Спосіб удосконалення горизонтального методу виявлення listeria monocytogenes у м’ясі забійних тварин, птиці та м’ясопродуктах

Реферат: Спосіб удосконалення горизонтального методу виявлення Listeria monocytogenes у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах. Використовують дослідну суспензію, яка готується у 3 співвідношенні 1:5 (проби м'яса та м'ясопродуктів у кількості 10-11 г та 50-55 см первинно селективного збагаченого середовища - половинного бульйону Фрезера), з послідуючим інкубуванням отриманої суспензії упродовж 21-23 годин за температури 31±1 °C та наступним 3 вторинним збагаченням: отриману культуру у кількості 0,05-0,06 см переносять у пробірку, в 3 якій міститься 5-6 см вторинно збагаченого середовища (бульйону Фрезера), потім проводячи інкубування середовища з посівами упродовж 46-48 годин за температури 37 °C, та 3 3 подальшому проведенні посіву із первинно (5-6 см ) та вторинно (2,5-3 см ) збагаченої культури на селективне середовище ПАЛКАМ-агар. UA 109383 U (12) UA 109383 U UA 109383 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до сільського господарства, зокрема до ветеринарної медицини, і може бути використана для удосконалення горизонтального методу виявлення Listeria monocytogenes у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах при встановленні їх безпечності у виробничих лабораторіях на потужностях з переробки, реалізації і зберіганні м'яса та м'ясопродуктів, у бактеріологічних відділах державних лабораторіях ветеринарної медицини. За результатами цього методу можна отримати якісні показники при удосконаленні горизонтального методу виявлення Listeria monocytogenes у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах. Аналогом корисної моделі є спосіб визначення загальної кількості мікроорганізмів, згідно з ГОСТ 9958-81 [1], який базується на особливості аеробів та факультативних анаеробів рости на живильному агарі за температури 37±0,5 °C з утворенням колоній та послідуючим їх підрахунком. Недоліком даного методу є те, що він довготривалий, громіздкий і значні грошові затрати на живильний агар. Крім того, даний метод дає похибку від 25 до 45 %. Прототипом корисної моделі є горизонтальний метод виявлення Listeria monocytogenes [2], у якому застосовують великий об'єм первинно та вторинно селективних рідких збагачених середовищ (половинний бульйон Фрезера та бульйон Фрезера) і для дослідження береться вихідна суспензія, що готується у співвідношенні 1:9 (маса проби м'яса, м'ясопродуктів до об'єму селективного первинно збагаченого середовища). Недоліком даного методу є те, що він громіздкий, з підвищеною вартістю середовищ, реактивів та інкубування в селективному середовищі Оксфорд-агарі за температури 30 °C прийнятна лише для кормів. Крім цього даний метод дає похибку у 10-15 %. В основу корисної моделі поставлено задачу - розробити спосіб удосконалення горизонтального методу виявлення Listeria monocytogenes у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах шляхом використання дослідної суспензії, яка готується у співвідношенні 1:5 (проби м'яса та м'ясопродуктів у кількості 10-11 г та 50-55 см первинно селективного збагаченого середовища - половинного бульйону Фрезера), послідуючого інкубування отриманої суспензії упродовж 21-23 годин за температури 31±1 °C та наступного вторинного 3 збагачення: після первинного збагачення отриману культуру у кількості 0,05-0,06 см 3 переносять у пробірку, в якій міститься 5-6 см вторинно збагаченого середовища (бульйон