Сполуки glp-1, зв’язані з поліетиленгліколем
Номер патенту: 92451
Опубліковано: 10.11.2010
Автори: Чжан Ляншен, Вік Ендрю Марк, Дімарчі Річард Денніс, Міллікан Рон Лі, мол., Глезнер Вольфганг
Формула / Реферат
1. Пегільована сполука GLP-1, яка містить амінокислотну послідовність Формули IV (Послідовність № 6):
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Xaa11-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Хаа22-Хаа23-Хаа24-Хаа25-Хаа26-Хаа27-Рhе-Іlе-Хаа30-Тrр-Lеu-Хаа33-Хаа34-Хаа35-Хаа36-Хаа37-Хаа38-Хаа39-Хаа40-Хаа41-Хаа42-Хаа43-Хаа44-Хаа45-Хаа46-Хаа47
Формула IV (Послідовність № 6),
де:
Хаа7 - L-гістидин, D-гістидин, дезаміногістидин, 2-аміногістидин, -гідроксигістидин, гомогістидин, α-фторметилгістидин або α-метилгістидин;
Xaa8 - Ala, Gly, Val, Leu, lle, Ser або Thr;
Xaa11 - Thr або Cys;
Xaa12 - Phe, Trp, Tyr або Cys;
Xaa16 - Val, Trp, Ile, Leu, Phe, Tyr або Cys;
Xaa18 - Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, Ile, Leu, Val;
Xaa19 - Tyr, Trp або Phe;
Xaa20 - Leu, Phe, Tyr або Trp;
Xaa22 - Gly, Glu, Asp, Lys або Cys;
Хаа23 - Gln або Cys;
Xaa24 - Ala або Cys;
Xaa25 - Ala, Val, Ile, Leu або Cys;
Xaa26 - Lys або Cys;
Xaa27 - Glu, Ile, Ala або Cys;
Хаа30 - Ala, Glu або Cys;
Xaa33 - Val або Ile;
Хаа34 - Lys, Asp, Arg, Glu або Cys;
Хаа35 - Gly або Cys;
Хаа36 - Gly, Pro, Arg або Cys;
Xaa37 - Gly, Pro, Ser або Cys;
Xaa38 - Ser, Pro, His або Cys;
Хаа39 - Ser, Arg, Thr, Trp, Lys або Cys;
Xaa40 - Ser, Gly або Cys;
Xaa41 - Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly або Cys;
Xaa42 - Pro, Ala, Cys, NH2 або відсутня;
Хаа43 - Pro, Ala, Cys, NH2 або відсутня;
Xaa44 - Pro, Ala, Arg, Lys, His, Cys, NH2 або відсутня;
Xaa45 - Ser, His, Pro, Lys, Arg, Cys, NH2 або відсутня;
Xaa46 - His, Ser, Arg, Lys, Cys, NH2 або відсутня; та
Xaa47 - His, Ser, Arg, Lys, Cys, NH2 або відсутня;
та де:
щонайменше один залишок Cys ковалентно приєднаний до молекули поліетиленгліколю, та за умови, що у разі відсутності Хаа42, Хаа43, Хаа44, Хаа45 або Хаа46, відсутньою є також кожна кислота у 5'-3' напрямку; та за умови, що згадана молекула має щонайбільше два залишки Cys.
2. Пегільована сполука GLP-1 за п. 1 за умови, що згадана пегільована сполука GLP-1 не відрізняється від GLP-1(7-37)OH або GLP-1(7-36)NH2 більше ніж 7 амінокислотами у межах амінокислот 7-37.
3. Пегільована сполука GLP-1 за п. 1 за умови, що згадана пегільована сполука GLP-1 не відрізняється від GLP-1(7-37)OH або GLP-1(7-36)NH2 більше ніж 6 амінокислотами у межах амінокислот 7-37.
4. Пегільована сполука GLP-1 за п. 1 за умови, що згадана пегільована сполука GLP-1 не відрізняється від GLP-1(7-37)OH або GLP-1(7-36)NH2 більше ніж 5 амінокислотами у межах амінокислот 7-37.
5. Пегільована сполука GLP-1 за п. 1 за умови, що згадана пегільована сполука GLP-1 не відрізняється від GLP-1(7-37)OH або GLP-1(7-36)NH2 більше ніж 4 амінокислотами у межах амінокислот 7-37.
6. Пегільована сполука GLP-1 за п. 1 за умови, що згадана пегільована сполука GLP-1 не відрізняється від GLP-1(7-37)OH або GLP-1(7-36)NH2 більше ніж 3 амінокислотами у межах амінокислот 7-37.
7. Застосування пегільованої сполуки GLP-1 за будь-яким із пп. 1-6 для виготовлення лікарського засобу для лікування діабету, ожиріння, інсульту, інфаркту міокарда, синдрому подразненої товстої кишки або функціональної диспепсії.
8. Застосування за п. 7, яке відрізняється тим, щозгаданий лікарський засіб застосовують для лікування діабету.
9. Застосування за п. 8, яке відрізняється тим, що згаданий діабет є інсулінонезалежним діабетом.
10. Застосування за п. 7, яке відрізняється тим, що згаданий лікарський засіб застосовують для лікування ожиріння.
Текст
1. Пегільована сполука GLP-1, яка містить амінокислотну послідовність Формули IV (Послідовність № 6): Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Xaa11-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Хаа22-Хаа23-Хаа24-Хаа25Хаа26-Хаа27-Рhе-Іlе-Хаа30-Тrр-Lеu-Хаа33-Хаа34Хаа35-Хаа36-Хаа37-Хаа38-Хаа39-Хаа40-Хаа41-Хаа42Хаа43-Хаа44-Хаа45-Хаа46-Хаа47 Формула IV (Послідовність № 6), де: Хаа7 - L-гістидин, D-гістидин, дезаміногістидин, 2аміногістидин, -гідроксигістидин, гомогістидин, αфторметилгістидин або α-метилгістидин; Xaa8 - Ala, Gly, Val, Leu, lle, Ser або Thr; Xaa11 - Thr або Cys; Xaa12 - Phe, Trp, Tyr або Cys; Xaa16 - Val, Trp, Ile, Leu, Phe, Tyr або Cys; Xaa18 - Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, Ile, Leu, Val; Xaa19 - Tyr, Trp або Phe; Xaa20 - Leu, Phe, Tyr або Trp; Xaa22 - Gly, Glu, Asp, Lys або Cys; Хаа23 - Gln або Cys; 2 (19) 1 3 92451 4 ся від GLP-1(7-37)OH або GLP-1(7-36)NH2 більше ніж 3 амінокислотами у межах амінокислот 7-37. 7. Застосування пегільованої сполуки GLP-1 за будь-яким із пп. 1-6 для виготовлення лікарського засобу для лікування діабету, ожиріння, інсульту, інфаркту міокарда, синдрому подразненої товстої кишки або функціональної диспепсії. 8. Застосування за п. 7, яке відрізняється тим, що згаданий лікарський засіб застосовують для лікування діабету. 9. Застосування за п. 8, яке відрізняється тим, що згаданий діабет є інсулінонезалежним діабетом. 10. Застосування за п. 7, яке відрізняється тим, що згаданий лікарський засіб застосовують для лікування ожиріння. Цей винахід має відношення до сполук GLP-1 (глюкагоноподібний пептид-1), ковалентно приєднаних до однієї або декількох молекул поліетиленгліколю або його похідної та споріднених композицій і способів, придатних для лікування станів або розладів, для яких є благотворним зниження рівня глюкози у крові, зменшення споживання їжі, зменшення випорожнювання шлунка або кишечнику, зменшення рухової функції шлунка або перистальтики кишечнику. Передумови створення винаходу Глюкагоноподібний пептид-1 (GLP-1) викликає численні біологічні ефекти, наприклад, стимулювання секреції інсуліну, пригнічення секреції глюкагону, пригнічення випорожнювання шлунка, пригнічення рухової функції шлунка або перистальтики кишечнику, посилення використання глюкози та спричинення втрати маси. GLP-1 може додатково запобігати вичерпанню функції βклітин підшлункової залози, що відбувається у разі прогресування інсулінонезалежного цукрового діабету (NIDDM). Суттєвою характеристикою GLP1 є його здатність до стимулювання секреції інсуліну без пов'язаного з цим ризику гіпоглікемії, що спостерігається у разі проведення інсулінотерапії або застосування пероральних методів лікування деяких типів, під час здійснення яких відбувається підвищення експресії інсуліну. Придатність методів лікування із залученням GLP-1 обмежується тим, що GLP-1(1-37) має низьку активність, а два природні "укорочені" пептиди, GLP-1(7-37)OH та GLP-1(7-36)NH2, швидко виводяться in vivo і мають надзвичайно короткий період напіввиведення in vivo. Відомо, що ендогенно продукована дипептидилпептидаза IV (DPP-IV) інактивує циркулюючі пептиди GLP-1 шляхом видалення N-кінцевих залишків гістидину та аланіну і є головною причиною короткого періоду напіввиведення in vivo. Вдавались до різних способів подовження періоду напіввиведення пептиду GLP-1 або уповільнення виведення згаданого пептиду з організму з одночасним збереженням біологічної активності. Патент США №5,705,483 розкриває аналоги пептиду GLP-1, стійкі до розщеплення DPP-IV завдяки включенню модифікацій до N-кінцевої ділянки згаданого пептиду. Альтернативним варіантом підходу до подовження періоду напіввиведення пептидів GLP-1 є дериватизація, де до різних амінокислот GLP-1 приєднуються великі ацильні групи, які запобігають доступу DPP-IV до Nкінцевої ділянки згаданого пептиду. (Дивись міжнародну заявку PCT/DK97/00340, подану 22 серп ня 1997 року, що має назву "GLP-1 Derivatives", яка претендує на пріоритет за тимчасовими датськими заявками №0931/96, яка була подана 30 серпня 1996 року, №1259/96, яка була подана 8 листопада 1996 року, і №1470/96, яка була подана 20 грудня 1996 року). Опис конкретних аналогів GLP-1 наведено у заявках на патент США №60/346,474, яка була подана 8 січня 2002 року, та №60/405,097, яка була подана 21 серпня 2002 року, за якими зараз є міжнародна заявка PCT/US03/058203, яка була подана 3 січня 2003 року під назвою "Extended Glucagon-Like Peptide-1 Analogs", і які у повному обсязі включені до цього опису. У цих заявках наведено опис аналогів GLP-1(7-37)OH, де різні амінокислоти, у разі додання до С-кінцевої ділянки, забезпечують одержання аналогів пептиду GLP-1 із подовженим періодом напіввиведення та зменшеною швидкістю виведення, порівняно з відповідними характеристиками вихідної молекули. Окрім того, опис аналогів GLP-1 з підвищеною ефективністю наведено у заявці на патент США №60/314,573, яка була подана 23 серпня 2001 року, за якою зараз є міжнародна заявка PCT/US02/21325, яка була подана 14 серпня 2002 року під назвою "Glucagon-Like Peptide-1 Analogs" (яка включена до цього опису). Ексендин-4 може впливати in vitro на рецептор GLP-1 клітин певного типу, у тому числі клітин, що секретують інсулін [Гоук (Goke) та інші, J. Biol. Chem., (1993) 268:19650-19655]. Опис конкретних пегільованих молекул ексендину та агоніста ексендину наведено у міжнародній заявці PCiVlJSOO/11814 (яка включена до цього опису у повному обсязі). Незважаючи на те, що різні варіанти підходу забезпечили одержання сполук GLP-1 з довшим періодом напіввиведення або більшою ефективністю, порівняно з нативним GLP-1, додаткові варіанти підходу, які можуть застосовуватись самостійно або у комбінації з відомими варіантами підходу, є необхідними для додаткового зменшення швидкості виведення сполуки GLP-1 та збільшення періоду напіввиведення сполуки GLP-1 для оптимізації, тим самим, її придатності для застосування як лікарський засіб, що може вводитись мінімальну кількість разів впродовж більш тривалого періоду часу. У ковалентному приєднанні однієї або декількох молекул поліетиленгліколю до невеликого, біологічно активного пептиду, наприклад, GLP-1 або ексендину-4, криється ризик введення негативних характеристик, наприклад, нестабільності молекули та настільки значного зниження біологічної активності, яке робить молекулу непридатною 5 для застосування як лікарський засіб. Цей винахід, однак, ґрунтується на встановленні того, що результатом ковалентного приєднання однієї або декількох молекул поліетиленгліколю до конкретних залишків сполуки GLP-1 є одержання біологічно активної сполуки пегільованого GLP-1 з подовженим періодом напіввиведення та зменшеною швидкістю виведення, порівняно з відповідними характеристиками вихідного GLP-1 або Val8-GLP-1 (або нативного ексендину-4 для модифікованих пептидів ексендину-4 за цим винаходом). Сполуки пегільованого GLP-1 за цим винаходом мають більшу придатність як лікарський засіб, а також більшу зручність для застосування, аніж нативний GLP-1 завдяки тому, що вони повністю або частково зберігають біологічну активність нативного GLP-1 і, водночас з цим, мають збільшений період напіввиведення та/або зменшену швидкість виведення, порівняно з відповідними характеристиками нативної сполуки GLP-1 або з відповідними характеристиками