Спосіб диференційованого одержання фізіологічно активних композицій із тканин морських молюсків рапанів

1. Спосіб диференційованого одержання фізіологічно активних композицій із тканин морських молюсків рапанів, що включає подрібнення сировини, екстракцію її етанолом, відстоювання на холоді до випадіння осаду та декантацію, фільтрацію спиртового екстракту від осаду і його упарювання, очистку активованим вугіллям, концентрування та стабілізацію вітаміном Е, який відрізняє ться тим, що після екстракції сировини 96 %-м етиловим спиртом проводять додаткову екстракцію сировини підкисленим розчином етилового спирту, декантують, об'єдн ують спиртовий та підкислений спиртово-водний екстракти, відстоюють на холоді до випадіння осаду, фільтр ують від осаду, концентрують упарюванням, очищують гексаном при співвідношенні 1:3, верхній гексановий шар відкидають, нижній ліпід-білковий шар C2 2 UA 1 3 85985 ними кислотами (ПНЖК) в структурі композицій фізіологічно активних речовин із тканин морських молюсків рапанів, які можуть бути використані, як субстанції лікарських засобів у профілактичних і лікувальних цілях, а саме, для лікування гіпертонії та відновлення функції репродуктивної системи і гормональних відхилень людини (неплідності чоловіків та жінок в період менопаузи), для нормалізації метаболічних порушень регуляторної функції організму та неспецифічних імунозахисних механізмів, як природні антиоксиданти мембраностабілізатори та імуномодулятори. Особливістю морських молюсків є надзвичайна різноманітність фізіологічно активних речовин, які входять до їх складу. Аналіз сучасної інформації вказує, що екстракти ліпідів та комплекси речовин ліпід-білкової природи з різних тканин морських організмів, які включають ліпіди, стероїди, гормони та гормоноподібні речовини, високополієнові жирні кислоти, фосфоліпіди з омега-3 ПНЖК в структурі та ін., мають ряд цінних біологічних властивостей, що дає можливість створення нових природних лікувальних засобів специфічної дії. Відомо про спосіб виділення з молюсків кальмарів біологічно активного комплексу, що містить фосфоліпіди з омега-3 ПНЖК в структурі, вільні та зв'язані амінокислоти, нуклеотидні компоненти, коротко ланцюгові регуляторні пептиди, гормоноподібні речовини. Проте спосіб пропонує використання лише репродуктивних органів кальмарів, в той час як інші фізіологічно активні компоненти, що є в тілі молюска, не використовуються [1]. Відомо про спосіб виділення та біологічні властивості біополімеру, з тканин молюсків (мідій, рапанів, ампулярій), шляхом гідролізу з використанням амілолітичних та протеолітичних ферментів, концентруванням гідролізатів до (34,036,0) % вмісту сухи х речовин, осадженням біополімеру спиртом при рН 6,4-:6,6 з кінцевим вмістом спирту в суміші (73,0-75,0) %. Виділений біополімер має біологічну активність: антиоксидантну, цуркознижувальну, гепатопротекторну та тиреотропну. Проте технологія з використанням гідролізу сировини за допомогою амілолітичних та протеолітичних ферментів є тр удомісткою [2]. Найближчим аналогом за технічним рішенням є “Спосіб обробки морських організмів” [3]. Спосіб обробки морських організмів, який включає подрібнення сировини, екстракцію етанолом, перерозчинення в гексані, відстоювання на холоду до утворення осаду і супернатанту, з останнього випаровування гексану, перерозчинення в етанолі, очищення активованим вугіллям, стабілізація вітаміном Е і одержання комплексу фосфоліпідів; осад переосаджують сумішшю етанолу з ефіром у співвідношенні (1-3):1, розділяють на рідку та тверду фазу, після чого останню перерозчинюють в етанолі, очищують активованим вугіллям та ультрафільтрацією до одержання речовини з тестостерогенними властивостями. Цей спосіб включає три етапи виділення двох окремих продуктів: фосфоліпідного комплексу та речовини з тестостерогенними властивостями. Практичне 4 значення має тільки одержання комплексу поверхнево активних речовин з виходом до 6%. Одержання гормоноподібної речовини з тестостерогенними властивостями не має практичного значення через низький її вихід. У зв'язку з цим прототип має низький спектр властивостей, що обмежує лікування різних захворювань. Крім цього, вказаний спосіб трудомісткий і застосовує небажаний реактив - діетиловий ефір, що може завадити впровадженню способу в промислове виробництво. Задачею винаходу, що заявляється, є розробка нового оптимального способу диференційованого одержання з тканин морських молюсків рапанів фізіологічно активних композицій, та виявлення їх специфічних лікувальних властивостей. Задача винаходу вирішується тим, що з тканин морських молюсків рапанів, виділяють концентрований екстракт (гліколіпопептидний комплекс), який за допомогою колонкової хроматографії диференційовано розділяють на індивідуальні фізіологічно активні композиції: ліпопептидну, нуклеопептидну та фосфоліпідну з омега-3 ПНЖК в структурі, - та визначають їх специфічну фізіологічну дію. Заявлений спосіб здійснюється таким чином. Сировину (тканини морських молюсків рапанів тіло, печінку, репродуктивні органи) подрібнюють у замороженому стані, екстрагують подрібнену сировину спочатку 96%-ним етиловим спиртом при співвідношенні 1:10 та після фільтрації залишок сировини повторно екстрагують 50% водноспиртовим етанолом, підкисленим оцтовою кислотою до рН не менше 4,0, проводять декантацію одержаного екстракту і об'єднання двох екстрактів, який відрізняється тим, що одержаний екстракт відстоюють на холоду до випадіння осаду, фільтрують від осаду та здійснюють його концентрування, одержаний залишок очищують гексаном при співвідношенні 1:3 не менше трьох разів. Гексановий шар відкидають, а нижній ліпід-білковий шар очищують активованим вугіллям у кількості 2%, фільтрують, концентрують і одержують субстанцію гліколіпопептидного комплексу, до якого додають вітамін Е та після упарювання одержаний залишок перерозчинюють в незначній кількості етанолу (1/10 об'єму) і проводять хроматографічне розділення розчиненого залишку на колонці з сефадексом LH-20 в системі бутанол : оцтова кислота : вода при співвідношенні 5:2:3 для вилучення нуклеотидів та нуклеозидів, виділяючи ліпопептидну композицію, яка має поглинання в УФ-області при 200-210нм, нуклеопептидну композицію, яка має поглинання в УФ-області при 254нм, фосфоліпідну композицію з омега-3 ПНЖК в стр уктурі, яка не має характерного максимуму поглинання в УФ-області, а також решту - вільні амінокислоти та інші мінорні біологічно активні речовини. Одержані фізіологічно активні композиції мають вигляд маслоподібних речовин. Виділені фізіологічно активні композиції стандартизовані фізико-хімічними методами, визначено їх діюче начало, розроблено специфічні реакції для характеристики справжності 5 85985 ліпопептидної та нуклеопептидної композицій. Фосфоліпідна композиція з омега-3 ПНЖК в структурі ідентична такій, як описано раніше [4], і специфічно характеризується поверхневоактивними властивостями, може бути використана як сурфактант при легеневих захворюваннях. Фосфоліпідна композиція з омега-3 