Горизонтальний спосіб виявлення salmonella у молоці та молокопродуктах

Реферат: Горизонтальний спосіб виявлення Salmonella у молоці та молокопродуктах, при якому використовують дослідну суспензію, яка готується у співвідношенні 1:5. Виконують інкубування отриманої суспензії упродовж 16±2 годин за температури 35±1 °C та селективне концентрування. Отриману культуру у кількості 0,06-0,07 см переносять у пробірку, в якій 3 міститься 5-6 см середовища RV та витримують у термостаті за температури 41±1 °C 3 упродовж 23±2 годин. Далі переносять отриману культуру у кількості 5,0-5,1 см у колбу, що 3 містить 50-51 см середовища селеніту цистину та витримують у термостаті за температури 35±1 °C упродовж 23±2 годин. Здійснюють посів отриманої культури із двох середовищ шляхом селективного концентрування за допомогою електронного контуру на поверхню чашки Петрі у 3 кількості 2,0-2,5 см , що містить тверде селективне середовище - феноловий червоний брильянтовий зелений агар-агар та витримують за температури 35±1 °C упродовж 23±2 годин, щоб отримати ізольовані типові колонії Salmonella червоного кольору при зміні середовища з рожевого на червоний колір. UA 115759 U (12) UA 115759 U UA 115759 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до сільського господарства, зокрема до ветеринарної медицини, і може бути використана для удосконалення горизонтального методу виявлення Salmonella у молоці та молокопродуктах при встановленні їх безпечності у виробничих лабораторіях на потужностях з переробки, виробництва, реалізації і зберігання молока та молокопродуктів, у бактеріологічних відділах державних лабораторіях ветеринарної медицини. За результатами цього методу можна отримати якісні показники при удосконаленні горизонтального методу виявлення Salmonella у молоці та молокопродуктах. Аналогом корисної моделі є спосіб визначення загальної кількості мікроорганізмів у молоці та молокопродуктах згідно з ДСТУ 7357:2013 [1], який базується на особливості аеробів та факультативних анаеробів рости на живильному агарі за температури 37±0,5 °C з утворенням колоній та послідуючим їх підрахунком. Недоліком даного методу є те, що він довготривалий, громіздкий і значні грошові затрати на живильний агар. Крім цього даний метод дає похибку від 25 до 45 %. Прототипом корисної моделі є горизонтальний метод виявлення Salmonella у молоці та молокопродуктах [2], у якому застосовують великий об'єм середовища попереднього концентрування (буферизованої лептонної води) і для дослідження береться вихідна суспензія, що готується у співвідношенні 1:10 (маса проби молока, молокопродуктів до об'єму середовища попереднього концентрування). Недоліком даного методу є те, що він громіздкий, з підвищеною вартістю середовищ, довго тривалістю інкубування у селективних середовищах. Крім цього даний метод дає похибку у 15-20 %. В основу даної корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб удосконалення горизонтального методу виявлення Salmonella у молоці та молокопродуктах шляхом зміни кількості використовуваної дослідної суспензії, яка готується у співвідношенні 1:5 (проби молока 3 3 та молокопродуктів у кількості 10-11 см (г) та 50-55 см середовища попереднього концентрування (буферизованої пептонної води), послідуючим інкубуванням отриманої суспензії упродовж 16±2 годин за температури 35±1 °C та наступним селективним 3 концентруванням: отриману культуру у кількості 0,06-0,07 см переносять у пробірку, в якій 3 міститься 5,0-5,1 см середовища RV (середовище хлориду малахітового зеленого Раппапорта3 3 Васіліадіса) та 5-6 см цієї отриманої культури також переносять у колбу, що містить 50-51 см середовища селеніту цистину. Витримують ці два засіяних середовища відповідно у термостаті