Val8-GLP-1(737)OH. Тривалість періоду напіввиведення GLP1(7-37) із сироватки становить усього від 3хв до 5хв. Тривалість дії аміду GLP-1(7-37), у разі підшкірного введення, становить приблизно 50хв. Навіть аналоги та похідні GLP-1, що є стійкими до розщеплення ендогенною протеазою, не мають достатньо тривалого періоду напіввиведення, щоб запобігти їх повторному введенню впродовж 24год періоду часу. Тривалість періоду напіввиведення сполук пегільованого GLP-1 за цим винаходом може перевищувати 24год, що надає можливість зменшення кількості введень сполуки пегільованого GLP-1 з одночасним підтриманням високого рівня вмісту згаданої сполуки у крові впродовж тривалого періоду часу. Такі сполуки пегільованого GLP-1 можуть знайти терапевтичне застосування для лікування суб'єктів із розладами, що включають (але ними не обмежуються) діабет, ожиріння, розлади рухової функції шлунка та/або перистальтики кишечнику і розлади випорожнювання шлунка та/або кишечнику з конкретною перевагою, яка полягає у тому, що сполуки пегільованого GLP-1 за цим винаходом можуть вводитись впродовж періоду 24год меншою кількістю доз, що підвищує зручність для суб'єкта, який потребує такого лікування, та ймовірність піддатливості згаданого суб'єкта до необхідного дозованого введення. Короткий виклад суті винаходу Цей винахід пропонує сполуки GLP-1, ковалентно приєднані до однієї або декількох молекул поліетиленгліколю (PEG) або його похідної, де кожна молекула поліетиленгліколю приєднана при амінокислоті Cys чи Lys або до карбоксильного кінця згаданого пептиду, результатом чого є одержання пегільованих сполук GLP-1 із періодом напіввиведення, що становить щонайменше 1год, за варіантом, якому віддають перевагу, щонайменше 3год, 5год, 7год, 10год, 15год, 20год і за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, щонайменше 24год. Показник виведення згаданих пегільованих сполук GLP-1 за цим винаходом, за варіантом, якому віддають перевагу, становить 200мл/(год·кг) або менше, за варіантом, якому віддають більшу 92451 6 перевагу, 180мл/(год·кг), 150мл/(год·кг), 120мл/(год·кг), 100мл/(год·кг), 80мл/(год·кг), 60мл/(год·кг) або менше і за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, є меншим за 50мл/(год·кг), 40мл/(год·кг) або 20млДгод·кг). Одним із варіантів здійснення цього винаходу є пегільована сполука GLP-1, що містить амінокислотну послідовність GLP-1(7-37)OH, яка представлена ПОСЛІДОВНІСТЮ №1, де молекула поліетиленгліколю ковалентно приєднана при 3, 2 або 1 залишку, вибраному з групи, яку складають Lys26, Lys34 та Gly37: 7 His-Ala-Glu-10Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-15Asp-ValSer-Ser-Tyr-20Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-25Ala-Lys-GluPhe-Ile-30Ala-Trp-Leu-Val-Lys-35Gly-Arg-37Gly (ПОСЛІДОВНІСТЬ №1). Іншим варіантом здійснення цього винаходу є пегільована сполука GLP-1, що містить амінокислотну послідовність GLP-1(7-36)NH2, яка представлена ПОСЛІДОВНІСТЮ №2, де молекула поліетиленгліколю ковалентно приєднана при 3, 2 або 1 залишку, вибраному з групи, яку складають Lys26, Lys34 та Arg36: 7 His-Ala-Glu-10Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-15Asp-ValSer-Ser-Tyr-20Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-25Ala-Lys-GluPhe-Ile-30Ala-Trp-Leu-Val-Lys-35Gly-Arg (ПОСЛІДОВНІСТЬ №2). Іншим варіантом здійснення цього винаходу є пегільована сполука GLP-1, що містить амінокислотну послідовність Формули І (ПОСЛІДОВНІСТЬ №3): Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Xaa11-Xaa12-Thr-Ser-AspXaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33Xaa34-Хаа35-Хаа36-Хаа37 Формула 1 (ПОСЛІДОВНІСТЬ №3), де: Хаа7 - L-гістидин, D-гістидин, дезаміногістидин, 2-аміногістидин, β-гідроксигістидин, гомогістидин, фторметилгістидин або -метилгістидин; Хаа8 - Ala, Gly, Val, Leu, lle, Ser або Thr; Хаа11 - Thr або Cys; Xaa12 - Phe, Trp, Туr або Cys; Xaa16 - Val, Trp, lle, Leu, Phe, Туr або Cys; Xaa18 - Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, lle, Leu, Val; Xaa19 - Tyr, Trp або Phe; Xaa20 - Leu, Phe, Tyr або Trp; Xaa22 - Gly, Glu, Asp, Lys або Cys; Хаа23 - Gln або Cys; Xaa24 - Ala або Cys; Xaa25 - Ala, Val, lle, Leu або Cys; Xaa26 - Lys або Cys; Xaa27 - Glu, lle, Ala або Cys; Хаа30 - Ala, Glu або Cys; Xaa33 - Val або lle; Хаа34 - Lys або Cys; Хаа35 - Gly або Cys; Хаа36 - Arg або Cys; Хаа37 - Gly, His, Cys, NH2 або відсутня; та де: 2 або 1 залишок Cys ковалентно приєднаний до молекули поліетиленгліколю, або 3, 2 або 1 залишок Lys ковалентно приєднаний до молекули поліетиленгліколю або амінокислота карбоксильного кінця ковалентно приєднана до 7 молекули поліетиленгліколю; та за умови, що згадана молекула має 2, 1 або 0 Cys. Іншим варіантом здійснення цього винаходу є пегільована сполука GLP-1, що містить амінокислотну послідовність Формули II (ПОСЛІДОВНІСТЬ №4): Хаа7-Хаа8-Glu-Gly-Хаа11-Хаа12-Thr-Ser-AspХаа16-Ser-Хаа18-Tyr-Leu-Glu-Хаа22-Хаа23-Хаа24Хаа25-Хаа26-Хаа27-Рhе-Іlе-Хаа30-Тrр-Lеu-Хаа33Хаа34-Хаа35-Хаа36-Хаа37 Формула II (ПОСЛІДОВНІСТЬ №4), де: Хаа7 - L-гістидин, D-гістидин, дезаміногістидин, 2-аміногістидин, β-гідроксигістидин, гомогістидин, фторметилгістидин або -метилгістидин; Хаа8 - Gly, Ala, Yal, Leu, lle, Ser або Thr; Хаа11 - Thr або Cys; Xaa12 - Phe або Cys; Xaa16 - Val, Phe, Туr, Trp або Cys; Xaa18 - Ser, Туг, Trp, Phe, Lys, lle, Leu або Val; Xaa19 - Туr або Phe; Xaa22 - Gly, Glu, Asp, Lys або Cys; Хаа23 - Gln або Cys; Xaa24 - Ala або Cys; Xaa25 - Ala, Val, lle, Leu або Cys; Xaa26 - Lys або Cys; Xaa27 - Glu або Cys; Хаа30 - Ala або Cys; Хаа33 - Val або llе; Хаа34 - Lys або Cys; Хаа35 - Gly або Cys; Хаа36 - Arg або Cys; та Хаа37 - Gly, Cys, NH2 або відсутня; та де: 2 або 1 залишок Cys ковалентно приєднаний до молекули поліетиленгліколю, або 3, 2 або 1 залишок Lys є ковалентно приєднаний до молекули поліетиленгліколю або амінокислота карбоксильного кінця ковалентно приєднана до молекули поліетиленгліколю; та за умови, що згадана молекула має 2, 1 або 0 Cys. Іншим варіантом здійснення цього винаходу є пегільована сполука GLP-1, що містить амінокислотну послідовність Формули III (ПОСЛІДОВНІСТЬ №5): Xaa7-Хаа8-Glu-Gly-Xaa11-Xaa12-Thr-Ser-AspXaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33Xaa34-Хаа35-Хаа36-Хаа37-Хаа38-Хаа39-Хаа40-Хаа41Хаа42-Хаа43-Хаа44-Хаа45-Хаа46-Хаа47-Хаа48-Хаа49Хаа50 Формула III (ПОСЛІДОВНІСТЬ №5), де: Хаа7 - L-гістидин, D-гістидин, дезаміногістидин, 2-аміногістидин, β-гідроксигістидин, гомогістидин, фторметилгістидин або -метилгістидин; Хаа8 - Ala, Gly, Val, Leu, lle, Ser або Thr; Xaa11 - Thr або Cys; Xaa12 - Phe, Trp, Tyr або Cys; Xaa13 - Val, Trp, lle, Leu, Phe, Туr або Cys; Xaa18 - Ser, Trp, Tyr, Phe, Lys, lle, Leu або Val; Xaa19 - Tyr, Trp або Phe; Xaa20 - Leu, Phe, Tyr або Trp; Xaa22 - Gly, Glu, Asp, Lys або Cys; Хаа23 - Gln або Cys; 92451 8 Xaa24 - Ala або Cys; Xaa25 - Ala, Val, lle, Leu або Cys; Хаа26 - Lys або Cys; Хаа27 - Glu, lle, Ala або Cys; Хаа30 - Ala, Glu або Cys; Хаа33 - Val або llе; Хаа34 - Lys, Asp, Arg, Glu або Cys; Xaa35 - Gly або Cys; Хаа36 - Gly, Pro, Arg або Cys; Хаа37 - Gly, Pro, Ser або Cys; Хаа38 - Ser, Pro, His або Cys; Xaa39 - Ser, Arg, Thr, Tip, Lys або Cys; Xaa40 - Ser, Gly або Cys; Xaa41 - Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly або Cys; Xaa42 - Pro, Ala, Cys чи NH2 або відсутня; Хаа43 - Pro, Ala, Cys, NH2 або відсутня; Xaa44 - Pro, Ala, Arg, Lys, His, Cys, NH2 або відсутня; Xaa45 - Ser, His, Pro, Lys, Arg, Gly, Cys, NH2 або відсутня; Хаа46 - His, Ser, Arg, Lys, Pro, Gly, Cys, NH2 або відсутня; та Xaa47 - His, Ser, Arg, Lys, Cys, NH2 або відсутня; Xaa48 - Gly, His, Cys, NH2 або відсутня; Xaa49 - Pro, His, Cys, NH2 або відсутня; Xaa50 - Ser, His, Cys, Ser-NH2, His-NH2, CysNH2 або відсутня; та де: 2 або 1 залишок Cys ковалентно приєднаний до молекули поліетиленгліколю, або 3, 2 або 1 залишок Lys ковалентно приєднаний до молекули поліетиленгліколю або амінокислота карбоксильного кінця ковалентно приєднана до молекули поліетиленгліколю; та за умови, що у разі відсутності Хаа42, Хаа43, Хаа44, Хаа45, Хаа46, Хаа47, Хаа48 або Хаа49, відсутньою є також кожна кислота у 5'-3' напрямку; та за умови, що згадана молекула має2, 1 або 0 Cys. Іншим варіантом здійснення цього винаходу є пегільована сполука GLP-1, що містить амінокислотну послідовність Формули IV (ПОСЛІДОВНІСТЬ №6): Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Xaa11-Xaa12-Thr-Ser-AspXaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33Xaa34-Хаа35-Хаа36-Хаа37-Хаа38-Хаа39-Хаа40-Хаа41Хаа42-Хаа43-Хаа44-Хаа45-Хаа46-Хаа47 Формула IV (ПОСЛІДОВНІСТЬ №6), де: Хаа7 - L-гістидин, D-гістидин, дезаміногістидин, 2-аміногістидин, β-гідроксигістидин, гомогістидин, фторметилгістидин або -метилгіствдин; Xaa8 - Ala, Gly, Val, Leu, lle, Ser або Thr; Хаа11 - Thr або Cys; Xaa12 - Phe, Trp, Туr або Cys; Хаа16 - Val, Trp, lle, Leu, Phe, Туr або Cys; Xaa18 - Ser, Trp, Туr, Phe, Lys, lle, Leu, Val; Xaa19 - Tyr, Trp або Phe; Xaa20 - Leu, Phe, Tyr або Trp; Xaa22 - Gly, Glu, Asp, Lys або Cys; Хаа23 - Gln або Cys; Xaa24 - Ala або Cys; Xaa25 - Ala, Val, lle, Leu або Cys; Хаа26 - Lys або Cys; 9 Xaa27 - Glu, lle, Ala або Cys; Xaa30 - Ala, Glu або Cys; Хаа33 - Val або llе; Хаа34 - Lys, Asp, Arg, Glu або Cys; Хаа35 - Gly або Cys; Хаа36 - Gly, Pro, Arg або Cys; Хаа37 - Gly, Pro, Ser або Cys; Хаа38 - Ser, Pro, His або Cys; Хаа39 - Ser, Arg, Thr, Trp, Lys або Cys; Xaa40 - Ser, Gly або Cys; Xaa41 - Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly або Cys; Xaa42 - Pro, Ala, Cys, NH2 або відсутня; Хаа43 - Pro, Ala, Cys, NH2 або відсутня; Xaa44 - Pro, Ala, Arg, Lys, His, Cys, NH2 або відсутня; Xaa45 - Ser, His, Pro, Lys, Arg, Cys, NH2 або відсутня; Xaa46 - His, Ser, Arg, Lys, Cys, NH2 або відсутня; та Xaa47 - His, Ser, Arg, Lys, Cys, NH2 або відсутня; та де: 2 або 1 залишок Cys ковалентно приєднаний до молекули поліетиленгліколю, або 3, 2 або 1 залишок Lys ковалентно приєднаний до молекули поліетиленгліколю або амінокислота карбоксильного кінця ковалентно приєднана до молекули поліетиленгліколю; та за умови, що у разі відсутності Хаа42, Хаа43, Хаа44, Хаа45 або Хаа46, відсутньою є також кожна кислота у 5'-3' напрямку; та за умови, що згадана молекула має 2, 1 або 0 Cys. Іншим варіантом здійснення цього винаходу є пегільована сполука GLP-1, що містить амінокислотну послідовність Формули V (ПОСЛІДОВНІСТЬ №7): Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Xaa11-Xaa12-Thr-Ser-AspXaa16-Ser-Ser-Tyr-Lys-Glu-Хаа22-Хаа23-Хаа24-Хаа25Хаа26-Хаа27-Рhе-Іlе-Хаа30-Тrр-Leu-Хаа33-Хаа34Хаа35-Хаа36-Хаа37-Хаа38-Хаа39-Хаа40-Хаа41-Хаа42Хаа43-Хаа44-Хаа45-Хаа46-Хаа47 Формула V (ПОСЛІДОВНІСТЬ №7), де: Хаа7 - L-гістидин, D-гістидин, дезаміногістидин, 2-аміногістидин, β-гідроксигістидин, гомогістидин, фторметилгістидин або -метилгістидин; Хаа8 - Gly, Val, Leu, lle, Ser або Thr; Хаа11 - Thr або Cys; Xaa12 - Phe або Cys; Xaa16 - Val, Trp, lle, Leu, Phe, Туr або Cys; Xaa22 - Gly, Glu, Asp, Lys або Cys; Хаа23 - Gln або Cys; Xaa24 - Ala або Cys; Xaa25 - Ala, Val, lle, Leu