Дигідразиди та їх похідні, які інгібують матричні функції днк

Дипдразиди та їх ПОХІДНІ загальної формули О X = -(СН2)т - ( т = 1-5), -CHR- (R = (R)-CH3-, (S)СНз-, (R)-(CH3)2CH-, (S)-(CH3)2CH- ), Y, Y' = тип I - тридин-2,6-ді-іл, тип II - піридин-2,5-ді-іл, які інгібують матричні функції ДНК Де п = 1, 2, ю Винахід відноситься до хімії біологічно активних сполук і може бути використаний при створенні противірусних препаратів Інгібування матричних функцій нуклеїнових кислот є ключовим моментом дії протипухлинних і проти інфекцій них препаратів і добре корелює з їх активністю (див Zimmer С, Puschendorf В, Grumcke Н, Chandra P, Venner H, Influence of netropsm and distamycm A on the secondary structure and template activity of DNA // Eur J Biochem -1971 - Vol 21 № 1 - P 269-278) ВІДОМІ біс-акридинові полинтеркалятори які інгібують ріст клітин експериментальних пухлинних ЛІНІЙ Але сполуки, які мають високу активність, мають також високу токсичність Нетоксичними є біс-акридини, які містять в лінкерному фрагменті амідні групи, загальної формули ю п. m - 2 - 4 (див L Р G Wakelm Polytunctional DNA intercalate agents // Medicinal Research reviews -1986 Vol 6, № 3 - P 275 - 340) Але ці сполуки мають низьку активність ВІДОМІ також комбілексини формули 52445 n-1-З які мають високу ефективність інгібування темплатної функції ДНК і високий рівень інгібування поділу пухлинних клітин (Baraldi P G , Balbom G , Caccian В , Guiotto A , MamVedmi S , Romagnoh R , Spalluto G , Thurston D E , Howard P W , Bianchi N , Rutighano C, Mischiati C, Gamban R Synthesis, in Vitro Antiproliterative Activity, and DNA-Bmdmg Properties of Hybrid Molecules Containing Pyrrolo[2Je][l,4]benzodiazepme and Minor-Groove-Binding Ohgopyrrole Carriers // J Med Chem -1999 -V 42, № 25 -P 5131 -5141) Але наведені сполуки мають високу цитотоксичність і не виявляють противірусної активності В основу винаходу поставлено завдання створити нові біс-штеркалятори, які містять в лінкерному фрагменті амідні зв'язки і забезпечують інгібування матричних функцій ДНК Поставлене завдання вирішене синтезом нових дипдразидів та їх похідних загальної формули н Де п= 1,2, X = -(СН2)т- ( т - 1 - 5), -CHR- (R = (R)-CH3-, (S)-CH3-, (R)-(CH3)2CH-, (S)-(CH3)2CH- ) Y, Y' = у тип 1 - тридин-2,6-ді-іл, тип II - тридин-2,5ДІ-ІЛ Задача вирішується введенням у лінкерний фрагмент біс-штеркалятора похідних пі-ридин2,6-дикарбоновоі та піридин-2,5-дикарбоновоі кислот та застосуванням пдразидної групи для приєднання штеркалятора Для оцінки здатності сполук інгібувати матричні функції ДНК застосовано метод інгібування полімеразної ланцюгової реакції, який добре корелює з противірусною та протипухлинною активностями Заявником синтезовані дипдразиди та їх ПОХІДНІ у КІЛЬКОСТІ 102 сполуки (див таблицю, де 1- 26 - ВИХІДНІ речовини, 27 - 128 - сполуки, що заявляються) Сполуки, що заявляються, одержують за такою схемою 49,4 (ІЧ-74, 76-85,87-% 97-JOS, ] № 117,11? 