Фармацевтична композиція, що містить похідну гідроксамової кислоти, спосіб лікування з її використанням та протектор мітохондріального геному та/або мітохондрій

1 Фармацевтична композиція для захисту мітохондріального геному та/або мітохондрм від пошкоджень або для лікування захворювань, що пов'язані з такими пошкодженнями, яка включає від 0,1 до 95 мас % похідної пдроксамової кислоти формули І XR R1 R^A-C-N-O-CHJ-CH-CHJ-N де R1 є атомом водню або Сі 5 алкільною групою, R2 є атомом водню, С-і 5 алікільною групою, Сз 8 циклоалкільною групою або фенільною групою, яка необов'язково може бути заміщена гідроксильною або фенільною групою, або R1 та R2 разом з атомом азоту, до якого вони приєднані, утворюють п'яти-восьмичленне кільце, що може містити один або більше атом(ів) азоту, кисню або сірки, та вищезгадане кільце може бути сполучене з бензольним кільцем, R3 є атомом водню, фенільною групою, нафтильною групою або піридильною групою, причому вказані групи можуть бути заміщені одним або більше атомом(ами) галогену або Сі 4 алкоксильною(ими) групою (групами), Y є гідроксильною групою, X є аміногрупою, R утворює з В ХІМІЧНИЙ зв'язок, А є Сі 4 алкіленовою групою або ХІМІЧНИМ ЗВ'ЯЗКОМ або групою формули КИСЛОТИ, СПОСІБ ГЕНОМУ ТА/АБО (CH)m-(CH)n де R4 є атомом водню або фенільною групою, R5 є атомом водню або фенільною групою, m має значення 0, 1 або 2, п має значення 0, 1 або 2, або и фармацевтично прийнятної кислотноадитивної солі як активного інгредієнта у суміші з одним або більше традиційним(и) НОСІЄМ(НОСІЯМИ) 2 Фармацевтична композиція за п 1, яка відрізняється тим, що похідна пдроксамової кислоти являє собою сполуку формули II R 3 — ( С Н ) т — (СН) П N — О — СН,— СН—СН, Y •R2 П, де R1, R2, R3, R4, R5, т та п такі, як вказано в п 1, X являє собою аміногрупу, Y означає пдроксигрупу або и фармацевтично прийнятну кислотноадитивну сіль 3 Фармацевтична композиція за п 1 або п 2, яка відрізняється тим, що похідна пдроксамової кислоти являє собою сполуку формули II, де R1 та R2 разом з атомом азоту, до якого вони приєднані, утворюють піперидинову групу, m та п мають значення 0, X та Y такі, як вказано в п 2, або її фармацевтично прийнятну кислотно-адитивну сіль 4 Фармацевтична композиція за будь-яким з пунктів 1-3, яка відрізняється тим, що похідна пдроксамової кислоти являє собою О-(3-піперидино-2пдрокси-1-пропіл)нікотинамідооксим або його фармацевтично прийнятну кислотно-адитивну сіль 5 Застосування сполуки похідної пдроксамової кислоти формули І, де R, R1, R , R3, X, Y, А та В такі, як вказано у п 1, або її фармацевтично прийнятної адитивної солі як протектора мітохондріального геному та/або мітохондрій 6 Застосування за п 5, яке відрізняється тим, що похідна пдроксамової кислоти являє собою сполуку формули II, де R1, R2, R3, R4, R5, X, Y, m та п такі, як визначено в п 2, або и фармацевтично О 1 ю 57712 прийнятну адитивну сіль 7 Застосування за п 5 або п 6, яке відрізняється тим, що похідна пдроксамової кислоти являє со1 2 бою сполуку формули II, де R і R разом з атомом азоту, до якого вони приєднані, утворюють піперидинову групу, m та п мають значення 0, Хта У такі, як вказано в п 2 8 Застосування за будь-яким з пунктів 5-7, яке відрізняється тим, що похідною пдроксамової кислоти є О-(3-піперидино-2-пдрокси-1пропіл)нікотинамідоксим або його фармацевтично прийнятна кислотно-адитивна сіль 9 Спосіб лікування захворювань, пов'язаних з пошкодженнями мітохондріального геному та/або мітохондрій, при якому використовують фармацевтичну композицію за п 1, що як активний компонент містить похідну пдроксамової кислоти формули І або и фармацевтично прийнятну кислотноадитивну сіль 10 Спосіб за п 9, який відрізняється тим, що захворюванням, пов'язаним з пошкодженнями мітохондріального геному та/або