або Cys; Xaa26 - Lys або Cys; Xaa27 - Glu або Cys; Хаа30 - Ala або Cys; Xaa33 - Val або llе; Хаа34 - Lys, Asp, Arg, Glu або Cys; Хаа35 - Gly або Cys; Хаа36 - Gly, Pro, Arg або Cys; Хаа37 - Gly, Pro, Ser або Cys; Xaa38 - Ser, Pro, His або Cys; Xaa39 - Ser, Arg, Thr, Tip, Lys або Cys; Xaa40 - Ser, Gly або Cys; 92451 10 Xaa41 - Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly або Cys; Xaa42 - Pro, Ala або Cys; Xaa43 - Pro, Ala або Cys; Xaa44 - Pro, Ala, Arg, Lys, His, Cys, NH2 або відсутня; Xaa45 - Ser, His, Pro, Lys, Arg, Cys, NH2 або відсутня; Хаа46 - His, Ser, Arg, Lys, Cys, NH2 або відсутня; та Xaa47 - His, Ser, Arg, Lys, Cys, NH2 або відсутня; та де: 2 або 1 залишок Cys ковалентно приєднаний до молекули поліетиленгліколю, або 3, 2 або 1 залишок Lys ковалентно приєднаний до молекули поліетиленгліколю або амінокислота карбоксильного кінця ковалентно приєднана до молекули поліетиленгліколю; та за умови, що у разі відсутності Хаа44, Хаа45, Хаа46 або Хаа47, відсутньою є також кожна кислота у 5'-3' напрямку; та за умови, що згадана молекула має 2, 1 або 0 Cys. Іншим варіантом здійснення цього винаходу є пегільована сполука GLP-1, що містить амінокислотну послідовність Формули VI (ПОСЛІДОВНІСТЬ №8): Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Xaa11-Xaa12-Thr-Ser-AspXaa16-Ser-Ser-Tyr-Lys-Glu-Хаа22-Хаа23-Хаа24-Хаа25Хаа26-Хаа27-Рhе-Іlе-Хаа30-Тrp-Leu-Хаа33-Хаа34Хаа35-Хаа36-Хаа37-Хаа38-Хаа39-Хаа40-Хаа41-Хаа42Хаа43-Хаа44-Хаа45-Хаа46-Хаа47 Формула VI (ПОСЛІДОВНІСТЬ №8), де: Хаа7 - L-гістидин, D-гістидин, дезаміногістидин, 2-аміногістидин, β-гідроксигістидин, гомогістидин, фторметилгістидин або -метилгістидин; Хаа8 - Gly, Val, Leu, lle, Ser або Thr; Хаа11 - Thr або Cys; Хаа12 - Phe або Cys; Xaa16 - Val або Cys; Хаа22 - Gly, Glu, Asp, Lys або Cys; Хаа23 - Gln або Cys; Xaa24 - Ala або Cys; Xaa25 - Ala, Val, lle, Leu або Cys; Хаа26 - Lys або Cys; Xaa27 - Glu або Cys; Хаа30 - Ala або Cys; Xaa33 - Val або lle; Хаа34 - Lys або Cys; Xaa35 - Gly або Cys; Хаа36 - Gly або Cys; Xaa37 - Pro або Cys; Хаа38 - Ser, Pro, His або Cys; Хаа39 - Ser, Arg, Thr, Тrp, Lys або Cys; Xaa40 - Ser, Gly або Cys; Xaa41 - Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly або Cys; Xaa42 - Pro, Ala або Cys; Хаа43 - Pro, Ala або Cys; Xaa44 - Pro, Ala, Arg, Lys, His, Cys, NH2 або відсутня; Xaa45 - Ser, His, Pro, Lys, Arg, Cys, NH2 або відсутня; Хаа46 - His, Ser, Arg, Lys, Cys, NH2 або відсутня; та 11 ня; Xaa47 - His, Ser, Arg, Lys, Cys, NH2 або відсут та де: 2 або 1 залишок Cys ковалентно приєднаний до молекули поліетиленгліколю, або 3, 2 або 1 залишок Lys ковалентно приєднаний до молекули поліетиленгліколю або амінокислота карбоксильного кінця ковалентно приєднана до молекули поліетиленгліколю; та за умови, що у разі відсутності Хаа44, Хаа45, Хаа46 або Хаа47, відсутньою є також кожна кислота у 5'-3' напрямку; та за умови, що згадана молекула має 2, 1 або 0 Cys. Іншим варіантом здійснення цього винаходу є пегільована сполука GLP-1, що містить амінокислотну послідовність Формули VII (ПОСЛІДОВНІСТЬ №9): His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-SerSer-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-AlaTrp-Leu-Val-Lys-Gly-Gry-Pro-Xaa38-Хaa39-Хaa40Хаа41-Хаа42-Хаа43-Хаа44-Хаа45-Хаа46-Хаа47-Хаа48Хaa49-Хaa50 Формула VII (ПОСЛІДОВНІСТЬ №9), де: Хаа11 - Thr або Cys; Хаа12 - Phe або Cys; Хаа16 - Val або Cys; Хаа22 - Gly або Cys; Хаа23 - Gln або Cys; Хаа24 - Ala або Cys; Хаа25 - Ala або Cys; Хаа26 - Lys або Cys; Хаа27 - Glu або Cys; Хаа30 - Ala або Cys; Хаа37 - Lys або Cys; Хаа35 - Gly або Cys; Хаа36 - Gly або Cys; Хаа37 - Pro або Cys; Хаа38 - Ser, Pro, His або Cys; Хаа39 - Ser, Arg, Thr, Trp, Lys або Cys; Xaa40 - Ser, Gly або Cys; Xaa41 - Ala, Asp, Arg, Glu, Lys, Gly або Cys; Xaa42 - Pro, Ala, Cys, NH2 або відсутня; Хаа43 - Pro, Ala, Cys, NH2 або відсутня; Xaa44 - Pro, Ala, Arg, Lys, His, Cys, NH2 або відсутня; Xaa45 - Ser, His, Pro, Lys, Arg, Gly, Cys, NH2 або відсутня; Хаа46 - His, Ser, Arg, Lys, Pro, Gly, Cys, NH2 або відсутня; та Xaa47 - His, Ser, Arg, Lys, Cys, NH2 або відсутня; Xaa48 - Gly, His, Cys, NH2 або відсутня; Xaa49 - Pro, His, Cys, NH2 або відсутня; та Хаа50 - Ser, His, Cys, Ser-NH2, His-NH2, CysNH2 або відсутня; де згадана сполука GLP-1 включає від однієї до семи додаткових замін та де: 2 або 1 залишок Cys ковалентно приєднаний до молекули поліетиленгліколю, або 3, 2 або 1 залишок Lys ковалентно приєднаний до молекули поліетиленгліколю або амінокислота карбоксильного кінця ковалентно приєднана до молекули поліетиленгліколю; 92451 12 та за умови, що у разі відсутності Хаа44, Хаа45, Хаа46 або Хаа47, відсутньою є також кожна кислота у 5'-3' напрямку; та за умови, що згадана молекула має 2, 1 або 0 Cys; та за умови, що у разі відсутності Хаа42, Хаа43, Хаа44, Хаа45, Хаа46, Хаа47, Хаа48 або Хаа49, відсутньою є також кожна кислота у 5'-3' напрямку. Варіанти здійснення Формули I-VII, яким віддають перевагу, включають сполуки GLP-1, що відрізняються від GLP-1(7-37)OH або GLP-1(736)NH2 не більше ніж 7 амінокислотами, не більше ніж 6 амінокислотами, не більше ніж 5 амінокислотами, не більше ніж 4 амінокислотами або не більше ніж З амінокислотами. Перевагу віддають також тому, щоб сполуки GLP-1 Формул I-VII мали валін або гліцин у положенні 8 і глутамінову кислоту у положенні 22. Перевагу віддають також тому, щоб сполуки GLP-1 Формул I-VII мали валін або гліцин у положенні 8 і глутамінову кислоту у положенні 30. Перевагу віддають також тому, щоб сполуки GLP-1 Формул I-VII мали валін або гліцин у положенні 8 і гістидин або цистеїн у положенні 37. Перевагу віддають також тому, щоб сполуки GLP-1 Формул І-VII мали 2 або 1 чи 0 залишків цистеїну. Перевагу віддають також тому, щоб на одну сполуку GLP-1 припадала одна молекула поліетиленгліколю. Іншим варіантом здійснення цього винаходу є пегільована сполука GLP-1, що містить амінокислотну послідовність Формули VIII (ПОСЛІДОВНІСТЬ №10): Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-Xaa14Xaa15-Xaa16-Xaa17-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Xaa21-Xaa22Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Xaa30Xaa31-Xaa32-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38Xaa39-Xaa40-Xaa41-Xaa42-Хаа43-Хаа44-Хаа45 Формула VIII (ПОСЛІДОВНІСТЬ №10), де: Хаа7 - L-гістидин, D-гістидин, дезаміногістидин, 2-аміногістидин, β-гідроксигістидин, гомогістидин, фторметилгістидин, -метилгістидин, Arg, Туr, Ala або Val; Хаа8 - Gly, Ser, Ala або Thr; Xaa9 - Glu, Ala або Asp; Xaa10 - Gly, Ala або Val; Xaa11 - Thr, Cys або Ala; Xaa12 - Phe, Cys, Ala або Туг; Xaa13 - Thr або Ser; Xaa14 - Ser, Ala або Thr; Xaa15 - Asp або Glu; Xaa16 - Leu, Cys, Ala, lle, Val або Met; Xaa17 - Ser або Ala; Xaa18 - Lys або Ala; Xaa19 - Gln або Ala; Xaa20 - Met, Ala, Leu, lle або Val; Xaa21 - Glu або Ala; Xaa22 - Glu, Cys або Ala; Хаа23 - Glu, Cys або Ala; Xaa24 - Ala або Cys; Xaa25 - Val, Cys або Ala; Xaa26 - Arg, Cys або Ala; Xaa27 - Leu, Cys або Ala; Xaa28 - Phe, Ala або Тут; Xaa29 - lle, Val, Leu, Gly або Met; Xaa30 - Glu, Cys, Ala або Asp; 13 Хаа31 - Trp, Ala, Phe або Туr; Хаа32 - Leu або Ala; Xaa33 - Lys або Ala; Хаа34 - Asn, Cys або Ala; Хаа35 - Gly або Cys; Хаа36 - Gly або Cys; Xaa37 - Pro або Cys; Хаа38 - Ser, Cys, NH2 або відсутня; Хаа39 - Ser, Cys, NH2 або відсутня; Хаа40 is - Gly, Cys, NH2 або відсутня; Хаа41 - Ala, Cys, NH2 або відсутня; Xaa42 - Pro, Cys, NH2 або відсутня; Хаа43 - Pro, Cys, NH2 або відсутня; Xaa44 - Pro, Cys, NH2 або відсутня; та Xaa45 - Ser, Cys, NH2 або відсутня; та де: 2 або 1 залишок Cys ковалентно приєднаний до молекули поліетиленгліколю, та за умови, що молекула має 2 або 1 Cys; за додаткової умови, що не більше трьох з-посеред Хаа9, Хаа10, Хаа11, Хаа12, Хаа14, Хаа15, Хаа16, Хаа17, Хаа18, Хаа19, Хаа20, Хаа21, Хаа22, Хаа23, Хаа24, Хаа26, Хаа27, Хаа30, Хаа31, Хаа32 є Ala; та за умови, що у разі якщо Xaa1 є His, Arg або Туr, тоді принаймні одна з-посеред Хаа9, Хаа10 та Хаа16 є Ala; та за додаткової умови, що у разі відсутності Хаа38, Хаа39, Хаа40, Хаа41, Хаа42, Хаа43 або Хаа44, відсутньою є також кожна кислота у 5'-3' напрямку. Положення 7, 28, 29, 31 та 32 Формули VIII не можуть бути зайняті амінокислотою цистеїном без наслідкової неприйнятної втрати активності. Полімери поліетиленгліколю ("PEG"), що застосовуються у цьому винаході, за варіантом, якому віддають перевагу, мають молекулярну масу у межах від 500Да до 100000Да, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, у межах від 20000Да до 60000Да; за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, у межах від 20000Да до 40000Да; можуть бути нерозгалуженими або розгалуженими молекулами і можуть бути похідними поліетиленгліколю, як описується у цій галузі. Цей винахід включає спосіб стимулювання рецептораGLP-1 у суб'єкта, що потребує такого стимулювання, причому згаданий спосіб включає стадію введення згаданому суб'єкту ефективної кількості пегільованої сполуки GLP-1, опис якої наводиться. Цей винахід включає також спосіб стимулювання рецептора GLP-1 у суб'єкта, що потребує такого стимулювання, причому згаданий спосіб включає стадію введення згаданому суб'єкту ефективної кількості непегільованої сполуки GLP-1 з послідовністю, яка представлена ПОСЛІДОВНОСТЯМИ № 3-Ю за умови, що згадана молекула має 2 або 1 Cys. До суб'єктів, що потребують стимулювання рецептора GLP-1, належать ті, що страждають на інсулінонезалежний діабет, стрес-індуковану гіперглікемію, ожиріння, розлади рухової функції шлунка та/або перистальтики кишечнику чи розлади випорожнювання шлунка та/або кишечнику, у тому числі, наприклад, синдром подразненої товстої кишки та функціональну диспепсію. Докладний опис винаходу Глюкагоноподібний пептид 1 (GLP-1) є пептидом, що складається з 37 амінокислот і секрету 92451 14 ється L-клітинами кишечнику у відповідь на ковтання їжі. У цій галузі існує опис численних аналогів і похідних GLP-1. Цей винахід описує модифікації сполук GLP-1, наслідком яких є подовжений період напіввиведення та/або знижена швидкість виведення. Шляхом введення 1 або 2 залишків Cys на ділянки певних амінокислот згаданого пептиду одержують тіолову групу, з якою ковалентно зв'язується поліетиленгліколь (PEG) або похідна поліетиленгліколю, наслідком чого є одержання пегільованої сполуки GLP-1. На додаток до цього, залишки лізину або карбоксильний кінець пептидів, аналогів або фрагментів GLP-1 за цим винаходом можуть ковалентно зв'язуватись з однією або декількома молекулами поліетиленгліколю або похідної поліетиленгліколю з одержанням молекули з подовженим періодом напіввиведення та/або зниженою швидкістю виведення. GLP-1(7-37)OH має амінокислотну послідовність, представлену ПОСЛІДОВНІСТЮ №1: 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 His- Ala- Glu- Gly- Thr- Phe- Thr- Ser- Asp- Val- Ser18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Ser- Tyr- Leu- Glu- Gly- Gln- Ala- Ala- Lys- Gly- Phe29 30 31 32 33 34 35 36 37 lle- Ala- Trp- Leu- Val- Lys- Gly- Arg- Gly(Послідовність №1) Термін "поліпептид" або "пептид", що застосовується у цьому описі, означає будь-яку структурну форму (наприклад, первинну, вторинну або третинну форму) амінокислотної послідовності, що включає більше за 5 залишків амінокислот, яка може піддаватись або може не піддаватись додатковій модифікації (наприклад, ацетилюванню, карбоксилюванню, фосфорилуванню, ліпідизуванню або ацилюванню). Термін "нативний" означає поліпептид, амінокислотна послідовність якого є ідентичною до амінокислотної послідовності, яка виявляється у природі. Термін "нативний" є призначеним для позначення алельних варіантів конкретного поліпептиду. Термін "амінокислота" застосовується у цьому описі у найширшому значенні і включає природні, а також штучні амінокислоти, у тому числі варіанти і похідні амінокислот. Фахівцю у цій галузі буде зрозуміло, приймаючи до уваги це широке визначення, що посилання на амінокислоту у цьому описі включає, наприклад, природні протеогенні Lамінокислоти; D-амінокислоти; хімічно модифіковані амінокислоти, наприклад, варіанти і похідні амінокислот; природні непротеогенні амінокислоти, наприклад, норлейцин, β-аланін, орнітин тощо; та хімічно синтезовані сполуки, властивості яких, як відомо у цій галузі, є характерними для амінокислот. Прикладами штучних амінокислот є метиламінокислоти (наприклад, -метилаланін), Dамінокислоти, гістидиноподібні амінокислоти (наприклад, 2-аміногістидин, β-гідроксигістидин, гомогістидин, -фторметилгістидин та -метилгістидин), амінокислоти, що мають надлишковий метилен у бічному ланцюзі (гомоамінокислоти) та амінокислоти, у яких карбоновокислотна функціональна група бічного ланцюга замінена на сульфокислот 15 ну групу (наприклад, цистеїнова кислота). Однак, за варіантом, якому віддають перевагу, сполуки GLP-1 за цим винаходом включають лише природні амінокислоти, за винятком конкретних випадків, які вказуються у цьому описі. Термін "сполуки GLP-1", що застосовується у цьому описі, означає нативний GLP-1, [GLP-1(737)OH або GLP-1(7-36)NH2], аналоги GLP-1, похідні GLP-1, біологічно активні фрагменти GLP-1, подовжений GLP-1 або аналог чи фрагмент подовженого пептиду GLP-1 (дивись, наприклад, заявки на патент США №60/346474 та №60/405,097), аналоги ексендину-4 і похідні ексендину-4, що включають один або два залишки Cys у конкретних положеннях згаданого пептиду, як описано у цьому описі. За традицією, прийнятою у цій галузі, амінокінець нативного GLP-1(7-37)OH має номер залишку 7, у той час як карбоксильний кінець позначається номером 37. Інші амінокислоти поліпептиду послідовно нумеруються, як показано у ПОСЛІДОВНОСТІ №1. У нативній молекулі, наприклад, положення 12 займає фенілаланін, а положення 22 займає гліцин. Термін "фрагмент GLP-1" або "фрагмент сполуки GLP-1", що застосовується у цьому описі, означає біологічно активний поліпептид, який одержують після видалення однієї або декількох амінокислот із JV-кінця та/або С-кінця сполуки GLP-1. Номенклатура, яка застосовується для опису GLP1(7-37)OH, може використовуватись і для опису фрагментів GLP-1. Наприклад, GLP-1(9-36)OH означає фрагмент GLP-1, який одержали шляхом усічення двох амінокислот із N-кінця і однієї амінокислоти з С-кінця. Амінокислоти фрагменту позначаються тією самою цифрою, що і відповідна амінокислота GLP-1(7-37)OH. Наприклад, TV-кінцева глутамінова кислота GLP-1(9-36)OH знаходиться у положенні 9; положення 12 займає фенілаланін; а положення 22 зайняте гліцином, як і у GLP-1(737)OH. Сполуки GLP-1 включають аналоги GLP-1 і аналоги ексендину-4. Для кращого розуміння, "аналоги ексендину-4", що входять до групи "сполук GLP-1", завжди мають один або два залишки Cys. За варіантом, якому віддають перевагу, аналог GLP-1 має амінокислотну послідовність GLP1(7-37)OH або подовженого пептиду GLP-1, як описано у заявках на патент США № 60/346474, яка була подана 1 серпня 2002 року, і №60/405,097, яка була подана 21 серпня 2002, обидві з яких мають назву "Extended Glucagon-Like Peptide-1 Analogs", або його фрагменту, модифікованого таким чином, що 1, 2, 3, 4, 5 або 6 амінокислоти відрізняються від амінокислоти, що знаходиться у відповідному положенні GLP-1(7-37)OH або фрагменту GLP-1(7-37)OH, або є модифікованим таким чином, що 0, 1, 2, 3, 4, 5 або 6 амінокислоти відрізняються від амінокислоти, що знаходиться у відповідному положенні подовженого пептиду GLP-1. Опис аналогів GLP-1, яким віддають найбільшу перевагу, наведено у Формулах І, II, III, IV, V, VI і VII. Опис аналогів ексендину-4, яким віддають найбільшу перевагу, наведено у Формулі VIII. 92451 16 Термін "пегільована", у разі посилання на сполуку GLP-1 за цим винаходом, означає сполуку GLP-1, хімічно модифіковану шляхом ковалентного приєднання однієї або декількох молекул поліетиленгліколю або його похідної. Окрім того, термін "PEG" означає поліетиленгліколь або його похідну, відомі у цій галузі (дивись, наприклад, патенти США №5,445,090; №5,900,461; №5,932,462; №6,436,386; №6,448,369; №6,437,025; №6,448,369; №6,495,659; №6,515,100 та №6,514,491). За варіантом, якому віддають перевагу, у пегільованих сполук GLP-1 за цим винаходом, поліетиленгліколь (або його похідна) ковалентно приєднаний до одного або декількох залишків лізину або цистеїну сполуки GLP-1. За варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, поліетиленгліколь ковалентно приєднаний до одного або декількох залишків цистеїну сполуки GLP-1. Для пегілування аналогів ексендину-4 за цим винаходом, поліетиленгліколь приєднують до одного або двох залишків цистеїну, які вводять до ексендину-4 або аналога ексендину-4 у положеннях, вказаних у Формулі VIII. За факультативним варіантом, молекула поліетиленгліколю може бути приєднана до сполуки GLP-1 за допомогою лінкерної або спейсерної молекули (дивись типові спейсерні молекули, описані у патенті США №6,268,343). У номенклатурі, що застосовується у цьому описі для позначення сполук GLP-1, вказують замінну амінокислоту і її положення, з подальшим позначенням назви вихідного пептиду. Наприклад, Glu22-GLP-1(7-37)OH означає сполуку GLP-1, у якій гліцин, що за нормальних обставин знаходиться у положенні 22 GLP-1(7-37)OH, було замінено на глутамінову кислоту; Val8Glu22-GLP-1(7-37)OH (або V8E22-GLP-1(7-37)OH) означає сполуку GLP-1, у якій аланін, що за нормальних обставин знаходиться у положенні 8, і гліцин, що за нормальних обставин знаходиться у положенні 22 GLP-1(737)OH, були замінені на валін та глутамінову кислоту, відповідно. Val8-ексендин-4 означає сполуку GLP-1, у якій серин, що за нормальних обставин знаходиться у положенні 8 ексендину-4, було замінено на валін. За варіантом, якому віддають перевагу, сполуки GLP-1 за цим винаходом мають інсулінотропну активність. Термін "інсулінотропна активність" означає здатність до стимулювання секреції інсуліну у відповідь на підвищені рівні глюкози, що тим самим спричинює засвоєння глюкози клітинами і зниження рівнів глюкози у плазмі. Інсулінотропна активність може визначатись за допомогою методів, відомих у цій галузі, у тому числі із застосуванням експериментів in vivo та аналізів in vitro, що визначають зв'язувальну активність рецептора GLP-1 або активацію рецептора, наприклад, аналізів із застосуванням інсулоцитів підшлункової залози або клітин інсуліноми, як описано у патенті ЕР №619,322 на ім'я Гелфанд (Gelfand) та інші і патенті США №5,120,712, відповідно. Інсулінотропну активність у людей традиційно визначають шляхом визначення рівнів інсуліну або рівнів Спептиду. У цілях цього винаходу, до аналізу передачі сигналу рецептором GLP-1 in vitro вдаються для 17 визначення, чи буде пегільована сполука GLP-1 за цим винаходом демонструвати інсулінотропну активність in vivo. Інсулінотропна активність є активністю, що може застосовуватись для демонстрації того, що пегільована сполука GLP-1 є біологічно активною. Термін "ефективність in vitro", що застосовується у цьому описі, є критерієм здатності пептиду до активації рецептора GLP-1 у аналізі на основі клітин. Ефективність in vitro виражають як "ЕС50", що являє собою ефективну концентрацію сполуки, яка забезпечує 50% активність у експерименті з визначення залежності між разовою дозою і реакцією. У цілях цього винаходу, ефективність in vitro визначають за допомогою флуоресцентного аналізу із застосуванням клітин НЕК-293 (культура клітин нирки людського ембріона), що стабільно експресують рецептор людського GLP-1. Ці клітини НЕК-293 стабільно інтегруються до вектора на основі ДНК, що має елемент реагування цАМФ (CRE), який стимулює експресію гена β-лактамази (BLAM). Взаємодія сполуки (або агоніста) GLP-1 зі згаданим рецептором ініціює сигнал, результатом якого є активація елемента реагування цАМФ і подальша експресія β-лактамази. Після цього субстрат β-лактамази CCF2/AM, який випромінює флуоресценцію у разі розщеплення β-лактамазою (PanVera LLC), додають до клітин, яких піддавали впливу специфічної кількості агоніста GLP-1 для забезпечення визначення активності агоніста GLP1. Докладний опис згаданого аналізу наведено у роботі Злокарнік (Zlokarnik) та інші, (1998) Science 279:84-88. Значення ЕС50 для сполук, перелік яких наведено у Прикладі 4, визначили за допомогою аналізу BLAM, опис якого було наведено вище. Відповідні значення ефективності in vitro можуть бути визначені шляхом аналізування Val8-GLP-1(737)OH або нативного GLP-1 як контролю з призначенням контролю 100% еталонного значення. Термін "період напіввиведення з плазми" означає час, впродовж якого половина відповідних молекул циркулює у плазмі до виведення. Альтернативним терміном є термін "період напіввиведення". Термін "подовжений" або "довший", що застосовується у контексті періоду напіввиведення з плазми або періоду напіввиведення, означає статистично значуще збільшення періоду напіввиведення пегільованої сполуки GLP-1 відносно періоду напіввиведення еталонної молекули (наприклад, непегільованої форми пептиду або нативного пептиду), що визначалось за порівнянних умов. За варіантом, якому віддають перевагу, період напіввиведення пегільованої сполуки GLP-1 за цим винаходом становить щонайменше 1год, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, щонайменше 3год, 5год, 7год, 10год, 15год, 20год і за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, щонайменше 24год. Період напіввиведення, який повідомляється у Прикладі 5 цього опису, являє собою період напіввиведення, що відповідає кінцевій логарифмічній лінійній швидкості виведення. Фахівцям у цій галузі техніки зрозуміло, що період напіввиведення є похідним параметром, що змінюється у залежності як від швидкості виведення, так і об'єму розподілу. 