Спосіб біотестування хімічних сполук

1. Способ биотестирования химических соединений, включающий изолирование фрагмента тонкой кишки экспериментального животного, воздействие на объект тестирующего раствора и оценки характера его действия, отличающийся тем, что изолирование фрагмента осуществляют на анестезированном животном выполнением двух кишечных надрезов, ограничивающих длину фрагмента, фиксации в них катетеров: проксимального - для перфузирования кишки тестируемым раствором, дистального - для сбора оттекающего кишечного химуса; спустя 1-3 часа перфузирования производят забор крови любым известным способом, затем определяют в химусе: 28391 пример, для оценки токсичности соединений по биофизическим параметрам, и требует дополнительного более детального анализа метаболических показателей, характеризующих процессы чрезэпителиального транспорта химических соединений. Кроме того, очень существенным недостатком указанного способа является его нефизиологичность, отсутствие крово- и лимфотока на пути транспортируемых веществ и возникновение дополнительных барьеров, которые могут существенно искажать параметры транспорта ионов через кишечный эпителий. Задача способа биотестирования химических соединений состоит в определении характера метаболического воздействия химического соединения на функциональное состояние кишечника: токсичности и/или биологической активности исследуемого химического соединения, которое оценивается по прижизненному изменению показателей чрезмембранного кишечного транспорта, в результате чего становится возможной количественная оценка воздействия тестируемого соединения, повышается точность способа. Поставленная задача решается тем, что в способе биотестирования химических соединений, включающем изолирование фрагмента тонкой кишки экспериментального животного, воздействие на объект тестирующего раствора и оценку характера его действия, изолирование фрагмента осуществляют на анестезированном животном выполнением двух кишечных надрезов, ограничивающих длину фрагмента, фиксации в них катетеров: проксимального для перфузирования кишки тестируемым раствором, дистального - для сбора оттекающего кишечного химуса: спустя 1-3 часа перфузирования производят забор крови любым известным способом, затем определяют в химусе: содержание эндогенного креатинина, натрия и калия, в плазме крови - концентрацию креатинина, после чего рассчитывают величину кишечного клиренса креатинина, а затем определяют отношение содержания натрия и/или калия в химусе к величине кишечного клиренса, причем при достоверном снижении отношения, в сравнении с контролем, тестируемое соединение считают токсичным. В способе биотестирования химических соединений, по предлагаемому способу, величину кишечного клиренса креатинина определяют по формуле: Clcr=Ccrхим´Vхим/Pcr, где Clcr - кишечный клиренс креатинина, мл: Ссrхим - концентрация креатинина в химусе, мкмоль/л: Pсr - концентрация креатинина в плазме крови, мкмоль/л; Vхим - объем химуса, мл. Способ реализуется следующим образом. Операцию проводят на фоне анестезии (при нембуталовой анестезии - 40 мг/кг массы тела). Для эксперимента лучше использовать крыс массой 150-200 г. Вскрывают брюшную полость, стараясь не повредить сосуды брыжейки. Обнажают, предназначенный для исследования, участок тонкой кишки длиной 15 см и надрезают (изолируют) кишку с обеих сторон, сохраняя на всем протяжении выбранного участка кровеносные сосуды и нервные волокна. В оба надрезанных конца вставляют катетеры для введения и сбора жидкости, фиксируют их лигатурами, после чего кишку погружают в брюшную полость. Перед началом исследования изолированный участок кишки с помощью шприца через катетер промывают 20-25 мл изотонического раствора, например, раствора хлористого натрия, 0,85-0,90%. Затем производят перфузию изолированного фрагмента этим же раствором, нагретым до 37°С, со скоростью перфузии 0,11 мл/мин (установлена экспериментально). Скорость регулируют с помощью роликового зажима капельницы через проксимальный катетер (катетер ввода). В течение всего времени исследования операционный столик и перфузирующие растворы подогреваются до 37°С. Через дистальный, отводящий катетер собирают кишечное содержимое - химус. Собранный химус за первые 30 минут отбрасывается (данные недействительны из-за интенсивно протекающих переходных процессов адаптации). К катетеру ввода подсоединяют тестируемый раствор. За последующие 1-3 часа химус отбирается для анализа. После окончания опыта производятзабор 2,5-3 см3 крови и животное выводят из эксперимента. В химусе определяют