Кондуктометрична біосенсорна система для визначення концентрації лактози у розчині

Кондуктометрична біосенсорна система для визначення концентрації лактози у розчині, що складається з генератора змінного струму, опорів навантаження, диференційного підсилювача, фазочутливого нановольтметра, реєструючого приладу, робочої комірки для досліджуваного розчину 3 36831 ють в якості затравки для кристалізації при виробництві згущеного молока. Вихід та якість молочних продуктів, що визначаються складом молока, концентрацією, структурою та властивостями його компонентів, знаходяться в прямій залежності від зоотехнічних факторів та стану тварин (кормовий раціон, здоров'я тварин, лактаційний період та інше). В свою чергу, вміст лактози, яка є основною компонентою молока та молочних продуктів, є одним із показників якості молочних продуктів. До того ж, на сьогодні, багато людей страждають лактозною недостатністю (вроджений чи набутий стан, що характеризується зниженням активності ферменту лактози, що розщеплює лактозу до молочної кислоти в тонкому кишечнику). Клінічним проявом цієї хвороби є інтолерантність до лактози [1]. У зв'язку з усім ви щесказаним, зрозуміло, що на сьогодні, існує необхідність у наявності добре налагодженої системи моніторингу концентрації лактози, перш за все, в складі молочних продуктів на молочному виробництві, а також в багатьох інших галузях (медичне, харчове виробництво). Більш того, визначення лактози може знадобитися в ензимології та мікробіології для більш детального вивчення процесів ферментації, молочнокислого бродіння та інше. Сучасні стандартні методи високоточного визначення лактози потребують наявності кваліфікованого персоналу та складного і дорогого обладнання, яке необхідне для рідинної, газової хроматографії, хімічних, гравіметричних та оптичних методів [2]. Ще одним недоліком наведених вище методів є необхідність в досить складній попередній підготовці проб для аналізу. Ін ші методи, поляриметрія та рефрактометрія, є простими і швидкими, але менш точними та селективними. На противагу їм біосенсори є більш зручними, точними, селективними, швидкими та дешевими приладами. Створення біосенсора для визначення лактози може спростити та покращити систему моніторингу вмісту лактози в молочних продуктах та медичних препаратах. На сьогодні існує ряд лабораторних прототипів біосенсорів для визначення лактози [3-16]. Більшість з них є амперометричними з різними іммобілізованими на поверхню електродів ферментами: b-галактозидаза та галактозооксидаза [3], bгалактозидаза та глюкозооксидоза (ГОД) [2, 4-7], пероксидаза хріну, глюкозооксидоза та bгалактозидаза [8], b-галактозидаза, мутаротаза та глюкозодегідрогеназа [9], b-галактозидаза, галактозодегідрогеназа [10-12], целобіозодегідрогеназа [13]. Деякі автори також повідомляють про розробку біосенсорів для визначення лактози з використанням різних медіаторів [8, 14], що дещо ускладнює систему визначення. Наприклад, в роботі [14] в якості робочого електроду використовували графітовий електрод з адсорбованим на нього медіатором ферроценом, а в роботі [8] в якості медіатора використовували аміносаліцилову кислоту. В іншій роботі [15] автори повідомляють про створення біосенсора для визначення лактози на основі мікробіологічних клітин Kluyveromyces marx 4 ianus, які містили фермент b-галактозидазу та клітини Gluconobacter oxydans з ферментом ГОД. Ці клітини були іммобілізовані з желатином на поверхні електродів за допомогою глутарового альдегіду. Перевага такого клітинного біосенсора була в тому, що клітини Gluconobacter oxydans були здатні окислювати обидва аномера глюкози, що давало можливість обходитись без ферменту