Імуностимулююча нуклеїнова кислота з поліпшеною імуностимулюючою ефективністю

1. Імуностимулююча нуклеїнова кислота, що містить TCGTCGTTTTACGGCGCCGTTGCCG (SEQ ID NO: 44). 2. Імуностимулююча нуклеїнова кислота за п. 1, що по суті складається з TCGTCGTTTTACGGCGCCGTTGCCG (SEQ ID NO: 44). 3. Імуностимулююча нуклеїнова кислота за п. 1, де щонайменше один міжнуклеотидний зв'язок модифікований фосфоротіоатом. 4. Імуностимулююча нуклеїнова кислота за п. 1, де кожен міжнуклеотидний зв'язок модифікований фосфоротіоатом. 5. Імуностимулююча нуклеїнова кислота за п. 1, де щонайменше один нуклеотид в олігонуклеотиді являє собою заміщений або модифікований пурин або піримідин. 6. Імуностимулююча нуклеїнова кислота за п. 5, де заміщений піримідин являє собою С5- або С6заміщений піримідин. 7. Імуностимулююча нуклеїнова кислота за п. 5, де заміщений пурин являє собою С8- або С7заміщений пурин. 8. Імуностимулююча нуклеїнова кислота за п. 5, де заміщений або модифікований пурин або піримідин вибраний з групи, що складається із 5заміщених цитозинів, 6-заміщених цитозинів, N4заміщених цитозинів, 5-азацитозину, 2меркаптоцитозину, ізоцитозину, псевдоізоцитози 2 (19) 1 3 88457 4 14. Фармацевтична композиція, що містить імуноDX8951f, Лемонал DP2202, FK 317, Піцибаніл/ОКстимулюючу нуклеїнову кислоту за будь-яким з пп. 432, AD 32/Валрубіцин, Метастрон/похідне строн1-11 і протираковий лікарський засіб. цію, Темодал/Темозоломід, Евацет/ліпосомальний 15. Спосіб лікування раку, що передбачає доксорубіцин, Ютаксан/Паклітаксел, Таквведення суб'єкту, що страждає на рак або схильсол/Паклітаксел, Кселод/Капецитабін, Фуртуному до ризику його розвитку, імуностимулюючої лон/Доксифлуридин, Циклопакс/оральний паклітануклеїнової кислоти за будь-яким з пп. 1-11 в кільксел, Оральний Таксоїд, SPU-077/Цисплатин, HMR кості, ефективній для лікування або попередження 1275/Флавопіридол, CP-358(774)/EGFR, СРраку. 609(754)/інгібітор онкогену RAS, BMS16. Спосіб за п. 15, де рак вибраний з базально182751/оральну платину, UFT(Тегафур/Урацил), клітинної карциноми, раку жовчних шляхів, раку Ергамізол/Левамізол, Енілурацил/776С85/5FUсечового міхура, раку кістки, раку мозку і центраенхансер, Кампто/Левамізол, Камптольної нервової системи, раку молочної залози, зар/Іринотекан, Томудекс/Ралтитрексед, Лейстараку шийки матки, хоріокарциноми, раку ободової і тин/Кладрибін, Паксекс/Паклітаксел, Докпрямої кишки, раку сполучної тканини, раку травсил/ліпосомальний доксорубіцин, ної системи, ендометріального раку, раку стравоКелікс/ліпосомальний доксорубіцин, Флудаходу, злоякісної пухлини ока, злоякісної пухлини ра/Флударабін, Фармарубіцин/Епірубіцин, Депоголови і шиї, раку шлунка, інтраепітеліальної неоЦит, ZD1839, LU 79553/Біс-Нафталімід, LU плазії, раку нирки, раку глотки, лейкозу, раку печі103793/Доластин, Келікс/ліпосомальний доксорунки, раку легені, лімфоми, включаючи лімфому біцин, Гемзар/Гемцитабін, ZD 0473/Анормед, YM Ходжкіна і неходжкінську лімфому, меланоми, міє116, насіння лодину, інгібітори CDK4 і CDK2, інгібіломи, нейробластоми, раку порожнини рота, раку тори PARP, D4809/Дексифосфамід, яєчника, раку підшлункової залози, раку передміІфес/Меснекс/Іфосфамід, Вумон/Теніпозид, Парахурової залози, ретинобластоми, рабдоміосаркоплатин/Карбоплатин, Плантинол/цисплатин, Вепеми, раку прямої кишки, раку нирки, злоякісної пухзид/Етопозид, ZD 9331, Таксотер/Доцетаксел, лини респіраторної системи, саркоми, раку шкіри, проліки гуаніну арабінозиду, аналог Таксану, нітраку шлунка, раку яєчка, раку щитовидної залози, розосечовини, алкілуючі агенти, такі як мелфелан і раку матки, злоякісної пухлини сечовидільної сисциклофосфамід, Аміноглутетимід, Аспарагіназу, теми або інших карцином і сарком. Бусульфан, Карбоплатин, Хлоромбуцил, Цитара17. Спосіб за п. 15, де рак являє собою рак, чутлибін НСl, Дактиноміцин, Даунорубіцин НСl, Естравий до лікування інтерфероном альфа (IFN- a ). мустин фосфат натрію, Етопозид (VP16-213), Флоксуридин, Фторурацил (5-FU), Флутамід, 18. Спосіб за п. 17, де рак, чутливий до лікування Гідроксисечовину (гідроксикарбамід), Іфосфамід, IFN- a , вибраний з лейкозу ворсистих клітин, хроІнтерферон Альфа-2а, Альфа-2b, Лейпроліду аценічного мієлолейкозу, шкірного Т-клітинного лейкотат (аналог фактора вивільнення LHRH), Ломустин зу, множинної мієломи, фолікулярної лімфоми, (CCNU), Мехлоретамін НСl (азотний аналог гірчизлоякісної меланоми, плоскоклітинної карциноми, чного газу), Меркаптопурин, Месну, Мітотан, Мітопов'язаної зі СНІДом саркоми Капоші, нирковоксантрон НСl, Октреотид, Плікаміцин, Прокарбазин клітинної карциноми, карциноми передміхурової НСl, Стрептозоцин, Тамоксифену цитрат, Тіогуазалози, дисплазії шийки матки або карциноми товнін, Тіотепу, Вінбластину сульфат, Амсакрин(mстої кишки. AMSA), Азацитидин, Еритропоетин, Гексаметил19. Спосіб за п. 15, де суб'єкту проводять протирамеламін (НММ), Інтерлейкін 2, Мітогуазон (метилкове лікування. GAG; метилгліоксаль-біс-гуанілгідразон; MGBG), 20. Спосіб за п. 19, де протиракове лікування явПентостатин (2'-дезоксикоформіцин), Семустин ляє собою опромінення. (метил-CCNU), Теніпозид (VM-26) або Віндезину 21. Спосіб за п. 19, де протиракове лікування явсульфат. ляє собою хірургічне втручання. 25. Спосіб за п. 22, де протираковий лікарський 22. Спосіб за п. 19, де протиракове лікування явзасіб являє собою імунотерапевтичний засіб. ляє собою протираковий лікарський засіб. 26. Спосіб за п. 25, де імунотерапевтичний засіб 23. Спосіб за п. 22, де протираковий лікарський являє собою Ритуксан, Рибутаксин, Герцептин, засіб являє собою хіміотерапевтичний засіб. Квадрамет, Панорекс, IDEC-Y2B8, ВЕС2, С225, 24. Спосіб за п. 23, де хіміотерапевтичний засіб Онколім, SMART M195, ATRAGEN, Оварекс, Бекявляє собою метотрексат, вінкристин, адріаміцин, сар, LDP-03, іор т6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, цисплатин, хлоретилнітрозосечовини, що не місOV103, 3622W94, анти-VEGF, Зенапакс, MDX-220, тять цукру, 5-фторурацил, мітоміцин С, блеоміцин, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, доксорубіцин, дакарбазин, таксол, фрагілін, МегCEACIDE, Претаргет, NovoMAb-G2, TNT, Gliomabламін GLA, валрубіцин, кармустин і поліфепросан, H, GNI-250, EMD-72000, ЛімфоЦид, CMA 676, МоММІ270, BAY 12-9566, інгібітор RASнофарм-С, 4B5, iop egf.r3, iop c5, BABS, aнти-FLKфарнезилтрансферази, інгібітор фарнезилтранс2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1D10 Ab, SMART ABL ферази, ММР, MTA/LY231514, 364 Ab або ImmuRAIT-CEA. LY264618/Лометрексол, Гламолек, СІ-994, TNP27. Спосіб за п. 22, де протираковий лікарський 470, Гікамтин/Топотекан, РКС412, Валспозасіб являє собою протиракову вакцину. дар/РSС833, Новантрон/Мітроксантрон, Мета28. Спосіб за п. 27, де протиракова вакцина являє рет/Сурамін, Батимастат, Е7070, ВСН-4556, CSсобою EGF, антиідіотипічні протиракові вакцини, 682, 9-АС, AG3340, AG3433, Інцел/VХ-710, VX-853, антиген Gp75, GMK- вакцину проти меланоми, ZD0101, ISI641, ODN 698, ТА 2516/Мармістат, кон'юговану з гангліозидом вакцину MGV, ВВ2516/Мармістат, CDP 845, D2163, PD183805, 5 88457 6 Her2/neu, Оварекс, M-Vax, O-Vax, L-Vax, тератоп 31. Спосіб за п. 30, де IFN І типу являє собою інSTn-KHL, BLP25 (MUC-1), ліпосомальну ідіотипічну терферон альфа (IFN- a ). вакцину, Мелацин, вакцини з пептидними антиге32. Спосіб індукції експресії інтерферону гамма нами, токсин/антигенні вакцини, вакцину на основі (IFN- g ), що передбачає MVA, PACIS, BCG-вакцину, TA-HPV, TA-CIN, DISCконтактування клітини, здатної експресувати IFNвірус або ImmuCyst/TheraCys. g , з імуностимулюючою нуклеїновою кислотою за 29. Спосіб за п. 15, де суб'єкту проводять більше будь-яким з пп. 1-11 в кількості, ефективній для ніж одну протиракову терапію. індукції експресії IFN- g . 30. Спосіб індукції експресії інтерферону І типу 33. Спосіб активації природної клітини-кілера (NK), (IFN), що передбачає що передбачає контактування клітини, здатної експресувати IFN І контактування NK-клітини з імуностимулюючою типу, з імуностимулюючою нуклеїновою кислотою нуклеїновою кислотою за будь-яким з пп. 1-11 в за будь-яким з пп. 1-11 в кількості, ефективній для кількості, ефективній для активації NK-клітини. індукції експресії IFN І типу. Даний винахід в основному відноситься до імуностимулюючих нуклеїнових кислот, композицій на їх основі і способів застосування імуностимулюючих нуклеїнових кислот. Бактерійна ДНК, на відміну від ДНК хребетних, чинить імуностимулюючий ефект для активації Вклітин і природних клітин-кілерів. Tokunaga Τ et al. (1988) Jpn J Cancer Res 79:682-6; Tokunaga Τ et al. (1984) JNCI 72: 955-62; Messina JP et al. (1991) J Immunol 147: 1759-64; і огляди в Krieg, 1998, In: Applied Oligonucleotide Technology, C.A. Stein and A.M. Krieg, (Eds.), John Wiley and Sons, Inc., New York, NY, pp. 431-448) і Krieg AM (2002) Annu Rev Immunol 20: 709-60. В даний час зрозуміло, що такі імуностимулюючі ефекти бактерійної ДНК є результатом присутності неметильованих CpGдинуклеотидів в оточенні конкретних основ (CpGмотивів), звичайних в бактерійних ДНК, але метильованих і рідко присутніх в ДНК хребетних. Krieg AM et al. (1995) Nature 374: 546-9; Krieg AM (1999) Biochim Biophys Acta 1489: 107-16. Імуностимулюючі ефекти бактерійної ДНК можна мімікрувати синтетичними олігодезоксинуклеотидами (ODN), що містять ці CpG-мотиви. Такі CpG-ODN чинять сильні імуностимулюючі ефекти на мишачі і людські лейкоцити, включаючи проліферацію В-клітин; секрецію цитокінів і імуноглобулінів; цитолітичну активність натуральних клітинкілерів (NK) і секрецію інтерферону гамма (IFN-g); і активацію дендритних клітин (DC) та інших антиген-презентуючих клітин для експресії костимулюючих молекул і секреції цитокінів, особливо цитокінів Тh1-типу, важливих для стимуляції Тклітинних відповідей Тh1-типу. Дані імуностимулюючі ефекти природного фосфодіефірного кістяка CpG-ODN високо специфічні для CpG, оскільки дані ефекти значно зменшуються, якщо CpGмотив метильований, замінений на GpC, або іншим чином видалений або змінений. Krieg AM et al. (1995) Nature 374: 546-9; Hartmann G et al. (1999) Proc Natl. Acad Sci USA 96: 9305-10. У ранніх дослідженнях вважали, що імуностимулюючий CpG-мотив слідує формулі пуринпурин-СрС-піримідин-піримідин. Krieg AM et al. (1995) Nature 374: 546-9; Pisetsky DS (1996) J Immunol 156:421-3; Hacker H et al. (1998) EMBO J 17:6230-40; Lipford GB et al. (1998) Trends Microbiol 6:496-500. Однак, в цей час зрозуміло, що мишачі лімфоцити досить добре відповідають на фосфодіефірні CpG-мотиви, що не слідують даній «формулі» [Yi АК et al. (1998) J Immunol 160:5898-906), і те ж саме справедливе для В-клітин і дендритних клітин людини [Hartmann G et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96:9305-10; Liang H et al. (1996) J Clin Invest 98: 1119-29]. Даний винахід частково відноситься до імуностимулюючих CpG-вмісних олігонуклеотидів і олігонуклеотидних аналогів, що мають вторинну структуру з інвертованим повтором на 3'-кінці молекули або біля нього. Вторинна структура залучає формування дуплекса або структур вищого порядку в певних умовах. Як важлива властивість олігонуклеотидів і олігонуклеотидних аналогів за винаходом, інвертований повтор не є суворим Уотсон-Криківським паліндромом, але переважніше перерваний проміжною послідовністю або аналогами нуклеотидів. Як друга властивість олігонуклеотидів і олігонуклеотидних аналогів за винаходом, кістяк можна модифікувати для включення в склад в стратегічних місцях міжнуклеотидні зв'язки, стійкі до нуклеази або чутливі до нуклеази, таким чином сприяючи активності і зменшуючи потенційну токсичність. Додатково виявлено, що дані олігонуклеотиди і олігонуклеотидні аналоги проявляють імуностимулюючу активність і А-класу, і Вкласу і, отже, їх класифікують як нові імуностимулюючі молекули нуклеїнових кислот С-класу. Винахід частково оснований на відкритті авторами даного винаходу, що CpG-вмісні імуностимулюючі олігонуклеотиди і олігонуклеотидні аналоги, що містять незавершений паліндром, на 3'-кінці молекули або біля нього, мають певні переваги, виходячи з їх отримання і їх біологічної активності. Конкретно, олігонуклеотиди і олігонуклеотидні аналоги С-класу по даному винаходу звичайно с мономерними в розчині. Вважають, що дані однакові молекули можуть формувати in vitro структури внутрішньомолекулярного дуплекса, надаючи їм стабільність проти нуклеазного розщеплення. Вважають також, що ті ж самі нуклеїнові кислоти можуть формувати внутрішньомолекулярний дуплекс і, можливо, навіть структури більш високого порядку в оточенні внутрішньоендосомального 7 88457 8 середовища, де, як вважають, вони проявляють В одному аспекті винахід відноситься до комсвою біологічну активність. позиції, що містить імуностимулюючу молекулу нуклеїнової кислоти формули І Z1[(X1Y1R1)N(X2Y2R2)kZ2]p(S,)qN1(Nn)...(N2)(N1)S2(N1#)(N2#)...(Nn#)Z3 де кожен з Z1, Z2 і Z3 незалежно являє собою будь-яку послідовність довжиною від 0 до 12 нуклеотидів, що необов'язково включає ненуклеотидний лінкер або абазичний d-спейсер; кожен з X1 і Х2 незалежно являє собою нуклеотид. що включає в себе тимін, урацил, аденін або 5-заміщений урацил; кожен з Y1 і Y2 незалежно являє собою цитозин (С) або модифікований цитозин; кожен з R1 і R2 незалежно являє собою гуанін (G) або модифікований гуанін; кожен з N і N' незалежно являє собою будь-яку послідовність довжиною від 0 до 12 нуклеотидів, що необов'язково містить ненуклеотидний лінкер або абазичний d-спейсер; S1 являє собою ненуклеотидний лінкер, абазичний лінкер (d-спейсери), ланки триетиленгліколю або ланки гексаетиленгліколю, що необов'язково передбачають 2'5'-, 5'5' -, 3'3'-, 2'2' - або 2'3'міжнуклеозидні зв'язки; S2 являє собою будь-яку непал індромну послідовність довжиною від 1 до 10 нуклеотидів або ненуклеотидний лінкер, абазичний лінкер (d-спейсери), ланки триетиленгліколю або ланки гексаетиленгліколю; кожен з N1, N2, ... Nn і N1#, N2# ... Nn# являє собою будь-який нуклеотид або модифікований нуклеотид, де спарюються основи N, з N1#, спарюються основи N2 з N2# і спарюються основи Nn з Nn#; k являє собою ціле число від 0 до 5; n вляє собою ціле число від 2 до 16; р являє собою ціле число від 1 до 6; і q являє собою ціле число від 0 до 10, і де, коли (Nn)...(N2)(N1)S2(N1#)(N2#)...(Nn#) має довжину від 10 до 42 нуклеотидів, S2 мас довжину від 4 до 10 нуклеотидів, S2 включає в себе ненуклеотидний лінкер, абазичний лінкер (d-спейсери), ланки триетиленгліколю або ланки гексаетиленгліколю, і/або (Nn)...(N2)(N1)S2(N1#)(N2#)...(Nn#) має вміст GC менш ніж 2/3. В одному варіанті здійснення кожен з N1, N2, ... Nn і N1#, N2#,... Nn# вибирають з С, G або їх модифікацій, де спарюються основи С з G. В одному варіанті здійснення кожний з N1, N2, ... Nn і N1#, N2#, ... Nn# вибирають з Τ, А або їх модифікацій, і спарюються основи Τ з А. В даному й інших варіантах здійсненнякожний з С, G, А або Τ може відноситися до дезоксинуклеотидів з відповідними основами цитозином, гуаніном, аденіном і тиміном. В одному варіанті здійснення кожний з N1, N2, ... Nn і N1#, N2#, ... Nn# вибирають з С, Т, A, G або їх модифікацій, і спарюються основи С з G, спарюються основи Τ з G, спарюються основи А з Τ і спарюються основи А з G. В одному варіанті здійснення кожен з N1, Ν2, ... Νn, і Ν1#, Ν2#, ... Nn# вибирають з немодифікованих або модифікованих нуклеотидів, що формують Уотсон-Криківські пари основ, тобто кожна пара основ N1-N1#, N2-N2#, ... Nn-Nn# являє собою УотсонКриківську пару основ. В одному варіанті здійснення щонайменше один з кожного з N1, N2, ... Nn, і Ν1#, Ν2#, ... Nn# вибирають з немодифікованих або модифікованих (формула І) нуклеотидів, що формують не Уотсон-Криківські пари основ, тобто щонайменше одна пара основ N1-N1#, N2-N2#, ... Nn-Nn# являє собою не УотсонКриківську пару основ. В одному варіанті здійснення імуностимулююча молекула нуклеїнової кислоти містить частково стабілізований кістяк щонайменше з одним фосфодіефірним зв'язком. В одному варіанті здійснення імуностимулюючі молекули нуклеїнових кислот містять кістяк щонайменше з одним стабілізованим міжнуклеотидним зв'язком. В одному варіанті здійснення всі міжнуклеотидні зв'язки олігонуклеотиду являють собою фосфоротіоатні зв'язки. В одному варіанті здійснення імуностимулююча молекула нуклеїнової кислоти містить частково стабілізований кістяк з фосфодіефірним зв'язком, що з'єднує щонайменше один з Y1R1 або Y2R2. В одному варіанті здійснення Y1 являє собою С. В одному варіанті здійснення R1 являє собою G. В одному варіанті здійснення Y1 являє собою С і R1 являє собою G. В одному варіанті здійснення X1 або Х2 являє собою Т. В одному варіанті здійснення X1 являє собою Т, Х2 являє собою Τ, Υ, являє собою С, R1 являє собою G і k дорівнює 1. В одному варіанті здійснення X1 являє собою Т, Х2 являє собою Τ, Υ, являє собою С, R1 являє собою G, k дорівнює 1, p дорівнює 1, кожний з Ν, Ν' і Ζ3 містить нуль нуклеотидів і Ζ2 являє собою ТТТТ або d(UUUU), де d(UUUU) являє собою dUdUdUdU, тобто (дезоксии)4. В одному варіанті здійснення S2 являє собою ненуклеотидний лінкер. В одному варіанті здійснення S2 містить щонайменше один абазичний залишок d-спейсера. В одному варіанті здійснення олігонуклеотид містить щонайменше один розгалужений ненуклеозидний зв'язок. В одному варіанті здійснення імуностимулююча молекула нуклеїнової кислоти містить щонайменше одну подвійну ланку, щонайменше одну потрійну ланку або щонайменше одну подвійну ланку і щонайменше одну потрійну ланку. В одному варіанті здійснення S1 являє собою подвійну ланку або потрійну ланку. В одному варіанті здійснення олігонуклеотид містить щонайменше один 2'5'-, 5'5'-, 3'3'-, 2'2'- або 2'3'-міжнуклеозидний зв'язок. В одному варіанті здійснення імуностимулююча молекула нуклеїнової кислоти формули І не є антисмисловою нуклеїновою кислотою. В одному аспекті винахід відноситься до імуностимулюючої молекули нуклеїнової кислоти формули II 9 88457 Z1(Nn)(Nn-1)...(N2)(N1)S2(N1#)(N2#)...