за температури 41±1 °C упродовж 23±1 годин та за температури 35±1 °C упродовж 23±1 годин, потім здійснюють посів отриманої культури із двох середовищ за допомогою електронного 3 контуру на поверхню чашки Петрі у кількості 2,0-2,5 см , що містить тверде селективне середовище - феноловий червоний - брильянтовий зелений агар-агар та витримують за температури 35±1 °C упродовж 23±2 годин, щоб отримати ізольовані типові колонії Salmonella червоного кольору при зміні середовища з рожевого на червоний колір. Поставлена задача вирішується тим, що використовують дослідну суспензію, яка готується у 3 3 співвідношенні 1:5 (проби молока та молокопродуктів у кількості 10-11 см (г) та 50-55 см середовища попереднього концентрування (буферизованої пептонної води), послідуючим інкубуванням отриманої суспензії упродовж 16±2 годин за температури 35±1 °C та наступним 3 селективним концентруванням: отриману культуру у кількості 0,06-0,07 см переносять у 3 пробірку, в якій міститься 5-6 см середовища RV (середовище хлориду малахітового зеленого Раппапорта-Васіліадіса) та витримують у термостаті за температури 41±1 °C упродовж 23±2 3 3 годин. Також 5,0-5,1 см отриманої цієї культури переносять у колбу, що містить 50-51 см середовища селеніту цистину та витримують у термостаті за температури 35±1 °C упродовж 23±2 годин. Потім здійснюють посіви отриманої культури із двох середовищ шляхом селективного концентрування за допомогою електронного контуру на поверхню чашки Петрі у 3 кількості 2,0-2,5 см , що містить тверде селективне середовище - феноловий червоний брильянтовий зелений агар-агар та витримують за температури 35±1 °C упродовж 23±2 годин, щоб отримати ізольовані типові колонії Salmonella червоного кольору при зміні середовища з рожевого на червоний колір. Етапи вирішення поставленої задачі наведено у нижчезазначених прикладах. Приклад 1. Для розробки методу використовують дослідну суспензію, яка готується у 3 3 співвідношенні 1:9 (проби молока та молокопродуктів у кількості 15-16 см (г) та 135-144 см середовища попереднього концентрування (буферизованої лептонної води), послідуючим інкубуванням отриманої суспензії упродовж 20±2 годин за температури 28:11 °C та наступним 3 селективним концентруванням: отриману культуру у кількості 0,2-0,4 см переносять у пробірку, 3 в якій міститься 20-22 см середовища RV (середовище хлориду малахітового зеленого Раппапорта-Васіліадіса) та інкубують у термостаті за температури 35±1 °C упродовж 48±2 3 годин. Також 8,0-8,1 см отриманої цієї культури переносять у колбу, що містить 80-81 см 1 UA 115759 U 5 10 15 20 25 30 35 40 середовища селеніту цистину та інкубують у термостаті за температури 28±1 °C упродовж 20±2 годин. Потім здійснюють посіви отриманої культури із двох середовищ шляхом селективного концентрування за допомогою електронного контуру на поверхню чашки Петрі у кількості 2,5-3,0 см, що містить тверде селективне середовище - феноловий червоний-брильянтовий зелений агар-агар та витримують за температури 34±1 °C упродовж 25±2 годин, щоб отримати ізольовані типові колонії Salmonella червоного кольору при зміні середовища з рожевого на червоний колір. Приклад 2. Для розробки методу використовують дослідну суспензію, яка готується у 3 3 співвідношенні 1:7 (проби молока та молокопродуктів у кількості 20-21 см (г) та 140-147 см середовища попереднього концентрування (буферизованої пептонної води), послідуючим інкубуванням отриманої суспензії упродовж 24±2 годин за температури 29+1 °C та наступним 3 селективним концентруванням: отриману культуру у кількості 0,1-0,2 см переносять у пробірку, 3 в якій міститься 10-12 см середовища RV (середовище хлориду малахітового зеленого Раппапорта-Васіліадіса) та інкубують у