Фрезера), потім інкубують середовище з посівами упродовж 46-48 годин за температури 37 °C, 3 у подальшому проводять посів із первинно (5-6 см ) та вторинно (2,5-3 см) збагаченої культури на селективне середовище ПАЛКАМ-агар, щоб отримати чітко відокремлені колонії Lisieria monocytogenes упродовж 24±2 годин за температури 37±1 °C у вигляді маленьких сіро-зелених чи оливково-зелених колоній, діаметром 1,5-2 мм, інколи з чорним ореолом, через 48 год. - у формі зелених колоній діаметром 1,5-2 мм із запалим центром та чорним ореолом навколо. Задача вирішується тим, що використовують дослідну суспензію, яка готується у 3 співвідношенні 1:5 (проби м'яса та м'ясопродуктів у кількості 10-11 г та 50-55 см первинно селективного збагаченого середовища половинного бульйону Фрезера), з послідуючим інкубуванням отриманої суспензії упродовж 21-23 годин за температури 31±1 °C та наступним вторинним збагаченням: після первинного збагачення отриману культуру у кількості 0,05-0,06 3 3 см переносять у пробірку, в якій міститься 5-6 см вторинно збагаченого середовища (бульйон Фрезера), потім інкубують середовище з посівами упродовж 46-48 годин за температури 37 °C, 3 3 у подальшому проводять посів із первинно (5-6 см ) та вторинно (2,5-3 см ) збагаченої культури на селективне середовище ПАЛКАМ-агар, щоб отримати чітко відокремлені колонії Listeria monocytogenes упродовж 24±2 годин за температури 37±1 °C у вигляді маленьких сіро-зелених чи оливково-зелених колоній, діаметром 1,5-2 мм, інколи з чорним ореолом, та через 46±2 год. за температури 37±1 °C - у формі зелених колоній діаметром 1,5 2 мм із запалим центром та чорним ореолом навколо. Етапи вирішення даної задачі наведено у нижчезазначених прикладах. Приклад 1. Для розробки методу використовують дослідну суспензію, яка готується у співвідношенні 1:6 (проби м'яса та м'ясопродуктів у кількості 15-16 г та 90-96 см первинно селективного збагаченого середовища половинного бульйону Фрезера), з послідуючим інкубуванням отриманої суспензії упродовж 20-21 годин за температури 28±1 °C та наступним вторинним збагаченням: після первинного збагачення отриману культуру у кількості 0,2-0,4 см 3 переносять у пробірку, в якій міститься 20-22 см вторинно збагаченого середовища (бульйон Фрезера), потім інкубують середовище з посівами упродовж 48-50 годин за температури 37 °C, 3 у подальшому проводять посів із первинно (10-11 см ) та вторинно (1,5-2,0 см) збагаченої культури на селективне середовище ПАЛКАМ-агар, щоб отримати чітко відокремлені колонії Listeria monocytogenes упродовж 22±2 годин за температури 34±1 °C у вигляді маленьких сірозелених чи оливково-зелених колоній, діаметром 1,5-2 мм, інколи з чорним ореолом, та через 1 UA 109383 U 5 10 15 20 25 30 44±2 год. за температури 35±1 °C - у формі зелених колоній діаметром 1,5-2 мм із запалим центром та чорним ореолом навколо. Приклад 2. Для розробки методу використовують дослідну суспензію, яка готується у співвідношенні 1:8 (проби м'яса та м'ясопродуктів у кількості 30-31 г та 240-248 см первинно селективного збагаченого середовища - половинного бульйону Фрезера), з послідуючим інкубуванням отриманої суспензії упродовж 24-25 годин за температури 29±1 °C та наступним 3 вторинним збагаченням: після первинного збагачення отриману культуру у кількості 0,1-0,2 см 3 переносять у пробірку, в якій міститься 10-12 см вторинно збагаченого середовища (бульйон Фрезера), потім інкубують середовище з посівами упродовж 46-48 годин за температури 38 °C, 3 у подальшому