(Nn-1#)(Nn#)(S1)qZ3[(X1Y1R1)N(X2Y2R2)kZ2]p де кожен з Z1, Z2 і Z3, незалежно являє собою будь-яку послідовність довжиною від 0 до 12 нуклеотидів, що необов'язково містить ненуклеотидний лінкер або абазичний d-спейсер; кожен з Х1 і Х2 незалежно являє собою нуклеотид, що включає в себе тимін, урацил, аденін або 5-заміщений урацил; кожен з Υ1 і Y2 незалежно являє собою цитозин (С) або модифікований цитозин; кожний з R1 і R2 незалежно являє собою гуанін (G) або модифікований гуанін; N являє собою будь-яку послідовність довжиною від 0 до 12 нуклеотидів, що необов'язково включає ненуклеотидний лінкер або абазичний d-спейсер; S1 являє собою ненуклеотидний лінкер, абазичний лінкер (d-спейсери), ланки триетиленгліколю або ланки гексаеіиленгліколю, що необов'язково передбачають 2'5'-, 5'5'-, 3'3'-, 2'2'- або 2'3'-міжнуклеозидні зв'язки; S2 являє собою будь-яку непаліндромну послідовність довжиною від 1 до 10 нуклеотидів або ненуклеотидний лінкер, абазичний лінкер (d-спейсери), ланки триетиленгліколю або ланки гексаетиленгліколю; кожен з N1, N2, ... Νn-1, Νn і Ν1#, Ν2#, ... Νn-1#, Nn# являє собою будь-який нуклеотид або модифікований нуклеотид, де спарюються основи N1 з N1#, спарюються основи N2 з N2#, і спарюються основи Nn з Nn#; k являє собою ціле число від 0 до 5; n являє собою ціле число від 2 до 16; p являє собою ціле число від 1 до 6; і q являє собою ціле число від 0 до 10, і де, коли (Nn)...(N2)(N1)S2(N1#)(N2#)...(Nn#) має довжину від 10 до 42 нуклеотидів, S2 має довжину від 4 до 10 нуклеотидів, S2 включає в себе ненуклеотидний лінкер, абазичний лінкер (dспейсери) ланки триетиленгліколю або ланки гексаетиленгліколю і/або (Nn)...(N2)(N1)S2(N1#)(N2#)...(Nn#) має вміст GC менше ніж 2/3. В одному варіанті здійснення Ζ1(Νn)(Νn-1]) являє собою TYR, де Υ являє собою цитозин або модифікований цитозин і R являє собою гуанін або модифікований гуанін. В одному варіанті здійснення кожен з N1, N2, ... Nn-1, Nn і N1#, N2#,... Nn-1#, Nn# вибирають з С, G або їх модифікацій, де спарюються основи С з G. В одному варіанті здійснення кожний з N1, N2, ... Nn-1, Nn і N1#, N2#,... Nn-1#, Nn# вибирають з Τ, А або їх модифікацій, і спарюються основи Τ з А. В даному й інших варіантах здійснення кожний з С, G, А і Τ може відноситись до дезоксинуклеотидів з відповідними основами цитозином, гуаніном, аденіном і тиміном. В одному варіанті здійснення кожний з N1, N2, ... Nn-1, Nn і N1#, N2#,... Nn-1#, Nn# вибирають з С, Τ, Α, G і або їх модифікацій, і спарюються основи С з G, спарюються основи Τ з G, спарюються основи А з Т, і спарюються основи А з G. В одному варіанті здійснення кожен з N1, N2, ... Nn-1, Nn і N1#, N2#,... Nn-1#, Nn# вибирають з немодифікованих або модифікованих нуклеотидів, що формують Уотсон-Криківські пари основ, тобто кожна пара основ N1-N1#, N2-N2#, ... Nn-Nn# являє собою Уотсон-Криківську пару основ. В одному варіанті здійснення щонайменше один з кожного N1, N2, ... Nn-1, Nn і N1#, N2#,... Nn-1#, 10 (формула II) Nn# вибирають з немодифікованих або модифікованих нуклеотидів, що формують не УотсонКриківські пари основ, тобто щонайменше одна пара основ Ν1-Ν1#, Ν2-Ν2#, ... Νn-Νn# являє собою не Уотсон-Криківську пару основ. В одному варіанті здійснення імуностимулююча молекула нуклеїнової кислоти містить частково стабілізований кістяк щонайменше з одним фосфодіефірним зв'язком. В одному варіанті здійснення імуностимулююча молекула нуклеїнової кислоти містить кістяк щонайменше з одним стабілізованим міжнуклеотидним зв'язком. В одному варіанті здійснення всі міжнуклеотидні зв'язки олігонуклеотиду являють собою фосфоротіоатні зв'язки. В одному варіанті здійснення імуностимулююча молекула нуклеїнової кислоти містить частково стабілізований кістяк з фосфодіефірним зв'язком, що з'єднує щонайменше один з Y1R1 або Y2R2. В одному варіанті здійснення Υ1 являє собою С. В одному варіанті здійснення R1являє собою G. В одному варіанті здійснення Υ1 являє собою С і R1 являє собою G. В одному варіанті здійснення Х1 або Х2 являє собою Т. В одному варіанті здійснення Х1 являє собою Т, Х2 являє собою Τ, Υ1 являє собою С, R1 являє собою G і k дорівнює 1. В одному варіанті здійснення Х1 являє собою Т, Х2 являє собою Т, Υ1 являє собою С, R1 являє собою G, k дорівнює 1, p дорівнює 1, кожен з Ν, Ν' і Ζ3 містить нуль нуклеотидів, і Ζ2 являє собою ТТТТ або d(UUUU), де d (UUUU) являє собою dUdUdUdU, тобто (дезоксии)4. В одному варіанті здійснення S2 являє собою ненуклеотидний лінкер. В одному варіанті здійснення S2 містить щонайменше один абазичний залишок d-спейсера. В одному варіанті здійснення олігонуклеотид містить щонайменше один розгалужений ненуклеозидний зв'язок. В одному варіанті здійснення імуностимулююча молекула нуклеїнової кислоти містить щонайменше одну подвійну ланку, щонайменше одну потрійну ланку або щонайменше одну подвійну ланку і щонайменше одну потрійну ланку. В одному варіанті здійснення S1 являє собою подвійну ланку або потрійну ланку. В одному варіанті здійснення олігонуклеотид містить щонайменше один 2'5'-, 5'5'-, 3'3'-, 2'2'- або 2'3'-міжнуклеозидпий зв'язок. В одному варіанті здійснення імуностимулююча молекула нуклеїнової кислоти формули І не є антисмисловою нуклеїновою кислотою. В одному аспекті винахід відноситься до імуностимулюючої молекули нуклеїнової кислоти формули III (Z')m Z3(S3) (формула III) 11 88457 12 де Z' являє собою Ν2#, ... Nn# являє собою будь-який нуклеотид або Z1[(X1Y1R1)N(X2Y2R2)kZ2]p(S1)qN'(Nn)...(N3)(N2)(N1)S2( модифікований нуклеотид, де спарюються основи N1#)(N2#)(N3#)...(Nn#), кожний з Ζ1, Ζ2 і Z3 незалежно Ν1 з N1#, спарюються основи N2 з N2#, спарюються являє собою будь-яку послідовність довжиною від основи N3 з N3# і спарюються основи Nn з Nn#; k 0 до 12 нуклеотидів, що необов'язково містить являє собою ціле число від 0 до 5; m являє собою ненуклеотидний лінкер або абазичний d-спейсер; ціле число від 2 до 10; n являє собою ціле число кожен з X1 і Х2 незалежно являє собою нуклеотид, від 2 до 16; p являє собою ціле число від 1 до 6 і q що включає в себе тимін, урацил, аденін або 5являє собою ціле число від 0 до 10. заміщений урацил; кожен з Υ1 і Y2 незалежно явУ конкретних варіантах здійснення ляє собою цитозин або модифікований цитозин; Z1[(X1Y1R1)N(X2Y2R2)kZ2]p(S1)q являє собою непалікожний з R1 і R2 незалежно являє собою гуанін або ндромну послідовність модифікований гуанін; кожний з N і N' незалежно У конкретних варіантах здійснення являє собою будь-яку послідовність довжиною від Z1[(X1Y1R1)N(X2Y2R2)kZ2]p(S1)q являє собою 0 до 12 нуклеотидів, що необов'язково включає TCGTCGTTTT (SEQ ID NO: 40), TCGTCGTTLL, ненуклеотидний лінкер або абазичний d-спейсер; TCGA, TCGAC, TCGACGTC або TCGACGTCG, де S1 являє собою ненуклеотидний лінкер, абазичний L являє собою d-спейсер. лінкер (d-спейсери) ланки триетиленгліколю або У конкретних варіантах здійснення ланки гексаетиленгліколю, що необов'язково пеZ1[(X1Y1R1)N(X2Y2R2)kZ2]p(S1)q являє собою паліндредбачають 2'5'-, 5'5'-, 3'3'-, 2'2'-або 2'3'ромну послідовність. міжнуклеозидні зв'язки; S2 являє собою будь-яку У конкретних варіантах здійснення непаліндромну послідовність довжиною від 1 до 10 Z1[(X1Y1R1)N(X2Y2R2)kZ2]p(S1)q являє собою нуклеотидів або ненуклеотидний лінкер, абазичTCGACGTCGA (SEQ ID NO: 19) або ний лінкер (d-спейсери), ланки триетиленгліколю TCGTCGACGA (SEQ ID NO: 34). або ланки гексаетиленгліколю; S3 являє собою У конкретних варіантах здійснення прямий або опосередкований 2'5'-, 5'5'-, 3'3'-, 2'2'Z1[(X1Y1R1)N(X2Y2R2)kZ2]p(S1)q являє собою або 2'3'-міжнуклеозидний зв'язок або ненуклеотиTCGCGACGTT (SEQ ID NO: 26) або дний лінкер, де вказаний ненуклеотидний лінкер TCGCGTCGTT (SEQ ID NO: 69). містить абазичні лІнкери (d-спейсери), ланки триВ одному варіанті здійснення етиленгліколю або ланки гексаетиленгліколю, що (Nn)...(N2)(N1)S2(N1#)(N2#)...(Nn#)Z3 включає в себе полегшують 2'5'-, 5'5'-, 3'3'-, 2'2'- або 2'3'-зв'язок m послідовність частин послідовності; кожен з N1, N2, ... Nn і Ν1#, де L являє собою d-спейсер. В одному з варіантів здійснення (Nn)...(N2)(N1)S2(N1#)(N2#)...(Nn#) включає в себе послідовність GGCGCGCTGCCG (SEQ ID NO: 13). В одному з варіантів здійснення імуностимулююча молекула нуклеїнової кислоти включає в себе послідовність В одному з варіантів здійснення імуностимулююча молекула нуклеїнової кислоти включає в себе послідовність де L являє собою d-спейсер. В одному з варіантів здійснення імуностимулююча молекула нуклеїнової кислоти включає в 13 88457 14 себе послідовність TCGCGACGTTCGGCGCGCTGCCG (SEQ ID NO: TCGCGTCGTTCGGCGCGCTGCCG (SEQ ID NO: 27). 30). В одному з варіантів здійснення імуностимуВ одному з варіантів здійснення імуностимулююча молекула нуклеїнової кислоти включає в лююча молекула нуклеїнової кислоти включає в себе послідовність, вибрану з себе послідовність де L являє собою d-спейсер, * являє собою фосфоротіоат і _ являє собою фосфодіефір. В одному з варіантів здійснення імуностимулююча молекула нуклеїнової кислоти включає в себе послідовність, вибрану з де * являє собою фосфоротіоат і _ являє собою фосфодіефір. В одному з варіантів здійснення імуностимулююча молекула нуклеїнової кислоти включає в себе послідовність, вибрану з 15 88457 16 де * являє собою фосфоротіоат і _ являє собою фосфодіефір. В одному з варіантів здійснення імуностимулююча молекула нуклеїнової кислоти включає в себе послідовність, вибрану з де * являє собою фосфоротіоат і _ являє собою фосфодіефір. В одному з варіантів здійснення імуностимулююча молекула нуклеїнової кислоти включає в себе послідовність являє собою фосфоротіоат і _ являє собою фосфодіефір. В одному з варіантів здійснення імуностимулююча молекула нуклеїнової кислоти включає в себе послідовність, вибрану з дe * являє собою фосфоротіоат і _ являє собою фосфодіефір. В одному з варіантів здійснення імуностимулююча молекула нуклеїнової кислоти включає в себе послідовність де * являє собою фосфоротіоат і _ являє собою фосфодіефір. В одному з варіантів здійснення імуностимулююча молекула нуклеїнової кислоти включає в себе послідовність де * являє собою фосфоротіоат і _ являє собою фосфодіефір. В одному з варіантів здійснення щонайменше один нуклеотид в олігонуклеотиді являє собою заміщений або модифікований пурин або піримідин. В одному з варіантів здійснення заміщений піримідин являє собою С5- або С6-заміщений піримідин. В одному з варіантів здійснення заміщений пурин являє собою С8- або С7-заміщений пурин. В одному з варіантів здійснення заміщений або модифікований пурин або піримідин вибраний з групи, яка включає в себе 5-заміщені цитозини, 6-заміщені цитозини, N4-заміщені цитозини, 5азацитозин, 2-меркаптоцитозин, ізоцитозин, псевдоізоцитозин, аналоги цитозину з конденсованими кільцевими системами і похідними урацилу, похідні тиміну, 7-деазагуанін, 7-деаза-7-заміщений гуанін, 7-деаза-8-заміщений гуанін, 7-деаза-8азагуанін, гіпоксантин, N2-заміщені гуаніни, 5аміно-3-метил-3H, 6Н-тіазоло[4,5-d]піримідин-2,7 17 88457 18 що закінчується інвертованим повтором, здатним діон, 2,6-діамінопурин, 2-амінопурин, пурин, індол, формувати структуру шпильки або стебла-петлі, заміщені аденіни, 8-заміщений гуанін і 6-тіогуанін. де вказана структура містить GC-багате стебло В одному з варіантів здійснення заміщений довжиною 2-6 послідовних пар основ і щонайменабо модифікований пурин або піримідин вибраний ше одну неспарену або некомплементарно спарез групи, яка включає в себе 5-метилцитозин, 5ну основу, і (с) частково стабілізований кістяк, що фторцитозин, 5-хлорцитозин, 5-бромцитозин, 5містить щонайменше один фосфодіефірний зв'яйодцитозин, 5-гідроксицитозин, 6-гідроксицитозин, зок 5'-CpG-3'. Будь-який або обидва з С і G в CpG5-гідроксиметилцитозин, 5-дифторметилцитозин і динуклеотиді може бути модифікованим. незаміщений або заміщений 5-алкінілцитозин, N4В одному з варіантів здійснення GC-багате етилцитозин, Ν,Ν'-пропіленцитозин, феноксазин, стебло має довжину 2 послідовні пари основ. 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-бромвінілурацил, В одному з варіантів здійснення GC-багате 4-тіоурацил, 5-гідроксіурацил, 5-пропінілурацил, 2стебло має довжину 3 послідовні пари основ. тіотимін, 4-тіотимін, 6-заміщені тиміни, 7-деаза-7В одному з варіантів здійснення GC-багате (С2-С6)-алкінілгуанін, N2-метилгуанш, N6стебло має довжину 4 послідовні пари основ. метиладенін, 8-оксоаденін, 8-гідроксигуанін і 8В одному з варіантів здійснення GC-багате бромгуанін. стебло має довжину 5 послідовних пар основ. В одному з варіантів здійснення заміщений В одному з варіантів здійснення GC-багате або модифікований пурин або піримідин вибраний стебло має довжину 6 послідовних пар основ. з групи, яка включає в себе універсальну основу, В одному з варіантів здійснення GC-багате ароматичну циклічну систему і атом водню (dстебло містить щонайменше 2 пари основ G-C. спейсер). В одному з варіантів здійснення GC-багате В одному з варіантів здійснення заміщений стебло містить щонайменше З пари основ G-C. або модифікований пурин або піримідин вибраний У конкретному варіанті здійснення щонайменз групи, яка включає в себе 4-метиліндол, 5ше одна неспарена або некомплементарно спаренітроіндол, 3-нітропірол, Р-основу і K-основу, бенна основа являє собою Т. зімідазол, дихлорбензімідазол, амід 1-метил-1НВ одному з варіантів здійснення частково ста[1,2,4]триазол-3-карбонової кислоти, фторбензол і білізований кістяк, що містить щонайменше один дифторбензол. фосфодіефірний зв'язок 5'-CpG-3', додатково місВ одному з варіантів здійснення будь-який з N, тить безліч фосфоротіоатних міжнуклеотидних S, X, або Ζ заміщений залишком, вибраним з грузв'язків. пи, яка включає в себе С6-С30 алкільний ланцюг, В одному з варіантів здійснення 5'-кінець має жовчні кислоти, холеву кислоту, таурохолеву киспослідовність, представлену як лоту, дезоксихолат, холестерин, олеїллітохолеву кислоту, олеоїлхоленову кислоту, гліколіпіди, фосфоліпіди, сфінголіпіди, ізопреноїди, стероїди, В одному з варіантів здійснення 3'-кінець завітаміни, вітамін Е, насичені жирні кислоти, ненакінчується інвертованим повтором, що має послісичені жирні кислоти, складний ефір жирних кисдовність основ, представлену як лот, тригліцериди, пірени, порфірини, тексафірин, CGGCGCCGTGCCG (SEQ ID NO: 19). адамантан, акридини, біотин, кумарин, флуоресВ одному з варіантів здійснення 3'-кінець зацеїн, родамін, Техас червоний, дигоксигенін, дикінчується інвертованим повтором, що має посліметокситритил, трет-бутилдиметилсиліл, третдовність основ, представлену як бутилдифенілсиліл, ціанінові барвники, ціаніновий CGGCGTCGTGCCG (SEQ ID NO: 9). барвник Су3, ціаніновий барвник Су576, барвник В одному аспекті винахід відноситься до імуХехст 33258, псорален і ібупрофен. ностимулюючої нуклеїнової кислоти, що має послідовність основ, представлену як В одному аспекті винахід відноситься до імуностимулюючої молекули нуклеїнової кислоти, що В одному аспекті винахід відноситься до імумістить (а) 5'-кінець, що починається імуностимуностимулюючої нуклеїнової кислоти, що має полюючим мотивом, вибраним з (TCG)nN і слідовність основ, представлену як RDCGY1Y2N, де Τ являє собою тимін, С являє собою неметильований цитозин, G являє собою гуаВ одному аспекті винахід відноситься до імунін, R являє собою пурин, D не є С, кожен з Υ1 і Υ2 ностимулюючої нуклеїнової кислоти, що має понезалежно являє собою піримідин, n є цілим чисслідовність основ, представлену як лом від 1 до 4, включно, і N являє собою будь-яку послідовність довжиною 0-12 основ; (b) 3'-кінець, де * означає фосфоротіоатний міжнуклеотидний зв'язок і _ означає фосфодіефірний міжнуклеотидний зв'язок. В одному аспекті винахід відноситься до імуностимулюючої нуклеїнової кислоти, що має послідовність основ, представлену як 19 88457 20 де * означає фосфоротіоатний міжнуклеотидний зв'язок і _ означає фосфодіефірний міжнуклеотидний зв'язок. В одному аспекті винахід відноситься до імуностимулюючої нуклеїнової кислоти, що має послідовність основ, представлену як де * означає фосфоротіоатний міжнуклеотидний зв'язок і _ означає фосфодіефірний міжнуклеотидний зв'язок. В одному аспекті винахід відноситься до імуностимулюючої нуклеїнової кислоти, що має послідовність основ, представлену як де * означає фосфоротіоатний міжнуклеотидний зв'язок і _ означає фосфодіефірний міжнуклеотидний зв'язок. В одному аспекті винахід відноситься до вакцини, що містить імуностимулюючу молекулу нуклеїнової кислоти за винаходом і антиген. В одному аспекті винахід відноситься до фармацевтичної композиції, що містить імуностимулюючу молекулу нуклеїнової кислоти за винаходом і фармацевтично прийнятний носій. В одному з аспектів винахід відноситься до способу індукції експресії інтерферону І типу (IFN). Спосіб за даним аспектом винаходу передбачає контактування клітини, здатної експресувати IFN І типу, з імуностимулюючою молекулою нуклеїнової кислоти за винаходом в кількості, ефективній для індукції експресії IFN І типу. В одному з варіантів здійснення IFN І типу являє собою інтерферон альфа (IFN-a). В одному з варіантів здійснення IFN І типу являє собою інтерферон бета (IFN-b). В одному з аспектів винахід відноситься до способу індукції експресії інтерферону гамма (IFNg). Спосіб за даним аспектом винаходу передбачає контактування клітини, здатної експресувати IFN-g, з імуностимулюючою нуклеїновою кислотою за винаходом в кількості, ефективній для індукції експресії IFN-g. В одному з аспектів винахід відноситься до способу активації природної клітини-кілера (NK). Спосіб по даному аспекту винаходу передбачає контактування NK-клітини з імуностимулюючою нуклеїновою кислотою за винаходом в кількості, ефективній для активації NK-клітини. В одному з аспектів винахід відноситься до способу лікування інфекції. Спосіб по даному аспекту винаходу передбачає введення суб'єкту, що страждає від інфекції або схильного до ризику її розвитку, імуностимулюючої нуклеїнової кислоти за винаходом в кількості, ефективній для лікування або попередження інфекції. В одному з варіантів здійснення суб'єкт має інфекцію, вибрану з вірусної, бактерійної, грибкової або паразитарної інфекції, або схильний до ризику її розвитку. В одному з варіантів здійснення суб'єкт має вірусну інфекцію вірусом, вибраним з вірусу гепатиту В (HBV), вірусу гепатиту С (HCV), цитомегаловіруса (CMV), вірусу Епштейна-Барра (EBV), вірусу папіломи, вірусу імунодефіциту людини (HIV) або вірусу простого