термостаті за температури 38±1 °C упродовж 46±2 3 3 годин. Також 6,0-6,1 см отриманої цієї культури переносять у колбу, що містить 60-61 см середовища селеніту цистину та інкубують у термостаті за температури 29±1 °C упродовж 24±2 годин. Потім здійснюють посіви отриманої культури із двох середовищ шляхом селективного концентрування за допомогою електронного контуру на поверхню чашки Петрі у кількості 3,5-4,0 см, що містить тверде селективне середовище - феноловий червоний - брильянтовий зелений агар-агар та витримують за температури 39±1 °C упродовж 23±2 годин, щоб отримати не типові колонії для Salmonella блідо-рожевого кольору при не зміні середовища з рожевого на червоний колір. Приклад 3. Для розробки методу використовують дослідну суспензію, яка готується у 3 3 співвідношенні 1:5 (проби молока та молокопродуктів у кількості 10-11 см (г) та 50-55 см середовища попереднього концентрування (буферизованої пептонної води), послідуючим інкубуванням отриманої суспензії упродовж 16±2 годин за температури 35±1 °C та наступним 3 селективним концентруванням: отриману культуру у кількості 0,06-0,07 см переносять у пробірку, в якій міститься 5-6 см середовища RV (середовище хлориду малахітового зеленого Раппапорта-Васіліадіса) та інкубують у термостаті за температури 41±1 °C упродовж 23±2 3 3 годин. Також 5,0-5,1 см отриманої цієї культури переносять у колбу, що містить 50-51 см середовища селеніту цистину та інкубують у термостаті за температури 35±1 °C упродовж 23±2 годин. Потім здійснюють посіви отриманої культури із двох середовищ шляхом селективного концентрування за допомогою електронного контуру на поверхню чашки Петрі у кількості 2,0-2,5 3 см , що містить тверде селективне середовище - феноловий червоний - брильянтовий зелений агар-агар та витримують за температури 35±1 °C упродовж 23±2 годин, щоб отримати ізольовані типові колонії Salmonella червоного кольору при зміні середовища з рожевого на червоний колір. Порівняльна оцінка результатів випробування вищезазначених способів удосконалення горизонтального методу виявлення Salmonella у молоці та молокопродуктів до прототипу наведені у таблиці 1. 2 UA 115759 U Таблиця 1 Порівняння способів удосконаленого горизонтального методу виявлення Salmonella у молоці та молокопродуктів до прототипу Приклади № Показники, що Прототип п/п порівнюються 1 2 3 1. Приготування дослідної суспензії: Кількість молока, молокопродуктів, 25,0 15-16 20-21 10-11 3 см 250 135-144 140-147 50-55 або г 1:10 1:9 1:7 1:5 Кількість буферизованої пептонної 3 води, см Співвідношення 2. Витримування вихідної суспензії в термостаті: 35 або 37 °C 28±1 °C 29±1 °C 35±1 °C За температури 16-20 20±2 24±2 16±2 Експозиція, год. 3. Селективне концентрування 1: 3 Кількість культури, см 0,1 0,2-0,4 0,1-0,2 0,06-0,07 Кількість RV 10 20-22 10-12 5-6 3 середовища, см 4. Інкубування середовища RV із 42 °C посівом за температури 24, і якщо 35 °C 38 °C 41±1 °C Експозиція, год. необхідно 48 48±2 46±2 23±2 5. Селективне концентрування 2: 3 Кількість культури, см 10 8,0-8,2 6,0-6,2 5,0-5,1 Кількість середовища селеніту 100 80-82 60-62 50-51 3 цистину, см 6. Інкубування середовища селеніту 35 або 37 °C 28±1 °C 29±1 °C 35±1 °C цистину із посівом за температури 24 і більше 20±2 24±2 23±2 Експозиція, год. до 42 7. Посів на чашки Петрі отриманої культури після селективного 3,0 2,5-3,0 3,5-4,0 2,0-2,5 концентрування 1: Феноловий Феноловий Феноловий Феноловий 3 Кількість культури, см червоний червонийчервонийчервоний Середовище тверде селективне брильянтовий брильянтовий брильянтовий брильянтовий Інкубування за температури зелений агар- зелений агар- зелений агар- зелений агарЕкспозиція, год. агар агар агар агар 35 або 37 °C 34±1 °C 39±1 °C 35±1 °C 24 і більше 25±2 23±2 23±2 до 48 8. Ідентифікація колоній Salmonella: ізольовані ізольовані ізольовані ізольовані Забарвлення колоній через 24 год. типові типові типові типові колонії колонії колонії колонії червоного червоного червоною червоного кольору кольору кольору кольору 3 UA 115759 U Продовження таблиці 1 9. 