проводять посів із первинно (6-8 см) та вторинно (3,5-4,0 см ) збагаченої культури на селективне середовище ПАЛКАМ-arap, щоб отримати чітко відокремлені колонії Listeria monocytogenes упродовж 23±2 годин за температури 35±1 °C у вигляді маленьких сірозелених чи оливково-зелених колоній, діаметром 1,5-2 мм, інколи з чорним ореолом, та через 45±2 год. за температури 37±1 °C - у формі зелених колоній діаметром 1,5-2 мм із запалим центром та чорним ореолом навколо. Приклад 3. Для розробки методу використовують дослідну суспензію, яка готується у співвідношенні 1:5 (проби м'яса та м'ясопродуктів у кількості 10-11 г та 50-55 см первинно селективного збагаченого середовища - половинного бульйону Фрезера), з послідуючим інкубуванням отриманої суспензії упродовж 21-23 годин за температури 31±1 °C та наступним вторинним збагаченням: після первинного збагачення отриману культуру у кількості 0,05-0,06 3 3 см переносять у пробірку, в якій міститься 5-6 см вторинно збагаченого середовища (бульйон Фрезера), потім інкубують середовище з посівами упродовж 46-48 годин за температури 37 °C, 3 3 у подальшому проводять посів із первинно (5-6 см ) та вторинно (2,5-3,0 см ) збагаченої культури на селективне середовище ПАЛКАМ-агар, щоб отримати чітко відокремлені колонії Listeria monocytogenes упродовж 24±2 годин за температури 37±1 °C у вигляді маленьких сірозелених чи оливково-зелених колоній, діаметром 1,5-2 мм, інколи з чорним ореолом, та через 46±2 год. за температури 37±1 °C - у формі зелених колоній діаметром 1,5 2 мм із запалим центром та чорним ореолом навколо. Порівняльна оцінка результатів випробування вищезазначених способів удосконалення горизонтального методу виявлення Listeria monocytogenes у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктів до прототипу наведені у таблиці 1. Таблиця 1 Порівняння способів удосконаленого горизонтального методу виявлення Listeria monocytogenes у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктів до прототипу № п/п 1. 2. 3. Показники, що порівнюються Приготування дослідної суспензії: Кількість м'яса, м'ясопродуктів, г Кількість половинного 3 бульйону Фрезера, см Співвідношення Отримання первинно збагаченої культури: Інкубування отриманої суспензії за температури Експозиція, год. Вторинне збагачення культури: Кількість культури після первинного збагачення, 3 см Кількість бульйону 3 Фрезера, см 1 Приклади 2 3 25,0 15-16 30-31 10-11 225 90-96 240-248 50-55 1:9 1:6 1:8 1:5 30 °C 28±1 °C 29±1 °C 31±1 °C 24 20-21 24-25 21-23 0,1 0,2-0,4 0,1-0,2 0,05-0,06 10 20-22 10-12 5~6 Прототип 2 UA 109383 U Продовження таблиці 1 4. 5. 6. 7. 8. Інкубування середовища Фрезера із посівом за температури Експозиція, год. Посів на чашки первинно збагаченої культури: 3 Кількість культури, см Середовище Інкубування за температури Експозиція, год. Ідентифікація колоній L isteria monocytogenes: Розмір колоній, мм Забарвлення колоній через 24 год. Посів на чашки вторинно збагаченої культури: 3 Кількість культури, см Середовище Інкубування за температури Експозиція, год. Ідентифікація колоній Listeria monocytogenes: Розмір колоній, мм Забарвлення колоній через 48 год. Швидкість визначення досліду, год. Стабільність показників по удосконаленому горизонтальному методу 10. виявлення Listeria monocytogenes у м'ясі, мясопродуктах % співвідношення результатів досліджень 11. щодо визначення наявності сальмонел у м'ясі, м'ясопродуктах % співвідношення результатів досліджень 12. щодо визначення наявності стафілококів у м'ясі, м'ясопродуктах 9. 