мітохондрій, є міопатія та/або кардюмюпатія 11 Спосіб за п 9, який відрізняється тим, що захворюваннями, пов'язаними з пошкодженнями Винахід відноситься до фармацевтичних композицій, що корисних для захисту мітохондріального геному та/або мітохондрій від пошкоджень або для лікування захворювань, які пов'язані з такими пошкодженнями, причому ці композиції, включають похідну пдроксамової кислоти формули пою, де R1 є атомом водню або Сі 5 алкільною гру2 R є атомом водню, Сі 5 алкільною групою, Сз 8 циклоалкільною групою або фенільною групою, яка може бути заміщена гідроксильною або фенільною групами, або R1 та R2, сумісно з атомом азоту, до якого вони приєднані, утворюють п'яти-восьмичленне кільце, що може містити ще один або більше атом(ів) азоту, кисню або сірки, та вищезгадане кільце може бути сполучене з бензольним кільцем, R3 є атомом водню, фенільною групою, нафтильною групою або піридильною групою, причому вказані групи можуть бути заміщені одним або більше атомом(ами) галогену або Сі 4 алкоксильною(ними) групою (групами), У є гідроксильною групою, X є аміногрупою, R утворює з В ХІМІЧНИЙ зв'язок, А є Сі 4алкіленовою групою або ХІМІЧНИМ ЗВ'ЯЗ КОМ або групою формули мітохондріального геному та/або мітохондрій, є нейродегенеративні захворювання, зокрема, хвороба Альцгеймера, хвороба Паркінсона, хвороба Хантінгтона 12 Спосіб за будь-яким з пунктів 9-11, який відрізняється тим, що використовують фармацевтичну композицію за п 2, що як активний компонент містить похідну пдроксамової кислоти формули II або и фармацевтично прийнятну кислотно-адитивну сіль 13 Спосіб за будь-яким з пунктів 9-12, який відрізняється тим, що використовують фармацевтичну композицію за п 3, що як активний компонент містить похідну пдроксамової кислоти формули II, де 1 2 R та R разом з атомом азоту, до якого вони приєднані, утворюють піперидинову групу, m та п мають значення 0, Х т а У такі, як вказано в п 2, або її фармацевтично прийнятну кислотно-адитивну сіль 14 Спосіб за будь-яким з пунктів 9-13, який відрізняється тим, що використовують фармацевтичну композицію за п 4, що як активний компонент містить О-(3-піперидино-2-пдрокси-1пропіл)нікотинамідооксим або його фармацевтично прийнятну кислотно-адитивну сіль де R4 є атомом водню або фенільною групою, R5 є атомом водню або фенільною групою, m має значення 0, 1 або 2, п має значення 0, 1 або 2, або його фармацевтично придатну кислотну адитивну сіль в якості активного інгредієнта HU-P No 177 578 та його еквівалент US-P No 4,308,399 описує ПОХІДНІ пдроксамової кислоти, що відносяться до групи сполук формули І, які є корисними для лікування діабетичної анпопатм HU-P No 207 998 та його еквівалент Е-Р No 417 210 також описують галогеніди пдроксамової кислоти, що мають вибірковий бета-блокуючий ефект, таким чином, являються корисними для лікування діабетичної анпопатм Заявка HU-P No 2385/92, що опублікована під No Т/66350 описує Інші ПОХІДНІ пдроксамової кислоти, Ці ВІДОМІ сполуки можуть бути використані в лікуванні судинних деформацій, в основному, в терапії цукрового діабету Добре відомо, що геном ядра людських клітин кодує біля 10000 генів, але в цитоплазмі також існує невеликий, незалежний мітохондріальний геном /Wellace а/с/, Science, 256, 628-632 (1992)/ Мітохондріальний геном кодує всього ІЗ генів /Clayton, D А , Cell, 28, 693-705 (1982)/, але без них клітина нездатна вживати кисень, тому, як наслідок пошкоджень мітохондріального геному, клітина стає анаеробною На відміну від ядерного геному, мітохондріальний геном не володіє здатністю до репарації ДНК та мітохондріальна ДНК (мтДНК) не стабілізована пстонами, що робить мітохондріальні гени значно більш уразливими, ніж гени, що ко 57712 дуються ядром /Tzagoloff, A , Myer, А М , Aimu мітохондріального