герпесу (HSV), або схильний до ризику її розвитку. В одному з варіантів здійснення суб'єкт має бактерійну інфекцію видами бактерій, вибраних з Leishmania, Listeria або Anthrax, або схильний до ризику її розвитку. В одному з аспектів винахід відноситься до способу лікування алергічного стану. Спосіб по даному аспекту винаходу передбачає введення суб'єкту, що страждає на алергічний стан або схильному до ризику його розвитку, імуностимулюючої нуклеїнової кислоти за винаходом в кількості, ефективній для лікування або попередження алергічного стану. В одному з варіантів здійснення алергічний стан являє собою алергічну астму. В одному з аспектів винахід відноситься до способу лікування раку. Спосіб по даному аспекту винаходу передбачає введення суб'єкту, що страждає на рак або схильному до ризику його розвитку, імуностимулюючої нуклеїнової кислоти за винаходом в кількості, ефективній для лікування або попередження раку. В одному з варіантів здійснення рак вибраний з базально-клітинної карциноми, раку жовчних шляхів, раку сечового міхура, раку кістки, раку мозку і центральної нервової системи, раку молочної залози, раку шийки матки, хоріокарциноми, раку ободової і прямої кишки, раку сполучної тканини, раку травної системи, ендометріального раку, раку стравоходу, злоякісної пухлини ока, злоякісної пухлини голови і шиї, раку шлунка, інтраепітеліальної неоплазії, раку нирки, раку глотки, лейкозу, раку печінки, раку легені, лімфоми, включаючи лімфому Ходжкіна і неходжкінську лімфому, меланоми, мієломи, нейробластоми, раку порожнини рота, раку яєчника, раку підшлункової залози, раку передміхурової залози, ретинобластоми, рабдоміосаркоми, раку прямої кишки, раку нирки, злоякісної пухлини респіраторної системи, саркоми, раку шкіри, раку шлунка, раку яєчка, раку щитовидної залози, раку матки, злоякісної пухлини сечовидільної системи або інших карцином і сарком. В одному з варіантів здійснення рак являє собою рак, чутливий до лікування інтерфероном альфа (IFN-a). В одному з варіантів здійснення рак, чутливий до лікування інтерфероном альфа (IFN-a) вибраний з лейкозу ворсистих клітин, хронічного мієлолейкозу, шкірного Т-клітинного лейкозу, множинної мієломи, фолікулярної лімфоми, злоякісної меланоми, плоскоклітинної карциноми, пов'язаної із СНІДом саркоми Капоші, нирково-клітинної карци 21 88457 22 номи, карциноми передміхурової залози, дисплазії Фіг.1 являє собою серію графіків, що показушийки матки або карциноми товстої кишки. ють індукцію за допомогою ODN 332, 333 і 334 IFNВ одному з аспектів винахід відноситься до заa і передачі сигналу TLR9. стосування імуностимулюючої нуклеїнової кислоти Фіг.2 являє собою серію графіків, що показуза винаходом для виробництва лікарського засобу ють індукцію за допомогою ODN 611, 614 і 620 IFNдля застосування в лікуванні інфекції. a і передачі сигналу TLR9. В одному з аспектів винахід відноситься до заФіг.3 являє собою графік, що показує продукстосування імуностимулюючої нуклеїнової кислоти цію IFN-a периферичними мононуклеарними кліза винаходом для виробництва лікарського засобу тинами крові (РВМС), стимульованими панеллю для застосування в лікуванні алергічного стану. олігонуклеотидів. В одному з аспектів винахід відноситься до заФіг.4 являє собою графік, що показує середні стосування імуностимулюючої нуклеїнової кислоти групові титри (GMT) загальних антигенспецифічза винаходом для виробництва лікарського засобу них IgG після імунізації 1мкг поверхневого антигедля застосування в лікуванні алергічної астми. ну вірусу гепатиту В (HBsAg) з вказаною кількістю В одному з аспектів винахід відноситься до заODN. стосування імуностимулюючої нуклеїнової кислоти Фіг.5 являє собою графік, що показує GMT виза винаходом для виробництва лікарського засобу ділених ізотипів антигенспецифічних IgG після для застосування в лікуванні раку. імунізації 1мкг HBsAg з вказаною кількістю ODN. Кожне з обмежень винаходу може охоплювати Фіг.6 являє собою графік, що показує відповіді різні варіанти здійснення за винаходом. Потрібно антигенспецифічних цитолітичних Т-лімфоцитів попередити, однак, що кожне з обмежень винахопісля імунізації 1мкг HBsAg з вказаною кількістю ду, що відноситься до будь-якого елементу або ODN. поєднання елементів, можна включити в кожний Фіг.7А являє собою графік, що показує здатаспект винаходу. ність до виживання у відповідності з різними видаДаний винахід можна більш просто і повно ми лікування ODN на мишачій моделі пухлини зрозуміти, якщо розглядати в сукупності з фігуранейробластоми. ми, що його супроводжують. Фігури наведені тільФіг.7В являє собою графік, що показує об'єм ки для ілюстративних цілей і не є необхідними для пухлини у відповідності з різними видами лікуванрозуміння або здійснення винаходу. ня ODN на мишачій моделі пухлини нейробластоми. 23 В одному аспекті винахід оснований на відкритті, що конкретні підкласи імуностимулюючих CpG-олігонуклеотидів, що мають певну вторинну структуру, високоефективно опосередковують імуностимулюючі ефекти. Дані CpG-нуклеїнові кислоти є терапевтично і профілактично корисними для стимуляції імунної системи для лікування раку, інфекційних захворювань, алергії, астми й інших захворювань і для допомоги при захисті проти помірних інфекцій після хіміотерапії раку. Сильні, але збалансовані клітинна і гуморальна імунні відповіді, що отримуються при стимуляції CpG, відображають власний природний захист організму проти патогенів, що вторгаються, і ракових клітин. Послідовності за винаходом мають деяку структурну схожість з класом CpGолігонуклеотидів, на який посилаються як на Склас або олігонуклеотидну з комбінованим мотивом CpG. Див. опубліковану міжнародну заявку на отримання патенту РСТ WO 03/015711. Подібно до описаних вище олігонуклеотидів С-класу, CpGолігонуклеотиди С-класу за даним винаходом мають певні 5'- і 3'-мотиви як частини молекули. Дані описані вище олігонуклеотиди С-класу мають традиційну «стимулюючу» CpG-послідовність, як правило, розташовану на 5'- або 3'-кінці і мотив «GCбагатого паліндрома», як правило, розташований на іншому кінці молекули або поблизу нього. Такі нуклеїнові кислоти з комбінованим мотивом надають імуностимулюючі ефекти, десь проміжні між такими ефектами, пов'язаними з традиційними CpG-ODN «В-класу», що є сильними індукторами активації В-клітин і активації дендритних клітин, і такими ефектами, пов'язаними з більш недавно описаним класом CpG-вмісних імуностимулюючих 88457 24 нуклеїнових кислот (CpG-ODN «Α-класу»), які с сильними індукторами IFN-a і активації NK-клітин, але порівняно слабкими індукторами активації Вклітин і активації DC. Нові CpG-олігонуклеотиди С-класу за даним винаходом також відрізняються по структурі від описаних раніше CpG-олігонуклеотидів С-класу. У порівнянні з описаними раніше CpGолігонуклеотидами С-класу, імуностимулюючі молекули нуклеїнових кислот за даним винаходом характеризуються більш м'якими вимогами по відношенню до GC-багатого паліндрома на одному кінці молекули. Наприклад, описані раніше CpGолігонуклеотиди С-класу в одному з варіантів здійснення містять суворий або точний паліндром довжиною щонайменше 10 нуклеотидів, що має вміст GC щонайменше 2/3. У деяких варіантах здійснення паліндром описаних раніше олігонуклеотидів С-класу може містити не більш, ніж мінімальне число послідовних некомплементарно спарених нуклеотидів. На відміну від описаних раніше олігонуклеотидів С-класу, аналоги олігонуклеотидів С-класу за даним винаходом характеризуються паліндромними мотивами, які можуть мати, в різних варіантах здійснення, менше за 10 нуклеотидів; вміст GC між нулем і менш ніж 2/3; різні аналоги нуклеотидів і замісники, включаючи позбавлені будь-яких нуклеїнових основ (d-спейсер); подовжену інвертовану послідовність, що містить чотири або більше послідовних нуклеотидів або замісників нуклеотидів, що не формують Уотсон-Криківські пари основ, і будь-які їх поєднання. Крім того, в деяких варіантах здійснення 3'-частини двох або більше молекул можна з'єднати разом за їх 3'-кінці. Вияв 25 88457 26 лено, що олігонуклеотиди даного нового підкласу, 3'-кінець нуклеїнової кислоти закінчується інщо не мають точного паліндрома, ще здатні, подівертованим повтором, здатним формувати струкбно до описаних раніше CpG-олігонуклеотидів з туру шпильки або стебла-петлі. Термін «закінчукомбінованим мотивом, індукувати високі рівні ється» відноситься до структури на 3'-кінці або продукції IFN, включаючи IFN І типу (наприклад, поблизу нього. Таким чином, кінець неточного паліндрома може розташовуватися на фактичному IFN-a, IFN-b) і IFN-g. 3'-кінці молекули, або, як альтернатива, 3'-кінець «Паліндром» і, еквівалентно, «паліндромна може містити 1 або декілька додаткових нуклеотипослідовність», як застосовують тут, відноситься дів, що не є частиною структури інвертованого до послідовності нуклеїнової кислоти, точно звоповтору. Переважно 3'-кінець молекули містить 3 ротно комплементарної собі самій (тобто, послідоабо менше нуклеотидів, що не формують частину вності, такої як ABCDEE'D'C'B'A', в якій А і А', В і В', структури інвертованого повтору. С і С, D і D', Ε і Е' являють собою основи, здатні За одним з варіантів здійснення «інвертований формувати звичайні Уотсон-Криківські пари основ, повтор, здатний формувати структуру шпильки тобто G-C, А-Т і A-U. Як застосовують тут, «палінабо стебла-петлі», як застосовують тут, відноситьдром» в суворому значенні виключає інвертовану ся до послідовності нуклеотидів, що формує GCпослідовність або інвертовану ненуклеотидну багате стебло або шпильку довжиною 2-10 посліструктуру, що не бере участі в формуванні звидовних пар основ і що містить щонайменше одну чайних Уотсон-Криківських пар основ. неспарену або некомплементарно спарену основу. «Інвертований повтор», як застосовують тут, В окремих варіантах здійснення GC-багате стебло відноситься до неточного паліндрома, тобто помає довжину 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 послідовних слідовності нуклеїнової кислоти, в якій присутні як пар основ. У деяких варіантах здійснення GCнуклеотиди, здатні формувати звичайні Уотсонбагате стебло містить щонайменше 2, 3 або 4 паКриківські пари основ, так і нуклеотиди, аналоги ри основ G-C. нуклеотидів й інші структури, що не беруть участі в За одним з варіантів здійснення «інвертований формуванні звичайних Уотсон-Криківських пар повтор, здатний формувати структуру шпильки основ (наприклад, послідовність, така як ABCDEабо стебла-петлі», як застосовують тут, відноситьS- E'D'C'B'A', в якій А і А', В і В', С і С', D і D', Ε і Е' ся до послідовності нуклеотидів, що формує АТявляють собою основи, здатні формувати звичайні багате стебло або шпильку довжиною від 2 до 10 Уотсон-Криківські пари основ, і S являє собою непослідовних пар основ і що містить щонайменше паліндромну послідовність або ненуклеотидний одну неспарену або некомплементарно спарену лінкер або абазичний лінкер (d-спейсер)). У конкоснову. В окремих варіантах здійснення АТ-багате ретних варіантах здійснення нуклеотиди, аналоги стебло має довжину 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 понуклеотидів й інші структури, що не беруть участі в слідовних пар основ. У деяких варіантах здійсненформуванні звичайних Уотсон-Криківських пар ня АТ-багате стебло містить щонайменше 2, 3 або основ, переривають точний у всьому іншому палі4 пари основ А-Т. ндром. У конкретних варіантах здійснення нуклеоУ деяких випадках щонайменше одна неспатиди, що не беруть участі в формуванні звичайних рена або некомплементарно спарена основа з'єдУотсон-Криківських пар основ, можуть формувати нує містком кінці стебла або шпильки. Це може не Уотсон-Криківські пари основ з іншим нуклеотидозволяти формування вторинної структури надом, наприклад, G-T. Не Уотсон-Криківська пара данням точки перегину в молекулі для стебел для основ, як застосовують тут, являє собою будь-яку утворення пари основ і формування шпильки. Як пару основ, відмінну від Уотсон-Криківської пари альтернатива неспарена або некомплементарно основ, що включає в себе як необмежувальні приспарена основа (основи) може бути присутньою клади Хугстенівські взаємодії і так зване неодновсередині стебла. Якщо некомплементарно спазначне спаровування. У конкретних варіантах рена основа присутня всередині стебла, тоді пездійснення нуклеотиди, що не беруть участі в фореважне стебло довжиною щонайменше 3 пари рмуванні звичайних Уотсон-Криківських пар, непаоснов. У деяких варіантах здійснення неспарена рні і не мають нуклеотидної основи або аналога або некомплементарно спарена основа являє сонуклеотидної основи, з яким можуть формувати бою Т. Неспарені нуклеотиди на кінці подвійних Уотсон-Криківську або не Уотсон-Криківську пару ланцюгів відомі також як виступаючі нуклеотиди основ, наприклад, G навпроти d-спейсера. У конкабо вільні кінці, які можуть значно стабілізувати ретних варіантах здійснення нуклеотиди, що не формування дуплекса або формування шпильки. беруть участі в формуванні пар основ, можуть Freier SM et al. (1983) Effects of 3'dangling end формувати нестандартні пари основ з іншим нукstacking on the stability of GGCC and CCGG double леотидом, наприклад, діамінопіридин може форhelixes. Biochemistry 22: 6198-206. мувати пару основ з ксантозином. Нуклеїнова кислота містить також частково За одним з варіантів здійснення 5'-кінець нукстабілізований кістяк, що містить щонайменше леїнової кислоти починається з імуностимулюючоодин фосфодіефірний зв'язок 5'-CpG-3'. го мотиву, вибраного з (TCG)nN і RDCGY1Y2N. T У деяких випадках дволанцюгова частина моявляє собою тимін, С являє собою неметильовалекули може містити також неприродні (нестанданий цитозин, G являє собою гуанін, R являє собою ртні) пари основ (наприклад, діамінопіридин, спапурин, D не є С, кожен з Υ1 і Y2 незалежно являє рений з ксантозином). Lutz MJ et al. (1998) собою піримідин, n являє собою ціле число від 1 Recognition of a non-standard base pair by до 4, включно, і N являє собою будь-яку послідовthermostable DNA polymerases. Bioorg Med Chem ність довжиною 0-12 пар основ. Lett 8: 1149-52. 27 88457 28 Формули визначають підгрупи класу CpG(Durand Μ et al. (1992) Triple-helix formation by an олігонуклеотидів, що демонструють відмінні імуноoligonucleotide containing one (dA) 12 and two (dT) стимулюючі властивості. У формулах 5' відносить12 sequences bridged by two hexaethylene glycol ся до вільного 5'-кінця олігонуклеотиду і 3' відноchains, Biochemistry 31: 9197-204; патент США ситься до вільного 3'-кінця олігонуклеотиду. №5658738 і патент США №5668265). Як альтернаОлігонуклеотиди можуть мати один або декітива, ненуклеотидний лінкер можна отримати з лька доступних 5'- або 3'-кінців. У деяких варіантах етандіолу, пропандіолу або з абазичної дезоксиздійснення 3'-кінець можна приєднати до іншого 3'рибозної ланки (d-спейсера) (Fontanel ML et al. кінця. Оскільки виявлена і описана тут важливість (1994) Sterical recognition by T4 polynucleotide 5'- і 3'-мотивів, можливо також отримати модифіkinase of non-nucleosidic moieties 5'-attached to ковані олігонуклеотиди, що мають два таких 5'oligonucleotides, Nucleic Acids Res 22: 2022-7) із або 3'-кінця. Цього можна досягти, наприклад, застосуванням звичайної фосфорамідитної хімії. сполученням двох олігонуклеотидів за допомогою Ненуклеотидні лінкери можна вводити один або зв'язку 3'-3' для отримання олігонуклеотиду, що декілька разів або поєднувати один з одним, домає два доступних 5'-кінці. 