содержание креатинина, натрия, калия, полученное в результате произведения концентрации вещества на объем химуса. В плазме крови определяют концентрацию креатинина (мкмоль/л) любым известным способом. Обнаруженный нами факт одностороннего транспорта креатинина в просвет перфузированной изолированной петли, аналогичен процессу фильтрации в почечных клубочках, что позволяет рассчитать кишечный клиренс эндогенного креатинина и определить объем выделяющегося в просвет кишки фильтрата: Clcr=Ccrхим´Vхим/Pcr, где Clcr - кишечный клиренс креатинина, мл: Ссrхим - концентрация креатинина в химусе, мкмоль/л: Pсr - концентрация креатинина в плазме крови, мкмоль/л; Vхим - объем химуса, мл. Рассчитывают содержание натрия (ENa) и/или калия (ЕК) в химусе: ЕNа=СNахим´Vхим; EK=СКхим´Vхим. Определяют соотношение ENa/Clcr и/или ЕК/Clcr в контроле и опытных пробах. Снижение показателя свидетельствует об уменьшении интенсивности мембранного транспорта натрия и калия на единицу фильтруемой в просвет кишки жидкости и обусловлено, преимущественно, снижением активности мембраносвязанного ключевого фермента - Nа, К-АТФазы базальной мембраны энтероцитов кишки [4]. Достоверное уменьшение соотношения, против контроля, происходит при ингибировании энергетических процессов аэробного дыхания, что является одним из признаков токсического действия тестируемого химического соединения. Таким образом, предлагаемый способ (модель), в сравнении с прототипом, позволяет получить количественную информацию о токсичности 2 28391 лия в химусе, соотношение кишечного клиренса креатинина к содержанию натрия и калия в химусе: Clcr=Ccrхим´Vхим/Pcr; ЕNа= СNахим´Vхим; EK=СКхим´Vхим; ENa/Clcr; EK/Clcr. Полученные исходные и расчетные показатели иллюстрируются в табл. 1 и 2. Крыса № 2. Масса тела 200 г. Способ реализуется аналогично, описанному для крысы № 1, но используется концентрация перфузирующего раствора нитрита натрия 1,1´10-2%. Результаты приведены в табл. 1 и 2. Крыса № 3. Масса тела 195 г. Способ реализуется аналогично, описанному для крысы № 1, но используется концентрация перфузирующего раствора нитрита натрия 0,11%. Результаты приведены в табл. 1 и 2. Для интактного контроля перфузирующим раствором являлась дистиллированная вода. По каждой концентрации тестируемого раствора проводят исследования не менее, чем на трех кишечных фрагментах. Определяют достоверность различия между опытом и контролем (табл. 3). Пример 2 Выполняется аналогично примеру 1, однако, время перфузирования и сбора химуса составляет 3 часа. Концентрацию перфузирующего раствора, в связи с увеличением периода перфузии, снижают в три раза: Р-р № 1=0,4·10-3%, № 2=0,4·10-2%, № 3=0,04%. Данные, полученные в этом эксперименте, представлены в табл. 4 и 5. Преимущество предлагаемого способа, в частности, при определении пороговой дозы, в сравнении с токсикологическим, состоит в значительном сокращении количества животных и сроков исследования. Аналогичное токсикологическое исследование проводится in vivo в течение 9-18 мес. на 3-4 дозах исследуемого соединения, с большим количеством животных в группах, т.к. исследования метаболических показателей необходимо проводить в динамике эксперимента через 0,5, 1,5, 3, 6, 9, 12 и 18 месяцев. Необходимо указать также, что изучение функционального состояния желудочно-кишечного тракта на целостном организме, позволяет получить лишь косвенную и весьма неточную оценку, опосредованную параллельно протекающими компенсационными и адаптационными процессами в организме животного. Преимущество предлагаемого способа в сравнении с прототипом заключается в повышении степени адекватности модели, т.к. исследования проводятся на живом организме; использование нового критерия - расчета кишечного клиренса эндогенного креатинина служит основой для повышения точности оценки, в частности, при тестировании химических соединений на токсичность. (либо метаболической активности) изучаемого соединения на живом организме, физиологически более адекватную, чем в опытах in vitro на изолированных фрагментах кишки в прототипе. Оптимальный период продолжительности перфузирования и сбора химуса от 1 до 3 часов объясняется тем, что продолжительность менее 1 часа недостаточна для полноты оценки протекающих процессов из-за различной скорости всасывания изучаемых соединений, свыше трех часов - исследование проводить нецелесообразно, т.