походження, Rev Biochem, 55, 249-285 (1986)/ Поглинання KSS (Синдром Кернса-Сайера) більш, ніж 90% кисню клітиною проходить у внутMERRF (міоклональна епілепсія та синдром рішній мітохондріальній мембрані, де, окрім норшорсткуватого червоного волокна) мального оксидування, також формується ВІЛЬНІ LHON (спадкова оптична нейропатія Лебера) радикали кисню/Stryer, L, Biochemistry, 4, видання, MELAS (мітохондріальна міопатія, енцефалоW Н Freeman and Co , New York, 1995/, Такі ВІЛЬНІ патія, лактозний ацитозта параліч-подібш епізоди) радикали можуть легко модифікувати мітохондріаХвороба Лея льні ДНК у безпосередній близькості від їх формуСРЕО (хронічна прогресивна зовнішня фтальвання Формування вільних радикалів реактивного мофлет) кисню значно підвищується, наприклад, під час Синдром Альпера реоксигенацм внаслідок ішемії, при якій підвищена Приклади залежних від віку дегенеративних концентрація вільних радикалів може призвести до захворювань, при яких пошкоджено мітохондріазначних та незворотних пошкоджень мітохондріальний геном льної ДНК /Marklund, S L , J Мої Cell Cardiol, 20, Нейродегенеративні захворювання, (Додаток II), 23-30 (1988)/ Навіть за нормальних Хвороба Альцгеймера, умов ВІЛЬНІ радикали спричиняють малі, але кумуХвороба Паркінсона, лятивні пошкодження мтДНК Тому, вірогідно, що ALS (амютрофний латеральний склероз) пошкодження мтДНК підвищуються з віком HD (Хвороба Хантінгтона), /Wellace, D C , Annu Rev Biochem, 61 1175-1212 Кардюмюпатм та ІНШІ міопатії (1992)/, хоча рівень пошкоджень залежить від інТаким чином, винахід відноситься до фармадивідуального організму, та що такі пошкодження цевтичних композицій, що містять від 0,1 до 95% мтДНК можуть легко приводити до розвитку карпо масі похідної пдроксамової кислоти формули І діомюпатм та нейродегенеративних захворювань у або и фармацевтичне придатної кислотної адитилюдей похилого віку /Cortopassi, G А , Arnheim, N , вної солі в якості активного інгредієнта у суміші з Nucleic Acids Res , 18, 6027-6033 (1990)/ одним або більше традиційним(ми) носієм(носіями) Через порушення метаболізму енергії клітини пошкодження мітохондріального геному можуть В описі та формулі Сі 5 з алкільною групою є, викликати тяжкі захворювання, таю як міопатії наприклад, метальна, етильна, н-пропільна, ізо/Luft, R, Proc Natl, Acad Sci, USA, 91, 8731-8738 пропільна, н-бутильна або н-пентильна групами, (1994)/, розширені або гіпертрофічні кардюмюпапереважно, метильна або етильна група тіі/Qzawa, Т et al, Biochem Biophys Res Сз 8 циклоалкільною групою є, наприклад, цикCommun , Г70 830-836 (1990)/, надалі можуть гралопропільна, циклопентильна, циклогексильна, ти роль в КІЛЬКОСТІ нейродегенеративних захворюциклогептильна або циклооктильна групи, перевавань, що збільшуються з віком (таких, як хвороба жно, циклопентильна або циклогексильна групи Паркінсона, хвороба Хантінгтона, хвороба АльцП'яти-восьмичленним кільцем, що містить геймера) та у важких симптомах діабету /Luft R один або більше гетероатомів), може бути, наприпроцитована публікація/ клад, пірол, піразол, імідазол, оксазол, тіазол, пірідин, гаршазин пірімідин, піперазин, морфолін, інДо деяких з вище перерахованих захворювань дол, ХІНОЛІН і т ш кільце (наприклад, міопатії) застосовується лікування з антиоксидантами (лікування коферментом 0 та Атомом галогену є, наприклад, атом фтору, вітаміном С) /Shoffner, J М , Wallace, D С , Adv хлору, брому або йод> переважно, атом хлору або Hum Genet, 19, 267-330 (1990), Це лікування приброму носить результат тільки зрідка Подальші тести Фармацевтично прийнятними кислотними адилікування були проведеш, щоб уникнути пошкотивними солями сполук формули І є кислотні адиджень реоксигенацм, що наступила після ішемії тивні солі, які утворені з фармацевтичне прийнятзастосовуючи