мутаротази. До того, авторами було відмічено, що додавання DEAE-декстрану та інозитолу до біоселективної мембрани біосенсорів покращувало стабільність біосенсорів у 16 разів порівняно зі стабільністю біосенсорів без стабілізаторів. В роботі [5] є повідомлення про створення амперометричного мультибіосенсора для визначення декількох сахаридів (лактози, мальтози, сахарози та глюкози). Авторами цієї роботи було показано також, що активність ферменту bгалактозидази в желатиновій мембрані більше ніж в альбуміновій. В роботі [16] повідомляється про розробку біосенсору на основі ІСПТ для визначення лактози, до складу якого входила термофільна глюкокіназа та b-галактозидаза. Ферменти не втрачали активності при температурі +50°С. Авторами статті [7] був розроблений амперометричний мультибіосенсор для визначення глюкози, галактози та лактози та успішно апробований на практиці для визначення цих сахаридів в молоці. Отже, на сьогоднішній день більшість розроблених біосенсорів для визначення лактози є амперометричними [3-15]. Але, порівняно з кондуктометричними біосенсорами для визначення лактози, вони мають ряд недоліків. Перш за все, це вимірювання з використанням високого потенціалу, що призводить до похибок завдяки присутності у розчинах інших електроокислюючих компонентів, таких, наприклад, як аскорбінова кислота. По-друге - необхідність в технологічно складному та дорогому електроді порівняння. По-третє - необхідність роботи з високою напругою, що призводить до фарадеївських процесів на електродах. До того ж, амперометричні біосенсори, як правило, є більш дорогими порівняно з кондуктометричними. В цілому, порівняно з іншими електрохімічними біосенсорами, кондуктометричні методи аналізу є достатньо простими, зручними, точними та дозволяють вирішити ряд важливих науководослідних та виробничих задач [17, 18]. На сьогоднішній день кондуктометричний біосенсор для селективного визначення лактози ще не застосовувався. В основу запропонованої корисної моделі поставлено задачу створення кондуктометричної біосенсорної системи для визначення концентрації лактози у розчині, яка б дозволила селективно та більш точно визначати лактозу у досліджуваних зразках. Поставлена задача вирішується за рахунок застосування двох кондуктометричних біосенсорів, перший з яких призначений для визначення глюкози, а другий - для сумарного визначення лактози і глюкози, та використання трьох ферментів (галактозидаза-мутаротаза-глюкозооксидаза) в складі ферментної мембрани другого кондуктометричного біосенсора для селективного визначення концентрації лактози в розчині. 5 36831 Поставлена задача вирішується запропонованою кондуктометричною біосенсорною системою для визначення концентрації лактози у розчині, що складається з генератору змінного струму, опорів навантаження, диференційного підсилювача, фазочутливого нановольтметра, реєструючого приладу, робочої комірки для досліджуваного розчину та двох кондуктометричних біосенсорів, кожен з яких складається з перетворювача на основі двох ідентичних пар планарних електродів, при цьому у кожного кондуктометричного біосенсора на першу пару електродів нанесена ферментна мембрана, а на другу пару електродів нанесена мембрана порівняння, один з кондуктометричних біосенсорів забезпечений ферментною мембраною на основі глюкозооксидази, чутливою до глюкози, а другий кондуктометричний біосенсор забезпечений ферментною мембраною, що складається із ферментної системи галактозидаза-мутаротазаглюкозооксидаза та призначений для сумарного визначення лактози і глюкози, при цьому вся кондуктометрична біосенсорна система підключена до джерела живлення. В основі роботи кондуктометричної