3'3'- або 5'5'-зв'язок зволяючи будь-яку бажану відстань між З'-кінцями може являти собою фосфодіефірний, фосфоротідвох ODN, що підлягають зв'язуванню. оатний або будь-який інший модифікований міжну«Ненуклеотидний лінкер» як застосовують тут, клеозидний місток. Способи здійснення такого відноситься до будь-якого лінкерного елемента, зв'язування відомі в даній галузі. Наприклад, такі що не є нуклеотидом або його полімером (тобто зв'язки описані в Seliger Η et al. (1991) полінуклеотидом), де нуклеотид включає в себе Oligonucleotide analogs with terminal 3'-3' - and 5'-5'пуринову або піримідинову нуклеїнову основу і internucleotidic linkages as antisense inhibitors of фосфат цукру. Таким чином, ненуклеотидний лінviral gene expression, Nucleosides & Nucleotides 10: кер включає в себе абазичний нуклеотид (d469-77 and Jiang Ζ et al. (1999) Pseudo-cyclic спейсер), тобто нуклеотидоподібну сахарофосфаoligonucleotides: in vitro and in vivo properties, Bioorg тну ланку, в якій нуклеїнова основа замінена атоMed Chem 1:2121-35. мом водню. Ненуклеотидний лінкер може являти Крім того, 3'-3'-зв'язані або 5'-5'-зв'язані ODN, собою поліетиленгліколь, що включає в себе як де зв'язок між 3'- або 5'-кінцевими нуклеотидами необмежувальні приклади триетиленгліколь і гекне є фосфодіефірним, фосфоротіоатним або інсаетиленгліколь. шим модифікованим містком, можна отримати із У деяких варіантах здійснення олігонуклеотид застосуванням додаткового спейсера, такого як має одну з наступних структур: три- або тетраетиленглікольфосфатна група Символ * означає присутність стабілізованого міжнуклеотидного зв'язку і _ означає присутність фосфодіефірного зв'язку. Імуностимулюючі олігонуклеотиди, як правило, мають довжину в діапазоні від 6 до 100 нуклеотидів. У деяких варіантах здійснення довжина знаходиться в діапазоні 6-40, 13-100, 13-40, 13-30, 15-50 або 15-30 нуклеотидів, або в будь-якому діапазоні цілих чисел між ними. Терміни «нуклеїнова кислота» і «олігонуклеотид» застосовують поперемінно, позначаючи множинні нуклеотиди (тобто молекули, що містять цукор (наприклад, рибозу або дезоксирибозу)), пов'язані з фосфатною групою і з взаємозамінною органічною основою, що являє собою заміщений піримідин (наприклад, цитозин (С), тимін (Т) або урацил (U)) або заміщений пурин (наприклад, аденін (А) або гуанін (G)). Як застосовують тут, терміни «нуклеїнова кислота» і «олігонуклеотид» відносяться до олігорибонуклеотидів також як до олігодезоксирибонуклеотидів. Терміни «нуклеїнова кислота» і «олігонуклеотид» повинні відноситься також до полінуклеозидів (тобто полінуклеотиду мінус фосфат) і будь-якого іншого полімеру, що містить органічну основу. Молекули нуклеїнових кислот можуть бути отримані з існуючих джерел нуклеїнових кислот (наприклад, геномної або кДНК), але переважно є синтетичними (наприклад, отриманими синтезом нуклеїнових кислот). Терміни «нуклеїнова кислота» і «олігонуклеотид», як застосовують тут, відносяться до молекул нуклеїнової кислоти і олігонуклеотидів за винаходом, так само як до аналогів олігонуклеотидів за винаходом. Терміни «олігодезоксинуклеотид» і, еквівалентно, «ODN», як застосовують тут, відноситься до немодифікованих олігодезоксинуклеотидів за винаходом так само як до аналогів олігодезоксинуклеотидів за винаходом. Терміни «нуклеїнова кислота» і «олігонуклеотид», як застосовують тут, відносяться до молекул нуклеїнової кислоти і олігонуклеотидів із заміщеннями або модифікаціями, такими як заміщення або модифікації в основах і/або цукрі. Наприклад, вони включають в себе нуклеїнові кислоти, що мають цукор кістяка, ковалентно приєднані до низькомолекулярних органічних груп, що відрізняються від 29 88457 30 олігонуклеотиду від деградації внутрішньоклітингідроксильної групи в 2'-положенні і відрізняються ними екзо- і ендонуклеазами. від фосфатної групи або гідроксигрупи в 5'Фосфодіефірний міжнуклеозидний місток, лоположенні. Такі модифіковані нуклеїнові кислоти калізований на 3'- і/або 5'-кінці нуклеозиду можна можуть містити 2'-О-алкіловану рибозну групу. замінити модифікованим міжнуклеозидним містКрім того, модифіковані нуклеїнові кислоти можуть ком, де модифікований міжнуклеозидний місток містити цукор, такий як арабінозу або 2'вибраний, наприклад, з фосфоротіоату, фосфорофторарабінозу замість рибози. Відповідно, нуклеїдитіоату, NR1R2-фосфорамідату, боранфосфату, нові кислоти можуть бути гетерогенними в складі кістяка, що таким чином містять будь-які можливі a-гідроксибензилфосфату, фосфат-(С1-С21)-Опоєднання ланок полімеру, сполучених разом, алкілового складного ефіру, фосфат-[(С6-С12)такими як пептид-нуклеїнові кислоти (що мають арил-(С1-С21)-О-алкіл]складного ефіру, (С1-С8)пептидоподібний кістяк з основами нуклеїнових алкілфосфонатних і/або (С6-С12)кислот). Інші приклади більш детально описані арилфосфонатних містків, (С7-С12)-aнижче. гідроксиметиларилу (наприклад, описаного в WO Імуностимулюючі олігонуклеотиди за даним 95/01363), де (С6-С12)-арил, (С6-С20)-арил і (С6винаходом можуть охоплювати різні хімічні модиС14)-арил, необов'язково, замінений галогеном, фікації або заміщення в порівнянні з природними алкілом, алкокси-, нітро-, ціано-, і де R1 і R2 незаРНК і ДНК, що залучають фосфодіефірний міжнулежно один від одного являють собою водень, (С1клеозидний місток, b-D-рибозна ланка і/або прироС18)-алкіл, (С6-С20)-арил, (С6-С14)-арил-(С1-С8)дна нуклеозидна основа (аденін, гуанін, цитозин, алкіл, переважно водень, (С1-С8)-алкіл, переважно тимін, урацил). Приклади хімічних модифікацій (С1-С4)-алкіл і/або метоксіетил, або R1 і R2 разом з відомі фахівцям в даній галузі і описані, наприатомом азоту, що несе їх, формують 5-6-членне клад, в Uhlmann Ε et al. (1990) Chem Rev 90:543; гетероциклічне кільце, яке може додатково містити "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" додатковий гетероатом з групи О, S або N. Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Заміна фосфодіефірного містка, локалізованоTechniques, S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, го на 3'- і/або 5'-кінці нуклеозиду, дефосфо-містком USA 1993; Crooke ST et al. (1996) Armu Rev [дефосфо-містки описані, наприклад, в Uhlmann E Pharmacol Toxicol 36: 107-29; і Hunziker J et al. and Peyman A in "Methods in Molecular Biology", (1995) Mod Synth Methods 7: 331-417. ОлігонуклеоVol. 20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", тид за даним винаходом може містити одну або S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa 1993, декілька модифікацій, де кожна модифікація локаChapter 16, pp. 355 ff], де дефосфо-місток, наприлізована в конкретному фосфодіефірному міжнукклад, вибраний з дефосфо-містків формацетальлеозидному містку і/або в конкретній b-D-рибозній ної, 3-тіоформацетильної, метилгідроксиламінової, ланці і/або в конкретному положенні природної оксимної, метилендиметил-гідразо, диметиленсунуклеозидної основи в порівнянні з олігонуклеотильфонової і/або силілової груп. дом такої ж послідовності, складеним з природних Сахарофосфатну ланку (наприклад, b-DДНК або РНК. рибозу і фосфодіефірний міжнуклеозидний місток, Наприклад, олігонуклеотиди можуть містити що разом формують сахарофосфатну ланку) з одну або декілька модифікацій, де кожну модифісахарофосфатного кістяка (тобто сахарофосфаткацію незалежно вибирають з ний кістяк складається з сахарофосфатних ланок) a) заміни фосфодіефірного міжнуклеозидного можна замінити іншою ланкою, де інша ланка, намістка, локалізованого на 3'- і/або 5'-кінці нуклеоприклад, придатна для побудови «морфолінозиду модифікованим міжнуклеозидним містком, похідного» олігомеру (як описано, наприклад, в b) заміни фосфодіефірного містка, локалізоваStirchak ЕР et al. (1989) Nucleic Acids Res 17:6129ного на 3'- і/або 5'-кінці нуклеозиду дефосфо41), що являє собою, наприклад, заміну «морфомістком, ліно-похідною» ланкою; або для побудови поліаміc) заміни сахарофосфатної ланки з сахарофодної нуклеїнової кислоти («PNA»; як описано, насфатного кістяка молекули іншою ланкою, приклад, в Nielsen ΡΕ et al. (1994) Bioconjug Chem d) заміни b-D-рибозної ланки ланкою модифі5:3-7), що являє собою, наприклад, заміну ланкою кованого цукру і кістяка PNA, наприклад, 2-аміноетилгліцином. Оліe) заміни природної нуклеозидної основи могонуклеотид може мати інші модифікації і заміни в дифікованою нуклеозидною основою. кістяку, такі як пептидні нуклеїнові кислоти з фосБільш докладні приклади хімічних модифікацій фатними групами (PHONA), замкнені нуклеїнові олігонуклеотиду наступні. кислоти (LNA) і олігонуклеотиди з ділянками кістяОлігонуклеотиди можуть містити модифіковані ка з алкіловими лінкерами або амінолінкерами. міжнуклеотидні зв'язки, такі як описані вище в а Алкіловий лінкер може бути розгалуженим або або b. Дані модифіковані зв'язки можуть бути частнерозгалуженим і хірально однорідним або рацеково стійкими до деградації (наприклад, стабілізомічною сумішшю. ваними). «Стабілізована молекула олігонуклеотиb-рибозну ланку або b-D-2'-дезоксирибозну ду» означає олігонуклеотид, внаслідок таких ланку можна замінити модифікованою цукровою модифікацій відносно стійкий до деградації in vivo ланкою, де модифіковану цукрову ланку, напри(наприклад, за допомогою екзо- або ендонуклеаклад, вибирають з b-D-рибози, a-D-2'зи). Олігонуклеотиди з фосфоротіоатними зв'язкадезоксирибози, L-2'-дезоксирибози, 2'-F-2'ми, в деяких варіантах здійснення, можуть забездезоксирибози, 2'-F-арабінози, 2'-О-(С1-С6)печувати максимальну активність і захист алкілрибози, де 2'-О-(С1-С6)-алкілрибоза переважніше являє собою 2'-О-метилрибозу, 2'-О-(С2-С6) 31 88457 32 бромцитозин, 5-йодцитозин, 5-гідроксицитозин, 5алкенілрибозу, 2'-[О-(С1-С6)-алкіл-О-(С1-С6)-алкіл]гідроксиметилцитозин, 5-дифторметилцитозин і рибозу, 2'-NH2-2'-дезоксирибозу, b-Dнезаміщений або заміщений 5-алкінілцитозин), 6ксилофуранозу, a-арабінофуранози, 2,4заміщені цитозини (наприклад, 6-гідроксицитозин), дидезокси-b-D-еритрогексопіранози і аналогів цукN4-заміщені цитозини (наприклад, N4ру, карбоциклічних [описаних, наприклад, в етилцитозин), 5-азацитозин, 2-меркаптоцитозин, Froehler (1992) J Am Chem Soc 114:8320] і/або з ізоцитозин, псевдоізоцитозин, аналоги цитозину з відкритим ланцюгом (описаних, наприклад, в конденсованими кільцевими системами (наприVandendriessche et al. (1993) Tetrahedron 49:7223), клад, Ν,Ν'-пропіленцитозин або феноксазин), і і/або біцикло-цукрових аналогів (описаних, наприурацил і його похідні (наприклад, 5-фторурацил, 5клад, в Tarkov Μ et al. (1993) Helv Chim Acta бромурацил, 5-бромвінілурацил, 4-тіоурацил, 576:481). гідроксіурацил, 5-пропінілурацил). Деякі з переваУ деяких варіантах здійснення цукор являє сожних цитозинів включають в себе 5-метилцитозин, бою 2'-О-метилрибозу, особливо для одного або 5-фторцитозин, 5-гідроксицитозин, 5обох нуклеотидів, зв'язаних фосфодіефірним або гідроксиметилцитозин і N4-етилцитозин. В інших фосфодіефірно-подібним міжнуклеозидним зв'язваріантах здійснення за винаходом цитозинову ком. основу замінюють універсальною основою (наприНуклеїнові кислоти містять також заміщені пуклад, 3-нітропірол, Р-основа), ароматичною кільрини і піримідини, такі як С-5-пропінпіримідин і 7цевою системою (наприклад, фторбензол і дифтодеаза-7-заміщені модифіковані основи. Wagner рбензол) або атомом водню (d-спейсер). RW et al. (1996) Nat Biotechnol 14: 840-4. Пурини і Гуанін можна замінити модифікованою гуаніпіримідини включають в себе як необмежувальні новою основою. Модифікований гуанін, як застоприклади аденін, цитозин, гуанін, тимін і урацил, і совують тут, являє собою природну або неприродінші природні і неприродні нуклеїнові основи, зану пуринову основу, що є аналогом гуаніну, яким міщені і незаміщені ароматичні молекули. можна замінити дану основу без зниження імуноМодифікована основа являє собою будь-яку стимулюючої активності олігонуклеотиду. Модифіоснову, що хімічно відрізняється від природної ковані гуаніни включають в себе як необмежуваоснови, що звичайно знаходиться в ДНК і РНК, льні приклади 7-деазагуанін, 7-деаза-7-заміщений такої як Т, С, G, А і U, але що розділяє основні гуанін (такий як 7-деаза-7-(С2-С6)-алкінілгуанін), 7хімічні структури з природними основами. Модифідеаза-8-заміщений гуанін, гіпоксантин, N2ковану нуклеозидну основу можна вибрати, напризаміщені гуаніни (наприклад, N2-метилгуанін), 5клад, з гіпоксантину, урацилу, дигідроурацилу, аміно-З-метил-3H, 6Н-тіазоло[4,5-d]піримідин-2,7псевдоурацилу, 2-тіоурацилу, 4-тіоурацилу, 5діон, 2,6-діамінопурин, 2-амінопурин, пурин, індол, аміноурацилу, 5-(С1-С6)-алкілурацилу, 5-(С2-С6)аденін, заміщені аденіни (наприклад, N6алкенілурацилу, 5-(С2-С6)-алкінілурацилу, 5метиладенін, 8-оксоаденін), 8-заміщений гуанін (гідроксиметил)-урацилу, 5-хлорурацилу, 5(наприклад, 8-гідроксигуанін і 8-бромгуанін) і 6фторурацилу, 5-бромурацилу, 5-гідроксицитозину, тіогуанін. В іншому варіанті здійснення за винахо5-(С1-С6)-алкілцитозину, 5-(С2-С6)дом гуанін замінюють універсальною основою (наалкенілцитозину, 5-(С2-С6)-алкінілцитозину, 5приклад, 4-метиліндолом, 5-нітроіндолом і Kхлорцитозину, 5-фторцитозину, 5-бромцитозину, основою), ароматичною кільцевою системою (наN2-диметилгуаніну, 2,4-діамінопурину, 8приклад, бензімідазолом або дихлорбензімідазоазапурину, заміщеного 7-деазапурину, переважно лом, амідом 1-метил-1Н-[1,2,4]триазол-37-деаза-7-заміщеного і/або 7-деаза-8-заміщеного карбонової кислоти) або атомом водню (dпурину, 5-гідроксиметилцитозину, N4спейсер). алкілцитозину, наприклад, N4-етилцитозину, 5В одному варіанті здійснення і С, і G з CGгідроксидезоксицитидину, 5динуклеотиду являють собою немодифіковані осгідроксиметилдезоксицитидину, N4нови цитозину і гуаніну, відповідно. В одному варіалкілдезоксицитидину, наприклад, N4анті здійснення С в CG-динуклеотіді є неметильоетилдезоксицитидину, 6-тіодезоксигуанозину, і ваним. дезоксирибонуклеозиду з нітропіролу, С5Для застосування за даним винаходом, олігопропінілпіримідину і діамінопурину, наприклад, 2,6нуклеотиди за винаходом можна синтезувати de діамінопурину, інозину, 5-метилцитозину, 2novo із застосуванням будь-якого з ряду процедур, амінопурину, 2-аміно-6-хлорпурину, гіпоксантину добре відомих в даній галузі, наприклад, bабо інших модифікацій природних нуклеозидних ціаноетил-фосфорамідний спосіб (Beaucage SL et основ. Даний список є приблизним і не повинен al. (1981) Tetrahedron Lett 22:1859); або нуклеозидінтерпретуватися як обмежувальний. Н-фосфонатний спосіб (Garegg et al. (1986) У конкретні формули, описані тут, можна Tetrahedron Lett 27:4051-4; Froehler ВС et al. (1986) включати модифіковані основи. Наприклад, цитоNucleic Acids Res 14: 5399-407; Garegg et al. (1986) зин можна замінювати модифікованим цитозином. Tetrahedron Lett 27: 4055-8; Gaffhey et al. (1988) Модифікований цитозин, як застосовують тут, явTetrahedron Lett 29: 2619-22). Дані хімічні способи ляє собою природну або неприродну піримідинову можна здійснювати за допомогою автоматизоваоснову, що є аналогом цитозину, яким можна заних синтезаторів нуклеїнових кислот, доступних в мінити дану основу без зниження імуностимулююпродажу. На дані олігонуклеотиди посилаються як чої активності олігонуклеотиду. Модифіковані цина синтетичні олігонуклеотиди. На виділений олітозини включають в себе як необмежувальні гонуклеотид, як правило, посилаються як на олігоприклади 5-заміщені цитозини (наприклад, 5нуклеотид, відділений від компонентів, з якими він метил цитозин, 5-фторцитозин, 5-хлорцитозин, 5 33 88457 34 звичайно пов'язаний в природі. Як приклад, видіBa-Ph, Ph-Ph, Ph-Su і Ph-Ba. Якщо олігонуклеотилений олігонуклеотид може являти собою олігонуди додатково модифікують конкретними ненуклеоклеотид, відділений від клітини, від ядра, від мітотидними замісниками, можуть бути присутніми хондрій або від хроматину. зв'язки між модифікованими частинами олігонукМодифіковані кістяки, такі як фосфоротіоати, леотидів. Дані модифікації включають в себе таможна синтезувати із застосуванням автоматичкож модифіковані нуклеїнові кислоти, наприклад, них способів, що застосовують фосфорамідатпі PNA, LNA, або морфоліно-олігонуклеотидні аналоабо Н-фосфонатні хімічні способи. Арил- або алги. кіл-фосфонати можна отримати, наприклад, як Зв'язки переважно складаються з С, Η, Ν, О, описано в U.S. Pat. No. 4469863; і алкілфосфотриS, В, Ρ і галогену і містять від 3 до 300 атомів. ефіри (в яких заряджена киснева група алкіловаПрикладом з 3 атомами є ацетальний зв'язок на, як описано в патенті США №5023243 і євро(ODNl-3'-O-CH2-O-3'-ODN2; Froehler and Matteucci), пейському патенті №092574) можна отримати що з'єднує, наприклад 3'-гідроксигрупу одного нукавтоматичним твердофазним синтезом із застосулеотиду з 3'-гідроксигрупою другого олігонуклеованням комерційно доступних реагентів. Способи тиду. Прикладом з приблизно 300 атомами є PEGотримання інших модифікацій і заміщень кістяка 40 (тетраконтаполіетиленгліколь). Переважними ДНК описані (наприклад, Uhlmann Ε et al. (1990) зв'язками є фосфодіефірний, фосфоротіоатний, Chem Rev 90:544; Goodchild J (1990) Bioconjugate метилфосфонатний, фосфорамідатний, боранфоChem 1:165). сфонатний, амідний, простий ефірний, тіоефірний, Імуностимулюючі олігонуклеотиди можуть місацетальний, тіоацетальний, сечовинний, тіосечотити також один або декілька незвичайних зв'язків винний, сульфонамідний, Шиффова основи і диміж нуклеотидами або аналогічними нуклеотидам сульфідний зв'язки. Іншою можливістю є застосускладовими. Звичайним міжнуклеозидним зв'язком вання системи Solulink BioConjugation (TriLink є 3'5'-зв'язок. Всі інші зв'язки вважають незвичайBioTechnologies, San Diego, CA). ними міжнуклеозидними зв'язками, такими 2'5'-, Якщо олігонуклеотид складений з двох або бі5'5'-, 3'3'-, 2'2'- і 2'3'-зв'язки. Таким чином, номенкльше частин послідовності, дані частині можуть латуру від 2' до 5' вибирають відповідно до атома бути ідентичними або різними. Так, в олігонуклеовуглецю рибози. Однак, якщо застосовують нетиді із 3'3'-зв'язком послідовності можуть бути ідеприродні цукрові складові, такі як аналоги цукру з нтичними, наприклад, 5'-ODNl-3'3'-ODNl-5', або розширеним кільцем (наприклад, гексаноза, цикрізними, наприклад, 5'-ODNl-3'3'-ODN2-5'. Крім логексен або піраноза) або ди- або трициклічні того, хімічна модифікація різних частин олігонуканалоги цукру, тоді дану номенклатуру змінюють леотиду, так само як і лінкер, що їх з'єднує, можуть відповідно до номенклатури мономера. У 3'відрізнятися. Оскільки поглинання коротких олігонуклеотидів, очевидно, менш ефективне, ніж довдезокси-b-D-рибопіранозних аналогах (званих тагих олігонуклеотидів, з'єднання двох або більше кож р-ДНК) мононуклеотиди сполучені, наприклад, коротких послідовностей приводить до поліпшеної 4'2'-зв'язком. імунної стимуляції. Довжина коротких олігонуклеоЯкщо нуклеотид містить один 3'3'-зв'язок, тоді тидів переважно становить 2-20 нуклеотидів, даний олігонуклеотид, як правило, має два незв'ябільш переважно 3-16 нуклеотидів, але найбільш заних 5'-кінці. Подібним чином, якщо нуклеотид переважно 5-10 нуклеотидів. Переважними є зв'ямістить один 5'5'-зв'язок, тоді даний олігонуклеозані олігонуклеотиди, що мають два або більше тид, як правило, має два незв'язаних 3'-кінці. Донезв'язаних 5'-кінців. ступність незв'язаних кінців нуклеотидів може бути Часткові послідовності олігонуклеотидів можна більш доступна їх рецепторам. Обидва типи нетакож зв'язувати ненуклеотидними лінкерами, зокзвичайних зв'язків (3'3'- і 5'5'-) описані Ortigao JF et рема, абазичними лінкерами (d-спейсерами), ланal. (1992) Antisense Res Dev 2: 129-46, внаслідок ками триетиленгліколю або ланками гексаетиленгчого опубліковано, що олігонуклеотиди, що мають ліколю. Інші лінкери включають в себе 3'3'-зв'язок, показують поліпшену стабільність по алкіламінолінкери, такі як С3, С6, С12відношенню до розщеплення нуклеазами. амінолінкери, і також алкілтіолові лінкери, такі як Різні типи зв'язків можна також поєднувати в С3 або С6-тіолові лінкери. Олігонуклеотиди можна одній молекулі, що може приводити до розгалузв'язувати також ароматичними залишками, які ження олігомеру. Якщо одна частина олігонуклеонадалі можна замінити алкільними або заміщенитиду приєднана 3'-кінцем за допомогою 3'3'-зв'язку ми алкільними групами. до другої частини олігонуклеотиду і 2'-кінцем за Олігонуклеотиди можуть містити також подводопомогою 2'3'-зв'язку до третьої частини молекуєну або потроєну ланку (Glen Research, Sterling, ли, це приводить, наприклад, до утворення розгаVA), зокрема, такі олігонуклеотиди із 3'3'-зв'язками. луженого нуклсотиду з трьома 5'-кінцями (3'3'- 2'3'Подвоєна ланка в одному з варіантів здійснення розгалуженого). може основуватися на 1,3-біс-[5-(4,4'В принципі, зв'язки між різними частинами олідиметокситритилокси)пентиламідо]пропіл-2-[(2гонуклеотиду або між різними олігонуклеотидами, ціаноетил)-(N,N-діізопропіл)]фосфорамідит. Повідповідно, можна здійснювати через всі