92451 18 Швидкість виведення є показником здатності тіла до виведення лікарського препарату. В міру того як швидкість виведення зменшується унаслідок, наприклад, модифікацій лікарського препарату, може очікуватись збільшення періоду напіввиведення. Ця взаємозалежність точно підтримується, однак, лише у разі відсутності зміни об'єму розподілу. Придатна приблизна залежність між кінцевим логарифмічним лінійним періодом напіввиведення (t1/2), швидкістю виведення (С) і об'ємом розподілу (V) надається рівнянням: t1/2/0,693 (V/C). Швидкість виведення вказує не кількість лікарського засобу, що виводиться, а, скоріше, об'єм біологічної рідини, наприклад, крові або плазми, який повинен бути повністю звільненим від лікарського засобу, щоб вважати це виведенням. Швидкість виведення виражають у вигляді об'єму на одиницю часу. За варіантом, якому віддають перевагу, показник виведення пегільованих сполук GLP-1 за цим винаходом становить 200мл/(год·кг) або менше, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, 180мл/(год·кг), 150мл/(год·кг), 120мл/(год·кг), 100мл/(год·кг), 80мл/(год·кг), 60мл/(год·кг) або менше і, за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, 50мл/(год·кг), 40мл/(год·кг) або 20мл/(год·кг) (Дивись Приклад 5). За цим винаходом, амінокислота Cys не може включатись до GLP-1 або пептидів-аналогів GLP-1 у положеннях 7, 28, 29, 31 або 32 унаслідок втрати активності одержаним пептидом. Припускається, що усі інші залишки можуть бути замінені на цистеїн, однак перевагу віддають тому, щоб цистеїн був включений у положенні(-ях), вибраному з групи, яку складають положення 11, 12, 16, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 34, 35, 36 та 37 GLP-1 або пептидіваналогів GLP-1, причому перевагу віддають тому, щоб на одну молекулу припадало не більше за 2 або 1 амінокислоту цистеїн. У разі присутності амінокислоти цистеїну у молекулі GLP-1, ще більшу перевагу віддають тому, щоб ця кислота знаходилась у положенні(-ях), вибраному(-их) з групи, яку складають положення 22, 26, 34, 35, 36 та 37, і навіть ще більшу перевагу віддають тому, щоб ця амінокислота знаходилась у положенні 26 та/або 34. Одержана молекула може піддаватись пегілуванню на амінокислоті цистеїн, результатом чого є одержання модифікованої молекули, що зберігає усю або частину біологічної активності, з одночасним довшим періодом напіввиведення, аніж відповідний показник немодифікованої молекули або відповідний показник нативної молекули. За альтернативним варіантом цього винаходу, GLP-1 або пептиди-аналоги GLP-1 можуть піддаватись пегілуванню на одному, двох або трьох залишках лізину у положеннях 18, 22 та 26; або на амінокислоті карбоксильного кінця пептиду. Іншим варіантом здійснення цього винаходу є непегільовані сполуки GLP-1 із послідовністю, яка представлена ПОСЛІДОВНОСТЯМИ №3-10, за умови існування у згаданій молекулі 2 або 1 Cys. Заявники відкрили, що залишки у конкретному положенні сполук GLP-1 можуть замінюватись на Cys і все ще зберігати біологічну активність. Ці непегільовані сполуки GLP-1 можуть бути проміж 19 ними продуктами, що застосовуються у процесі одержання пегільованих сполук GLP-1 за цим винаходом. Ці сполуки можуть також застосовуватись як лікарські засоби для лікування розладів, при яких немає потреби у подовженому періоді напіввиведення, наприклад, у разі синдрому подразненої товстої кишки. Після одержання і очищення пептиду для застосування за цим винаходом, він модифікується шляхом ковалентного зв'язування щонайменше однієї молекули поліетиленгліколю із залишками Cys або Lys чи з карбоксикінцевою амінокислотою. Важко надати чутливим молекулам пептиду або білка відповідних нових властивостей шляхом приєднання полімерів без спричинення втрати їх функціональності. У цій галузі існує опис цілого ряду методів здійснення ковалентного зв'язування з поліетиленгліколем і конкретний спосіб, що застосовується у цьому винаході, не є обмежувальним (дивись оглядову роботу Роберте. Μ. (Roberts Μ.) та інші, Advanced Drug Delivery Reviews, 54:459-476, 2002). Зв'язування поліетиленгліколю з карбоксильним кінцем може здійснюватись шляхом ферментативного спряження із застосуванням рекомбінантного пептиду GLP-1 як попередника або за допомогою альтернативних методів, відомих у цій галузі і описаних, наприклад, у патенті США №4,343,898 або у International Journal of Peptide ά Protein Research. 43:127-38, 1994. Шляхом пегілування білків можна подолати багато фармакологічних та токсикологічних/імунологічних проблем, пов'язаних із застосуванням пептидів або білків як лікарських засобів. Однак, для будьякого окремого пептиду немає впевненості у тому, наскільки значною буде втрата біологічної активності пегільованою формою пептиду, порівняно з непегільованою формою цього самого пептиду. На біологічну активність пегільованих білків можуть впливати такі фактори: і) розмір молекули поліетиленгліколю; іі) конкретні ділянки зв'язування; ііі) ступінь модифікування; iv) несприятливі умови сполучення; ν) для зв'язування застосовується сполучна група або ж відбувається безпосереднє зв'язування полімеру; vi) одержання шкідливих побічних продуктів; vii) пошкодження, що спричинюється активованим полімером; або viii) збереження заряду. У залежності від реакції сполучення, що застосовується, наслідком модифікації цитокінів полімерами, зокрема, є різке зниження біологічної активності [Френсіс Г.Е. (Francis G.E.) та інші, (1998) PEGylation of cytokines and other therapeutic proteins and peptides: the importance of biological optimization of coupling techniques, Intl. J. Hem. 68:1-18]. Біологічна активність in vitro пегільованих сполук GLP-1 за цим винаходом становить щонайменше 0,5% від біологічної активності нативного GLP-1 або, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, від біологічної активності Val8-GLP-1(737)OH. За варіантом, якому віддають більшу перевагу, біологічна активність in vitro пегільованих сполук GLP-1 за цим винаходом становить щонайменше 1% або 3% від біологічної активності нативного GLP-1 або, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, від біологічної активності 92451 20 Valg-GLP-1(7-37)OH. Така біологічна активність може визначатись аналізом активності in vitro, як описано (Приклад 4) або іншими аналізами GLP-1, відомими у цій галузі. Незважаючи на те, що біологічна активність деяких пегільованих сполук GLP-1 за цим винаходом може бути нижчою за біологічну активність нативного GLP-1 або Val8GLP-1(7-37)OH, як визначається конкретним аналізом, це зниження активності компенсується подовженим періодом напіввиведення та/або нижчим показником виведення цієї сполуки і може навіть бути сприятливою характеристикою для сполуки GLP-1 з подовженим періодом напіввиведення. Додатково припускається, що положення пептиду GLP-1, у яких, як було встановлено, знаходиться залишок цистеїну без втрати біологічної активності, можуть бути замінені на цистеїн у аналогічному положенні ексендину-4 із забезпеченням одержання аналога ексендину-4, який все ще зберігає здатність до зв'язування рецептора GLP-1. За варіантом, якому віддають перевагу, аналог ексендину-4 за цим винаходом має не більше за 2 або 1 амінокислоту Cys. За варіантом, якому віддають перевагу, залишки Cys, що знаходяться у згаданій молекулі, займають положення, вибрані з групи, яку складають положення 11, 12, 16, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 та 44 (дивись Формулу VIII); за варіантом, якому віддають перевагу, положення, вибрані з групи, яку складають положення 22, 26, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 та 44; і за варіантом, якому віддають ще більшу перевагу, положення 26 та/або 34. Амінокислоти Cys, що знаходяться у згаданій молекулі, ковалентно приєднані до молекули поліетиленгліколю, результатом чого є одержання пегільованого аналога ексендину-4 з періодом напіввиведення, довшим за період напіввиведення нативного ексендину-4. За варіантом, якому віддають перевагу, пегільований пептид-аналог ексендину-4 (як описано у Формулі VIII) за цим винаходом має біологічну активність, що становить щонайменше 0,5%, 1,0%, 3%, 10%, 30% або 50% від біологічної активності непегільованого аналога ексендину-4. Послідовність ексендину-4 дикого типу виглядає так: HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGA PPS (ПОСЛІДОВНІСТЬ №11). У своїй типовій формі, поліетиленгліколь являє собою нерозгалужений полімер із кінцевими гідроксильними групами і має формулу НОСН2СН2-(СН2СН2О)n-СН2СН2-ОН, де n знаходиться у межах від приблизно 8 до приблизно 4000. Кінцевий атом водню може замінюватись на захисну групу, наприклад, алкільну або алканольну групу. За варіантом, якому віддають перевагу, поліетиленгліколь має щонайменше одну гідроксильну групу, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, це є кінцева гідроксильна група. Це саме та гідроксильна група, що за варіантом, якому віддають перевагу, активується для реагування з пептидом. Існує багато форм поліетиленгліколю, придатних для цього винаходу. У цій галузі існують численні похідні поліетиленгліколю, які є придатними для застосування у цьому винаході. (Дивись, 21 наприклад, патенти США №5,445,090; №5,900,461; №5,932,462; №6,436,386; №6,448,369; №6,437,025; №6,448,369; №6,495,659; №6,515,100 та №6,514,491 і роботу Заліпскі С. (Zalipsky S.) Bioconjugate Chem. 6:150-165, 1995). Молекула поліетиленгліколю, ковалентно приєднана до сполук GLP-1 за цим винаходом, не обмежується конкретним типом. Молекулярна маса поліетиленгліколю, за варіантом, якому віддають перевагу, становить 500-100,000Да, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, 20,000-60,000Да і за варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, 20,000-40,000Да. Молекула поліетиленгліколю може бути нерозгалуженою або розгалуженою і пегільовані сполуки GLP-1 за цим винаходом можуть мати 1, 2, 3, 4, 5 або 6 молекул поліетиленгліколю, приєднаних до згаданого пептиду. За варіантом, якому віддають найбільшу перевагу, на одну молекулу пегільованої сполуки GLP-1 припадає одна молекула поліетиленгліколю; однак у разі, коли на молекулу пептиду припадає більше однієї молекули поліетиленгліколю, перевагу віддають варіанту, за яким їх повинно бути не більше шести. Додатково передбачається, що обидва кінці молекули поліетиленгліколю можуть мати гомо- або гетерофункціональні групи для перехресного зв'язування двох або декількох сполук GLP1. Цей винахід пропонує сполуки GLP-1 з ковалентно приєднаними до них однією або декількома молекулами поліетиленгліколю. Один зі способів одержання пегільованих сполук GLP-1 за цим винаходом залучає застосування поліетиленглікольмалеіміду для безпосереднього приєднання поліетиленгліколю до тіолової групи згаданого пептиду. Введення тіолової функціональної групи може здійснюватись шляхом додання або введення залишку Cys до пептиду у положеннях, опис яких було наведено вище. Тіолова функціональна група може також вводитись до бічного ланцюга згаданого пептиду (наприклад, шляхом ацилювання аміногрупи лізину тіоловмісної кислоти). У процесі пегілування за цим винаходом, для одержання стабільної тіоефірної сполучної групи вдаються до реакції Міхаеля. Згадана реакція є високоспецифічною і відбувається за м'яких умов у присутності інших функціональних груп. Поліетиленглікольмалеімід застосовувався як хімічно активний полімер для одержання чітко визначених, біологічно активних кон'югатів поліетиленгліколю-білка. За варіантом, якому віддають перевагу, у цій процедурі застосовують мольний надлишок тіоловмісної сполуки GLP-1 відносно поліетиленглікольмалеіміду для проходження реакції до її завершення. Згадані реакції, за варіантом, якому віддають перевагу, здійснюють при рН у межах від 4,0 до 9,0 при кімнатній температурі впродовж 15-40год. Надлишок непегільованого тіоловмісного пептиду легко відокремлюють від пегільованого продукту за допомогою традиційних методів відокремлення. Типові умови, необхідні для пегілування сполук GLP-1, наведені у Прикладі 1. Пегілування цистеїну може бути здійснене з використанням поліетиленглікольмалеіміду або розгалуженого поліетиленглікольмалеіміду. 