Горизонтальний спосіб виявлення listeria monocytogenes у молоці та молокопродуктах

Реферат: Горизонтальний спосіб виявлення Listeria monocytogenes у молоці та молокопродуктах, в якому використовують дослідну суспензію, яка готується у співвідношенні 1:5, з послідуючим інкубуванням отриманої суспензії упродовж 21-23 годин за температури 31±1 °C та наступним 3 вторинним збагаченням. Отриману культуру у кількості 0,05-0,06 см переносять у пробірку, в 3 якій міститься 5-6 см вторинно збагаченого середовища . Проводять інкубування середовища з 3 посівами упродовж 46-48 годин за температури 37 °C. Проводять посів із первинно (5-6 см ) та 3 вторинно (2,5-3,0 см ) збагаченої культури на селективне середовище ПАЛКАМ-агар для отримання чітко відокремлених колонії Listeria monocytogenes діаметром 1,5-2 мм упродовж 24±2 годин за температури 37±1 °C у вигляді маленьких сіро-зелених чи оливково-зелених колоній та через 46±2 годин за температури 37±1 °C - у формі зелених колоній із впалим центром та чорним ореолом навколо. UA 115758 U (12) UA 115758 U UA 115758 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до сільського господарства, зокрема до ветеринарної медицини, і може бути використана для удосконалення горизонтального методу виявлення Listeria monocytogenes у молоці та молокопродуктах при встановленні їх безпечності у виробничих лабораторіях на потужностях з переробки, виробництва, реалізації і зберігання молока та молокопродуктів, у бактеріологічних відділах державних лабораторіях ветеринарної медицини. За результатами цього методу можна отримати якісні показники при удосконаленні горизонтального методу виявлення Listeria monocytogenes у молоці та молокопродуктах. Аналогом корисної моделі є спосіб визначення загальної кількості мікроорганізмів у молоці та молокопродуктах згідно з ДСТУ 7357:2013 [1], який базується на особливості аеробів та факультативних анаеробів рости на живильному агарі за температури 37±0,5 °C з утворенням колоній та послідуючим їх підрахунком. Недоліком даного методу є те, що він довготривалий, громіздкий і значні грошові затрати на живильний агар, Крім цього даний метод дає похибку від 20 до 35 %. Прототипом корисної моделі є горизонтальний метод виявлення Listeria monocytogenes у молоці та молокопродуктах [2], у якому застосовують великий об'єм первинно та вторинно селективних рідких збагачених середовищ (половинний бульйон Фрезера та бульйон Фрезера) і для дослідження береться вихідна суспензія, що готується у співвідношенні 1:9 (маса проби молока, молокопродуктів до об'єму селективного первинно збагаченого середовища). Недоліком даного методу є те, що він громіздкий, з підвищеною вартістю середовищ, реактивів та інкубування в селективному середовищі Оксфорд-агарі за температури 30 °C прийнятне лише для кормів. Крім цього даний метод дає похибку у 15-25 %. В основу даної корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб удосконалення горизонтального методу виявлення Listeria monocytogenes у молоці та молокопродуктах шляхом використання дослідної суспензії, яка готується у співвідношенні 1:5 (проби молока та 3 3 молокопродуктів у кількості 10-11 см (г) та 50-55 см первинно селективного збагаченого середовища - половинного бульйону Фрезера), послідуючим інкубуванням отриманої суспензії упродовж 21-23 годин за температури 31±1 °C та наступним вторинним збагаченням: після 3 первинного збагачення отриману культуру у кількості 0,05-0,06 см переносять у пробірку, в якій 3 міститься 5 6 см вторинно