частини трійна ланка в одному з варіантів здійснення може молекули поки це не впливає негативно на впізнаосновуватися на введенні трис-2,2,2-[3-(4,4'вання її рецептором. Відповідно до природи нукледиметокситритилокси)пропілоксиметил]етил-[(2їнової кислоти, зв'язок може залучати складову ціаноетил)-(N,N-діізопропіл)]фосфорамідиту. Розцукру (Su), гетероциклічну нуклеїнову основу (Ва) галуження олігонуклеотидів множинними подвоєабо фосфатний кістяк (Ph). Таким чином, можливі ними, потроєними або іншими ланками, що позв'язки типу Su-Su, Su-Ph, Su-Ba, Ba-Ba, Ba-Su, 35 88457 36 гії, астми або раку. Альтернативно і в доповнення множують, приводить до дендримерів, що є додатімуностимулюючі CpG-олігонуклеотиди можна даковим варіантом здійснення за даним винаходом. вати самостійно без антигену або алергену для Олігонуклеотиди можуть також містити лінкерні захисту проти інфекції, алергії, або раку, або можланки, що отримуються пептид-модифікуючими на вводити з іншими терапевтичними засобами. або олігонуклеотид-модифікуючими реагентами Імуностимулюючі CpG-олігонуклеотиди можна (Glen Research, Sterling, VA). Крім того, лінкери вводити також з іншими терапевтичними засобаможуть містити один або декілька неприродних ми. Повторні дози можуть дозволити більш триваамінокислотних залишків, сполучених пептидними лий захист. (амідними) зв'язками. Суб'єкт, схильний до ризику, як застосовують Іншою можливістю для зв'язку олігонуклеотитут, є суб'єктом, що має будь-який ідентифіковадів є перехресне зв'язування гетероциклічних осний ризик впливу патогену, що викликає інфекцію, нов [Verma S et al (1998) Annu Rev Biochem 67:99або алергену або ризик розвитку злоякісної пухли134; page 124]. Ще однією можливістю є зв'язок ни. Наприклад, суб'єктом, схильним до ризику розміж групою цукру однієї послідовності з гетероциквитку інфекції, може бути суб'єкт, який планує полічною основою іншої частини послідовності [Iyer їздку в район, де виявлений конкретний тип et al. (1999) Curr Opin Mol Therapeutics 1: 344-58; інфекційного агента, або їм може бути суб'єкт, page 352]. внаслідок способу життя або медичних процедур Різні олігонуклеотиди, що містять незвичайні схильний до впливу рідин організму, які можуть зв'язки, синтезовані загальновизнаними способамістити інфекційні організми, або безпосередньо ми і можуть бути сполучені разом on-line під час організму, або ним може бути будь-який суб'єкт, твердофазного синтезу. Як альтернатива, їх можякий мешкає в районі, де виявлений інфекційний на з'єднати разом після синтезу окремих часткових організм або алерген. Суб'єкти, схильні до ризику послідовностей. розвитку інфекції, також включають в себе повні CpG-фосфоротіоатні олігонуклеотиди з сильпопуляції, яким медичні організації рекомендують ною стимулюючою активністю в мишачій системі вакцинацію конкретним антигеном інфекційного мають тенденцію показувати більш низьку активорганізму. Якщо антиген є алергеном, і у суб'єкта ність в імунних клітинах людини або інших, що не розвиваються алергічні відповіді на даний конкревідносяться до гризунів. ДНК, що містить дані мотний антиген, і суб'єкт може бути схильний до тиви (TCG)nN або RDCGY1Y2N, сильно стимулює впливу антигену, наприклад, під час сезону запипериферичні клітини крові людини до продукції лення, тоді даний суб'єкт є схильним до ризику IFN-a. розвитку алергічної відповіді. Суб'єкт, схильний до Відповідно до винаходу виявлено, що підгрупи ризику розвитку алергії або астми, має на увазі імуностимулюючих CpG-олігонуклеотидів чинять суб'єктів, ідентифікованих як такі, що страждають істотні імуностимулюючі ефекти на клітини людина алергію або астму, але що не мають активного ни, такі як РВМС, що дозволяє передбачати, що захворювання під час лікування імуностимулюютакі імуностимулюючі CpG-олігонуклеотиди є ефечими CpG-олігонуклеотидами. Суб'єкт, схильний ктивними терапевтичними засобами для вакцинадо ризику розвитку алергії або астми, також має на ції людини, імунотерапії раку, імунотерапії астми, увазі суб'єктів, що вважаються схильними до ризизагального поліпшення імунної діяльності, поліпку розвитку алергії або астми через генетичні факшення гематопоетичного відновлення після опротори або фактори зовнішнього середовища. мінення або хіміотерапії і інших імуномодулюючих Суб'єктом, схильним до ризику розвитку раку, варіантів застосування. є суб'єкт, що має високу імовірність розвитку раку. Як застосовують тут, терміни обробка, лікуваДані суб'єкти включають в себе, наприклад, суб'єкти або лікування, коли їх застосовують по віднотів, що мають генетичну аномалію, для якої покашенню до порушення, такого як інфекційне захвозаний кореляційний зв'язок з підвищеною імовірнірювання, рак, алергія або астма, відносяться до стю розвитку раку, суб'єктів, схильних до впливу профілактичного лікування, що збільшує стійкість асоційованих з раком речовин, таких як тютюн, суб'єкта до розвитку захворювання (наприклад, до азбест або інші хімічні токсини, і суб'єктів, які раінфекції патогеном) або, іншими словами, що зменіше лікувалися від раку і знаходяться у вираженій ншує імовірність того, що у суб'єкта розвинеться ремісії. Коли схильного до розвитку раку суб'єкта захворювання (наприклад, він стане інфікованим лікують імуностимулюючими CpGпатогеном), так само як до лікування захворюванолігонуклеотидами і, необов'язково, антигеном, ня після того, як у суб'єкта розвинеться захворюспецифічним для типу раку, ризику до розвитку вання, щоб боротися із захворюванням (наприякого схильний суб'єкт, суб'єкт може бути здатний клад, зменшити або припинити інфекцію) або щоб вбивати ракові клітини при їх розвитку. Якщо у попередити захворювання від погіршення. суб'єкта починає формуватися пухлина, суб'єкт Таким чином, імуностимулюючі CpGрозвиває специфічну імунну відповідь проти пухолігонуклеотиди в деяких аспектах за винаходом линного антигену. корисні як вакцина для лікування суб'єкта, що У доповнення до застосування імуностимулюстраждає на алергію або астму, інфекцію, виклиючих CpG-олігонуклеотидів для профілактичного кану інфекційним організмом, або на рак, для яколікування винахід також відноситься до застосуго ідентифікований специфічний пухлинний антивання імуностимулюючих CpG-олігонуклеотидів ген, або схильного до ризику їх розвитку. для лікування суб'єктів, які страждають на інфекІмуностимулюючі CpG-олігонуклеотиди, таким чицію, алергію, астму або рак. ном, можна вводити суб'єкту в сполученні з антигеном або алергеном для лікування інфекції, алер 37 88457 38 Суб'єкт, що страждає від інфекції, є суб'єктом, бути злоякісною або незлоякісною пухлиною. Ращо зазнавав впливу інфекційного патогену і має кові захворювання або пухлини включають як негострі або хронічні детектовані рівні патогену в обмежувальні приклади рак жовчних шляхів; рак організмі. Імуностимулюючі CpG-олігонуклеотиди мозку; рак молочної залози, рак шийки матки; хоможна застосовувати з антигеном або іншою теріокарциному; рак ободової кишки; ендометріальрапією або без них для підняття природженого або ний рак; рак стравоходу; рак шлунка; інтраепітеліантигенспецифічного системного імунітету або альні неоплазії; лімфоми; рак печінки; рак легень імунітету слизових оболонок, здатного зменшувати (наприклад, дрібноклітинний і не дрібноклітинний); рівень інфекційного патогену або знищувати його. меланому; нейробластоми; рак порожнини рота; Інфекційне захворювання, як застосовують тут, рак яєчника; рак підшлункової залози; рак передявляє собою захворювання, що розвивається внаміхурової залози; рак прямої кишки; саркоми; рак слідок присутності чужорідного мікроорганізму в шкіри; рак яєчка; рак щитовидної залози і рак нирорганізмі. Особливо важливо розвивати ефективні ки, так само як інші карциноми і саркоми. В одному вакцинні стратегії і способи лікування для захисту з варіантів здійснення рак являє собою лейкоз поверхонь слизових оболонок організму, що є певорсистих клітин, хронічний мієлолейкоз, шкірний рвинною ділянкою входу патогену. Т-клітинний лейкоз, множинну мієлому, фолікуляСуб'єкт, що страждає на алергію, є суб'єктом, рну лімфому, злоякісну меланому, плоскоклітинну здатним розвивати алергічну реакцію у відповідь карциному, нирково-клітинну карциному, рак пена алерген. Алергія відноситься до набутої гіперредміхурової залози, рак сечового міхура або рак чутливості до речовини (алергену). Алергічні стани ободової кишки. включають в себе як необмежувальні приклади Суб'єкт означає людину або хребетну тварину, екзему, алергічні риніти або гострий нежить, полівключаючи як необмежувальні приклади собаку, ноз, кон'юнктивіт, бронхіальну астму, алергічну кішку, коня, корову, свиню, вівцю, козу, індичку, астму, уртикарний висип (кропивницю), харчові курку, примата, наприклад, мавпу, і рибу (аквакуалергії і інші атопічні стани. льтурні види), наприклад, лосося. Таким чином, Алергії, як правило, викликані утворенням ансполуки можна застосовувати для лікування раку і титіл IgE проти безпечних алергенів. Цитокіни, що пухлин, інфекцій і алергії/астми у людей і суб'єктів, індукуються системним введенням або введенням що не відносяться до людини. Рак є однією з голона слизові оболонки імуностимулюючих CpGвних причин смерті тварин - супутників людини олігонуклеотидів, переважно відносяться до класу, (наприклад, кішок і собак). У випадках, коли CpG-олігопуклеотид вводять званого Тh1 (прикладами є IL-12, IP-10, IFN-a і разом з антигеном, суб'єкт може бути схильний до IFN-g), і індукують і гуморальну, і клітинну імунні впливу антигену. Як застосовують тут, термін відповіді. Іншим основним типом імунної відповіді, «схильний до впливу» відноситься до активної асоційованим з продукцією цитокінів IL-4 і IL-5, є стадії приведення суб'єкта в контакт з антигеном імунна відповідь, звана Th2. Як правило, алергічні або до пасивного впливу антигену на суб'єкта in захворювання, вочевидь, викликані імунними відvivo. Способи активного приведення суб'єкіа в конповідями Тh2-типу. Основуючись на здатності імутакт з антигеном добре відомі в даній галузі. Як ностимулюючих CpG-олігонуклеотидів, описаних правило, антиген вводять безпосередньо суб'єкту тут, зсувати імунну відповідь суб'єкта від переважбудь-якими способами, такими як внутрішньовенного Th2 (пов'язаного з продукцією антитіл IgE і не, внутрішньом'язове, оральне, черезшкірне, на алергією) до збалансованої відповіді Th2/Th1 (що слизову оболонку, інтраназальне, інтратрахеальпе є захисним проти алергічних реакцій), можна ввоабо підшкірне введення. Антиген можна вводити дити суб'єкту ефективну дозу імуностимулюючих системно або місцево. Способи введення антигену CpG-олігонуклеотидів для лікування астми і алері імуностимулюючого CpG-олігонуклеотиду більш гії. детально описані нижче. Суб'єкт, пасивно схильТаким чином, імуностимулюючі CpGний до впливу антигену, стає доступним для вплиолігонуклеотиди мають значну терапевтичну кориву імунних клітин в організмі. Суб'єкт може пасивсність в лікуванні алергічних станів і астми. Рівні но зазнавати впливу антигену, наприклад, за Тh2-цитокінів, особливо IL-4 і IL-5, підвищені в дидопомогою входу чужорідного патогену в організм хальних шляхах суб'єктів, що страждають на астабо за допомогою розвитку пухлинної клітини, що му. Дані цитокіни стимулюють важливі аспекти експресує чужорідний антиген на своїй поверхні. астматичної запальної відповіді, включаючи переСпособи, в яких суб'єкт пасивно схильний до микання ізотипів IgE, хемотаксис і активацію еозивпливу антигену, можуть особливо залежати від нофілів і ріст тучних клітин. Тh1-цитокіни, особлирозподілу за часом введення імуностимулюючого во IFN-g і IL-12, можуть пригнічувати формування CpG-олігонуклеотиду. Наприклад, для суб'єкта, Тh2-клонів і продукцію Тh2-цитокінів. Астма відносхильного до ризику розвитку пухлини або інфекситься до захворювань респіраторної системи, що ційного захворювання, або алергічної або астмахарактеризується запаленням, звуженням дихальтичної відповіді, суб'єкту можна вводити імуностиних шляхів і підвищеною реактивністю дихальних мулюючий CpG-олігонуклеотид на регулярній шляхів до речовин, що вдихаються. Астма часто, основі, коли ризик є найбільшим, наприклад, під хоч не виключно, асоційована з атопічними або час сезону алергії або після впливу речовини, що алергічними симптомами. Таким чином, астма викликає рак. Крім того, імуностимулюючий CpGвключає в себе алергічну астму і не алергічну астолігонуклеотид можна вводити мандрівникам пему. ред їх поїздкою в зарубіжні країни, де вони схильні Суб'єкт, що страждає від раку, є суб'єктом, що до ризику впливу інфекційних агентів. Подібним має детектовані злоякісні клітини. Пухлина може 39 88457 40 чином, імуностимулюючий CpG-олігонуклеотид фрагменти або похідні і також синтетичні сполуки, можна вводити солдатам або цивільному насеідентичні або подібні до природних антигенів мікленню при ризику впливу біологічної зброї для роорганізмів і що індукують імунну відповідь, спеіндукції системної імунної відповіді або імунної цифічну для даного мікроорганізму. Сполука є повідповіді слизових оболонок на антиген, коли і якдібною до природного антигену мікроорганізму, що суб'єкт схильний до його впливу. якщо вона індукує імунну відповідь (гуморальну Антиген, як застосовують тут, являє собою і/або клітинну) на природний антиген мікроорганізмолекулу, здатну провокувати імунну відповідь. му. Такі антигени загальновживані в даній галузі і Антигени включають в себе як необмежувальні добре відомі звичайним фахівцям в даній галузі. приклади клітини, екстракти клітин, білки, поліпепВіруси, виявлені у людини, включають в себе тиди, пептиди, полісахариди, полісахаридні кон'юяк необмежувальні приклади Retroviridae (напригати, пептидні і непептидні міметики полісахаридів клад, віруси імунодефіциту людини, такі як HIV-1 та інших молекул, низькомолекулярні молекули, (на який посилаються також як на HTLV-III, LAV ліпіди, гліколіпіди, вуглеводи, віруси і вірусні екстабо HTLV-III/LAV або HIV-III; й інші ізоляти, такі як ракти, і багатоклітинні організми, такі як паразити і HIV-LP); Picornaviridae (наприклад, поліовіруси, алергени. Термін антиген в широкому значенні вірус гепатиту А; ентеровірус, віруси Коксакі людивідноситься до будь-якого типу молекули, пізнавани, ріновіруси, еховіруси); Calciviridae (наприклад, ної імунною системою хазяїна як чужорідна. Антиштами, що викликають гастроентерит); Togaviridae гени включають в себе як необмежувальні при(наприклад, вірус кінського енцефаліту, віруси клади пухлинні антигени, мікробні антигени і краснухи); Flaviviridae (наприклад, віруси лихоманалергени. ки Денге, віруси енцефаліту, віруси жовтої лихоПухлинний антиген, як застосовують тут, явманки); Coronaviridae (наприклад, коронавіруси); ляє собою сполуку, таку як пептид або білок, поRhabdoviridae (наприклад, віруси везикулярного в'язаний з поверхнею пухлинної або ракової клітистоматиту, віруси сказу); Filoviridae (наприклад, ни і здатну провокувати імунну відповідь в віруси Ебола); Paramyxoviridae (наприклад, віруси оточенні молекули МНС. Пухлинні антигени можна парагрипу, вірус епідпаротиту, вірус кору, респіраотримати з ракових клітин отриманням грубих ексторно-синцитіальний вірус); Orthomyxoviridae (натрактів ракових клітин, наприклад, як описано в приклад, віруси грипу); Bunyaviridae (наприклад, Cohen PA et al. (1994) Cancer Res 54: 1055-8, або віруси Хантаан, буньявіруси, флебовіруси і найрочастковим очищенням антигенів, або рекомбінантвіруси); Arena viridae (віруси геморагічної лихоманним способом, або синтезом відомих антигенів de ки); Reoviridae (наприклад, реовіруси, орбівіруси і novo. Пухлинні антигени включають в себе як неротавіруси); Bornaviridae; Hepadnaviridae (вірус обмежувальні приклади антигени, що експресовані гепатиту В); Parvoviridae (парвовіруси); рекомбінантним способом, їх імуногенну частину Papovaviridae (віруси папіломи, віруси поліоми); або цілу пухлинну або ракову клітину. Такі антигеAdenoviridae (більшість аденовірусів), ни можна виділити або отримати рекомбінантним Herpesvindae (вірус простого герпесу (HSV) 1 і 2, або будь-якими іншими способами, відомими в вірус вітряної віспи, цитомегаловірус (CMV), вірус даній галузі. герпесу); Poxviridae (віруси натуральної віспи, віЯк застосовують тут, терміни «раковий антируси коров'ячої віспи, поксвіруси); Iridoviridae (наген» або «пухлинний антиген» застосовують попеприклад, вірус африканської лихоманки свиней) і ремінно по відношенню до антигенів, які диференнекласифіковані віруси (наприклад, збудник гепаціально експресовані раковими клітинами і, таким титу дельта (що вважається дефектним сателітом чином, можуть бути використані для націлення на вірусу гепатиту В); гепатиту С; Норволк і споріднеракові клітини. Ракові антигени являють собою ні віруси і астровіруси). антигени, потенційно здатні стимулювати приблиІ грампозитивні, і грамнегативні бактерії слузно пухлиноспецифічні імунні відповіді. Деякі з жать антигенами для хребетних тварин. Такі грамданих антигенів кодовані, але необов'язково експозитивні бактерії включають в себе як необмежупресовані нормальними клітинами. Такі антигени вальні приклади види Pasteurella, види можна охарактеризувати як такі, що мовчать в Staphylococci і види Streptococcus. Грамнегативні нормі (тобто не експресовані) в нормальних клітибактерії включають в себе як необмежувальні принах, такі, які експресовані тільки на конкретних клади Escherichia coli, види Pseudomonas і види стадіях диференціювання і такі, які тимчасово ексSalmonella. Конкретні інфекційнібактерії включапресовані, такі як антигени ембріона і плоду. Інші ють в себе як необмежувальні приклади ракові антигени кодовані мутантними клітинними Helicobacter pyloris, Borrelia burgdorferi, Legionella генами, такі як онкогени (наприклад, активований pneumophilia, види Mycobacteria (наприклад, Μ. онкоген ras), генами супресорів (наприклад, мутаtuberculosis, Μ. avium, Μ. intracellulare, Μ. kansasii, нтний р53), гібридні білки, отримані при внутрішніх Μ. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria делеціях або хромосомних транслокаціях. Ще інші gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria ракові антигени можуть бути кодовані вірусними monocytogenes, Streptococcus pyogenes генами, такими, які несуть пухлинні РНК- або ДНК(Streptococcus групи A), Streptococcus agalactiae віруси. (Streptococcus групи В), Streptococcus (групи Мікробний антиген, як застосовують тут, являє viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus собою антиген мікроорганізму і включає в себе як bovis, Streptococcus (анаеробні види), необмежувальні приклади віруси, бактерії, паразиStreptococcus pneumoniae, патогенні види ти і гриби. Такі антигени включають в себе інтактCampylobacter, види Enterococcus, Haemophilus ний мікроорганізм, так само як природні ізоляти і їх influenzae, Bacillus anthracis, Corynebacterium 41 88457 42 diphtheriae, види Corynebacterium, Erysipelothrix pratense); Phalaris (наприклад, Phalaris rhusiopathiae, Clostridium perfringens, Clostridium arundinacea); Paspalum (наприклад, Paspalum tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella notatum); Sorghum (наприклад, Sorghum pneumoniae, Pasturella multocida, види Bacteroides, halepensis) і Bromus (наприклад, Bromus inermis). Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus Антиген може бути в основному очищеним. moniliformis, Treponema pallidum, Treponema Термін в основному очищений, як застосовують pertenue, Leptospira, Rickettsia і Actinomyces israelii. тут, відноситься до антигену, наприклад, поліпепПриклади грибів включають в себе тиду, в основному вільному від інших білків, ліпіCryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, дів, вуглеводів або інших речовин, з якими він поCoccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, в'язаний в природі. Фахівець в даній галузі може Chlamydia trachomatis, Candida albicans. очистити поліпептидні антигени із застосуванням Інші інфекційні організми (наприклад, протисзвичайних способів очищення білків. В основному ти) включають в себе види Plasmodium, такі як чистий поліпептид часто дає одну головну смугу в Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, невідновлювальному поліакриламідному гелі. У Plasmodium ovale і Plasmodium vivax, і Toxoplasma випадку частково глікозильованих поліпептидів gondii. Переносимі з кров'ю і/або тканинні паразити або поліпептидів, що мають декілька стартових включають в себе види Plasmodium, Babesia кодонів, в невідновлювальному поліакриламідному microti, Babesia divergens, Leishmania tropica, види гелі може існувати декілька смуг, але вони форLeishmania, Leishmania braziliensis, Leishmania мують відмітний малюнок для даного поліпептиду. donovani, Trypanosoma gambiense і Trypanosoma Чистоту поліпептидного антигену можна також rhodesiense (сонна африканська хвороба), визначити секвенуванням N-кінця. Інші типи антиTrypanosoma cruzi (хвороба Шагаса) і Toxoplasma генів, такі як полісахариди, низькомолекулярні, gondii. міметики і т. д., відносяться до винаходу і, необоІнші значимі з медичної точки зору мікрооргав'язково, можуть бути в основному чистими. нізми широко описані в літературі, наприклад, див. Олігонуклеотиди за винаходом можна вводити C.G.A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere суб'єкту з протимікробним засобом. ПротимікробTindall, Great Britain 1983, яка наведена тут як поний засіб, як застосовують тут, відноситься до силання в повному об'ємі. природної або синтетичної сполуки, здатної вбиАлерген відноситься до речовини (антигену), вати або інгібувати інфекційні мікроорганізми. Тип яка може індукувати алергічну або астматичну протимікробного засобу, застосовного за винаховідповідь у чутливого суб'єкта. Список алергенів дом, залежить від типу мікроорганізму, яким сувеличезний і може включати пилок, отрути комах, б'єкт інфікований або схильний до ризику бути лупу тварин, пил, спори грибів і лікарські засоби інфікованим. Протимікробні засоби включають в (наприклад, пеніцилін). Природні алергени, алерсебе як необмежувальні приклади протибактеріагени тварин і рослин включають в себе як необльні засоби, противірусні засоби, протигрибкові межувальні приклади білки, специфічні для настузасоби і протипаразитарні засоби. Такі фрази як пних родів: Canine (Canis familiaris); «протимікробний засіб», «протибактеріальний заDermatophagoides (наприклад, Dermatophagoides сіб», «противірусний засіб», «протигрибковий заfarinae); Felis (Felis domesticus); Ambrosia сіб», «протипаразитарний засіб» і «засіб для зни(Ambrosia artemiisfolia; Lolium (наприклад, Lolium щення паразитів» мають твердо сталі значення perenne або Lolium multiflorum); Cryptomeria для звичайних фахівців в даній галузі і визначені в (Cryptomeria japonica); Alternaria (Alternaria звичайних медичних текстах. Коротко, протибакalternata); Alder; Alnus (Alnus gultinoasa); Betula теріальні засоби вбивають або інгібують бактерії і (Betula verrucosa); Quercus (Quercus alba); Olea включають в себе антибіотики, так само як інші (Olea europa); Artemisia (Artemisia vulgaris); синтетичні або природні речовини, що мають подіPlantago (наприклад, Plantago lanceolata); бні функції. Антибіотики являють собою низькомоParietaria (наприклад, Parietaria officinalis або лекулярні молекули, що продукуються як вторинні Parietaria judaica); Blattella (наприклад, Blattella метаболіти клітинами, такими як мікроорганізми. germanica); Apis (наприклад, Apis multiflorum); Як правило, антибіотики ушкоджують одну або Cupressus (наприклад, Cupressus sempervirens, декілька бактерійних функцій або структур, спеCupressus arizonica і Cupressus macrocarpa); цифічних для мікроорганізму і не присутніх в кліJuniperus (наприклад, Juniperus sabinoides, тинах-хазяїнах. Противірусні засоби можна видіJuniperus virginiana, Juniperus communis і Juniperus лити з природних джерел або синтезувати і ashei); Thuya (наприклад, Thuya orientalis); застосовувати для вбивання або інгібування віруChamaecyparis (наприклад, Chamaecyparis obtusa); сів. Протигрибкові засоби застосовують для лікуPeriplaneta (наприклад, Periplaneta americana); вання поверхневих грибкових інфекцій, так само як Agropyron (наприклад, Agropyron repens); Secale умовно-патогенних і первинних системних грибко(наприклад, Secale cereale); Triticum (наприклад, вих інфекцій. Протипаразитарні засоби вбивають Triticum aestivum); Dactylis (наприклад, Dactylis або інгібують паразитів. glomerata); Festuca (наприклад, Festuca elatior); Протипаразитарні засоби, на які посилаються Poa (наприклад, Poa pratensis або Poa compressa); також як на засоби для знищення паразитів, вклюAvena (наприклад, Avena sativa); Holcus (напричають в себе як необмежувальні приклади альбеклад, Holcus lanatus); Anthoxanthum (наприклад, ндазол, амфотерицин В, бензнідазол, бітіонол, Anthoxanthum odoratum); Arrhenatherum (наприхлорохін НСl, хлорохіну фосфат, кліндаміцин, деклад, Arrhenatherum elatius); Agrostis (наприклад, гідроеметин, діетилкарбамазин, дилоксаніду фуAgrostis alba); Phleum (наприклад, Phleum роат, ефлорнітин, фуразолідон, глюкокортикоїди, 43 88457 44 галофантрин, йодохінол, івермектин, мебендазол, ганцикловір (що застосовується для лікування від мефлохін, меглумін антимоніат, меларсопрол, цитомегаловіруса), ідоксуридин, рибавірин (що метрифонат, метронідазол, ніклозамід, ніфуртизастосовується для лікування від респіраторномокс, оксамніхін, паромоміцин, пентамідину ізетіосинцитіального вірусу), дидезоксіінозин, дидезокнат, піперазин, празиквантел, примахіну фосфат, сицитидин, зидовудин (азидотимідин), іміквімод і прогуаніл, пірантелу памоат, піриметамінрезіміквімод. сульфонаміди, піриметамін-сульфадоксин, хінакІнтерферони являють собою цитокіни, що секрин HCl, хініну сульфат, хінідину глюконат, спіраретуються клітинами, інфікованими вірусом, так міцин, стибоглюконат натрію (глюконат сурми насамо як імунними клітинами. Інтерферони діють за трію), сурамін, тетрациклін, доксициклін, допомогою зв'язування зі специфічними рецептотіабендазол, тинідазол, триметропримрами на клітинах, сусідніх з інфікованими клітинасульфаметоксазол і трипарсамід, деякі з яких зами, спричиняючи в клітині зміну, що захищає її від стосовують самостійно або в поєднанні з іншими. інфекції вірусом, a- і b-інтерферони також індукуПротибактеріальні засоби вбивають бактерії ють експресію молекул МНС класу І і класу II на або інгібують їх ріст або функцію. Великий клас поверхні інфікованої клітини, приводячи до збільпротибактеріальних засобів являє собою антибіошеної презентації антигену для пізнавання імунтики. На антибіотики, ефективні для знищення або ними клітинами хазяїна, a- і b-інтерферони достуінгібування широкого ряду бактерій, посилаються пні в рекомбінантних формах, і їх застосовують як на антибіотики широкого спектра дії. Інші типи для лікування хронічної інфекції гепатитом В і С. В антибіотиків переважно ефективні проти бактерій дозах, ефективних для противірусного лікування, грампозитивного або грамнегативного класів. На інтерферони мають важкі побічні ефекти, такі як дані типи антибіотиків посилаються як на антибіолихоманка, дисфорія і втрата ваги. тики вузького спектра дії. На інші антибіотики, Противірусні засоби, що застосовуються за ефективні проти окремого організму або захворювинаходом, включають в себе як необмежувальні вання і не ефективні проти інших типів бактерій, приклади імуноглобуліни, амантадин, інтерферопосилаються як на антибіотики обмеженого спектни, аналоги нуклеозидів і інгібітори протеаз. Конкра дії. Іноді протибактеріальні засоби класифікуретні противірусні засоби включають в себе як ють за їх первинним способом впливу. Як правило, необмежувальні приклади Ацеманан; Ацикловір; протибактеріальні засоби є інгібіторами синтезу Ацикловір Натрію; Адефовір; Аловудин; Алвірцепт клітинної стінки, інгібіторами клітинної мембрани, Судотокс; Амантадину Гідрохлорид; Аранотин; інгібіторами білкового синтезу, інгібіторами синтеАрілдон; Атевірдину Мезилат; Аврідин; Цидофовір; зу нуклеїнових кислот або функціональними інгібіЦипамфілін; Цитарабіну Гідрохлорід; Делавірдину торами і конкурентними інгібіторами. Мезилат; Десцикловір; Дидапозин; Дизоксарил; Противірусні засоби являють собою сполуки, Едоксудин; Енвіраден; Енвіроксим; Фамцикловір; що попереджають інфікування клітин вірусами або Фамотину Гідрохлорід; Фіацитабін; Фіалуридин; реплікацію вірусу всередині клітини. ПротивірусФозарилат; Фоскарнет Натрію; Фосфонет Натрію; них засобів набагато менше, ніж протибактеріальГанцикловір; Ганцикловір Натрію; Ідоксіуридин; них засобів, оскільки процес вірусної реплікації так Кетоксал; Ламівудин; Лобукавір; Мемотину Гідротісно пов'язаний з реплікацією ДНК в клітиніхлорид; Метисазон; Невірапін; Пенцикловір; Пірохазяїні, що неспецифічні противірусні засоби часто давір; Рибавірін; Римантадину Гідрохлорид; Саквіє токсичними для хазяїна. У процесі вірусної інфенавіру Мезилат; Сомантадину Гідрохлорид; кції існує декілька стадій, які можна блокувати або Сорівудин; Статолон; Ставудин; Тилорону Гідроінгібувати противірусними засобами. Дані стадії хлорид; Трифлуридин; Валацикловіру Гідрохловключають в себе приєднання вірусу до клітинирид; Відарабін; Відарабіну Фосфат; Відарабіну хазяїна (імуноглобулін або зв'язувальні пептиди), Фосфат Натрію; Віроксим; Зальцитабін; Зидовудин декапсидацію вірусу (наприклад, амантадин), сині Зинвіроксим. тез або трансляцію вірусної мРНК (наприклад, Протигрибкові засоби придатні для лікування і інтерферон), реплікацію вірусної РНК або ДНК попередження від інфекційних грибів. Іноді проти(наприклад, нуклеозидні аналоги), дозрівання білгрибкові засоби класифікують за механізмом дії. ків нового вірусу (наприклад, інгібітори протеаз) і Деякі протигрибкові засоби діють як інгібітори клібрунькування і вивільнення вірусу. тинної стінки за допомогою інгібування синтази Аналоги нуклеотидів являють собою синтетиглюкози. Вони включають в себе як необмежувачні сполуки, подібні до нуклеотидів, але які мають льні приклади базіунгін/ЕСВ. Інші протигрибкові неповну або аномальну дезоксирибозну або рибозасоби діють за допомогою дестабілізації цілісносзну групу. Після попадання нуклеотидних аналогів ті мембрани. Вони включають в себе як необмев клітину, вони зазнають фосфорилування, утвожувальні приклади імідазоли, такі як клотримазол, рюючи трифосфатну форму, яка конкурує з норсертаконзол, флуконазол, ітраконазол, кетоконамальними нуклеотидами за включення у вірусну зол, міконазол і воріконакол, так само як FK 463, ДНК або РНК. Після включення трифосфатної фоамфотерицин В, BAY 38-9502, МK 991, прадимірми нуклеотидного аналога в ланцюг нуклеїнової цин, UK 292, бутенафін і тербінафін. Інші протикислоти, що зростає, воно приводить до безповогрибкові засоби діють за допомогою руйнування ротного приєднання вірусної полімерази і, таким хітину (наприклад, хітиназа) або імуносупресії чином, термінації ланцюга. Аналоги нуклеотидів (крем 501). включають в себе як необмежувальні приклади Імуностимулюючі CpG-олігонуклеотиди можна ацикловір (що застосовується для лікування від поєднувати з іншими терапевтичними засобами, вірусу простого герпесу і вірусу вітряної віспи), такими як ад'юванти, для посилення імунних від 45 88457 46 повідей. Імуностимулюючий CpG-олігонуклеотид і Тh1-імунну відповідь. Це приводить до отримання інший терапевтичний засіб можна вводити одновідносно збалансованого Тh1/Тh2-середовища. часно або послідовно. Коли інші терапевтичні заПеремикання імунної відповіді з Th2- на Th1соби вводять одночасно, їх можна вводити в тому імунну відповідь можна оцінити вимірюванням рівж або окремих складах, але вводити в один і той нів цитокінів, отриманих у відповідь на нуклеїнову же час. Інші терапевтичні засоби вводять послідокислоту (наприклад, за допомогою індукції моновно один з одним і з імуностимулюючим CpGцитарних клітин і інших клітин для продукції Th1олігонуклеотидом, коли введення інших терапевцитокінів, включаючи IFN-a). Перемикання або тичних засобів і імуностимулюючого CpGзміна балансу імунної відповіді з Th2- на Th1олігонуклеотиду розділені у часі. Більш конкретно, відповідь особливо корисна для лікування астми. імуностимулюючий CpG-олігонуклеотид можна Наприклад, ефективною кількістю для лікування вводити до або після введення (або впливу) щоастми може бути кількість, придатна для переминайменше одного іншого терапевтичного засобу. кання Тh2-типу імунної відповіді, асоційованого з Розділення за часом між введенням даних сполук астмою, на Тh1-тип відповіді або збалансоване може бути питанням хвилин, або може тривати Th1/Th2-середовище. Рівні Тh2-цитокінів, особлидовше. Інші терапевтичні засоби включають в себе во IL-4 і IL-5, підвищені в дихальних шляхах суяк необмежувальні приклади ад'юванти, цитокіни, б'єктів, що страждають на астму. Описані тут імуантитіла, антигени і т. д. ностимулюючі CpG-олігонуклеотиди спричиняють Композиції за винаходом можна вводити також підвищення Th1-цитокінів, що допомагає відновз ад'ювантами, відмінними від нуклеїнових кислот. лювати рівновагу імунної системи, запобігати або Ад'ювант, відмінний від нуклеїнової кислоти, являє зменшувати несприятливі ефекти, пов'язані з песобою будь-яку молекулу або сполуку, за винятком реважною Тh2-імунною відповіддю. описаних тут імуностимулюючих CpGПеремикання імунної відповіді з Th2- на Тh1олігонуклеотидів, яка може стимулювати гумораімунну відповідь можна також оцінити вимірюванльну і/або клітинну імунну відповідь. Ад'юванти, ням рівнів специфічних ізотипів імуноглобуліну. відмінні від нуклеїнових кислот, включають в себе, Наприклад, у мишей IgG2a асоційований з Тh1наприклад, ад'юванти, що створюють ефект депо, імунною відповіддю, a IgGl і IgE асоційовані з Тh2імуностимулюючі ад'юванти і ад'юванти, що ствоімунною відповіддю. рюють ефект депо і стимулюють імунну систему. Імуностимулюючі CpG-олігонуклеотиди мають Імуностимулюючі CpG-олігонуклеотиди корисунікальну здатність стимулювати клітинні вижині також як ад'юванти для слизових оболонок. Равання, диференціювання, активацію і дозрівання ніше виявлено, що і системний імунітет, і імунітет дендритних клітин, і придатні для способів in vitro, слизових оболонок індукують введенням CpGin vivo i ex vivo, що залучають дендритні клітини. нуклеїнових кислот на слизові оболонки. Таким Імуностимулюючі CpG-олігонуклеотиди підвичином, олігонуклеотиди можна вводити в поєднанщують також літичну активність натуральних кліні з іншими ад'ювантами для слизових оболонок. тин-кілерів і антитіло-залежну клітинну цитотоксиІмунну відповідь можна також індукувати або чність (ADCC). ADCC можна здійснювати із посилювати спільним введенням або колінеарною застосуванням імуностимулюючих CpGекспресією цитокінів (Bueler & Mulligan, 1996; Chow олігонуклеотидів в поєднанні з антитілом, специet al., 1997; Geissler et al., 1997; Iwasaki et al., 1997; фічним до клітинної мішені, такої як ракова клітиKim et al., 1997) або костимулюючих молекул, тана. Коли імуностимулюючі CpG-олігонуклеотиди ких як В7 (Iwasaki et al., 1997; Tsuji et al., 1997), з вводять суб'єкту одночасно з антитілом, імунну імуностимулюючими CpG-олігонуклеотидами. Тесистему суб'єкта індукують для вбивання ракової рмін цитокін застосовують як загальну назву різклітини. Антитіла, придатні для процедури ADCC, номанітної групи розчинних білків і пептидів, що включають в себе антитіла, які взаємодіють з клідіють як гуморальні регулятори в концентраціях тиною в організмі. Багато з таких антитіл, специфівід нано- до пікомолярних, і які в нормальних або чних для клітинних мішеней, описані в даній галузі патологічних умовах модулюють функціональну і багато які комерційно доступні. активність окремих клітин і тканин. Дані білки таІмуностимулюючі CpG-олігонуклеотиди можна кож напряму опосередковують взаємодії між клітивводити також одночасно з протираковим лікуваннами і регулюють процеси, що відбуваються у поням. Протиракове лікування включає в себе прозаклітинному середовищі. Цитокіни включають в тиракові лікарські засоби, опромінення і хірургічні себе як необмежувальні приклади інтерлейкін-1 процедури. Як застосовують тут, «протиракові ме(IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, ILдикаменти» відносяться до засобу, що вводиться 15, IL-18, гранулоцитарно-макрофагальний колонісуб'єкту