ПНЖК в 6 структурі не має характерного максимуму поглинання в УФ-області спектра. Склад гліколіпопептидного комплексу, одержаного з морських молюсків рапанів, визначений хроматографічними методами для кількісного визначення фосфоліпідів та загальних ліпідів, наведено в табл. 1. Таблиця 1 Гліколіпопептидний комплекс з тканин молюсків рапанів (n=5) Склад гліколіпопептидного комплексу Фосфоліпіди, % від загальної суміші: - Фосфатидилхолін - Фосфатидилетаноламін - Сфінгомієлін - Фосфатидилсерин - Дифосфатидилгліцерид Загальні ліпіди: - Холестерин, мг/мл ліпідів - Загальний фосфор, мкг/мг ліпідів - Дієнові кон'югати, мкмоль/мг білку - Вуглеводи, мг Вміст компонентів 65-70 12-15 4-6 0,6-1,6 0,3-0,6 5,9±0,7 19,2±1,8 1,43±0,11 0,2±0,05 Порівняльні дані щодо вмісту жирних кислот у складі фосфоліпідів із різної сировини наведені в табл. 2. Таблиця 2 Вміст жирних кислот у складі фосфоліпідів із різної сировини (n=5), %: Жирна кислота Пальмітинова 16:0 Стеаринова 18:0 Олеїнова 18:1 Лінолева 18:2 a-Ліноленова 18:3 Арахідонова 20:4 Ейкозапентаєнова 25:0 Докозагексаєнова 22:6 Яйця курячі 33,9 10,5 31,1 17,7 3,1 Для перевірки специфічної дії виділеної ліпопептидної композиції використовують старих самців щурів, яким попередньо модулюють ниркову гіпертонію шляхом правосторонньої перев'язки ножки нирки. Через два тижні вводять ліпопептидну композицію перорально або внутрішньом'язово із рахунку 1мг на 100г маси тіла щоденно протягом двох тижнів і порівнюють вихідний рівень артеріального тиску з таким через Сировина Кальмари 28,8 10,1 12,7 0,28 0,34 16,0 11,4 13,4 Рапани 6,05 1,2 7,6 1,2 3,9 12,6 17,7 15,5 чотири тижні після операції (дослідна група). Як контроль використовують щурів із нирковою гіпертонією, які одержують воду або фізіологічний розчин протягом двох тижнів після операції. Виявлено, що в дослідної групи щурів, які приймали ліпопептидну композицію, відбувається значне зниження артеріального тиску порівняно з контрольною групою турів (табл. 3). 7 85985 8 Таблиця 3 Зміни артеріального тиску при введенні ліпопептидної композиції щурам Група щурів Вихідний артеріальний тиск, мм рт. ст. 98 96 120 107 115 120 Контроль Дослід Артеріальний тиск після введення препарату, мм рт. ст. вода або фізіологічний розчин 72 72 90 Для перевірки специфічної дії виділеної нуклеопептидної композиції використовують старих самців щурів, яким протягом 10 днів вводять внутрішньом'язово нуклеопептидну композицію в кількості 0,1мг/кг і дорослих щурів, яким також щоденно внутрішньом'язово вводять по 0,1мг/кг нуклеопептидної композиції. Контрольні групи старим і дорослим щурам вводять щоденно протягом 10 днів фізіологічний розчин по 0,4мл. Рівень тестостерону в крові визначають Ліпопептидна композиція Зниження артеріального тиску, % 63 70 60 26,5 25,0 27,5 41,1 39,0 50,0 радіоімунологічним методом [5]. До експерименту в старих щурів рівень тестостерону в крові в 4 рази нижчий ніж у дорослих нормальних щурів. Після експерименту рівень тестостерону у старих щурів, що одержували нуклеопептидну композицію, збільшується більш ніж в 5 разів. У контрольних дорослих тварин введення нуклеопептидної композиції не змінює рівень тестостерону в крові (табл. 4). Таблиця 4 Концентрація тестостерону в плазмі крові щурів при введенні нуклеопептидної композиції(n=6, М±m) Вихідний рівень тестостерону,нмоль/л-1 0,87±0,07 8,90±1,50 Групи тварин Старі тварини Дорослі тварини Рівень тестостерону після введення нуклеопептидної композиції, нмоль/л-1 10,58±0,71* 8,52±0,53* * дані імовірні Р