біосенсорної системи для визначення лактози лежить наступний каскад ферментативних реакцій: b-GAL (1) лактоза+Н2О ® галактоза+a-D-глюкоза MUT (2) a-D-глюкоза ® b-D-глюкоза GOD b-D-глюкоза+О2 ® D-глюконолактон+Н 2О2 (3) ß ¬ D-глюконова кислота+Н 2О ® залишок кис- (4) лоти+Н+ де b-GAL - b-галактозидаза, MUT - мутаротаза, GOD - глюкозооксидаза. b-галактозидаза, мутаротаза та глюкозооксидоза поетапно розщеплюють лактозу до перекису водню та D-глюконолактону. Глюконолактон, в свою чергу, спонтанно гідролізується до глюконової кислоти, яка дисоціює на залишок кислоти і протон, при цьому змінюється провідність розчину, яку і можна реєструвати за допомогою кондуктометричного перетворювача [19]. Співвідношення ферментів в складі ферментної мембрани було отримано експериментально з урахуванням активності кожного з ферментів. Суть корисної моделі пояснюється графічними матеріалами, де: на Фіг.1 показано блок-схему кондуктометричної біосенсорної системи; на Фіг.2 показано кондуктометричний біосенсор для визначення лактози; на Фіг.3 показано кондуктометричний біосенсор для визначення глюкози; на Фіг.4 показано калібрувальний графік залежності зміни провідності від концентрації глюкози; на Фіг.5 показано калібрувальний графік залежності зміни провідності від концентрації лактози; на Фіг.6 показано відтворюваність сигналу лактозного біосенсора на внесення лактози у розчин. Вимірювання проводились у 5мМ фосфатному буфері, pH 6,5. 6 Кондуктометрична біосенсорна система для визначення концентрації лактози у розчині складається з генератору змінного струму 1, робочої комірки для досліджуваного розчину 2, опорів навантаження 3, диференційного підсилювача 4, фазочутли вого нановольтметра 5, реєструючого приладу 6 та двох кондуктометричних біосенсорів 7 і 8, кожен з яких складається з двох ідентичних пар планарних електродів 9, 10, 11, 12 (Фіг.2) та 13, 14, 15, 16 (Фіг.3), відповідно, та, при цьому у першого кондуктометричного біосенсора (Фіг.2) на першу пару електродів 9, 10 нанесена ферментна мембрана 17, що складається з ферментної системи галактозидаза-мутаротаза-глюкозооксидаза, чутливої до лактози та глюкози, а у др угого біосенсора (Фіг.3) на першу пару електродів 13, 14 нанесено відповідно ферментна мембрана 18 на основі глюкозооксидази, чутливої тільки до глюкози, у обох кондуктометричних біосенсорів на другу пару електродів 11, 12 та 15, 16 нанесена мембрана порівняння 19 і 20 відповідно. Вся кондуктометрична біосенсорна система підключена до джерела живлення. Іммобілізацію ферментів в складі ферментної мембрани на поверхні електродів проводили за допомогою глутарового альдегіду. Для створення гелю для ферментної мембрани глюкозного біосенсора готували розчин з вмістом 7% глюкозоксидази, 13% BSA, 20% гліцерину у 20мМ фосфатному буфері, рН 7,4. Гель для мембрани порівняння робили таким же чином, але замість наважки ферментів брали 20% БСА. До складу гелю чергу, БСА в складі ферментної мембрани відігравав роль стабілізуючого агенту для ферментів. Перед нанесенням на поверхню електродів приготовлені гелі (для ферментної мембрани та мембрани порівняння) змішували з 1% водним розчином глутарового альдегіду у співвідношенні 1:1. В свою чергу, для створення гелю для ферментної мембрани лактозного біосенсора готували розчин з вмістом 6% b-галактозидаза, 8% мутаротази, 6% ГОД, 20% гліцерину у 20мМ фосфатному буфері, рН 7,4. Гель для мембрани порівняння робили таким же чином, але замість наважки ферментів брали 20% БСА. Обидва розчини були з однаковим вмістом білка. Перед нанесенням на поверхню електродів приготовлені гелі (для ферментної мембрани та мембрани порівняння) змішували з 2% водним