10. 11. 12. 13. 14. 5 10 Посів на чашки Петрі отримано культури після селективного концентрування 2: 3 Кількість культури, см Середовище Інкубування за температури Експозиція, год. 3 2,5-3,0 3,5-4,0 2,0-2,5 Феноловий Феноловий Феноловий Феноловий червоний червоний червоний червоний брильянтови брильянтов брильянтовий брильянтов й зелений ий зелений зелений ий зелений агар-агар агар-агар агар-агар агар-агар 35 або 37 °C 34±1 °C 39±1 °C 35±1 °C 24 і більше 25±2 23±2 23±2 до 48 Ідентифікація колоній Salmonella: ізольовані ізольовані не типові ізольовані Забарвлення колоній типові типові колонії типові через 24 год. колонії колонії блідоколонії червоного червоного рожевого червоного кольору кольору кольору кольору Швидкість визначення досліду, год. 110-120 год. 104±2 95±2 85±2 Стабільність показників по 88,5 81,3 67,4 99,8 удосконаленому горизонтальному методу виявлення Salmonella у молоці, молокопродуктах, % Співвідношення результатів 89,0-91,9 86,1-88,3 71,5-75,0 98,9-99,3 досліджень щодо визначення наявності лістерій у молоці, молокопродуктах, у % Співвідношення результатів 87,1-89,2 83,7-87,5 66,1-69,7 98,4-99,2 досліджень щодо визначення наявності стафілококів у молоці, молокопродуктах, у % Дані таблиці 1 свідчать, що більш достовірні дані у порівнянні з результатами досліджень щодо визначення наявності лісі ері й у молоці, молокопродуктах - у 98,9-99,3 % [3] та до результатів досліджень щодо визначення наявності стафілококів у молоці, молокопродуктах - у 98,4-99,2 % [4] були отримані при застосуванні методу за прикладом № 3. Також найвища стабільність показників по удосконаленому горизонтальному методу виявлення Salmonella у молоці та молокопродуктах була за прикладом № 3-99,8 %. Використовуючи метод за прикладом № 3, ми провели виявлення Salmonella у молоці та молокопродуктах удосконаленим горизонтальним методом на 67 пробах: молоко сире (уміст жиру 3,7 %) - 10 проб; молоко пастеризоване (уміст жиру 2,8 %) - 10 проб; вершки - 6 проб; вершки пастеризовані - 5 проб; сир кисломолочний - 6 проб; сир твердий - 7 проб; сир плавлений - 8 проб; масло вершкове - 9 проб; спред - 6 проб. Результати наведені у таблиці 2. 15 4 UA 115759 U Таблиця 2 Показники виявлення удосконаленого горизонтального методу виявлення Salmonella у молоці та молокопродуктах за прикладом № 3 № п/п 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 5 10 15 20 25 30 35 Перелік видів проб досліджуваного молока і молокопродуктів Молоко сире (уміст жиру 3,7 %), n=10 Молоко пастеризоване (уміст жиру 2,8 %), n=10 Вершки, n=6 Вершки пастеризовані, n=5 Сир кисломолочний, n=6 Сир твердий, n=7 Сир плавлений, n=8 Масло вершкове, n=9 Спред, n=6 Виявлення Salmonella за забарвленням та розміром колоній за прикладом № 3 Відсутність Кількість Наявність колоній Кількість колоній проб Salmonella проб Listerіа monocytogenes n=7 n=1 n=4 n=0 n=2 n=2 n=3 n=4 n=3 n=3 Ізольовані типові колонії червоного кольору Salmonella виявлено n=9 n=2 n=5 n=4 n=5 n=5 n=5 n=3 Характерних ізольованих типових колоній червоного кольору Salmonella не виявлено Проведеними дослідженнями встановлено, що були виявлені ізольовані типові колонії червоного кольору Salmonella через 23±2 години за температури 35±1 °C у наступних пробах молока та молокопродуктах: у 7 пробах молока сирого; у 4-х пробах вершків та масла вершкового; у 3-х пробах сиру плавленого та середах; у 2-х пробах сиру кисломолочного та сиру