128 Приклади одержання дипдразидів та їх похідних Приклад 1 Піридин-2,6-дикарбоновоі кислоти дихлоранпдрид (3) Кип'ятять 12 годин суміш 1,67г (0,01 моль) шридин-2,6-дикарбоновоі кислоти 1мл диметилформаміду і 50мл тюнілхлориду Реакційну суміш випарюють у вакуумі до сухого стану Сухий залишок промивають Юмл петролейного етеру, екстрагують діетиловим етером Екстракт випарюють у вакуумі до сухого стану ФІЗИКОХІМІЧНІ властивості одержаної сполуки наведені в таблиці Приклад 2 Піридин-2,5-дикарбоновоі кислоти дихлоранпдрид (4) Одержують аналогічно тому, як описано в прикладі 1 ФІЗИКО-ХІМІЧНІ властивості одержаної сполуки наведені в таблиці Приклад 3 Піридин-2,6-дикарбоновоі кислоти диметиловий естер (5) 2,03г (0,01 моль) піридин2,6-дикарбоновоі кислоти дихлоранпдриду обробляють при кімнатній температурі 15мл сухого метанолу Після ПОВНОГО розчинення хлорангідриду суміш кип'ятять 15 хвилин і охолоджують в бані з льодом Осад, який випав, відфільтровують і перекристалізовують з метанолу ФІЗИКО-ХІМІЧНІ властивості одержаної сполуки наведені в таблиці Приклад 4 Піридин-2,5-дикарбоновоі кислоти диметиловий естер (16) Одержують аналогічно тому, як описано в прикладі 3 ФІЗИКО-ХІМІЧНІ властивості одержаної сполуки наведені и таблиці Приклад 5 Піридип-2,6-дикарбоновоі кислоти дипдразид (27) Розчиняють 1,95 диметилового естеру піридин-2,6-дикарбоновоі кислоти в Юмл киплячою метанолу і додають 2мл 100%-го пдразинпдрату Суміш кип'ятять 2 години, осад, що випав, відфільтровують, промивають па фільтрі гарячим метанолом (3x1 Омл) і висушують у вакуумі ФІЗИКО-ХІМІЧНІ властивості одержаної сполуки наведені в таблиці Приклад 6 Піридин-2,5-дикарбоновоі кислоти дипдразид (38) Одержують аналогічно тому, як описано в прикладі 5 ФІЗИКО-ХІМІЧНІ властивості одержаної сполуки наведені у таблиці Приклад 7 2,6-Біс-(акридин-9ілпдразинокарбонід)піридин (75) Кип'ятять 24 години суміш 1,95г (0,01 моль) піридин-2,6дикарбонової кислоти дипдразиду і 6,27г (0,03 моль) 9-метоксіакридину в 20мл метанолу Осад, що випав, відфільтровують, промивають па фільтрі гарячим метанолом (3x1 Омл) і висушують у вакуумі ФІЗИКО-ХІМІЧНІ властивості одержаної сполуки наведені в таблиці Приклад 8 2,5-Біс-(акридин-9ілпдразинокарбоніл)піридин (107) Одержують аналогічно тому, як описано в при 52445 кладі 7 ФІЗИКО-ХІМІЧНІ властивості одержаної сполуки наведені в таблиці Приклад 9 Етил 2-(6-етоксикарбонілметилкарбамоіл-2-піридшікарбоксамідо)-ацетат (6) До розчину 10г карбонату натрію і 5г бікарбонату натрію в 50мл води додають 20мл суміші хлористого метилену та діетилового етеру (1 1) Суміш охолоджують до 0°С і додають 10-ма порціями Зг (0,022 моль) пдрохлориду етилового естеру гліцин) До одержаної суміші додають при 0°С та інтенсивному перемішуванні розчин 2,03г (0,01 моль) дихлоранпдриду піридин-2,6-дикарбоновоі кислоти в Юмл суміші хлористого метилену і діетилового етеру (1 1) По закінченні додавання дають поступово температурі піднятися до кімнатної і перемішують 8 годин Після завершення перемішування додають 50мл хлористого метилену, органічний шар відокремлюють, водний шар екстрагують хлористим метиленом, об'єднані