збагаченого середовища (бульйон Фрезера), потім інкубують середовище з посівами упродовж 46-48 годин за температури 37 °C, у подальшому проводять 3 3 посів із первинно (5-6 см ) та вторинно (2,5-3,0 см ) збагаченої культури на селективне середовище ПАЛКАМ-агар, щоб отримати чітко відокремлені колонії Listeria monocytogenes упродовж 24±2 годин за температури 37±1 °C у вигляді маленьких сіро-зелених чи оливковозелених колоній, діаметром 1,5-2 мм, інколи з чорним ореолом, через 48 годин - у формі зелених колоній діаметром 1,5-2 мм із впалим центром та чорним ореолом навколо. Поставлена задача вирішується тим, що використовують дослідну суспензію, яка готується у 3 3 співвідношенні 1:5 (проби молока та молокопродуктів у кількості 10-11 см (г) та 50-55 см первинно селективного збагаченого середовища - половинного бульйону Фрезера), послідуючим інкубуванням отриманої суспензії упродовж 21-23 годин за температури 31±1 °C та наступним вторинним збагаченням: після первинного збагачення отриману культуру у кількості 3 3 0,05-0,06 см переносять у пробірку, в якій міститься 5-6 см вторинно збагаченого середовища (бульйон Фрезера), потім інкубують середовище з посівами упродовж 46-48 годин за 3 3 температури 37 °C, у подальшому проводять посів із первинно (5-6 см ) та вторинно (2,5-3 см ) збагаченої культури на селективне середовище ПАЛКА М-агар, щоб отримати чітко відокремлені колонії Listeria monocytogenes упродовж 24±2 годин за температури 37±1 °C у вигляді маленьких сіро-зелених чи оливково-зелених колоній, діаметром 1,5-2 мм, інколи з чорним ореолом, та через 46±2 годин за температури 37±1 °C - у формі зелених колоній діаметром 1.5-2 мм із впалим центром та чорним ореолом навколо. Етапи вирішення даної задачі наведено у нижчезазначених прикладах. Приклад 1. Для розробки методу використовують дослідну суспензію, яка готується у 3 3 співвідношенні 1:6 (проби молока та молокопродуктів у кількості 15-16 см (г) та 90-96 см первинно селективного збагаченого середовища - половинного бульйону Фрезера), послідуючим інкубуванням отриманої суспензії упродовж 20-21 годин за температури 28±1 °C та наступним вторинним збагаченням: після первинного збагачення отриману культуру у кількості 3 3 0,2-0,4 см переносять у пробірку, в якій міститься 20-22 см вторинно збагаченого середовища (бульйон Фрезера), потім інкубують середовище з посівами упродовж 48-50 годин за температури 37 °C, у подальшому проводять посів із первинно (10-11 см) та вторинно (1,5-2,0 3 см ) збагаченої культури на селективне середовище ПАЛКАМ-агар, щоб отримати чітко відокремлені колонії Listeria monocytogenes упродовж 22±2 годин за температури 34±1 °C у вигляді маленьких сіро-зелених чи оливково-зелених колоній, діаметром 1,5-2 мм, інколи з 1 UA 115758 U 5 10 15 20 25 30 чорним ореолом, та через 44±2 годин за температури 35±1 °C - у формі зелених колоній діаметром 1,5-2 мм із впалим центром та чорним ореолом навколо. Приклад 2. Для розробки методу використовують дослідну суспензію, яка готується у 3 3 співвідношенні 1:8 (проби молока та молокопродуктів у кількості 30-31 см (г) та 240-248 см первинно селективного збагаченого середовища - половинного бульйону Фрезера), послідуючим інкубуванням отриманої суспензії упродовж 24-25 годин за температури 29±1 °C та наступним вторинним збагаченням: після первинного збагачення отриману культуру у кількості 3 3 0,1-0,2 см переносять у пробірку, в якій міститься 10-12 см вторинно збагаченого середовища (бульйон Фрезера), потім інкубують середовище з