92451 22 Сполуки GLP-1 мають різноманітні біологічні активності. Було, наприклад, встановлено, що GLP-1 стимулює виділення інсуліну, що спричинює засвоєння глюкози клітинами і зниження рівнів глюкози у сироватці [дивись, наприклад, Мойсов С. (Mojsov S.) (1992) Int. J. Peptide Protein Research, 40:333]. GLP-1 є особливо перспективним як лікарський засіб у разі інсулінонезалежного цукрового діабету (NIDDM), оскільки він не викликає ризику виникнення гіпоглікемії подібно до лікарських засобів, які застосовуються при лікування NIDDM. GLP-1 передбачається також як лікарський засіб для лікування ожиріння, синдрому подразненої товстої кишки і функціональної диспепсії. Передбачається, що застосування пегільованої сполуки GLP-1 за цим винаходом включає її застосування при виготовленні лікарського засобу для лікування інсулінонезалежного діабету, ожиріння, інсульту, інфаркту міокарда, синдрому подразненої товстої кишки або функціональної диспепсії. Пегілування сполуки GLP-1 може комбінуватись з іншими способами модифікування, відомими у цій галузі, для збільшення періоду напіввиведення GLP-1 (дивись, наприклад, заявки на патент США №60/346474, яка була подана 1 серпня 2002 року, і №60/405,097, яка була подана 21 серпня 2002 року), тобто для збільшення періоду напіввиведення згаданої сполуки навіть більше, ніж у разі лише пегілування або застосування іншого способу модифікування. Термін "сполуки GLP-1", що застосовується у цьому описі, охоплює також фармацевтично прийнятні солі сполук, опис яких наводиться. Сполука GLP-1 за цим винаходом може мати достатньо кислотну, достатньо основну або обидві функціональні групи і, відповідно, реагувати з будь-якою з цілого ряду неорганічних основ, неорганічних і органічних кислот з одержанням солі. Кислоти, які традиційно застосовуються для одержання солей, які одержують доданням кислот, є неорганічними кислотами, наприклад, хлористоводневою кислотою, бромистоводневою кислотою, йодистоводневою кислотою, сірчаною кислотою, фосфорною кислотою тощо, та органічними кислотами, наприклад, p-толуолсульфоновою кислотою, метансульфоновою кислотою, щавлевою кислотою, pбромфенілсульфоновою кислотою, вугільною кислотою, бурштиновою кислотою, лимонною кислотою, бензойною кислотою, оцтовою кислотою тощо. Прикладами таких солей є сульфат, піросульфат, бісульфат, сульфіт, бісульфіт, фосфат, вторинний кислий ортофосфат, первинний кислий ортофосфат, метафосфат, пірофосфат, хлорид, бромід, йодид, ацетат, пропіонат, деканоат, каприлат, акрилат, форміат, ізобутират, капроат, гептаноат, пропіолат, оксалат, малонат, сукцинат, суберат, себацат, фумарат, малеат, бутин1,4-діоат, гексин-1,6-діоат, бензоат, хлорбензоат, метилбензоат, динітробензоат, гідроксибензоат, метоксибензоат, фталат, сульфонат, ксилолсульфонат, фенілацетат, фенілпропіонат, фенілбутират, цитрат, лактат, гамма-гідроксибутират, гліколят, тартрат, метансульфонат, пропансульфонат, нафталін-1-сульфонат, нафталін-2-сульфонат, манделат тощо. 23 До солей, які одержують доданням основи, належать солі, одержані з неорганічних основ, наприклад, гідроксиди, карбонати, бікарбонаті амонію або лужних чи лужноземельних металів тощо. До таких основ, придатних для одержання солей за цим винаходом, належать, таким чином, гідроксид натрію, гідроксид калію, гідроксид амонію, карбонат калію тощо. Пегільовані сполуки GLP-1 за цим винаходом є особливо придатними для парентерального введення. Вони можуть вводитись також пероральним шляхом, назальним шляхом або шляхом інгаляції. Парентеральне введення може включати, наприклад, системне введення, наприклад, внутрішньом'язове, внутрішньовенне, підшкірне або внутрішньоочеревинне впорскування. Пегільовані сполуки GLP-1 можуть вводитись суб'єкту у поєднанні з прийнятним фармацевтичним носієм, розріджувачем або наповнювачем, як частина фармацевтичної композиції для лікування захворювань, які обговорювались вище. Фармацевтична композиція може бути розчином або, у разі парентерального введення, суспензією сполуки GLP-1 або суспензією сполуки GLP-1 у поєднанні з катіоном двохвалентного металу, наприклад, цинку. До складу придатних фармацевтичних носіїв можуть входити інертні інгредієнти, які не взаємодіють із пептидом або похідною пептиду. Можуть застосовуватись стандартні способи одержання фармацевтичних композицій, наприклад, описані у довіднику Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, штат Пенсільванія. Придатними фармацевтичними носіями для парентерального введення є, наприклад, стерильна вода, фізіологічний розчин, бактеріостатичний фізіологічний розчин (фізіологічний розчин, до складу якого входить приблизно 0,9% (мас./об'єм.) хлориду натрію), забуферений фосфатом фізіологічний розчин, розчин Хенкса, розчин лактату Рінгера-Локка тощо. Деякими прикладами придатних наповнювачів є лактоза, декстроза, цукроза, трегалоза, сорбіт і маніт. Пегільовані сполуки GLP-1 за цим винаходом можна вводити до складу лікарських засобів для введення таким чином, що рівні їх вмісту у плазмі крові підтримуються у ефективному діапазоні впродовж тривалих періодів часу. Головною перепоною для ефективної пероральної доставки пептиду, що застосовується як лікарський засіб, є низька біодоступність унаслідок розкладу пептидів кислотами та ферментами, низький рівень абсорбування через епітеліальні оболонки та перехід пептидів до нерозчинної форми під впливом середовища з кислим рН у травному тракті. Системи пероральної доставки пептидів, що передбачаються цим винаходом, є відомими у цій галузі. Пегільовані сполуки GLP-1 можуть, наприклад, включатись до желатинових мікросфер із подальшою пероральною доставкою. Пегільовані сполуки GLP-1 можуть, наприклад, включатись до мікросфер, до складу яких входить комерційно доступний, біосумісний полімер, що піддається біологічному розкладу, співполімер лактиду та гліколідуСООН, і оливкова олія як наповнювач. Дивись Джозеф (Joseph) та інші (2000) Diabetologia 92451 24 43:1319-1328. Комерційно доступною є також технологія виготовлення мікросфер інших типів, наприклад, із полімерів Medisorb® and Prolease® (фірма Alkermes), що піддаються біологічному розкладу. Полімери Medisorb® можуть бути одержані з будь-яким з ізомерів лактиду. Співвідношення лактид:гліколід може змінюватись у межах від 0:100 до 100:0, що надає можливість одержання полімеру з широким діапазоном властивостей. Це надає можливість конструювання систем доставки та імплантаційних засобів із тривалістю всмоктування, що коливається у межах від тижнів до місяців. У журналі "Emisphere" були надруковані численні статті з обговоренням технології пероральної доставки пептидів і білків. Дивись, наприклад, WO 9528838 на ім'я Леон-бей (Leonebay), у якому розкривають специфічні носії, до складу яких входять модифіковані амінокислоти, що полегшують абсорбцію. Пегільовані сполуки GLP-1, опис яких наведено, можуть застосовуватись для лікування суб'єктів з різноманітними захворюваннями і станами. Пегільовані сполуки GLP-1, передбачені цим винаходом, проявляють свої біологічні ефекти дією на рецептор, що згадується, як "рецептор GLP-1" (дивись Діллон (Dillon) та інші (1993) Cloning and Functional Expression of the Human Glucagon-like Peptide-1 (GLP-1) Receptor, Endocrinology, 133:1907-1910). Суб'єкти із захворюваннями та/або станами, що сприятливо реагують на стимулювання рецептора GLP-1 або на введення сполук GLP-1, можуть, таким чином, лікуватись пегільованими сполуками GLP-1 за цим винаходом. Про таких суб'єктів говорять, що вони "потребують лікування сполуками GLP-1" або "потребують стимулювання рецептора GLP-1". До них належать суб'єкти з інсулінонезалежним діабетом, інсулінозалежним діабетом, інсультом (дивись WO 00/16797 на ім'я Ефендік (Efendic)), інфарктом міокарда (дивись WO 98/08531 на ім'я Ефендік (Efendic)), ожирінням (дивись WO 98/19698 на ім'я Ефендік (Efendic)), змінами катаболізму після хірургічного втручання (дивись патент США №6,006,753 на ім'я Ефендік (Efendic)), функціональною диспепсією та синдромом подразненої товстої кишки (дивись WO 99/64060 на ім'я Ефендік (Efendic)). До них належать також суб'єкти, що потребують профілактичного лікування сполукою GLP-1, наприклад, суб'єкти з групи ризику розвитку інсулінонезалежного діабету (дивись WO 00/07617). До числа додаткових належать суб'єкти зі зниженням толерантності до глюкози або порушеним рівнем глюкози крові натщесерце, суб'єкти, маса тіла яких приблизно на 25% перевищує нормальну масу тіла для зросту та будови тіла цього суб'єкта, суб'єкти з частковою панкреатектомією, суб'єкти, що мають одного або декілька батьків з інсулінонезалежним діабетом, суб'єкти, що мали гестаційний діабет та суб'єкти, що мали гострий або хронічний панкреатит і знаходяться у групі ризику розвитку інсулінонезалежного діабету. Пегільовані сполуки GLP-1 можуть застосовуватись для нормалізації рівнів глюкози крові, запобігання вичерпання функції β-клітин підшлункової 25 залози, індукування проліферації β-клітин, стимулювання транскрипції гена інсуліну, забезпечення активації IDX-1/PDX-1 або інших факторів росту, поліпшення функціонування β-клітин, активації сплячих β-клітин, диференціювання клітин на βклітини, стимулювання розмноження β-клітин, пригнічення апоптозу β-клітин, регулювання маси тіла і індукування втрати маси. "Ефективною кількістю" пегільованої сполуки GLP-1 є кількість, що забезпечує бажаний терапевтичний та/або профілактичний ефект без спричинення неприйнятних побічних ефектів у разі введення суб'єкту, що потребує стимулювання рецептора GLP-1. Термін "бажаний терапевтичний ефект" включає один або декілька з наведених далі пунктів: 1) поліпшення симптому(-ів), пов'язаного(-них) із захворюванням або станом; 2) уповільнення появи симптомів, пов'язаних із захворюванням або станом; 3) підвищення тривалості життя порівняно з відсутністю лікування; і 4) кращу якість життя порівняно з відсутністю лікування. Наприклад, "ефективною кількістю" пегільованої сполуки GLP-1 для лікування діабету є кількість, яка забезпечить краще регулювання концентрації глюкози крові, аніж за відсутності лікування, результатом чого буде уповільнення появи діабетичних ускладнень, наприклад, ретинопатії, невропатії або хвороби нирок. "Ефективною кількістю" пегільованої сполуки GLP-1 для запобігання діабету є кількість, що уповільнить, порівняно з відсутністю лікування, появу підвищених рівнів глюкози крові, які потребували б лікування антигіпоглікемічними лікарськими засобами, наприклад, сульфонілсечовиною, тіазолідиндіонами, інсуліном та/або бігуанідинами. "Ефективна кількість" пегільованої сполуки GLP-1, введеної суб'єкту, буде залежати також від типу та тяжкості захворювання і від характеристик суб'єкта, наприклад, загального стану здоров'я, віку, статі, маси тіла і толерантності до лікарських засобів. У типовому випадку, пегільовані сполуки GLP-1 за цим винаходом будуть вводитись таким чином, що їх рівні у плазмі будуть знаходиться у діапазоні від приблизно 5пмоль/л до приблизно 200пмоль/л. Було визначено, що оптимальні рівні Val8-GLP-1(7-37)OH у плазмі знаходяться у межах від приблизно 30пмоль/л до приблизно 200пмоль/л. Типовий діапазон дозування пегільованих сполук GLP-1 за цим винаходом буде становити для дорослих від приблизно 0,01мг на добу до приблизно 1000мг на добу. За варіантом, якому віддають перевагу, величина дози коливається у межах від приблизно 0,1мг на добу до приблизно 100мг на добу, за варіантом, якому віддають більшу перевагу, від приблизно 1,0мг на добу до приблизно 10мг на добу. "Суб'єктом" є ссавець, за варіантом, якому віддають перевагу, людина, однак це може бути також тварина, наприклад, домашні тварини (наприклад, собаки, кішки тощо), сільськогосподарські тварини (наприклад, корови, вівці, свині, коні тощо) та лабораторні тварини (наприклад, пацюки, миші, морські свинки тощо). 