органічні шари промивають насиченим розчином хлориду натрію, висушують сульфатом натрію, розчинник випарюють у вакуумі до сухого стану ФізикоХІМІЧНІ властивості одержаної сполуки наведені в таблиці Аналогічно одержують сполуки 7 - 15, а також сполуки 17-26 ФІЗИКО-ХІМІЧНІ властивості одержаних сполук наведені в таблиці Приклад 10 N2, N6дипдразинокарбонілметил-2,6піридиндикарбоксаміду (28) Розчиняють 3,37г (0,01 моль) сполуки 6 в Юмл метанолу, додають 2 мл 100% пдразинпдрату і кип'ятять 8 годин Осад, що випав, відфільтровують, промивають па фільтрі льодяним метанолом (2x1 Омл) водою (Зх50мл) і висушують у вакуумі ФІЗИКО-ХІМІЧНІ властивості одержаної сполуки наведені таблиці Аналогічно одержують сполуки 29 - 37, а також сполуки 39 - 48 ФІЗИКО-ХІМІЧНІ властивості одержаних сполук наведені в таблиці Приклад 11 N2-riflpa3HHoN6 -{[2,7-ди-[2(діетиламшо) етокси]-9Н -9- флуорсніліденопдразинокарбо-ніл метил) -2,6піридиндикарбоксамід (50) Розчин 3,09г (0,01 моль) сполуки 28, 12,3г (0,03 моль) 2,7-ди-[2(діеІиламшо)етоксм]-9Н-9-флуорену і бмл (0,1 моль) льодяної оцтової кислоти кип'ятять у 25мл етанолу протягом 12 годин В реакційну суміш додають 250 мл 10% розчину аміаку та екстрагують бензолом (5х50мл) Екстракт промивають насиченим розчином хлориду натрію (2х50мл), висушують і бензол випарюють у вакуумі до сухого стану Сухий залишок екстрагують киплячим гептаном (2х50мл) Залишок с сполукою 50 Аналогічно одержують сполуки 49, 51 - 64 ФіЗИКО-ХІМІЧНІ властивості одержаних сполук наведені в таблиці Приклад 12 N2, Ы6-ди-{2,7-ди-[2(діетиламшо)етокси]-9Н-9флуореніліденопдразинокарбонілметил)-2,6міридиндикарбоксаміду (65) Гептановий екстракт, що отримано при синтезі сполуки 50, охолоджують до 0°С та відфільтровують осад, що випав Осад перекристалізовують з гептану ФІЗИКО-ХІМІЧНІ властивості одержаної сполуки наведені в таблиці Аналогічно одержують сполуки 66 - 74 та сполуки 97 - 106 ФІЗИКО-ХІМІЧНІ властивості одержа них сполук наведені в таблиці Приклад 13 Піридин-2,6-дикарбоновоі кислоти біс-[(акридин-9-іл-пдразинокарбоніл-метил)амід] (76) Кип'ятять 12 годин суміш 3,09г (0 01 моль) сполуки 28 і 4,8г (0,02 моль) 9-метоксіакридину в 50мл метанолу Осад, що одержано, відфільтровують з гарячої суміші, промивають на фільтрі гарячим метанолом (3x1 Омл) і висушують у вакуумі ФІЗИКО-ХІМІЧНІ властивості одержаної сполуки наведені в таблиці Аналогічно одержують сполуки 75, 77 - 85 і сполуки 107-117 ФІЗИКО-ХІМІЧНІ властивості одержаних сполук наведені в таблиці Приклад 14 Піридин-2 6-дикарбоновоі кислоти біс-[(антрацен-9-іл-метиленндразино-карбоніл метил)амід] (87) Кип'ятять 24 години суміш 3,09г (0,01 моль) сполуки 28, 6,19г (0,03 моль) антрацен-9-альдепду і 1,8мл льодяної оцтової кислоти в 50мл метанолу Гарячу суміш відфільтровують і відмивають надлишок антрацен-9-альдепду кип'ятінням в етанолі (5х25мл) з наступним фільтруванням гарячої суміші ФІЗИКО-ХІМІЧНІ властивості одержаної сполуки наведені в таблиці Аналогічно одержують сполуки 86, 88 96 та сполуки 118 128 ФІЗИКО-ХІМІЧНІ властивості одержаних