посівами упродовж 46-48 годин за 3 температури 38 °C, у подальшому проводять посів із первинно (6-8 см ) та вторинно 3 (3,5-4,0 см ) збагаченої культури на селективне середовище ПАЛКАМ-агар, щоб отримати чітко відокремлені колонії Listeria monocytogenes упродовж 23±2 годин за температури 35±1 °C у вигляді маленьких сіро-зелених чи оливково-зелених колоній, діаметром 1,5-2 мм, інколи з чорним ореолом, та через 45±2 годин за температури 37±1 °C - у формі зелених колоній діаметром 1,5-2 мм із впалим центром та чорним ореолом навколо. Приклад 3. Для розробки методу використовують дослідну суспензію, яка готується у 3 3 співвідношенні 1:5 (проби молока та молокопродуктів у кількості 10-11 см (г) та 50-55 см первинно селективного збагаченого середовища - половинного бульйону Фрезера), послідуючим інкубуванням отриманої суспензії упродовж 21-23 годин за температури 31±1 °C та наступним вторинним збагаченням: після первинного збагачення отриману культуру у кількості 3 3 0,05-0,06 см переносять у пробірку, в якій міститься 5-6 см вторинно збагаченого середовища (бульйон Фрезера), потім інкубують середовище з посівами упродовж 46-48 годин за 3 температури 37 °C, у подальшому проводять посів із первинно (5-6 см) та вторинно (2,5-3,0 см ) збагаченої культури на селективне середовище ПАЛКАМ-агар, щоб отримати чітко відокремлені колонії Listeria monocytogenes упродовж 24±2 годин за температури 37±1 °C у вигляді маленьких сіро-зелених чи оливково-зелених колоній, діаметром 1,5-2 мм, інколи з чорним ореолом, та через 46±2 годин за температури 37±1 °C - у формі зелених колоній діаметром 1,52 мм із впалим центром та чорним ореолом навколо. Порівняльна оцінка результатів випробування вищезазначених способів удосконалення горизонтального методу виявлення Listeria monocytogenes у молоці та молокопродуктах до прототипу наведені у таблиці 1. Таблиця 1 Порівняння способів удосконаленого горизонтального методу виявлення Listeria monocytogenes у молоці та молокопродуктах до прототипу № Показники, що порівнюються Прототип п/п 1. Приготування дослідної суспензії: 3 Кількість молока, молокопродуктів, см або г 25,0 Кількість половинного бульйону Фрезера, 225 3 см 1:9 Співвідношення 2. Отримання первинно збагаченої культури: Інкубування отриманої суспензії за 30 °C температури 24 Експозиція, год. 2 1 Приклади 2 3 15-16 90-96 1:6 30-31 240-248 1:8 10-11 50-55 1:5 28±1 °C 20-21 29±1 °C 24-25 31±1 °C 21-23 UA 115758 U Продовження таблиці 1 3. Вторинне збагачення культури: Кількість культури після первинного 3 збагачення, см 3 Кількість бульйону Фрезера, см 4. Інкубування середовища Фрезера із посівом за температури Експозиція, год. 0,1 10 0,2-0,4 20-22 0,1-0,2 10-12 0,05-0,06 5-6 35 або 37 °C 48±2 35 °C 48-50 38 °C 46-48 37 °C 46-48 5. Посів на чашки первинно збагаченої 10-12 10-11 6-8 культури: Оксфорд- ПАЛКАМ- ПАЛКАМ3 Кількість культури, см агар агар агар Середовище 30±1 °C 34±1 °C 35±1 °C Інкубування за температури 24 22±2 23±2 Експозиція, год. 6. Ідентифікація колоній Listeria 1 мм 1,5-2, 1,5-2, monocytogenes: сіруватого колонії колонії Розмір колоній, мм кольору, маленькі маленькі Забарвлення колоній через 24 год. оточені сіро-зелені сіро-зелені чорними чи оливкочи ореолами во-зелені, оливковоінколи з зелені, чорним інколи з ореолом чорним ореолом 5-6 ПАЛКАМагар 37±1 °C 24±2 1,5-2, колонії маленькі сірозелені чи оливковозелені, інколи з чорним ореолом 3,5-4,0 2,5-3,0 ПАЛКАМ- ПАЛКАМагар агар 37±1 °C 37±1 °C 45±2 46±2 7. Посів на чашки вторинно збагаченої 10-12 