35 або 37 °C 35 °C 38 °C 37 °C 48±2 48-50 46-48 46-48 10-12 Оксфордагар 10-11 ПАЛКАМагар 6-8 ПАЛКАМагар 5-6 ПАЛКАМагар 30±1 °C 34±1 °C 35±1 °C 37±1 °C 24 22±2 23±2 24±2 1,5-2, колонії маленькі сірозелені чи оливковозелені, інколи з чорним ореолом 1,5-2, колонії маленькі сірозелені чи оливковозелені, інколи з чорним ореолом 1,5-2, колонії маленькі сірозелені чи оливковозелені, інколи 3 чорним ореолом 10-12 1,5-2,0 3,5-4,0 2,5-3,0 Оксфордагар 35 або37 °C ПАЛКАМагар 35±1 °C ГІАЛКАМагар 37±1 °C ПАЛКАМагар 37±1 °C 48±2 44±2 45±2 46±2 2 мм, колонії темніють, зеленкуватий відтінок з чорним ореолом та западинами центрами 1,5-2 мм, колонії зелені із запалим центром та чорним ореолом 1,5-2 мм, колонії зелені із запалим центром та чорним ореолом 1,5-2 мм, колонії зелені із запалим центром та чорним ореолом 118 год. 114-115 год. 115-116 год. 113-І 14 год. 93,1 91,2 90,3 99,8 90,9-91,9 82,7-83,2 85,1-87,6 95,2-97,9 88,8-89,9 84,2-86,4 86,9-89,1 97,0-98,5 1 мм сіруватого кольору, оточені чорними ореолами Дані таблиці 1 свідчать, що більш достовірні дані у порівнянні з результатами досліджень щодо визначення наявності сальмонел у м'ясі, м'ясопродуктах - у 95,2-97,9 % [3] та до 3 UA 109383 U 5 результатів досліджень щодо визначення наявності стафілококів у м'ясі, м'ясопродуктах - у 97,0-98,5 % [4] були отримані при застосуванні методу за прикладом № 3. Також найвища стабільність показників по удосконаленому горизонтальному методу виявлення Listeria monocytogenes у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах була за прикладом № 3-99,8 %. Використовуючи метод за прикладом № 3, ми провели виявлення Listeria monocytogenes у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах удосконаленим горизонтальним методом на 33 пробах: м'ясо яловичини - 6 проб; м'ясо свинини - 5 проб; м'ясо курей - 7 проб; ковбаса варена 5 проб; ковбаса варено-копчена 5 проб; ковбаса копчена - 5 проб; м'ясний балик - 3 проби. Результати наведені у таблиці 2. 10 Таблиця 2 Показники удосконаленого горизонтального методу виявлення Listeria monocytogenes у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах за прикладом № 3 № п/п Види м'яса забійних тварин, птиці та м'ясопродуктів 1. М'ясо яловичини, n=6 2. 3. 4. 6. М'ясо свинини, n=5 М'ясо курей, n=7 Ковбаса варена, n=5 Ковбаса варенокопчена, n=5 Ковбаса копчена, n=5 7. М'ясний балик, n=3 5. 15 20 25 30 35 Виявлення Listeria monocytogenes за забарвленням та розміром колоній за прикладом № 3 Відсутність Кількість Наявність колоній Listeria Кількість колоній Listeria проб monocytogenes проб monocytogenes Через 24±2 год. колонії n=2 n=4 маленькі n=2 (1,5-2,0мм) сіро n=3 Характерних n=2 -зелені чи оливковоn=5 колоній n=2 зелені, інколи з n=3 Listeria чорним ореолом. Через monocytogenes n=1 n=4 46±2 год. не виявлено n=1 колонії (1,5-2,0-мм) n=4 зеленого кольору із n=1 запалим центром та n=2 чорним ореолом Проведеними дослідженнями встановлено, що були виявлені колонії Listeria monocytogenes через 24±2 години маленькі розміром 1,5-2,0 мм сіро-зеленого чи оливково-зеленого кольору, інколи з чорним ореолом; через 46±2 год. - зеленого кольору із запалим центром та чорним ореолом у наступних пробах м'яса забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах: у 2 пробах м'яса яловичини, свинини, м'яса курей, ковбасі вареній та у 1 пробі ковбаси варено-копченої, ковбаси копченої, м'ясного балика. У інших пробах м'яса та м'ясопродуктах характерних колоній Listeria monocytogenes не