антиоксидантну та метаболічну тених неорганічних кислот, таких, як соляна, сірчана рапію з використанням ліпоамідів Ліпоаміди кориІ Інші або з фармацевтичне прийнятними органічгують пошкодження серця, що викликані ішемією, з ними кислотами, такими, як оцтова кислота, фуоднієї сторони, шляхом їх антиоксидантного ефекмарова кислота, молочна кислота і т ш ту, з другої сторони, шляхом з позитивного впливу Переважна підгрупа сполук формули І складана мітохондріальний метаболізм /Sumegi, Balazs et ється з похідних пдроксамової кислоти формули al Biochem J , 297, 109-113 (1994)/, Без глибокого R' R' знання процесу пошкодження до сих пір не було розроблено ефективної терапії Базуючись на вищевикладеному, існує потреба у розвитку фармацевтичного продукту, який може захистити мітохондріальний геном від пошкоджень та також, запобігти таким пошкодженням Було виявлено, що сполуки формули І здатні захищати мітохондрільний геном від пошкоджень, таким чином, вони корисні для захисту мітохондріального геному та/або мітохондріи від пошкоджень або для лікування захворювань, які пов'язані з такими пошкодженнями Прикладами захворювань де R1, R2, R3 R4 R5, m та п такі, як позначено у відношенні формули І, X представляє собою атом галогену або аміногрупу, Y означає пдроксигрупу Особливо переважними сполуками формули II являються ті, в яких R1 та R2, сумісно з атомом азоту, до якого вони приєднані, формують піперидиногрупу, R3 означає піридильну групу, m та п мають значення О, X є таким, як позначено вище 57712 З цих сполук переважними зразками є наступні 0-(3-піперидино-2-пдрокси-1 пропіл)нікотинамідоксим (сполука "В") Сполуки формули І можуть бути виготовлені у ВІДПОВІДНОСТІ із способами, які ВІДОМІ З HU-P Nos 177 578 Фармацевтична композиція винаходу містить від 0 1 до 95% по масі, переважно, від 1 до 50% по масі, особливо переважно, від 5 до 30% по масі похідної пдроксамової кислоти формули І або її фармацевтичне прийнятної кислотної адитивної солі в якості активного інгредієнту та один або більше традиційний носій (носії) Фармацевтичні композиції винаходу можуть бути корисними для перюрального, парентерального або ректального введення або для локального застосування, та можуть бути твердими або рідкими Тверді фармацевтичні композиції, що підходять для перорального введення, можуть бути порошками, капсулами, таблетками, що вкриті плівкою таблетками, мікрокапсулами і т ш , та можуть містити зв'язуючі агенти, такі, як желатин, сорбітол, полі (вшілпіролідон) і т ш , наповнюючи агенти, такі, як лактоза глюкоза, крохмаль, фосфат кальція і т ш , додаткові субстанції для таблетування такі, як стеарат магнію, тальк, полі(етиленгліколь), силікат та т ш , зволожуючі агенти, такі, як лаурилсульфат натрію і т д в якості носія Рідкими фармацевтичними композиціями, що підходять для перорального введення можуть бути розчини, суспензії або емульсії та можуть містити, наприклад, суспендуючі агенти, такі як желатин, карбоксиметилцелюлоза і т д , емульгатори, такі, як моноолеат сорбітана і т ш , розчинники, такі, як вода, олії, пропіленгліколь, етанол і т ін , презерванти, такі, як метил-п-пдроксибензоат і т д в якості носія Фармацевтичні композиції, що підходять для парентерального введення, в основному, містять в якості активного інгредієнта стерильні розчини активного інгредієнта Дозування форм, які перераховані вище, як і ІНШІ лікарські форми, ВІДОМІ ЯК такі, див , наприклад, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co , Easton, USA (1990) Фармацевтичні композиції винаходу містять, звичайно, одиничну дозу Типова щоденна доза для дорослих пацієнтів складає від 0,1 до ЮООмг сполуки формули І або його фармацевтичне придатні кислотні адитивні солі Вищезгадана доза може бути введена в одній порції або