1,5-2,0 культури: Оксфорд- ПАЛКАМКількість культури, см агар агар Середовище 35 або 35±1 °C Інкубування за температури 37 °C 44±2 Експозиція, год. 48±2 8. Ідентифікація колоній Listeria 2 мм, 1,5-2 мм, 1,5-2 мм, monocytogenes: колонії колонії колонії Розмір колоній, мм темніють, зелені із зелені із Забарвлення колоній через 48 год. зеленкувавпалим впалим тий центром та центром та відтінок з чорним чорним чорним ореолом ореолом ореолом та западинами центрами 9. Швидкість визначення досліду, год. 118 год. 114-115год. 115-116 год. 10. Стабільність показників по удосконаленому 94,2 90,1 78,9 горизонтальному методу виявлення Listeria monocytogenes у молоці, молокопродуктах, % 11. Співвідношення результатів досліджень 89,5-92,2 81,3-83,0 85,4-87,0 щодо визначення наявності сальмонел у молоці, молокопродуктах, у % 12. Співвідношення результатів досліджень 87,1-89,0 82,5-85,1 87,3-89,3 щодо визначення наявності стафілококів у молоці, молокопродуктах, у % 1,5-2 мм, колонії зелені із впалим центром та чорним ореолом 113114год. 99,8 97,5-98,9 97,8-99,0 Дані таблиці 1 свідчать, що більш достовірні дані у порівнянні з результатами досліджень щодо визначення наявності сальмонел у молоці, молокопродуктах - у 97,5-98,9 % [3] та до 3 UA 115758 U 5 результатів досліджень щодо визначення наявності стафілококів у молоці, молокопродуктах - у 97,8-99,0 % [4] були отримані при застосуванні методу за прикладом № 3. Також найвища стабільність показників по удосконаленому горизонтальному методу виявлення Listeria monocytogenes у молоці та молокопродуктах була за прикладом № 3-99,8 %. Використовуючи метод за прикладом № 3, ми провели виявлення Listeria monocytogenes у молоці та молокопродуктах удосконаленим горизонтальним методом на 67 пробах: молоко сире (уміст жиру 3,7 %) - 10 проб; молоко пастеризоване (уміст жиру 2,8 %) - 10 проб; вершки - 6 проб; вершки пастеризовані - 5 проб; сир кисломолочний - 6 проб; сир твердий - 7 проб; сир плавлений - 8 проб; масло вершкове - 9 проб; спред - 6 проб. Результати наведені у таблиці 2. 10 Таблиця 2 Показники удосконаленого горизонтального методу виявлення Listeria monocytogenes у молоці та молокопродуктах за прикладом № 3 № Перелік видів Виявлення Listeria monocytogenes за забарвленням та розміром п/п досліджуваних проб молока колоній за прикладом № 3 та молокопродуктів Кількість Наявність колоній Listeria Кількість Відсутність проб monocytogenes проб колоній Listeria monocytogenes Молоко сире (уміст жиру Через 24±2 год. колонії n=8 Характерних 1. n=3 3,7 %), n=10 маленькі (1,5-2,0 мм) сіроколоній Listeria зелені чи оливково-зелені, monocytogenes Молоко пастеризоване 2. n=0 n=10 інколи з чорним ореолом. не виявлено (уміст жиру 2,8 %), n=10 Через 46±2 год. колонії (1,53. Вершки, n=6 n=2 n=4 2,0 мм) зеленого кольору із 4. Вершки пастеризовані, n=5 n=0 n=5 впалим центром та чорним 5. Сир кисломолочний, n=6 n=2 n=4 ореолом 6. Сир твердий, n=7 n=1 n=6 7. Сир плавлений, n=8 n=3 n=5 8. Масло вершкове, n=9 n=2 n=7 9. Спред, n=6 n=1 n=5 15 20 25 Проведеними дослідженнями встановлено, що були виявлені колонії Listeria monocytogenes через 24±2 години маленькі розміром 1,5-2,0 мм сіро-зеленого чи оливково-зеленого кольору, інколи з чорним ореолом; через 46±2 год. - зеленого кольору із впалим центром та чорним ореолом у наступних пробах молока та молокопродуктах: у 3-х пробах молока сирого та сиру плавленого; у 2-х пробах вершків, сиру кисломолочного та масла вершкового; у 1 пробі сиру твердого та спреду. У пробах молока та