з метою лікування раку. Як застосовують єстимулюючий фактор росту (GM-CSF), гранулотут, «лікування раку» передбачає попередження цитарний колонієстимулюючий фактор (G-CSF), розвитку раку, зменшення симптомів раку і/або IFN-g, IFN-a, IFN-b, фактор некрозу пухлин (TNF), інгібування росту розвиненої пухлини. В інших аспектах протиракові медикаменти вводять суб'єкTGF-b, Flt-3-ліганд і CD40-ліганд. У доповнення до ту, схильному до ризику розвитку раку, з метою цитокінів CpG-олігонуклеотиди можна застосовузменшення ризику розвитку раку. Різні типи противати в поєднанні з антитілами проти конкретних ракових медикаментів описані тут. З метою даного цитокінів, такими як анти-IL-10 і анти-TGF-b, так опису протиракові медикаменти класифіковані як само як з інгібіторами циклооксигенази, тобто інгіхіміотерапевтичні засоби, імунотерапевтичні засобіторами СОХ-1 і СОХ-2. би, протиракові вакцини, гормональне лікування і Олігонуклеотиди корисні гакож для перемимодифікатори біологічної відповіді. кання імунної відповіді з Th2-імунної відповіді на 47 88457 48 Крім того, способи за винаходом призначені тат (аналог фактору вивільнення LHRH), Ломустин для охоплення застосування більш ніж одного (CCNU), Мехлоретамін HCl (азотний аналог гірчипротиракового лікарського засобу разом з імуночного газу), Меркаптопурин, Месну, Мітотан (o.p'стимулюючими CpG-олігонуклеотидами. Як приDDD), Мітоксантрон HCl, Октреотид, Плікаміцин, клад, коли це доцільно, імуностимулюючі CpGПрокарбазин HCl, Стрептозоцин, Тамоксифену олігонуклеотиди можна вводити і з хіміотерапевцитрат, Тіогуанін, Тіотепа, Вінбластину сульфат, тичним засобом, і з імунотерапевтичним засобом. Амсакрин (m-AMSA), Азацитидин, Еритропоетин, Як альтернатива, протираковий медикамент може Гексаметилмеламін (НММ), Інтерлейкін 2, Мітогуаохоплювати імунотерапевтичний засіб і протиразон (метил-GAG; метилгліоксаль-біскову вакцину або хіміотерапевтичний засіб і прогуанілгідразон; MGBG), Пентостатин (2'тиракову вакцину, або хіміотерапевтичний засіб, дезоксиформіцин), Семустин (метил-CCNU), Теніімунотерапевтичний засіб і протиракову вакцину, позид (VM-26) і Віндезину сульфат. що всі вводяться одному суб'єкту з метою лікуванІмунотерапевтичний засіб може бути вибраний ня суб'єкта, що страждає від раку або схильного з групи, яка включає в себе як необмежувальні до ризику його розвитку. приклади Ритуксан, Рибутаксин, Герцептин, КвадХіміотерапевтичний засіб можна вибрати з рамет, Панорекс, IDEC-Y2B8, ВЕС2, С225, Онкогрупи, яка включає в себе як необмежувальні прилім, SMART Μ195, ATRAGEN, Оварекс, Бексар, клади метотрексат, вінкристин, адріаміцин, циспLDP-03, іор т6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, латин, хлоретилнітрозосечовини, що не містять 3622W94, анти-VEGF, Зенапакс, MDX-220, MDXцукру, 5-фторурацил, мітоміцин С, блеоміцин, док447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, сорубіцин, дакарбазин, таксол, фрагілін, Мегламін Претаргет, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250, GLA, валрубіцин, кармустин і поліферпосан, EMD-72000, ЛімфоЦид, СМА 676, Монофарм-С, ММІ270, BAY 12-9566, інгібітор RAS4В5, іор egf.r3, іор с5, BABS, анти-FLK-2, MDX-260, фарнезилтрансферази, інгібітор фарнезилтрансANA Ab, SMART 1D10 Ab, SMART ABL 364 Ab і ферази, ММР, MTA/LY231514, ImmuRAIT-CEA. LY264618/Лометексол, Гламолек, СІ-994, TNP-470, Протиракову вакцину можна вибрати з групи, Пкамтин/Топотекан, РKС412, Валсподар/Р8С833, яка включає в себе як необмежувальні приклади Новантроп/Мітроксантрон, Метарет/Сурамін, БатіEGF, антиідіотипічні протиракові вакцини, антиген мастат, Е7070, ВСН-4556, CS-682, 9-АС, AG3340, Gp75, GMK-вакцину проти меланоми, кон'юговану AG3433, Інцел/VX-710, VX-853, ZD0101, ISI641, з гангліозидом вакцину MGV, Her2/neu, оварекс, ODN 698, ТА2516/Мармістаі, ВВ2516/Мармістат, M-Vax, O-Vax, L-Vax, тератоп STn-KHL, BLP25 CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, Лемонал (MUC-1), ліпосомальну ідіотипічну вакцину, мелаDP2202, FK 317, Піцибаніл/ОK-432, цин, вакцини з пептидними антигенами, токАD32/Валрубіцин, Метастрон/похідний стронцію, син/антигенні вакцини, вакцину на основі MVA, Темодал/Темозоломід, Евацет/ліпосомальний доPACIS, BCG-вакцину, ТА-HPV, TA-CIN, DISC-вірус ксорубіцин, Ютаксан/Паклітаксел, Такі ImmuCyst/TheraCys. сол/Паклітаксел, Кселод/Капецитабін, ФуртуЗастосування імуностимулюючих CpGлон/Доксифлуридин, Циклопакс/оральний олігонуклеотидів в сукупності з імунотерапевтичпаклітаксел, Оральний Таксоїд, SPUними засобами, такими як моноклональні антитіла, 077/Цисплатин, HMR 1275/Флавопіридол, СРздатне збільшувати тривалу здатність до вижи358(774)/EGFR, СР-609(754)/інгібітор онкогену вання по ряду механізмів, що передбачають значRAS, BMS-182751/оральну платину, не збільшення ADCC (як обговорювалося вище), UFT(Тегафур/Урацил), Ергамізол/Левамізол, Еніактивацію NK-клітин і збільшення рівнів IFN-a. Нулурацил/776С85/5FU-енхансер, Кампто/Левамізол, клеїнові кислоти, коли їх застосовують в поєднанні Камптозар/Іринотекан, Тумодекс/Ралітрексед, з моноклональними антитілами, служать для зниЛейстатин/Кладрибін, Паксекс/Паклітаксел, Докження дози антитіла, необхідного для досягнення сил/ліпосомальний доксорубіцин, Кебіологічного результату. лікс/ліпосомальний доксорубіцин, ФлудаВинахід відноситься також до способів індукції ра/Флударабін, Фармарубіцин/Епірубіцин, із застосуванням імуностимулюючих CpGДепоЦит, ZD1839, LU79553/Біс-Нафталімід, LU олігонуклеотидів активації не специфічної до анти103793/Доластін, Кетікс/ліпосомальний доксорубігену природженої імунної відповіді і широкого специн, Гемзар/Гемцитабін, ZD 0473/Анормед, YM ктра стійкості до інфекційного зараження. Термін 116, насіння лодину, інгібітори CDK4 і CDK2, інгібіактивація природженої імунної відповіді, як застотори PARP, 04809/Дексифосфамід, совують тут, відноситься до активації імунних кліІфес/Меснекс/Іфосфамід, Вумон/Теніпозид, Паратин, відмінних від В-клітин пам'яті, і може передплатин/Карбоплатин, Плантинол/цисплатин, Вепебачати, наприклад, активацію моноцитів, зид/Етопозид, ZD 9331, Таксотер/Доцетаксел, нейтрофілів, макрофагів, дендритних клітин, NKпроліки гуаніну арабінозид, Аналог Таксану, нітроклітин і/або інших імунних клітин, які можуть відпозосечовини, алкілуючі агенти, такі як мелфелан і відати антиген-незалежним способом. Широкий циклофосфамід, Аміноглутетимід, Аспарагіназу, спектр стійкості до інфекційного зараження індукуБусульфан, Карбоплатин, Хлоромбуцил, Цитарається, оскільки імунні клітини знаходяться в активбін HCl, Дактиноміцин, Даунорубіцин HCl, Естраній формі і примовані для відповіді на будь-яку мустін фосфат натрію, Етопозид (VP16-213), Флосполуку або мікроорганізм, що вторгається. Клітиксуридин, Фторурацил (5-FU), Флутамід, ни необов'язково повинні бути специфічно примоГідроксисечовина (гідроксикарбамід), Іфосфамід, вані проти конкретного антигену. Це особливо коІнтерферон Альфа-2а, Альфа-2b, Лейпроліду аце 49 88457 50 рисне в біологічній війні або в інших умовах, опитака кількість, необхідна для індукції системного саних вище, таких як подорожі. імунітету, являє собою кількість, необхідну, щоб Імуностимулюючі CpG-олігонуклеотиди можна під дією антигену викликати розвиток IgG у відпобезпосередньо вводити суб'єкту або одночасно з відь на антиген. У поєднанні з наведеними тут покомплексом доставки нуклеїнової кислоти. Комясненнями за допомогою вибору серед різних акплекс доставки нуклеїнової кислоти означає молетивних сполук і оцінки чинників, таких як кулу нуклеїнової кислоти, асоційовану (наприклад, активність, відносна біодоступність, маса тіла паіонно або ковалентно пов'язану з, або інкапсульоцієнта, тяжкість несприятливих побічних ефектів і вану в) з засобами для направленої доставки (напереважний спосіб введення, можна планувати приклад, з молекулою, що здійснює високоафінне ефективний режим профілактичного або терапевзв'язування з клітиною-мішенню. Приклади комтичного лікування, що не приводить до істотної плексів доставки нуклеїнових кислот включають в токсичності і ще цілком ефективний для лікування себе нуклеїнові кислоти, асоційовані зі стерином конкретного суб'єкта. Ефективна кількість для (наприклад, холестерин), ліпідом (наприклад, катібудь-якого конкретного застосування може змінюонний ліпід, віросома або ліпосома), або засобом, ватися в залежності від таких чинників, як захвощо специфічно зв'язує клітину-мішень (наприклад, рювання або стан, що підлягає лікуванню, конкреліганд, пізнаваний специфічним рецептором клітитний імуностимулюючий CpG-олігонуклеотид, що ни-мішені). Переважні комплекси можуть бути довводиться, розмір суб'єкта, або тяжкість захворюсить стабільними in vivo для запобігання значному вання або стану. Звичайний фахівець в даній гароз'єднанню до інтерналізації клітиною-мішенню. лузі може емпірично визначити ефективну кільОднак, комплекс можна розщепити у відповідних кість конкретного імуностимулюючого CpGумовах всередині клітини, вивільняючи олігонуколігонуклеотиду і/або антигену, і/або іншого тералеотид в функціональній формі. певтичного засобу без вимоги проведення зайвих Імуностимулюючі CpG-олігонуклеотиди і/або експериментів. антигени, і/або інші лікарські засоби можна вводиДози описаних тут сполук для місцевого ввети самостійно (наприклад, в соляному розчині або дення або введення на слизові оболонки суб'єкта, буфері) або із застосуванням будь-яких носіїв для як правило, знаходяться в діапазоні приблизно від доставки, відомих в даній галузі. Наприклад, опи10мкг до 10г на одне введення, в залежності від сані наступні носії для доставки: Кохлеати (Gouldтого, що можливе щоденне, щотижневе або щоміFogerite et al., 1994, 1996); Емульсоми (Vancott et сячне застосування, або з будь-якою іншою кількіal., 1998, Lowell et al., 1997); ISCOM (Mowat et al., стю часу між застосуваннями, або як необхідно 1993, Carlsson et al., 1991, Hu et., 1998, Morein et інакше. Більш типово, дози для місцевого введенal., 1999); Ліпосоми (Childers et al., 1999, Michalek ня або введення на слизові оболонки знаходяться et al., 1989, 1992, de Haan 1995a, 1995b); Живі бакв діапазоні приблизно від 1мг до 500мг на введентерійні вектори (наприклад, Salmonella, Escherichia ня, і найбільш типово, приблизно від 1мг до 100мг, coli, бацила Кальметта-Герена, Shigella, з 2-4 введеннями, розділеними один від одного Lactobacillus) (Hone et al., 1996, Pouwels et al., добами або тижнями. Більш типово, дози імуно1998, Chatfield et al., 1993, Stover et al., 1991, стимулянта знаходяться в діапазоні приблизно від Nugent et al., 1998); Живі вірусні вектори (напри10мкг до 100мг на введення, і найбільш типово, від клад, коров'ячої віспи, аденовірус, простого герпе100мкг до 10мг, з щоденними або щотижневими су) (Gallichan et al., 1993, 1995, Moss et al., 1996, введеннями. Дози для парентеральної доставки Nugent et al., 1998, Flexner et al., 1988, Morrow et суб'єкту описаних тут сполук з метою індукції антиal., 1999); Мікросфери (Gupta et al., 1998, Jones et генспецифічної імунної відповіді, де сполуки доal., 1996, Maloy et al., 1994, Moore et al., 1995, ставляють з антигеном, але не з іншим лікарським O'Hagan et al., 1994, Eldridge et al., 1989); Нуклеїзасобом, звичайно в 5-10000 разів перевищують нові кислоти - вакцини (Fynan et al., 1993, Kuklin et ефективну дозу для застосувань вакцинного ад'юal., 1997, Sasaki et al., 1998, Okada et al., 1997, Ishii ванта або імунного стимулятора на слизових обоet al., 1997); Полімери (наприклад, карбоксиметилонках, більш типово, перевищують в 10-1000 раз, лцелюлоза, хітозан) (Hamajima et al., 1998, Jabbalі найбільш типово в 20-100 раз. Дози описаних Gill et al., 1998); Полімерні кільця (Wyatt et al., вище сполук для парентеральної доставки з ме1998); Протеосоми (Vancott et al., 1998, Lowell et тою індукції природженої імунної відповіді або для al., 1988, 1996, 1997); Фторид Натрію (Hashi et al., збільшення ADCC, або для індукції антигенспеци1998); Трансгенні рослини (Tacket et al., 1998, фічної імунної відповіді, коли імуностимулюючі Mason et al., 1998, Haq et al., 1995); Віросоми CpG-олігонуклеотиди вводять в поєднанні з інши(Gluck et al., 1992, Mengiardi et al., 1995, Cryz et al., ми лікарськими засобами, звичайно знаходяться в 1998); Вірусоподібні частинки (Jiang et al., 1999, діапазоні приблизно від 100мкг до 10г на введенLeibl et al., 1998). Інші носії для доставки відомі в ня, в залежності від того, що можливе щоденне, даній галузі. щотижневе або щомісячне застосування, або з Термін «ефективна кількість», як правило, відбудь-якою іншою кількістю часу між застосуванняноситься до кількості, достатньої для здійснення ми, або як необхідно інакше. Більш типово, паренбажаного біологічного ефекту. Наприклад, ефектеральні дози для даних цілей знаходяться в діативна кількість імуностимулюючого CpGпазоні приблизно від 1мг до 5г на введення, і олігонуклеотиду, що вводиться з антигеном для найбільш типово, приблизно від 1мг до 1г, з 2-4 індукції імунітету слизових оболонок, являє собою введеннями, розділеними один від одного добами кількість, необхідну, щоб під дією антигену виклиабо тижнями. Однак в деяких варіантах здійснення кати розвиток IgA у відповідь на антиген, тоді як парентеральні дози для даних цілей можна засто 51 88457 52 совувати в діапазоні, що в 5-10000 разів перевиролідон, агар або альгінову кислоту або їх сіль, щує звичайні дози, описані вище. таку як альгінат натрію. Оральні склади можна Для будь-якої описаної тут сполуки терапевтискладати також в сольовому розчині або буферах чно ефективну кількість можна спочатку визначити для нейтралізації внутрішніх кислих умов або мона модельних тваринах. Терапевтично ефективну жна вводити без будь-яких носіїв. дозу можна визначити також за даними для людиОболонки драже забезпечують відповідними ни для інших CpG-олігонуклеотидів, які тестували покриттями. З даною метою можна застосовувати для людей (для людей проводять клінічні випроконцентровані розчини цукру, що необов'язково бування), і для сполук, відомих як такі, що показумістять гуміарабік, тальк, полівінілпіролідон, гель ють схожу фармакологічну активність, таких як карбопол, поліетиленгліколь і/або діоксид титану, інші ад'юванти, наприклад, LT й інші антигени, для розчини глазурі і відповідні органічні розчинники цілей вакцинації. Більш високі дози можуть вимаабо суміші розчинників. Барвники або пігменти гатися для парентерального введення. Дозу, що можна додавати до покриттів таблеток або драже застосовується, можна уточнити на основі відносдля ідентифікації або для позначення різних споної біодоступності і активності сполуки, що вволучень доз активних сполук. диться. Оскільки уточнення дози для досягнення Фармацевтичні препарати, які можна застосомаксимальної ефективності, основане на описаних вувати орально, включають в себе заповнені капвище способах, і інші способи добре відомі в даній сули, виготовлені з желатину і пластифікатора, галузі, вони повністю в компетенції звичайних фатакого як гліцерин або сорбіт. Заповнені капсули хівців в даній галузі. можуть містити активні інгредієнти в суміші з напоКомпозиції за винаходом вводять в фармацевнювачем, таким як лактоза, зв'язувальних речовтично прийнятних розчинах, які в загальноприйвин, таких як крохмаль, і/або ковзні речовини, такі нятій практиці містять фармацевтично прийнятні як тальк або стеарат магнію, і, необов'язково, стаконцентрації солі, буферних речовин, консерванбілізатори. У м'яких капсулах активні сполуки мотів, сумісних носіїв, ад'ювантів і, необов'язково, жуть бути розчинені або суспендовані у відповідінших терапевтичних інгредієнтів. них рідинах, таких як жирні масла, рідкий парафін Для застосування в лікуванні ефективну кільабо рідкі поліетиленгліколі. Крім того, можна додакість імуностимулюючих CpG-олігонуклеотидів або вати стабілізатори. Можна застосовувати також інших лікарських засобів можна вводити суб'єкту мікросфери, складені для орального введення. будь-яким способом, що доставляє сполуку до Такі мікросфери добре визначені в даній галузі. Всі бажаної поверхні, наприклад, місцевим, на слизосклади для орального введення повинні бути в ву оболонку, системним. Введення фармацевтичдозах, прийнятних для такого введення. ної композиції за даним винаходом можна здійсДля букального введення композиції можуть нювати будь-якими способами, відомими набувати форми таблеток або пастилок, складефахівцям в даній галузі. Переважні шляхи введенних звичайним способом. ня включають в себе як необмежувальні приклади Сполуки можна вводити інгаляцією в легенеоральний, парентеральний, внутрішньовенний, вий тракт, особливо в бронхи, і більш конкретно, в внутрішньом'язовий, підшкірний, внутрішньоосеальвеоли в глибині легені із застосуванням звиредковий, внутрішньопухлинний, інтраназальний, чайних пристроїв для інгаляції. Сполуки можна під'язиковий, інтратрахеальний, вдихання, очний, доставляти в формі подачі аерозольного спрею з вагінальний і ректальний. упаковок під тиском або з розпилювача із застосуДля орального введення сполуки (тобто імунованням відповідного пропелента, наприклад, дихстимулюючі CpG-олігонуклеотиди, антигени і/або лордифторметану, трихлорфторметану, дихлорінші терапевтичні агенти) можна легко скласти тетрафторетану, вуглекислого газу або іншого поєднанням активної сполуки (сполук) з фармацеприйнятного газу. У разі аерозолю під тиском, втично прийнятними носіями, добре відомими в одиницю дозування можна визначати наданням даній галузі. Такі носії дозволяють складати сполуклапана для доставки виміряної кількості. Для доки за винаходом в формі таблеток, пілюль, драже, ставки сполук суб'єкту можна застосовувати апакапсул, рідин, гелів, сиропів, зависей, суспензій і рати для інгаляції. Апарат для інгаляції, як застоподібного для орального введення суб'єкту, що совують тут, являє собою будь-яке пристосування підлягає лікуванню. Фармацевтичні препарати для для введення аерозолю, так само як сухих порошорального застосування можна отримати у вигляді кових форм сполук. Даний тип обладнання добре твердого наповнювача, необов'язково, розмелюювідомий в даній галузі і описаний в деталях, як в чи отриману суміш і