterium longum ЛМ-6 з колекції мікроорганізмів кафедри біохімії та мікробіологи Одеської державної академії харчових технологій Культивування В longum проводили у пробірках, що містили бмл живильного середовища, протягом 24 годин при температурі 38°С До кожної пробірки вносили культуру В longum, яка міс8 тила 7,2 х 10 колонійутворюючих одиниць (КУО), в КІЛЬКОСТІ 3% від об'єму середовища Одержану біомасу центрифугували при 6000об/хв протягом ЗО хвилин, суспендували бактеріальні клітини у цитратному буфері з рН 5,8 та проводили дезінтеграцію бактеріальних клітин при 9Гц протягом 10 хвилин Супернатант досліджувався на присутність а-галактозидазної активності Активність a-D-галактозид аз И визначали за методом, який передбачає визначення адсорбції п-нітрофенолу, який утворюється в наслідок дії ферменту на п-нітрофенил-а-О-галактопіранозид За одиницю активності ферменту приймали КІЛЬКІСТЬ ферменту, яка утворює за і хвилину 1,0ммоль п-нітрофенолу з п-нітрофенил-a-Dгалактопіранозиду [Mulimam V Н, Ramalmgam Enzymic hydrolysis of raffmose and stachyose present soymilk by crude a-galactosidase from GibbereMa fujikuroi // Biochem Мої Biol Int- 1995Vol 36 -P 897-905] Отримані результати (фіг 1) свідчать, що при додаванні до живильного середовища MRS ферментованого дріжджами соєвого молока (варіант 4) активність а-галактозидази, що синтезується бактеріями, найвища порівняно з іншими варіантами та прототипом Було встановлено також, що максимальна активність ферменту - 9,2од/мл, досягається при додаванні до живильного середовища ферментованого дріжджами соєвого молока в КІЛЬКОСТІ 5% від об'єму середовища Подальше збільшення його КІЛЬКОСТІ не приводить до підвищення активності ферменту (фіг 2) Перелік фігур фігура 1 Діаграма "Вплив джерела індукторів біосинтезу альфа-галактозидази, що використовується, на активність ферменту" Фігура 2 Діаграма "Вплив вмісту ферментованого соєвого молока в живильному середовищі на активність альфа-галактозидази" Спосіб, що заявляється здійснюється наступним чином Приклад 1 6кг сухого соєвого молока розчиняють у 60л води Додають дріжджі Saccharomyces cerevisiae у КІЛЬКОСТІ 5 х 106 КУО/мл та культивують протягом 10 годин при температурі 37°С з наступним центрифугуванням при 6000об/хв протягом 40 хвилин та стерилізацією фільтрату при 98°С протягом ЗО - 40 хвилин До ферментеру обсягом 2м 3 додають 60л ферментованого соєвого молока (5% від загального обсягу живильного середовища), 1140л середовища MRS та 36л заквасочної культури, яка містить 7,2 х 108 КУО Bifidobacterium longum Проводять ферментацію протягом 24 годин при 54315 температурі 38°С Одержану біомасу центрифугують при 6000об/хв протягом ЗО хвилин, суспендують бактеріальні клітини у цитратному буфері з рН 5,8 та проводять дезінтеграцію бактеріальних клітин при 9Гц протягом 10 хвилин Супернатант розфасовують та висушують Активність одержаного ферменту становить 9,2од/мл Приклад 2 здійснюють аналогічно прикладу 1, при цьому ферментоване соєве молоко додають до живильного середовища в КІЛЬКОСТІ 3 6 Л (3% від загального обсягу живильного середовища) Активність одержаного ферменту становить 8,7од/мл Приклад 3 здійснюють аналогічно прикладу 1, при цьому ферментоване соєве молоко додають до живильного середовища в КІЛЬКОСТІ 7 2 Л (6% від загального обсягу живильного середовища) Активність одержаного ферменту становить 9,2од/мл Наведені приклади свідчать про те, що використання ферментованого соєвого молока, в КІ ЛЬКОСТІ менший, ніж така, що заявляється, приводить до зниження активності ферменту При використанні більшої КІЛЬКОСТІ ферментованого соєвого молока відбувається зайва витрата джерела індукторів біосинтезу ферменту, оскільки підвищення активності а-галактозидази, що одержують, не відбувається Активність а-галактозидази, отриманої за способом, що заявляється становить 9,2од/мл, що в 1,8 разів більше, ніж активність агалактозидази, отриманої за способомпрототипом, яка становить 5,2од/мл при визначенні активності з використанням п-нітрофенилa-D-галактопіранозиду Загальна тривалість технологічного процесу за способом, що заявляється, складає 24 години, в той час, як за способом-прототипом - 144 години Отже процес одержання ферменту скорочується в 6 разів Рисунок 1. Вплив джерела індукторів біосинтезу альфа-галактозидази, що використовується, на активність ферменту 10 Прототип Вариант 1 Вариант 2 Вариант 3 Вариант 4 Фіг. 1 54315 9,5 9,2 9 8,5 8 7 8.8 9,2 HS*f 8,3 8,5 8 I ф s о. 7,5 ф -8 7 6,5 6 5,5 5 0 1 2 3 4 5 8 Вміст ферментованого соєвого молока, % Фіг. 2 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044) 236 - 47 - 24