вершках пастеризованих характерних колоній Listeria monocytogenes не було виявлено. Ці дані були стабільними та достовірними, отже, ці показники можна використовувати при оцінюванні безпечності молока та молокопродуктів. Крім того, слід зазначити, що метод є економним, простим у виконанні, а його результати дають конкретні якісні показники по забарвленню та розміру колоній Listeria monocytogenes. Метод за прикладом № 3 нами пропонується як якісний спосіб удосконалення горизонтального методу виявлення Listeria monocytogenes у молоці та молокопродуктах поряд з іншими методами визначення їх безпечності (визначення загальної кількості мікроорганізмів (КМАФАнМ), визначення бактерій групи кишкової палички, сальмонел, стафілококів) [5]. Метод має перевагу перед існуючими якісними методами визначення безпечності молока та молокопродуктів тому, що результати мають достовірні показники за забарвленням та розміром колоній Listeria monocytogenes. 30 35 Джерела інформації: 1. Молоко та молочні продукти. Методи мікробіологічного контролювання: ДСТУ 7357:2013. К.: Мінекономрозвитку України, 2014. - 35 с. (Національний стандарт України). 2. Мікробіологія харчових продуктів та кормів для тварин. Горизонтальний метод виявлення та підрахування Listeria monocytogenes. Частина 1. Метод виявлення (ISO 11290-1:1996, ITD): ДСТУ ISO 11290-1:2003. - К.: Держспоживстандарт України, 2005. - 18 с. (Національний стандарт України). 4 UA 115758 U 5 10 3. Мікробіологія харчових продуктів і кормів для тварин. Горизонтальний метод виявлення Salmonella: ДСТУ EN 12824:2004. К.: Держспоживстандарт України, 2005. - 20 с. (Національний стандарт України). 4. Мікробіологія харчових продуктів і кормів для тварин. Горизонтальний метод підрахування коагулазопозитивних стафілококів. Частина 1. Метод з використовуванням агарового середовища Беард-Паркера (ISO 6888-1:1999, ITD): ДСТУ ISO 6888-1:2003. - К.: Держспоживстандарт України, 2005. - 10 с. (Національний стандарт України). 5. Івченко В.М. Довідник мікробіологічних методів дослідження харчових продуктів і кормів для тварин згідно з міжнародними стандартами / [В.М. Івченко, В.В. Шарандак, О.І. Горбатюк та ін.] - Біла Церква, 2006. - 264 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 25 Горизонтальний спосіб виявлення Listeria monocytogenes у молоці та молокопродуктах, який відрізняється тим, що використовують дослідну суспензію, яка готується у співвідношенні 1:5 3 3 (проби молока та молокопродуктів у кількості 10-11 см (г) та 50 55 см первинно селективного збагаченого середовища - половинного бульйону Фрезера), з послідуючим інкубуванням отриманої суспензії упродовж 21-23 годин за температури 31±1 °C та наступним вторинним 3 збагаченням: отриману культуру у кількості 0,05-0,06 см переносять у пробірку, в якій міститься 3 5-6 см вторинно збагаченого середовища (бульйону Фрезера), потім проводять інкубування середовища з посівами упродовж 46-48 годин за температури 37 °C, та в подальшому 3 3 проводять посів із первинно (5-6 см ) та вторинно (2,5-3,0 см ) збагаченої культури на селективне середовище ПАЛКАМ-агар для отримання чітко відокремлених колонії Listeria monocytogenes діаметром 1,5-2 мм упродовж 24±2 годин за температури 37±1 °C у вигляді маленьких сіро-зелених чи оливково-зелених колоній, інколи з чорним ореолом, та через 46±2 годин за температури 37±1 °C - у формі зелених колоній із впалим центром та чорним ореолом навколо. Комп’ютерна верстка О. Гергіль Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5