92451 26 Пептиди, що застосовуються для одержання пегільованих сполук GLP-1 за цим винаходом, можуть одержуватись за допомогою стандартних технологічних способів синтезу пептидів у рідкій або твердій фазі. Синтезатори пептидів є комерційно доступними, наприклад, від фірми Applied Biosystems (Foster City, штат Каліфорнія). Реактиви для твердофазного синтезу є комерційно доступними, наприклад, від фірми Midwest Biotech (Fishers, штат Індіана). Твердофазні синтезатори пептидів можуть застосовуватись відповідно до інструкцій виробника для блокування груп, що заважають, захисту амінокислот, призначених для реагування, сполучення, відокремлення та "кепування" амінокислот, що не прореагували. У типовому випадку, амінокислоту, захищену ↑-N-карбамоїльною групою та N-кінцеву амінокислоту на нарощуваному ланцюзі пептиду на смолі сполучають при кімнатній температурі у інертному розчиннику, наприклад, диметилформаміді, Nметилпіролідоні або метиленхлориді у присутності сполучної речовини, наприклад, дициклогексилкарбодііміду і 1-гідроксибензотриазолу та основи, наприклад, діізопропілетиламіну. ↑-Nкарбамоїльну захисну групу видаляють з одержаної пептидної смоли за допомогою такого реактиву, наприклад, як трифтороцтова кислота або піперидин, і реакцію сполучення повторюють з наступною необхідною N-захищеною амінокислотою, призначеною для додання до пептидного ланцюга. Придатні амінозахисні групи добре відомі у цій галузі, і їх опис наведено, наприклад, у довіднику Грін (Green) та Вутс (Wuts), "Protecting Groups in Organic Synthesis", видавництво John Wiley and Sons, 1991, який у повному обсязі включено до цього опису шляхом посилання. Прикладами є трет-бутилоксикарбоніл (tBoc) і фторенілметоксикарбоніл (Fmoc). Пептиди синтезують також за стандартними автоматизованими методиками твердофазового синтезу із застосуванням трет-бутоксикарбонілабо фторенілметоксикарбоніл-альфа-амінокислот з відповідним захистом бічних ланцюгів. Після завершення синтезу, пептиди відщеплюють від твердофазного носія з одночасним відщепленням бічних ланцюгів за допомогою стандартних методів із застосуванням фториду водню. Після цього неочищені пептиди піддають додатковому очищенню за допомогою хроматографування з оберненою фазою на колонках Vydac C18 із застосуванням градієнтів ацетонітрилу у 0,1% трифтороцтовій кислоті (TFA). Для видалення ацетонітрилу пептиди ліофілізують із розчину, що містить 0,1% TFA, ацетонітрил і воду. Ступінь очищення може перевірятись за допомогою аналітичного хроматографування з оберненою фазою. Ідентичність пептидів може перевірятись за допомогою мас-спектрометрії. Пептиди можуть розчинятись у водних буферах при нейтральному рН. Винахід ілюструється наведеними нижче прикладами, які є суто ілюстративними. Приклади Приклад 1 - Пегілування аналогів, споріднених із GLP-1 27 Реакції пегілування здійснюють за умов, що забезпечують можливість одержання тіоефірного зв'язку. Зокрема, рН розчину коливається у межах від приблизно 4 до 9, а концентрації тіолвмісного пептиду коливаються у межах 1-10моль надлишку відносно концентрації метоксиполіетиленгліколь-2малеіміду. Реакції пегілування, за нормальних умов, відбуваються при кімнатній температурі. Після цього пегільований пептид GLP-1 виділяють за допомогою високоефективної хроматографії з оберненою фазою або гель-хроматографії за розміром молекул (SEC). Характеристики пегільованих аналогів GLP-1 визначають за допомогою високоефективної хроматографії з оберненою фазою (RP-HPLC), високоефективної гельхроматографії за розміром молекул (HPLC-SEC), електрофорезу у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію (SDS-PAGE) та/або мас-спектрометрії з іонізацією методом лазерної десорбції (MALDI). Тіолвмісні пептиди GLP-1 реагують із поліетиленглікольмалеімідом (40кДа) з одержанням похідних, де поліетиленгліколь ковалентно приєднаний через тіоефірний зв'язок. Наприклад, пептид Сех-51-С (V8E22I33C40 GLP-1, довжина 45 амінокислот; 7,5мг, 1,8мкмоль) розчиняють у 2мл 200мМ фосфатного буфера, що містить 20мМ EDTA (етилендіамінтрифтороцтова кислота), рН 7,4. Після цього розчин продувають аргоном. До цього розчину додають 40мг метоксиполіетиленгліколь-2малеіміду (поліетиленглікольмалеімід із розгалуженим ланцюгом, партія РТ-02В-10, фірма Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, штат Алабама) (співвідношення поліетиленгліколь:пептид: 0,55моль:1моль). Тривалість реакції: 2год. Після цього 25мг пегільованого пептиду очищають шляхом хроматографування з оберненою фазою, визначають характеристики за допомогою гельхроматографування і визначають активність in vitro. Приклад 2 - Реакція поліетиленглікольмалеіміду (40кДа) з аналогами GLP Аналоги GLP-1, наприклад, C16E22V8GLP та V8C38GLP, піддають селективному пегілуванню на введеному залишку цистеїну із застосуванням малеімідактивованого mPEG (40кДа) з розгалуженим ланцюгом (фірма Shearwater Polymers, Inc.). Для проведення реакції пегілування пептид, призначений для пегілування, розчиняють у 100мМ трис-буфері при рН 8,0 і додають 1,25моль надлишок mPEG (40кДа). Реакційну суміш перемішують при кімнатній температурі впродовж 2-3год із подальшим діалізом впродовж ночі (мембрана 7кДа) проти 10мМ цитрату, 10мМ фосфату, рН 7,4 при температурі приблизно 5°С. Пегільовані молекули GLP очищають шляхом аніонообмінного хроматографування на колонці Mono-Q (фірма Amersham Biosciences Corp, Piscataway, штат Нью-Джерсі) із застосуванням градієнту NaCl при нейтральному рН. Приклад 3 - Реакція DSPE (3,4кДа) - поліетиленглікольмалеіміду з аналогами GLP-1 Аналоги GLP-1, наприклад, C16E22V8GLP-1 та V8C38GLP-1, піддають селективному пегілуванню на введеному залишку цистеїну із застосуванням 92451 28 малеімідактивованого mPEG (3,4кДа), що закінчується ліпідом, дистеароїлфосфатиділетаноламіном (DSPE) (фірма Shearwater Polymers, Inc.). Для проведення реакції пегілування, пептид розчиняють у 100мМ трис-буфері при рН 8,0 і додають 1,25моль надлишок DSPE (3,4кДа) - поліетиленглікольмалеіміду. Для полегшення розчинення DSPE (3,4кДа) - поліетиленглікольмалеіміду додають абсолютний етанол (до приблизно 17%). Реакційну суміш перемішують при кімнатній температурі впродовж 2-3год із подальшим діалізом впродовж ночі (мембрана 7кДа) проти 10мМ цитрату, 10мМ фосфату, рН 7,4 при температурі приблизно 5°С. Пегільований пептид очищають шляхом аніонообмінного хроматографування на колонці Mono-Q (фірма Amersham Biosciences Corp, Piscataway, штат Нью-Джерсі) із застосуванням градієнту NaCl при нейтральному рН. Приклад 4 - Аналіз активності in vitro Клітини НЕК-293 (культура клітин нирки людського ембріона), що експресують рецептор людського GLP-1, із застосуванням системи PanVera LLC CRE-BLAM висівають на сенсибілізовані поліd-лізином 96-лункові планшеті чорного кольору з прозорим дном із густиною від 20000 клітин до 40000 клітин/лунку/100мкл середовища DMEM (модифіковане за способом Дульбекко середовище Ігла) з 10% FBS (сироватка зародка великої рогатої худоби). Через день після висівання живильне середовище видаляють і додають 80мкл вільного від плазми середовища DMEM. На третій день після висівання до кожної лунки додають 20 мкл вільного від плазми середовища DMEM з 0,5% BSA (сироватковий альбумін великої рогатої худоби), що містить різні концентрації пегільованої сполуки GLP-1, для одержання дозозалежної кривої. У цілому, для одержання дозозалежної кривої, на основі якої визначають значення ЕС50, застосовують чотирнадцять розведень, що містять від 3нмоль до 30нмоль пегільованого пептиду. Після 5год інкубування з пегільованим пептидом додають 20мкл β-лактамазного субстрату (CCF2/AM, PanVera LLC) з інкубуванням впродовж 1год. Впродовж цього періоду часу за допомогою цитофлуорографа визначають рівень флуоресценції. Додатковий опис аналізу дивись у роботі Злокарнік (Zlokarnik) та інші (1998), Science, 278:84-88. Випробуванню піддавались наведені нижче пегільовані пептиди GLP-1, які мали наведені нижче значення ЕС50 (V8GLP-1=100%): V8C16 - 3,4кДа DPSE-PEG 4% V8 - 3,4кДа PEG-FMOC 87% V8C38 - 3,4кДа DPSE-PEG 18% V8C38 - 40кДа PEG 3% V8E22C16 - 40кДа PEG 0,7% V8Е22І33С40 - 40кДа PEG (CEX-51) 9,4+/-1,5% [n=5] Приклад 5 - Фармакокінетичний аналіз дериватизованого пептиду GLP-1 Пегільований аналог GLP-1 (VSE22I33Q0 ~ поліетиленгліколь (40кДа) (пегільований, С40модифікований СЕХ-51)) вводили пацюкамсамцям лінії SD внутрішньовенним (IV) або підшкірним (SC) шляхами у дозі 0,1мг/кг. V8C16 - 3,4кДа DPSE-PEG 4% 29 92451 V8 - 3,4кДа PEG-FMOC 87% V8C38 - 3,4кДа DPSE-PEG 18% V8C38-40кДа PEG 3% V8E22C16 - 40кДа PEG 0,7% V8E22I33C40 - 40кДа PEG (CEX-51) 9,4+/-1,5% [n=5] Тварин (2 пацюки на часову точку для IV, 3 пацюки на часову точку для SC) знекровлювали після введення дози у різні періоди часу у межах від 0год до 336год. Плазму збирали з кожного зразка і піддавали радіоімуноаналізу. Фармакокінетичні параметри, наведені у поданій нижче Таблиці 1, обчислювали за допомогою залежних від моделі 30 (IV дані) і незалежних (SC дані) методів (WinNonlin Pro). Період напіввиведення пегільованого аналога GLP-1 у разі внутрішньовенного введення становив приблизно 1,5 дня, у той час як період напіввиведення пегільованого аналога GLP-1 у разі підшкірного введення становив приблизно 1,3 дня. Із внутрішньовенним або підшкірним введенням 0,1мг/кг V8E22I33C40 - поліетиленгліколю (40кДа) не пов'язували жодних негативних клінічних спостережень. У разі цієї сполуки спостерігали подовжений