сполук наведені в таблиці Приклад 15 Оцінка здатності сполук, що заявляються, інгібувати матричні функції ДНК проводилася методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), який добре корелює з противірусною дією сполук Для цього в пробірку вміщують 2,5мкл розчину прямого та зворотною праймерів, 2,5мкл розчину дезоксинуклеозидтрифосфатів нашаровують Юмкл розплавленого воску, так, щоб він повністю покривав розчин Па поверхню застиглого воску додають Юмкл ПЛР-буферу з ферментом ДНКполімеразою (Taq-полімераза), поверх реакційної суміші нашаровують 20мкл мінеральної олії, щоб запобігти випаровуванню і зберегти стабільність об'єму розчину На олію додають 5мкл розчину сполуки 65 та 5мкл позитивного контролю (тотальна ДНК вірусу простого герпесу І типу виділена з штаму Л2 методом фенольної екстракції з преципітаиіпо етанолом) Внаслідок цього утворюється стійка трифазна система Пробірку установлюють у термостат і нагрівають до 65°С, при цьому віск розтоплюється і підіймається уверх, а верхня і нижня фази перемішуються Після цього проводять ампліфікацію - багатократне збільшення числа копій специфічної ділянки ДНК, що каталізується Taq-полімеразою Ампліфікацію проводять в наступному режимі 4 хвилини при 95°С - один цикл, 1 хв при 95°С, 1 хв при 67°С 1 хвилина при 72°С - ЗО циклів, 2 хвилини при 72°С - один цикл, після чого зразок охолоджують до + 4°С і зберігають при даній температурі Наявність або відсутність реплікату визначають електрофорезом Для цього готують розчин робочого буфера для електрофорезу В мірну колбу на ЮООмл вносять вміст флакону з буфером для електрофорезу (ТВЕ), доводять до мітки дистильованою водою і ретельно перемішують до повного розчинення осаду Із застосуванням цього буферу готують 1,5%-й агарозний гель, вміщують його в конічну колбу і додають 15мкл розчину етидію броміду (з 52445 концентрацією 25мМ), обережно перемішуючи Розтоплену ага-розу охолоджують до 50°С і заливають на платформу (товщина шару ~ 4мм) з гребінкою Після застигання обережно виймають гребінку, а платформу переносять в електрофоретичну камеру і заливають 800мл буферу ТВЕ так, щоб він укривав гель шаром 3-4мм Далі 15мкл розчину продукту ампліфікації змішують з 5мкл розчину барвника (бромофеноловий синій) Електрофорез проводять 25 хв при 80 8 100В та кімнатній температурі Наявність реплікату визначають після електрофорезу за допомогою УФ-трансілюмінатора при опромінюванні ультрафіолетовим світлом з довжиною хвилі ЗЮнм В агарозному гелі смужка оранжевого кольору не з'явилася, що свідчить про відсутність реплікату Таким чином, речовина, що досліджується, інгібує матричну функцію ДНК л~ ~ (CHih №), (СНЛ (CHjfc в с D E сн, о Ас An 13 52445 Сполуки, що заявляються, можуть знайти застосування в медицині при створенні противірусних засобів, а також як зонди нуклеїнових кислот в лабораторних дослідженнях Запропоновані спо 14 луки мають противірусну активність, вони здатні штеркалювати в ДНК і підвищувати й термостабільність ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71