у декількох порціях Реальна доза залежить від багатьох факторів та визначається лікарем Фармацевтичні композиції винаходу виготовляють шляхом змішування сполуки формули І або його фармацевтичне прийнятної кислотної адитивної солі з одним або більше носієм (носіями), та шляхом перетворення отриманої суміші в фармацевтичну композицію відомим способом Корисні способи ВІДОМІ з літератури, наприклад, з Remington Pharmaceutical Sciences Інше перетворення винаходу заключається у застосуванні сполуки формули І, де R, R1, R2, R , X, Y, А та В такі, як позначено у відношенні фор 8 мули І, або и фармацевтичне прийнятної кислотної адитивної солі, можливо, у суміші з одним або більше носієм (носіями), ЩО часто використовуються у фармацевтичних композиціях для виготовлення фармацевтичної композиції, яка корисна для захисту мітохондріального геному та/або мітохондрій від пошкоджень Інше перетворення винаходу заключається у 1 застосуванні сполуки формули І, де R, де R , R , 5 R X, Y, А та В такі, як позначено у відношенні формули І або и фармацевтично прийнятної кислотної адитивної солі, можливо, у суміші з одним або більше носієм (носіями), ЩО часто використовуються в фармацевтичних композиціях для виготовлення фармацевтичної композиції, яка корисна для лікування захворювань, що пов'язані з пошкодженнями мітохондріального геному та/або мітохондрм Такі захворювання включають, особливо, мюпатію, кардюмюпатію, як і нейродегенеративні захворювання, такі як хвороба Альцгеймера, хвороба Паркінсона або хвороба Хантінгтона Переважною реалізацією винаходу є застосування похідних пдроксамової кислоти формули II, де R1, R2, R3, R4, R , X, Y, m та п такі, як позначено у відношенні формули II, або їх фармацевтично прийнятних кислотних адитивних солей Найбільш переважною реалізацією винаходу є застосування сполук формули II, де R1 та R2, сумісно з атомом азоту, до якого вони приєднані, формують піперидинову групу, m та п мають значення О, X та Y, як вказано у відношенні формули II, або їх фармацевтичне прийнятних кислотних адитивних солей Особливо переважною реалізацією винаходу є застосування 0-(3-гаперидино-2-пдрокси-1 пропіл)нікотинамідоксима або його фармацевтично прийнятної кислотної адитивної солі Тести in vitro Захисний ефект похідних пдроксамової кислоти формули І на мітохондріальний геном тестували за їх здатністю захищати окисне фосфорилювання in vitro Теоретичною основою тестів є те, що енергія, яка необхідна для клітин, продукується аденозин-трифосфатом (АТФ), який синтезується в мітохондріях Порушення транспорту субстрату, цитратного шляху, дефект респіраторних комплексів та порушення зв'язку в окисному фосфорилюванні призводить до порушень постачання клітини енергією В тесті окисне фосфорилювання було пошкоджено шляхом обробки клітин дріжджів Saccharomyces cerevisiae та еритролейкемічних клітин К562 людини тепловим шоком, та визначали захисний ефект сполуки "В" Відомо, ЩО ОДИН З пошкоджуючих ефектів теплового шоку, який розвивається зразу ж, тобто на протязі декількох хвилин, зачіплює мітохондрію шляхом відриву дихального ланцюгу від окисного фосфорилювання Тести з використанням ХІМІЧНИХ роз'єднувачів показали, що протони, які внесені ферментними комплексами дихального ланцюгу під час електронного транспорту у простір між внутрішньою та зовнішньою мембранами мітохондрій, попадають назад у внутрішній простір внаслідок ефекту роз'єднувачів, таким чином, АТФ не синтезується Внаслідок теплового шоку відбувається схожий процес, який призводить до швидкого зни 57712 ження живлення клітин енергією Матеріали, що використовувались в тестуванні Культура клітин Saccharomyces cerevisiae Гаплоїдну клітинну ЛІНІЮ типу S288C культивували в середовищі YPG, що містить 1% дріжджового екстракту, 2% пептона та 