розчином ГА у співвідношенні 1:1. Після нанесення мембрани на поверхню електродів глюкозний та лактозний біосенсори висушували 1 годину у повітрі при кімнатній температурі. Вимірювання при використанні кондуктометричних перетворювачів у складі кондуктометричних біосенсорів для реєстрації перебігу ферментативних процесів проводилися за схемою, представленою на Фіг.1а. З низькочастотного генератору сигналів ГС - 112.1 1/ГС/ подавалася змінна напруга 10мВ з частотою f=100кГц на гребінчасті електроди 10, 11 та 14, 15 кондуктометричних біосенсорів 7 і 8 відповідно, які знаходились в комірці з розчином, що досліджувався. На пари електродів 9, 10 та 13, 14 були нанесені ферментні мембрани 17, 18 відповідно, а на інші пари електродів 11, 12 та 15, 16 - мембрани порівняння 19, 7 36831 20 відповідно. В схемі використовувалися опори навантаження RH=1кОм, які були підключені до електродів 9, 12 та 13, 16. Вихідні сигнали знімалися з відповідних опорів навантаження і поступали на диференційний препідсилювач 4 /ДП/ типу Unipan-233-6 (Польща). Звідти диференційний сигнал надходив до селективного нановольтметру 5 /НВ/ типу Unipan-233 (Польща), який ми і реєстрували самореєструючим пристроєм 6 /РП/. Оскільки лактозний кондуктометричний біосенсор дає відгук і на глюкозу і на лактозу, для визначення саме лактози необхідним є наявність також глюкозного кондуктометричного біосенсора. У зв'язку з цим вимірювання лактози в зразках необхідно проводити в два етапи. Спочатку отримується сигнал глюкозного кондуктометричного біосенсора на глюкозу, а потім сумарний сигнал лактозного кондуктометричного біосенсора на лактозу та глюкозу в досліджувальному розчині. Після визначення різниці між сигналами двох цих ферментних біосенсорів (глюкозного та лактозного) по калібрувальній кривій (Фіг.2,б) отримуємо концентрацію лактози в досліджувальному розчині. Одними із найважливіших показників роботи кондуктометричних біосенсорів є селективність. Для перевірки селективності лактозного кондуктометричного біосенсору було проведено ряд дослідів, в яких вивчалась реакція кондуктометричного біосенсору для визначення лактози на вміст інтерферуючи х речовин. Вимірювання проводилися в 10мМ фосфатному буферному розчині, рН 6,5. У комірку вносили інтерферуючі речовини в концентрації 0,5мМ (Таблиця 1), при цьому за 100% було обрано відгуки лактозного кондуктометричного біосенсору на 0,5мМ лактози. В цілому, запропонована кондуктометрична біосенсорна система виявилася селективною до ряду інтерферуючих речовин, тому і може бути в подальшому використана для роботи з реальними зразками. Відгук кондуктометричного лактозного біосенсора на 0,5мМ мальтози складає 8% від відгуку на таку ж концентрацію лактози. Оскільки в подальшому передбачається використовува ти лактозний сенсор в основному для визначення лактози в молочних продуктах, в яких, як правило, мальтоза не присутня, то ця чутливість сенсора по відношенню до мальтози не буде впливати на точність аналізу. Таблиця 1 Селективність біосенсору для визначення лактози 1мМ субстанції Лактоза Глюкоза Мальтоза Сахароза Фруктоза Арабіноза Манноза Відносний відгук лактозного біосенсора (%) 100 172,5 8,0 0 0 0 0 8 Також було проведено ряд дослідів по вивченню операційної стабільності кондуктометричного біосенсору для визначення лактози (Фіг.2,с). Вимірювання проводилися в 5мМ фосфатному буфері, рН 6,5. Лактозний біосенсор характеризувався високою відтворюваністю сигналу. Джерела інформації: 1. Adam Fox, Mike Thomson Adverse reactions to cows' //Milk Symposium: Metabolic Medicine. 