к. большинство веществ за 2,5-3,0 часа успевает проявить полностью свои эффекты в кишечнике, кроме того, к этому моменту заканчивается действие анестезирующего средства. Пример 1 Необходимо провести биотестирование растворов нитрита натрия разной концентрации на фрагменте тонкой кишки лабораторной крысы и определить пороговую концентрацию. За сутки до эксперимента крыс прекращают кормить. К воде доступ свободный. В день эксперимента готовят три раствора с разной концентрацией нитрита натрия для перфузирования тонкой кишки, основываясь на расчете минимальной недействующей дозы (для NaNO2=0,04 мг/кг), принятого в токсикологических исследованиях [5]: Р-р № 1 - 1,1·10-3% NaNO2. Концентрация NaNО2 в р-рах № 2 и № 3, соответственно, в 10 и 100 раз выше. Каждая концентрация оценивается отдельно на разных крысах. Крыса № 1. Масса тела 180 г. Вводят 7,2 г нембутала (из расчета 40 мг/кг массы тела). Крысу помещают на металлическую подогреваемую до 37°С пластину, фиксируют в положении лежа на спинке. Вскрывают брюшную полость, стараясь не повредить сосуды брыжейки. Обнажают тонкую кишку и накладывают лигатуру на участок, сразу же следующий за привратником, надрез производят несколько дистальнее лигатуры, в надрез вставляют катетер (катетер ввода перфузата). Второй надрез производят через 15 см по ходу кишки и вводят в кишку второй катетер (катетер отвода кишечного содержимого). Надрезы кишки осуществляют таким образом, чтобы не повредить кровеносные сосуды и нервные волокна. Катетеры фиксируют лигатурами, после чего кишку погружают в брюшную полость. Перед началом исследования изолированный участок кишки с помощью шприца через катетер промывают 20-30 мл 0,85% раствора хлористого натрия. Катетер подсоединяют к термостатируемой при 37°С капельнице с раствором нитрита натрия (1,1´10-3%). Засекают время и начинают перфузию изолированного участка кишки раствором. Регулируют скорость перфузии роликовым зажимом до 0,11 мл/мин. Через дистальный, отводящий катетер собирают содержимое кишки в пробирку. Химус, собранный за первые 30 минут, выливают, меняют пробирку для сбора содержимого. Через 1 час опыт прекращают. Производят забор крови методом декапитирования. Получено 4 см крови. В химусе определяют содержание креатинина, натрия и калия, в плазме крови определяют концентрацию креатинина. Рассчитывают кишечный клиренс эндогенного креатинина, содержание креатинина, натрия и ка Источники информации 1. Уголев А.М., Зарипов Б.З., Иезуитова Н.Н. и др. Сравнительная характеристика мембранного гидролиза и транспорта в остром и хроническом 3 28391 эксперименте // Мембранный гидролиз и транспорт. - Л., 1986. - С. 139-166. 2. Морозов И.А., Ю.А. Лысиков, В.В. Питран, С.И. Хвыля. Всасывание и секреция в тонкой кишке. – М.: Медицина, 1988. - 223 с. 3. Рыбальский Н.Г., Жакетов О.Л., Ульянова А.Е., Шепелев Н.П. Экологические аспекты экс пертизы изобретений. - Ч. 2. - М.: ВНИИПИ, 1989. 551 с. 4. Берхин Е.Б. Секреция органических веществ в почке. - Л.: Наука (Л-ое. отд.), 1979. – 156 с. 5. Габович Р.Д., Припутина Л.С. Гигиенические основы охраны продуктов питания от вредных химических веществ. - Киев: Здоров'я, 1987. - 248 с. Таблица 1 Определение пороговой концентрации водного раствора нитрита натрия способом биотестирования на фрагменте тонкой кишки в опыте in situ при перфузировании в течение 1 часа (исходные показатели) Изучаемые показатели Контроль Н2О дист. Поглощенный объем, мл 6,2 Объем, мл Na+, моль/л К+, моль/л Креатинин, мкмоль/л 2,25 57,2 7,7 132,2 Креатинин, мкмоль/л 70,4 Крыса № 1 р-р NaNO2 1,1´10-3% Перфузат 6,4 Химус 2,31 55,0 8,13 135,9 Плазма 75,0 Крыса № 2 р-р NaNO2 1,1´10-2% Крыса № 3 р-р NaNO2 0,11% 7,0 8,1 3,02 39,1 6,0 160,4 3,2 36,4 4,78 181,0 62,9 60,4 Таблица 2 Определение пороговой концентрации водного раствора нитрита натрия способом биотестирования на фрагменте тонкой кишки в опыте in situ при перфузировании в течение 1 часа (расчетные показатели) Изучаемые показатели Кишечный клиренс креатинина, мл ЕNa хим., мкмоль ЕК хим., мкмоль ЕNa/Clcr, мкмоль/мл ЕК/Clcr, мкмоль/мл Контроль Н2О дист. 4,22 128,7 17,3 30,5 4,1 Крыса № 1 р-р NaNO2 1,1´10-3% 4,19 127,05 18,78 30,3 4,48 Крыса № 2 р-р NaNO2 1,1´10-2% 7,70 120,8 18,12 15,3 2,35 Крыса № 3 р-р NaNO2 0,11% 9,6 116,5 14,32 12,13 1,49 Таблица 3 Оценка показателей биотестирования нитрита натрия на фрагменте тонкой кишки в опыте in situ (перфузирование 1 час) M±m Изучаемые показатели Кишечный клиренс креатинина, мл ЕNa хим., мкмоль ЕК хим., мкмоль Контроль Н2О дист. n=3 4,30±0,31 128,0±3,5 17,8±0,46 ЕNa/Clcr, мкмоль/мл 29,7±2,5 ЕК/Clcr, мкмоль/мл 4,03±0,27 р-р NaNO2 1,1´10-3% n=3 4,09±0,27 127,38±4,3 18,04±0,72 31,14±2,8 недостов. 4,41±0,5 недостов. р-р NaNO2 1,1´10-2% n=3 7,30±0,52 122,6±2,1 17,92±0,57 16,8±2,07 Р