3% гліцерину Культуру вирощували при встряхувашп у рідкому середовищі на водяній бані при 25°С, при аеробних умовах Культура К562 Клітинну ЛІНІЮ К562 еритролейкемічного типу походження від клітин хронічної мієлогенної лейкемії людини культивували у рідкому середовищі RPMI 1640 у присутності 10% телячої сироватки при температурі 37°С, у суміші рідкого газу, що містить 95% повітря та 5% диоксида вуглецю ОЛІГОМІЦИН Виробник карбоніл ціанід-тхлорофенілпдразона (СІ-ССР) Sigma Chemicals Co, St Louis, USA)/ Споживання кисню вимірювали слідуючим чином КЛІТИНИ на їх логарифмічній фазі росту центрифугували та, у випадку Saccharomyces cerevisiae, брали у десятикратній КІЛЬКОСТІ середовища YPG що містить 1% манози замість 2% гліцерину У випадку К562, після розділення клітини брали у концентрації 4x106 клітин/мл у середовищі RPMI 1640, що містить 20мМ HEPES Споживання кисню вимірювали у термостатичній кюветі на 2мл електродом Клера Деталі метода описані у наступній статті Patnarca, E J та Maresca, В Experimental Cell Research, 190 57-64 (1990) Стимуляція респіраторного рівню представлена у % з використанням формули [(V c l c c p /V o l l 9 )-1]x100 За одну годину до теплового шоку, після сепарації, до середовища додавали, ВІДПОВІДНО, 10 5 , 2 5x10 , 5x10 М сполуки "В" та розчинник (PBS, тобто фізіологічний розчин хлориду натрію, що містить фосфатний буфер) Тепловий шок проводили, витримуючи культуру при 42°С на протязі 5 хвилин замість звичайної температури 25°С У випадку клітин К562 культуру витримували при 48°С на протязі 10 хвилин замість звичайної температури 37°С Під час експериментів було відмічено, що тепловий шок значно роз'єднував електронний транспортний ланцюг від синтезу АТФ та у Saccharomyces cerevisiae тау клітин К 562 Стримані результати показані у Таблиці 1 та 2, де спосіб лікування показаний разом зі стимуляцією в % та отриманим захистом в % Таблиця 1 Захист окисного фосфорилювання у Saccaromyces cerevisiae Лікування 25( >С 42( 'С+розчинник 42( >С+1х105М сполуки "В" 42( >С+2 5х10 5 М сполуки "R" 42( >С+5х105М сполуки'Б" Стимуляція, Захист, % % 99±13 8±2 0 33±5 27 47±4 43 43±5 38 10 Таблиця 2 Захист окисного фосфорилювання К562 Лікування ( 37 >С ( 48 'С+розчинник ( 5 48 >С+1х10 М сполуки "В" ( 3 48 >С+2,5х10 М сполуки "R" ( 5 48 >С+5х10 М сполуки "В" Стимуляція, Захист, % % 117±22 27±3 0 70±8 36 95±11 57 97±11 58 Дані Таблиць 1 та 2 демонструють, що використання сполуки "В" незаперечне забезпечувало підвищений захист клітин шляхом запобігання роз'єднання мітохондріальних дихальних комплексів В досліджуваному проміжку оптимальною концентрацією сполуки "В" була 25 мікромоль У доповнення до збереження певної клітинної функції, найбільш можливе непряме запобігання формування вільних радикалів кисню 3 цього ми можемо заключити, що сполука "В" забезпечує захист проти пошкоджень мітохондріального геному Захист мітохондріи від роз'єднання, що індуковане тепловим шоком За нормальних умов дихальні комплекси виштовхують протони під час окислення NADH, створюючи протонний градієнт з двох сторін внутрішньої мітохондріальної мембрани Цей протонний градієнт забезпечує енергію для синтезу АТФ з АДФ та неорганічного фосфату Протони здатні знову увійти до простору внутрішньої мембрани тільки через F-iF-юАТФазу, утилізуючи енергію протонного градієнту для синтезу АТФ з АДФ та неорганічного фосфату (Рі) У відсутність АДТ або Рі підвищується протонний градієнт та дихальні комплекси, і мітохондріальне поглинання кисню інгібується Однак, якщо існує яке-небудь у внутрішній мембрані, протони здатні знову увійти до простору внутрішньої мембрани, та енергія протонного градієнту не утилізується F-iF-юАТФазою, і, таким чином, мітохондріальне окислення стає незалежним від АДФ (мітохондрм стають роз'єднаними) Добре