період напіввиведення, повільне виведення і відносно високу підшкірну біодоступність (приблизно 60%). Таблиця 1 Сполука Шлях введення Сmaxа (нг/мл) Tmaxb (дні) AUC0→∞с (нг·год/мл) t1/2d (дні) CL/Fe (мл/год/кг) Vss/Ff (мл/кг) V8Е22І33С40PEG (40 кДа) IV 1135 0,003 30293 1,5 3,3 161 SC 187 1-2 18128 1,3 5,5 256 % Fg 60 а Максимальна концентрація у плазмі, що спостерігалась. Час максимальної концентрації у плазмі, що спостерігалась. с Площа під кривою концентрація у плазмі - час, що визначалась від 0 до нескінченості. d Період напіввиведення у днях. е Загальне виведення з організму як функція біодоступності. f Об'єм розподілу у стаціонарному стані як функція біодоступності. g Відсоткова біодоступність. b У разі подібного внутрішньовенного введення V8-GLP(7-37)OH пацюкам лінії Fischer 344 у дозі 10 мкг/кг, одержали зовсім інші значення виведення та періоду напіввиведення, які наведено нижче. Виведення: 1449мл/год/кг. t1/2 (год): 0,05. Пегільований аналог GLP-1 (V8E22I33С45 - поліетиленгліколь (40кДа) (пегільований, С45модифікований СЕХ-51)) вводили мавпам-самцям роду cynomolgus внутрішньовенним (IV) або підшкірним (SC) шляхами у дозі 0,1мг/кг. Тварин знекровлювали після введення дози у різні періоди часу у межах від 0год до 336год. Плазму збирали з кожного зразка і піддавали радіоімуноаналізу. Фармакокінетичні параметри обчислювали за допомогою залежних від моделі (IV дані) і незалежних (SC дані) методів (WinNonlin Pro). Одержані фармакокінетичні параметри наведені у поданій нижче Таблиці 2. Період напіввиведення пегільованого аналога GLP-1 у разі внутрішньовенного введення становив приблизно 59,5год, у той час як період напіввиведення пегільованого аналога GLP-1 у разі підшкірного введення становив приблизно 61,6год. Таблиця 2 Доза (мг/кг) 0,1 Номер тварини 100473 100474 100477 Середнє SD Доза (мг/кг) 0,1 Номер тварини 100478 100480 Середнє Внутрішньовеннє введення Tmaxb AUC0→∞с (дні) (нг·год/мл) 1,0 149279 4,0 130341 0,0 215992 1,7 165204 2,1 1244991 Підшкірне введення Сmaxа Tmaxb AUC0→∞с (нг/мл) (дні) (нг·год/мл) 657 72,0 113518 976 48,0 138306 817 60,0 125912 Сmaxа (нг/мл) 1662 2282 2672 2205 509 t1/2d (дні) 59,5 42,1 76,8 59,5 17,4 CL (мл/год/кг) 0,67 0,77 0,46 0,63 0,16 Vss (мл/кг) 57,5 46,6 51,3 51,8 5,5 t1/2d (дні) 64,4 58,8 61,6 CL/Fe (мл/год/кг) 0,88 0,72 0,80 Vss/Ff (мл/кг) 81,8 61,3 71,6 31 92451 32 а Максимальна концентрація у плазмі, що спостерігалась. Час максимальної концентрації у плазмі, що спостерігалась. с Площа під кривою концентрація у плазмі - час, що визначалась від 0 до нескінченості. d Період напіввиведення. е Загальне виведення з організму як функція біодоступності. f Об'єм розподілу у стаціонарному стані як функція біодоступності. SD = стандартне відхилення. b Приклад 6 - Фармакокінетичний аналіз дериватизованого пептиду GLP-1 Пегільований аналог GLP-1 (V8E22I33C45 поліетиленгліколь (40кДа) (пегільований, С45модифікований СЕХ-51)) вводили мишам-самцям лінії C57BL/601aHsd-Lepob внутрішньовенним (IV) або підшкірним (SC) шляхами у дозі 3 нмоль/кг (12,33мг/кг=0,62мкг/50г мишу) або 10нмоль/кг (41мг/кг=2мкг/50г мишу), в той час як контрольним Середнє Статистична похибка Значення p тваринам вводили лише носій. Тваринам (6 мишей на часову точку) у 11:00 вводили однією ін'єкцією або пегільований аналог GLP-1 або носій. Миші не одержують їжі протягом ночі з подальшим введенням IPTGG (1г декстрози/кг внутрішньоочеревинно). Повторні проби для глюкози та інсуліну брали до та після ін'єкції глюкози через 15хв, 30хв, 60хв, 90хв та 120хв. Одержані фармакокінетичні параметри наведені у поданих нижче Таблицях. Глюкоза AUC носій 85965,75 58198,5 60381 73320,75 71703 72067,5 70272,75 4100,657 Носій Лінія ID миші GRP ob/ob ob/ob ob/ob ob/ob ob/ob ob/ob MR MS MZ NA NІ NK A A A A A A Середнє Статистична похибка 3нмоль PEG 28206 34884 33291 55793,25 48422,25 46707,75 41217,38 4346,437 0,000659 День 0 Маса День 0 Глюкоза 49,7 46,9 48,5 47,1 46,8 48,7 47,95 0,48563 231,4 260,5 206,3 209,6 180,3 222 3нмоль пегільованої сполуки GLP-1 ob/ob MO С ob/ob MP С ob/ob MT С ob/ob NC С ob/ob NE С ob/ob NG С Середнє Статистична похибка 49,4 45,7 53,3 49,9 50,3 49,5 49,6833 0,99144 187,1 212,8 253,5 226 247 207,7 10нмоль PEG 29765,25 22603,5 48125,25 54038,25 25024,5 24808,5 34060,88 5519,325 0,000365 День 0 Фактичний глюкози 462,8 521 412,6 419,2 360,6 444 436,7 21,99944 374,2 425,6 507 452 494 415,4 444,7 20,46022 рівень 33 92451 10нмоль пегільованої сполуки GLP-1 ob/ob MJ D ob/ob ML D ob/ob MU D ob/ob MY D ob/ob NB D ob/ob ND D Середнє Статистична похибка Носій ID миші 518 443,8 465,2 455,2 371,4 393 441,1 21,50366 Час 60 Фактичний рівень глюкози 869,1 759,3 609,3 623,4 635,4 662,7 693,2 41,42960294 Час 90 Фактичний рівень глюкози 528,9 506,1 495 3нмоль пегільованої сполуки GLP-1 МО 0,0988 70,2 206,4 МР 0,0914 96,6 386,7 МТ 0,1066 84 308,7 NC 0,0998 156 481,2 NE 0,1006 158,7 453,6 NG 0,099 83,7 433,5 Середнє 108,2 378,35 Стат.похибка 15,91596683 42,33590084 Значення р 0,074622229 0,127534361 325,2 408 369,6 521,7 531 461,4 436,15 33,90384197 0,012940369 240,9 295,2 273,3 532,8 287,1 378,6 334,65 43,80457168 0,004544365 214,2 196,5 247,2 449,1 389,7 258 518,7 310,5 405,3 339,2 328,6 57,00166664 52,57307296 0,073533898 0,021860517 10нмоль пегільованої сполуки GLP-1 MJ 0,0986 91,2 164,4 ML 0,0948 68,1 318,6 MU 0,0928 114,6 384,6 MY 0,0964 186 531,6 NB 0,103 92,4 354 ND 0,0852 90,3 277,5 Середнє 107,1 338,45 Стат.похибка 16,88549674 49,69268055 Значення h 0,049860093 0,06660094 312,3 285,3 489,3 606,3 261,6 272,7 371,25 583718448 0,013403998 290,1 152,1 420,3 447,3 151,5 209,4 278,45 53,42159208 0,002986998 2178 135 385,8 363,3 210,6 147 243,25 43,7524685 0,018193438 Доза Носій Середнє 3нмоль Середнє 10нмоль Середнє Носій ID миші Доза MR MS MZ ΝΑ Nl ΝΚ Час 15 Фактичний рівень глюкози 566,7 299,1 468,6 577,2 469,2 563,4 490,7 43,2838538 259 221,9 232,6 227,6 185,7 196,5 Час ЗО Фактичний рівень глюкози 771,9 568,8 597,9 612,3 628,2 649,8 638,15 28,99511166 MR MS MZ NA NІ NK Час 0 Фактичний рівень глюкози 0,0994 124,8 0,0938 83,4 0,097 130,5 0,0942 247,2 0,0936 174,6 0,0974 267 Середнє 17125 Стат.похибка 29,71165596 49,3 47,4 46,4 48,2 51,5 42,6 47,5667 1,22384 34 0 171,25 108,2 107,1 Час 0 Фактичний рівень інсуліну 0,0994 2,7 0,0938 12,3 0,097 2,7 0,0942 6,3 0,0936 33 0,0974 54 Середнє 5,45 Стат.похибка 1,498832879 15 490,7 378,35 338,45 Час 15 Фактичний рівень інсуліну 27 3,6 2,7 2,7 2,7 2,7 2,85 0,15 30 638,15 436,15 371,25 Час 30 Фактичний рівень інсуліну 2,7 2,7 2,7 27 2,7 2,7 2,7 0 60 693,2 334,65 278,45 Час 60 Фактичний рівень інсуліну 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 0 Час 120 Фактичний рівень глюкози 668,4 204 383,4 699,3 687,6 572,4 510 535,85 9,978476838 82,05989581 347,1 117 147,6 203,9 72,14284441 0,040209038 90 510 339,2 203,9 Час 90 Фактичний рівень інсуліну 120 535,85 328,6 243,25 Час 120 Фактичний рівень інсуліну 3,3 6,9 5,1 3,3 3,6 2,7 3,3 3 4,2 3 4,4 0,173205081 0,572712843 35 92451 36 3нмоль пегільованої сполуки GLP-1 МО 0,0988 4,8 36 МР 0,0914 5,7 16,5 MT 0,1066 54 4,5 NC 0,0998 70,8 59,4 NE 0,1006 27,9 14,7 NG 0,099 12,6 13,8 Середнє 21,2 18,75 Стат.похибка 10,54808039 8,42807807 Значення p 0,198202864 0 11819731 5,7 12,6 4,8 69,9 24,6 10,8 21,4 10,1231418 0,123985904 4,8 8,7 8,4 24,6 11,4 12 11,65 2,793295545 0,023885517 10нмоль пегільованої сполуки GLP-1 MJ 0,0986 39,3 165 ML 0,0948 13,5 36,9 MU 0,0928 32,4 13,8 MY 0,0964 121,2 122,7 NB 0,103 35,7 50,7 ND 0,0852 70,5 56,7 Середнє 52,1 49,55 Стат.похибка 15,73130637 16,2621801 Значення p 0,033003008 0,03509872 13,5 48 15,6 95,1 56,4 63,9 48,75 12,62063786 0,014767024 31,2 19,2 12 85,8 34,8 21,3 34,05 10,88735505 0,034608806 Носій Середнє 3нмоль Середнє 10нмоль Середнє Носій ID Доза миші MR MS MZ ΝΑ Nl ΝΚ 0 5,45 21,2 52,1 Час 0 Фактичний рівень Спептиду 0,0994 2127 0,0938 3243 0,097 1857 0,0942 3666 0,0936 2391 0,0974 2580 Середнє 2644 Стат.похибка 280,3597689 15 2,85 18,75 49,55 Час 15 Фактичний рівень Спептиду 1188 1875 1266 2571 2178 2517 1932,5 245,7235235 3нмоль пегільованої сполуки GLP-1 МО 0,0988 2130 МР 0,0914 2472 5445 MT 0,1066 2577 2919 NC 0,0998 9663 10278 NE 0,1006 6726 5349 NG 0,099 5010 4812 Середнє 5289,6 5155,5 Стат.похибка 1234,320279 1163,8275 Значення p 0,104283454 0,021669546 10нмоль пегільованої сполуки GLP-1 МІ 0,0986 7200 3501 ML 0,0948 3687 8049 MU 0,0928 5955 MY 0,0964 16212 17643 NB 0,103 8139 9174 ND 0,0852 12162 8478 Середнє 8892,5 9369 Стат.похибка 1856,727996 2096,294409 Значення p 0,015654599 0,025508262 30 2,7 21,4 48,75 60 2,7 11,65 34,05 Час 30 Фактичний рівень Спептиду 1167 1992 1392 2322 1776 2115 1794 180,3779366 Час 60 Фактичний рівень Спептиду 1182 2709 1533 2082 2181 2577 2044 241,5706936 3492 4632 2802 2613 4326 4149 6759 6747 3975 4329,6 615,6346725 0,012956014 4296 9627 6300 13266 11262 10785 9256 1365,273526 0,001556618 5670 4703,4 644,8310244 0,010105544 32,7 12,9 12,6 19,4 6,650563886 0,127758283 2,7 9,6 2,7 30 25,2 19,5 14,95 4,764504171 0,089610323 56,1 13,2 10,8 26,7 14,71631747 0,24535686 13,5 14,4 12,3 48,3 16,5 7,5 18,75 6,035768385 0,069087455 90 3 19,4 26,7 Час 90 Час 120 Фактичний Фактичний рівень С- рівень Спептиду пептиду 2736 5643 2916 1932 3051 2469 3777 2910 4695 2437 3803 282,7772975 471,6178538 7197 3843 6390 5810 1010,714104 0,095491566 1989 4248 3027 9849 9855 8337 6217,5 1447,410464 0,15910403 11124 4362 3867 6451 2340,865438 0,263009115 5901 4821 7278 11943 6954 4506 6900,5 1104,975497 0,082555028 10332 12423 7170 4947 8718 1352,954914 0,035883718 120 44 14,95 18,75 37 Носій Середнє 3нмоль Середнє 10нмоль Середнє 0 2644 5289,6 8892,5 92451 15 1932,5 5155,5 9369 30 1794 4329,6 9256 38 60 2044 4703,4 8718 90 2437 5810 6451 120 3803 6217,5 6900,5 39 92451 40 41 92451 42 43 92451 44 45 92451 46 47 92451 48 49 92451 50 51 92451 52 53 92451 54 55 92451 56 57 92451 58 59 92451 60
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюPolyethelene glycol link glp-1 compounds
Автори англійськоюDimarchi Richard Dennis, Glaesner Wolfgang, Millican Rohn Lee Junior, Vick Andrew Mark, Zhang Lianshan
Назва патенту російськоюСоединения glp-1, связанные с полиэтиленгликолем
Автори російськоюДимарчи Ричард Деннис, Глезнер Вольфганг, Милликан Рон Ли, мл., Вик Эндрю Марк, Чжан Ляншен
МПК / Мітки
МПК: C07K 14/00, A61K 38/26
Мітки: поліетиленгліколем, зв'язані, glp-1, сполуки
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/55-92451-spoluki-glp-1-zvyazani-z-polietilenglikolem.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Сполуки glp-1, зв’язані з поліетиленгліколем</a>
Попередній патент: 1,2,3-тризаміщені арильні і гетероарильні похідні як модулятори метаболізму, профілактика та лікування розладів, пов’язаних з ним, таких як діабет і гіперглікемія
Наступний патент: Каталізатор для окиснення метанолу у формальдегід, спосіб його виготовлення та спосіб окиснення метанолу у формальдегід
Випадковий патент: Зубчаста передача з двопарним і точковим зачепленням косих зубів