обробляючи суміш гранул, описі, знайденому в Remington: The Science and після додавання відповідних добавок, якщо бажаPractice of Pharmacy, 19th Edition, 1995, Mac но, для отримання оболонок таблеток або драже. Publishing Company, Easton, Pennsylvania, pages Відповідними наповнювачами є, зокрема, такі на1676-1692. Пристосування для інгаляції описане повнювачі, як цукор, включаючи лактозу, сахарозу, також в багатьох патентах США, таких як патент маніт або сорбіт; целюлозні препарати, такі як, США №6116237. наприклад, кукурудзяний крохмаль, пшеничний «Порошок», як застосовують тут, відноситься крохмаль, рисовий крохмаль, картопляний крохдо композицій, що складаються з тонко подрібнемаль, желатин, трагакантову камедь, метилцелюних твердих частинок. Сполуки, переважно, віднолозу, гідроксипропілметилцелюлозу, карбоксимесно вільно пересипаються, і їх можна розподіляти тилцелюлозу натрію і/або полівінілпіролідон (PVP). в пристосуванні для інгаляції з подальшою інгаляЯкщо бажано, можна додавати речовини, що розцією суб'єкту, так що сполуки досягають легень, падаються, такі як поперечно зшитий полівінілпіщо дозволяє проникнення в альвеоли. «Сухий 53 88457 54 порошок» відноситься до порошкової композиції, або наповнювачі. Такі носії або наповнювачі вклющо має такий вміст вологи, що частинки легко розчають в себе як необмежувальні приклади карбоподіляються в пристосуванні для інгаляції для фонат кальцію, фосфат кальцію, різні цукри, крохрмування аерозолю. Вміст вологи, як правило, маль, похідну целюлозу, желатин і полімери, такий складає менше за 10% по масі (%мас.) води, а в як поліетиленгліколі. деяких варіантах здійснення становить нижче приПрийнятними рідкими або твердими формами близно 5%мас. і переважно менше, ніж 3%мас. фармацевтичних препаратів є, наприклад, водні Порошок можна складати з полімерами і, необоабо сольові розчини для інгаляції, мікроінкапсув'язково, можна складати з іншими речовинами, льовані, в складі кохлеатів, що покривають мікротакими як ліпосоми, альбумін і/або інші носії. скопічні частки золота, що містяться в ліпосомах, Фахівці в даній галузі можуть вибирати дозущо розпилюються, аерозолі, осади для імплантації вання і системи доставки аерозолю для конкретнов шкіру або висушені на гострому предметі для го терапевтичного застосування, такі як описані, прошкрябування в шкіру. Фармацевтичні композинаприклад, в Gonda, I. "Aerosols for delivery of ції також включають в себе гранули, порошки, табtherapeutic and diagnostic agents to the respiratory летки, покриті таблетки (мікро)капсули, супозитоtract, "in Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier рії, сиропи, емульсії, суспензії, креми, краплі або Systems, 6:273-313 (1990), і в Moren, "Aerosol препарати з тривалим вивільненням активних dosage forms and formulations, "in Aerosols in сполук, в яких звичайно, як описано вище, застоMedicine. Principles, Diagnosis and Therapy, Moren, совують наповнювачі і добавки і/або допоміжні et al., Eds., Elsevier, Amsterdam, 1985. речовини, такі як розпушувачі, зв'язувальні, покриСполуки, якщо бажано доставляти їх системвні засоби, засоби, що набухають, ковзні речовино, можна складати для парентерального введенни, ароматизатори, підсолоджувачі або солюбіліня за допомогою ін'єкції, наприклад, за допомогою затори. Фармацевтичні композиції придатні для болюсного вливання або постійних вливань. Склазастосування у безлічі систем доставки лікарських ди для ін'єкцій можна представляти в формі однозасобів. Короткий огляд способів доставки лікарськратної дози, наприклад, ампули, або в контейнеких засобів див. в Langer R (1990) Science рах для множинних доз, з доданим консервантом. 249:1527-33, що наведене тут як посилання в повКомпозиції можуть набувати таких форм як суному об'ємі. спензії, розчини або емульсії в масляних або водІмуностимулюючі CpG-олігонуклеотиди і, нених носіях і можуть містити формулюючі засоби, обов'язково, інші лікарські засоби і/або антигени такі як суспендуючі, стабілізуючі і/або дисперсійні можна вводити самостійно (чистими) або в формі засоби. фармацевтично прийнятної солі. При застосуванні Фармацевтичні склади для парентерального в медицині солі повинні бути фармацевтично привведення містять водні розчини активних сполук у йнятними, однак фармацевтично не прийнятні солі водорозчинній формі. Крім того, суспензії активних можна легко застосовувати для отримання з них сполук можна приготувати як відповідні масляні фармацевтично прийнятних солей. Такі солі вклюсуспензії для ін'єкцій. Відповідні ліпофільні розчають в себе як необмежувальні приклади отричинники або носії включають в себе нелеткі масла, мані з наступних кислот: соляної, бромистоводнетакі як кунжутне масло, або синтетичний складний вої, сарної, азотної, фосфорної, малеїнової, ефір жирних кислот, таке як етилолеат або тригліоцтової, саліцилової, п-толуолсульфонової, винноцериди, або ліпосоми. Водні суспензії для ін'єкцій кам'яної, лимонної, метансульфонової, мурашиної, можуть містити речовини, що збільшують в'язкість малонової, янтарної, нафталін-2-сульфонової і суспензії, такі як карбоксиметилцелюлоза натрію, бензолсульфонової. Такі солі можна отримати сорбіт або декстран. Суспензія, необов'язково, також як солі лужних металів або лужноземельні може також містити відповідні стабілізатори або солі, такі як солі натрію, калію або кальцію з грузасоби, що збільшують розчинність, що дозволяє пою карбонової кислоти. отримання високо концентрованих розчинів. Придатні буферні агенти включають в себе Як альтернатива активні сполуки можуть бути оцтову кислоту і сіль (1-2%мас./об.); лимонну кисприсутніми в формі порошку для складання перед лоту і сіль (1-3%мас./об.); борну кислоту і сіль (0,5застосуванням з відповідним носієм, наприклад, 2,5%мас./об.) і фосфорну кислоту і сіль (0,8стерильною апірогенною водою. 2%мас./об.)· Придатні консерванти включають в Сполуки можна складати також в ректальні себе хлорид бензалконію (0,003-0,03%мас./об.); або вагінальні композиції, такі як супозиторії або хлорбутанол (0,3-0,9%мас./об.); парабени (0,01утримувальні клізми, наприклад, що містять зага0,25%мас./об.) і тимеросал (0,004-0,02%мас./об.)· льноприйняті основи для супозиторія, такі як кокоФармацевтичні композиції за винаходом міссове масло або інші гліцериди. тять ефективну кількість імуностимулюючого CpGУ доповнення до описаних вище складів, споолігонуклеотиду і, необов'язково, антигени і/або луки можна складати також як препарати-депо. інші терапевтичні засоби, необов'язково, укладені Такі склади тривалої дії можна складати з відповів фармацевтично прийнятний носій. Термін фардними полімерними або гідрофобними речовинамацевтично прийнятний носій означає один або ми (наприклад, як емульсію у відповідному маслі) декілька сумісних твердих або рідких наповнюваабо іонообмінними смолами або у вигляді важкочів, розріджувачів або інкапсулюючих речовин, розчинних похідних, наприклад, важкорозчинної придатних для введення людині або іншій хребетсолі. ній тварині. Термін носій означає органічний або Фармацевтичні композиції можуть містити танеорганічний інгредієнт, природний або синтетичкож відповідні твердофазні або гель-фазні носії ний, з яким об'єднують активний інгредієнт для 55 88457 56 полегшення застосування. Компоненти фармацевтю стимулювати периферичні мононуклеарні клітичних композицій також здатні змішуватися із тини крові людини (РВМС) для секреції IFN-a і сполуками за даним винаходом і один з одним стимулювати клітини НЕК293, стабільно трансфітаким чином, що не виникає взаємодії, що істотно ковані репортерною конструкцією з TLR9 людини і знижує бажану фармацевтичну ефективність. NF-kΒ для демонстрації передачі сигналу TLR9. Даний винахід далі проілюстрований наступODN придбані в Biospring (Frankfurt, Germany) і ними прикладами, які жодним чином не треба розперевірені на ідентичність і чистоту в Coley глядати як такі, що обмежують. Pharmaceutical GmbH (Langenfeld, Germany). ODN Приклади розчиняли в фосфатно-сольовому буфері (Sigma, Приклад 1 Germany) і зберігали при -20°С. Всі розведення Аналоги ODN С-класу індукують секрецію IFNпроводили з апірогенними реагентами. У тест ODN a і активність TLR9 людини in vitro включали наступні: У даних серіях експериментів аналоги ODN Скласу за винаходом тестували in vitro за їх здатніс де * означає фосфоротіоатний зв'язок, і _ означає фосфодіефірний зв'язок. CpG-ODN 2006 (TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT, SEQ ID NO: 56) застосовували як позитивний контроль для активації сигналу TLR9. CpG-ODN С-класу 2429 (TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG, SEQ ID NO: 53) застосовували як позитивний контроль для індукції IFN-a. He-CpG-ODN 1982 (TCCAGGACTTCTCTCAGGTT, SEQ ID NO: 18) застосовували як негативний контроль. Препарати лейкоцитної плівки периферичної крові здорових донорів чоловічої і жіночої статі отримані з Blood Bank of the University of Dusseldorf (Germany) і з них виділені РВМС центрифугуванням на Фікол-Гіпаку (Sigma). Виділені РВМС ресуспендували в культуральному середовищі RPMI 1640 (BioWhittaker, Belgium), доповненому 5% (об./об.) інактивованою нагріванням АВ сироваткою людини (BioWhittaker) або 10% (об./об.) інактивованою нагріванням FCS, 2мМ L-глутаміном (BioWhittaker), 100Од./мл пеніциліну і 100мкг/мл стрептоміцину (Invitrogen, Karlsruhe, Germany). Свіжі РВМС пересівали в 96-ямкові круглодонні плашки і інкубували 48 годин з ODN в концентрації, як вказано, у вологому інкубаторі при 37°С. Культуральні супернатанти збирали і, якщо не використовували негайно, заморожували при 20°С до потреби. Кількості IFN-a в супернатантах оцінювали із застосуванням твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA), розробленого із застосуванням комерційно доступних антитіл (Alexis GmbH, Grunberg, Germany). ODN 128, 331-344, 611 і 620 тестували з РВМС чотирьох різних донорів, a ODN 614 тестували з РВМС трьох різних донорів. Стабільно трансфіковані клітини НЕK293 застосовували для аналізу TLR9 людини по репортерномугена, експресуючи репортерну генетичну конструкцію з рецептором TLR9 людини і NF-kΒ. Клітини інкубували з ODN 16 годин при 37°С у вологому інкубаторі. Кожну точку даних отримували в трьох повторах. Клітини лізували і аналізували активність репортерного гена. Індекси стимуляції розраховували по відношенню до активності репортерного гена в середовищі без додавання ODN. Результати. Типові результати подані на Фіг.1 і Фіг.2. На Фіг.1 показано, що ODN С-класу 332, 333 і 334 індукують великі кількості IFN-a (звичайно приблизно 2000-2500пг/мл), коли присутні в концентрації 1мкМ. Кількість IFN-a, індукованого да 57 88457 58 ODN 611 (SEQ ID NO: 43), 614 (SEQ ID NO: 43) ними ODN, значно перевершує кількість IFN-a, і 620 (SEQ ID NO: 43) також порівнювали з ODN індуковану такою ж концентрацією ODN 2006 або 2429 (одним з перших описаних олігонуклеотидів 1982. На Фіг.1 показано також, що ODN С-класу С-класу, що містять паліндром). Дані нові ODN С332, 333 і 334 індукують значні величини сигналькласу показали більш високу активність в аналізі ної активності TLR9 (звичайно з індексом стимуляTLR9 людини, тоді як індукція IFN-a була такою ж, ції приблизно 15), коли присутні в концентрації 10мкМ. Величина сигнальної активності TLR9, що як і для 2429 (Фіг.3). індукується даними ODN, складала близько полоРазом взяті, результати даних експериментів вини сигнальної активності TLR9, що індукується показують, що аналоги ODN C-класу за винаходом такою ж концентрацією ODN 2006. По суті такі ж ефективно індукують секрецію IFN-a і активність результати отримані для ODN 128 і 335-344. TLR9 людини in vitro. На Фіг.2 показано, що ODN С-класу 611, 614 і Приклад 2 620 індукують навіть більш значні кількості IFN-a Додаткові аналоги ODN С-класу індукують се(звичайно приблизно 3000-4000пг/мл), коли присукрецію IFN-a in vitro тні в концентрації 1мкМ. Кількість IFN-a, індуковаВ даних серіях експериментів додаткові ананого даними ODN, значно перевершує кількість логи ODN С-класу за винаходом тестували in vitro IFN-a, індуковану ODN 2006 або 1982 в такій же за їх здатністю індукувати секрецію IFN-a. Аналоги концентрації. На Фіг.2 показано також, що ODN СODN C-класу в даних експериментах частково класу 611, 614 і 620 індукують значні величини характеризуються присутністю АТ-багатих перерисигнальної активності TLR9 (звичайно з індексом вистих інвертованих повторів, що містять залишки стимуляції приблизно 10-20), коли присутні в конd-спейсера замість звичайних нуклеотидних залицентрації 10мкМ. Величина сигнальної активності шків. TLR9, що індукується даними ODN, знов складала ODN отримували, як в прикладі 1. В тест ODN близько половини сигнальної активності TLR9, що включали наступні: індукується ODN 2006 в такій же концентрації. де * означає фосфоротіоатний міжнуклеотидний зв'язок, _ означає фосфодіефірний міжнуклеотидний зв'язок і L являє собою d-спейсер. РВМС людини отримували і обробляли способом, аналогічним прикладу 1. Кількості IFN-a в супернатантах оцінювали із застосуванням твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA) способом, аналогічним прикладу 1. Результати. ODN С-класу 645, 646 і 647, що частково характеризуються присутністю АТбагатих переривистих інвертованих повторів, індукують помірні кількості IFN-a (звичайно приблизно 1200-1500пг/мл), коли присутні в концентрації 1мкМ. Кількість IFN-a, індукованого даними ODN, значно перевершує кількість IFN-a, індуковану такою ж концентрацією ODN 2006 або 1982. ODN С-класу 649, 650 і 651, що частково характеризуються присутністю АТ-багатих переривистих інвертованих повторів, індукують великі кількості IFN-a (звичайно приблизно 2000-2500пг/мл), коли присутні в концентрації 1мкМ. Кількість IFN a, індукованого даними ODN, значно перевершує кількість IFN-a, індуковану такою ж концентрацією ODN 2006 або 1982. Разом взяті, результати даних експериментів показують, що аналоги ODN C-класу за винаходом, що частково характеризуються присутністю АТ-багатих переривистих інвертованих повторів, що містять залишки d-спейсера замість звичайних нуклеотидних залишків, ефективно індукують секрецію IFN-a in vitro. Приклад 3 Додаткові аналоги ODN С-класу індукують секрецію IFN-a і активність TLR9 людини in vitro У даних серіях експериментів аналоги ODN С-класу за винаходом тестували in vitro за їх здатністю стимулювати РВМС для секреції IFN-a і стимулювати клітини НЕK293, стабільно трансфіковані репортеркою конструкцією з TLR9 людини і NF-kΒ, для демонстрації передачі сигналу TLR9. Основний протокол описаний в прикладі 1, за винятком того, що в тест ODN включали наступні: 59 88457 де * означає фосфоротіоатний зв'язок, і _ означає фосфодіефірний зв'язок. ODN в різних концентраціях тестували аналізом TLR9 по репортерному гену. ЕС50 (концентрацію ODN, при якій ефект становить 50 процентів від максимального ефекту) розраховували із застосуванням SigmaPlot (SigmaPlot 2002 для Windows версії 8.0). Максимальний індекс стимуляції (max SI) розраховували як частка між найвищим значенням для всіх концентрацій, тестованих для будь-якого ODN, і середнім контрольним. Результати показані в таблиці, де видно, що звичайно індекси стимуляції лежали в діапазоні 10-30. Таблиця CnG-ODN С-класу за винаходом активують TLR9 людини ODN 801 2341 2357 882 893 894 2290 2337 664 2292 376 ЕС50 (нМ) 130 2900 1900 2700 3500 2800 1200 3900 1290 2700 230 max SI 29 27 19 15 11 11 11 11 5 5 2 РВМС людини при 48-годинній інкубації з даними CpG-ODN С-класу секретують великі кількості IFN-a. Типові кількості IFN-a після інкубації з ODN в концентраціях, менших або що дорівнюють 1мкМ, лежали в діапазоні 3000-4000пг/мл. Криві відповіді для IFN-a в даних експериментах дуже схожі на криві, показані на Фіг.2. Приклад 4 Аналоги ODN С-класу індукують ангигенспецифічну імунну відповідь in vivo У даних серіях експериментів аналоги ODN Скласу за винаходом тестували in vivo одночасно з вакцинацією мишей. Виявлено, що ODN С-класу за винаходом збільшують титри загальних антигенспецифічних IgG і IgG2a (Th1-подібних IgG у ми 60 шей), так само як відповіді антигенспецифічних цитотолітичних Т-лімфоцитів (CTL) до деякої міри щонайменше порівнянній з CpG-ODN В-класу 2006. ODN отримували, як в прикладі 1. Для всіх експериментів застосовували самиць мишей BALB/c (у віці 6-8 тижнів). Тварин придбавали в Charles River Canada (Quebec, Canada) і утримували в мікроізоляторах у відділі нагляду за тваринами Ottawa Hospital Research Institute, Civic Site. Для всіх аналізів in vitro застосовували наївні спленоцити мишей BALB/c. Тварин анестезували ізофлуораном і умертвляли зміщенням шийних хребців. Селезінки видаляли в асептичних умовах і вміщували в фосфатно-сольовий буфер (PBS)+0,2% бичачого сироваткового альбуміну (Sigma Chemical Company). Селезінки гомогенізували і спленоцити ресуспендували в середовищі для культивування клітин RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island, NY), доповненому 2% нормальною мишачою сироваткою (Cedarlane Laboratories, Ontario, Canada), розчином пеніцилінстрептоміцину (кінцева концентрація 1000Од./мл і 1мг/мл, відповідно; Sigma Chemical Company) і 5´10-5Μ (b-меркаптоетанолом (Sigma Chemical Company). Мишей BALB/c (n=10/групу) імунізували 1мкг поверхневого антигену гепатиту В (HBsAg) субтипу ad (International Enzymes, С А) самостійно або в поєднанні з 1-100мкг CpG-ODN 2006, 608, 611, 618 або CpG-ODN 620. У тварин відбирали кров і проводили повторну імунізацію через 4 тижні після первинної імунізації. Через 2 тижні після повторної імунізації 5 тварин з кожної групи умертвляли і видаляли селезінки для аналізів CTL. Антитіла (тотальні IgG, IgG1 і IgG2a), специфічні до HBsAg (анти-HBs) детектували і визначали кількісно аналізом ELISA з кінцевими розведеннями, який проводили в трьох повторах на зразках від окремих тварин. Кінцеві титри визначали як найбільше розведення плазми, що дас значення оптичної щільності (OD 450) в два рази вище, ніж для неімунної плазми зі значенням відсічки 0,05. Це представлене як середні групові титри (GMT)±SEM. Аналізи CTL проводили відповідно до звичайного способу. Коротко, селезінки видаляли через 4