2. Marrakchi M., D zyadevych S.V., Lagarde F., Marteiet C., Jaffre zic-renault N. Conductometric biosensor based on glucose oxidase and betagalactosidase for specific lactose determination in milk. -2007, doi: 10.1016/j.msec.2007.10.046. 3. Sharma S.K., Singhal R., Malhotra B.D., Sehgal N., Biosensors and Bioelectronics 20 (2004) 651. 4. Svorc J., Miertus S., Barlikova A. Hybrid biosensor for the determination of lactose //Analytical Chemistry. -1990. -62, -№15. -P.1628-1631. 5. Filipiak M., Fludra K., Gosciminska E. Enzymatic membranes for determination of some disacchrides by means of oxygen electrode //Biosensors and Bioelectronics. -1996. -4. -P.355-364. 6. Toshiaki Mori, Toshiaki Motonaga, Yoshio Okahata. Cast films of lipid-coated enzymes as selective sensors for disaccharides //Colloids and Surfaces A: Ph ysicochemical and Engineering Aspects. -1999. -146. -P.387-395. 7. V. Rajendran , J. Irudayaraj. Detection of glucose, galactose, and lactose in milk with a microdialysis-coupled flow injection amperometric sensor //Journal of Dairy Science. -2002. -6. -1357-1361. 8. Eshkenazi, E. Maltz, B. Zion, J. Rishpon. A three-cascaded-enzymes biosensor to determine lactose concentration in raw milk //Journal of Dairy Science. -2000. -9. -P.1939-1945. 9. Maestre E., Katakis I., Narvaez A., Dominguez E. A multianalyte flow electrochemical cell: application to the simultaneous determination of carbohydrates based on bioelectrocatalytic detection //Biosensors and Bioelectronics. -2005. -21. -P.774-781. 10. Kullick Т., Bock U., Schubert J., Scheper Т., Schugerl K. Electroanalytical chemistry and sensor //Analytica Chimica Acta. -1995. -300, -№1-3. -P.2531. 11. Kullick Т., Beyer M, Henning J., Lerch Т., Quack R., Zeitz A., Hitzmann В., Scheper Т., Schugerl K. Application of enzyme field-effect transistor sensor arrays as detectors in a flow-injection system for simultaneous monitoring of medium components. Part I. Preparation and calibration //Analytica Chimica Acta. -1994. -296. -P.263-269. 12. Kullick Т., Bock U., Schubert J., Scheper Т., Schugerl K. Application of enzyme-field effect transistor sensor arrays as detectors in a flow-injection analysis system for simultaneous monitoring of medium components. Part II. Monitoring of cultivation processes //Analytica Chimica Acta. -1995. -300. P.25-31. 13. Stoica L., Ludwig R., Haltrich D., Gorton L. Third-Generation Biosensor for Lactose Based on Newly Discovered Cellobiose Dehydrogenase //Analytical Chemistry. -2006. -78, -№2. -P.393-398. 9 36831 14. Tkac J., Sturdik E., Gemeiner P. Novel glucose non-interference biosensor for lactose detection based on galactose oxidase-peroxidase with and without co-immobilised b-galactosidase //Analyst. 2000. -125. -P.1285-1289. 15. Svitel J., Curilla O., Tkac J. Microbial cellbased biosensor for sensing glucose, sucrose or lactose //Biotechnol Appl Biochem. -1998. -2. -P.153158. 16. Kazuhito Aoki, Hiroko Suzuki, Yoshihiro Ishimaru, Shigeru Toyama, Yoshihito Ikariyama, Takeaki Iida. Thermophilic glucokinase-based sensors for the 10 determination of various saccharidea and glycosides //Sensors and Actuators B. -2005 -108. -P.727-732. 17. Дзядевич С.В., Солдаткін О.П. Кондуктометричний метод у ферментативному каталізі. //Укр. Біохим. Журн. -1994. -66, №4. 18. Дзядевич С.В., Кондуктометричні ферментні біосенсори: теорія, технологія, застосування //Біополімери і клітина. -2005. -21, №2 -С.91-106. 19. Дзядевич С.В., Шульга А.А., Пацковский С.В., Архипова В.Н., Солдаткин А.П., Стриха В.И. Тонкопленочный кондуктометрический датчик для ферментных биосенсоров //Электрохимия. -1994. 30, №8. -С.982-987. 11 Комп’ютерна в ерстка C.Литв иненко 36831 Підписне 12 Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601