було виявлено. Ці дані були стабільними та достовірними, отже, ці показники можна використовувати при оцінюванні безпечності м'яса забійних тварин, птиці та м'ясопродуктів. Крім цього, слід зазначити, що метод є економним, простим у виконанні, а його результати дають конкретні якісні показники по забарвленню та розміру колоній Listeria monocytogenes. Метод за прикладом № 3 нами пропонується як якісний спосіб удосконалення горизонтального методу виявлення Listeria monocytogenes у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах поряд з іншими методами визначення їх безпечності (визначення загальної кількості мікроорганізмів, визначення бактерій групи кишкової палички, сальмонел, стафілококів тощо) [5]. Метод має перевагу перед існуючими якісними методами визначення безпечності м'яса забійних тварин, птиці та м'ясопродуктів тому, що результати мають достовірні показники за забарвленням та розміром колоній Listeria monocytogenes. Джерела інформації: 1. Изделия колбасные и продукты из мяса. Методы бактериологического анализа: ГОСТ 9958-81. - М.: Госкомитет СССР по стандартам. 20 с. 2. Мікробіологія харчових продуктів та кормів для тварин. Горизонтальний метод виявлення та підрахування Listeria monocytogenes. Частина 1. Метод виявлення (ISO 11290-1:1996, ITD): ДСТУ ISO 11290-1:2003. - К.: Держспоживстандарт України, 2005. - 18 с. (Національний стандарт України). 4 UA 109383 U 5 10 3. Мікробіологія харчових продуктів і кормів для тварин. Горизонтальний метод виявлення Salmonella: ДСТУ EN 12824:2004. - К.: Держспоживстандарт України, 2005. - 20 с. (Національний стандарт України). 4. Мікробіологія харчових продуктів і кормів для тварин. Горизонтальний метод підрахування коагулазопозитивних стафілококів. Частина 1. Метод з використовуванням агарового середовища Беард-Паркера (ISO 6888-1:1999, ITD): ДСТУ ISO 6888-1:2003. - К.: Держспоживстандарт України, 2005. - 10 с. (Національний стандарт України). 5. Довідник мікробіологічних методів дослідження харчових продуктів і кормів для тварин згідно з міжнародними стандартами /В.Μ. Івченко, В.В. Шарандак, О.І. Горбатюк та ін. - Біла Церква, 2006. - 264 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 25 Спосіб удосконалення горизонтального методу виявлення Listeria monocytogenes у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах, який відрізняється тим, що використовують дослідну суспензію, яка готується у співвідношенні 1:5 (проби м'яса та м'ясопродуктів у кількості 10-11 г 3 та 50-55 см первинно селективного збагаченого середовища - половинного бульйону Фрезера), з послідуючим інкубуванням отриманої суспензії упродовж 21-23 годин за температури 31±1 °C 3 та наступним вторинним збагаченням: отриману культуру у кількості 0,05-0,06 см переносять у 3 пробірку, в якій міститься 5-6 см вторинно збагаченого середовища (бульйону Фрезера), потім проводячи інкубування середовища з посівами упродовж 46-48 годин за температури 37 °C, та 3 3 подальшому проведенні посіву із первинно (5-6 см ) та вторинно (2,5-3 см ) збагаченої культури на селективне середовище ПАЛКАМ-агар для отримання чітко відокремлених колонії Listeria monocytogenes діаметром 1,5-2 мм упродовж 24±2 годин за температури 37±1 °C у вигляді маленьких сіро-зелених чи оливково-зелених колоній, інколи з чорним ореолом, та через 46±2 годин за температури 37±1 °C - у формі зелених колоній із запалим центром та чорним ореолом навколо. Комп’ютерна верстка О. Гергіль Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5