твердого і у 1 пробі молока пастеризованого. У вершках пастеризованих характерних колоній червоного кольору Salmonella не було виявлено. Ці дані були стабільними та достовірними, отже, ці показники можна використовувати при оцінюванні безпечності молока та молокопродуктів. Крім цього слід зазначити, що метод є економним, простим у виконанні, а його результати дають конкретні якісні показники по червоному забарвленню ізольованих типовий колоній Salmonella. Метод за прикладом № 3 нами пропонується як якісний спосіб удосконалення горизонтального методу виявлення Salmonella у молоці та молокопродуктах поряд з іншими методами визначення їх безпечності (визначення загальної кількості мікроорганізмів (КМАФаМ), визначення бактерій групи кишкової палички, лістерій, стафілококів) [5]. Метод має перевагу перед існуючими якісними методами визначення безпечності молока та молокопродуктів тому, що результати мають достовірні показники за червоним забарвленням ізольованих типових колоній Salmonella. Джерела інформації: 1. Молоко та молочні продукти. Методи мікробіологічного контролювання: ДСТУ 7357:2013. К.: Мінекономрозвитку України 2014. - 35 с. (Національний стандарт України). 2. Мікробіологія харчових продуктів і кормів для тварин. Горизонтальний метод виявлення Salmonella: ДСТУ EN 12824:2004. - К.: Держспоживстандарт України, 2005. - 20 с. (Національний стандарт України). 3. Мікробіологія харчових продуктів та кормів для тварин. Горизонтальний метод виявлення та підрахування Listeria monocylogenes. Частина 1. Метод виявлення (ISO 11290-1:1996, ITD): ДСТУ ISO J 1290-1:2003. - К.: Держспоживстандарт України, 2005. - 18 с. (Національний стандарт України). 4. Мікробіологія харчових продуктів і кормів для тварин. Горизонтальний метод підрахування коагулазопозитивних стафілококів. Частина 1. Метод з використовуванням агарового середовища Беард-Паркера (ISO 6888-1:1999, ITD): ДСТУ ISO 6888-1:2003. - К.: Держспоживстандарт України, 2005. - 10 с. (Національний стандарт України). 5. Івченко В.М. Довідник мікробіологічних методів дослідження харчових продуктів і кормів для тварин згідно з міжнародними стандартами / [В.М. Івченко, В.В. Шарандак, О.І. Горбатюк та ін.] - Біла Церква, 2006. - 264 с. 5 UA 115759 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 15 Горизонтальний спосіб виявлення Salmonella у молоці та молокопродуктах, який відрізняється тим, що використовують дослідну суспензію, яка готується у співвідношенні 1:5 (проби молока 3 3 та молокопродуктів у кількості 10-11 см (г) та 50-55 см середовища попереднього концентрування (буферизованої пептонної води), з послідуючим інкубуванням отриманої суспензії упродовж 16±2 годин за температури 35±1 °C та наступним селективним концентруванням, отриману культуру у кількості 0,06-0,07 см переносять у пробірку, в якій 3 міститься 5-6 см середовища RV (середовище хлориду малахітового зеленого РаппапортаВасіліадіса) та витримують у термостаті за температури 41±1 °C упродовж 23±2 годин, далі 3 3 переносять отриману культуру у кількості 5,0-5,1 см у колбу, що містить 50-51 см середовища селеніту цистину та витримують у термостаті за температури 35±1 °C упродовж 23±2 годин, у послідуючому здійснюють посів отриманої культури із двох середовищ шляхом селективного концентрування за допомогою електронного контуру на поверхню чашки Петрі у кількості 2,0-2,5 3 см , що містить тверде селективне середовище - феноловий червоний - брильянтовий зелений агар-агар та витримують за температури 35±1 °C упродовж 23±2 годин, щоб отримати ізольовані типові колонії Salmonella червоного кольору при зміні середовища з рожевого на червоний колір. 20 Комп’ютерна верстка О. Гергіль Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6