відомо, що тепловий стрес може індукувати роз'єднання мітохондріального окислення від продукції мітохондріальної енергії (АТФ), що є наслідком теплового стресу, який індукований пошкодженням внутрішньої мембрани мітохондріи У пошкоджених областях мембран протони протікають зворотно з міжмембранного простору до компартаменту внутрішньої мембрани, таким чином, мітохондріальне окислення стає незалежним від АТФ Для тесту, мітохондрм ізолювали з контрольних пацюків або з пацюків, що оброблені 40мг/кг сполуки "В" за 6 годин до отримання, яке здійснювали як описано Sumegi et al , J Biol Chem , 259, 8748 (1984) Поглинання кисню визначали електродом Кларка у камері при 370С Визначали рівень поглинання кисню у присутності 5мМ АДФ, як і у відсутності АДФ, як показано в Таблиці 3, для як необроблених мітохондріи, так і для мітохондріи, що прешкубовані на протязі 8 хвилин при 42°С 11 57712 12 Таблиця З Захист мітохондрій від роз'єднання, яке індуковане нагріванням Обробка Без обробки 8хв при 43°С Рівень поглинання мітохондріями кисню присутності або відсутності АДФ Контрольні тварини 6±0 8 2 7±1 1 Тварини, що оброблені сполу- fi „ , г 5 0±1 2 кою "В" Таблиця 4 Захист холшерпчних нейронів сполукою "В" від індукованого пероксидом водню клітинного лізису Мітохондрм Показані дані є середнім значенням ± стандартна похибка за трьома експериментами Із таблиці 3 видно, що за нормальних умов мітохондріальне окислення у присутності АДФ відбувається, приблизно у 6 разів швидше, ніж у середовищі яке вільне від АДФ, демонструючи добре поєднання між мітохондріальним окисленням та синтезом АТФ Однак, тепловий стрес значно знижує об'єднання мітохондрій, та в контрольних випадках це значення знижувалось (2,7), але в мітохондріях з тварин, попередньо оброблених сполукою "В", все ж зберігалось відносно високий рівень об'єднання (5 1), Ці дані демонструють, що сполуки формули І та, особливо, сполука "В" захищали продукцію мітохондріальної енергії (синтез АТФ) від пошкодження, що викликане тепловим стресом Захист холшерпчних нейронів від індукованої пероксидом водню клітинної дегенерації Добре відомо, що пероксид водню наносить окисне пошкодження клітинам із-за утворення у клітинах вільних радикалів кисню Тому, індуковане пероксидом водню клітинне пошкодження може бути використано у якості загальної моделі дегенерації нейронів Були використані гібрид SN6 10 2 2, клітинна ЛІНІЯ септальних нейронів N18TG2+ED15 /Hammond et al , Science, 234, 1237 (1986)/ для вивчення захисного ефекту сполук формули І проти вільних радикалів кисню, які викликають клітинне пошкодження, що г головним механізмом у більшості нейродегенеративних захворювань Для тесту клітини розділили на дві групи на платі на 96 лунок Одну з груп підтримували у середовищі, що містить сполуку "В" (40мг/л), іншу підтримували в основному середовищі Обробку починали через 24 години після розділу Обидві групи оброблювали середовищем, що містить різні концентрації пероксиду водню Тест на виживання проводили через 48 годин після періодів обробки Тест на виживання Видаляли середовище з лунок, клітини промивали стерильним PBS та потім до кожної лунки додавали 150цг субстрату лужної фосфатази, розчиненого у 150цг свіжого диетиноламінного буферу (рН 9,8) Плашки шкубували при 300°С та зупиняли реакцію додаванням до кожної лунки 50 |ш пдрохлорида натрію Поглинання вимірювали при 405нм рідером плат Dynatech ELISA, для визначення фону використовували периферичні лунки кожної плати, що містять тільки середовище Отримані результати показані у Таблиці 4 Середовище контроль бОмМ Н2О2 120мМН2О2 100% 11 ±2% 8±3% Середовище зі сполукою "В" 100% 63±4% 52±5% Таблиця 4 демонструє, що протестована сполука формули І (тобто сполука "В") ефективно захищає холшерпчні нейрони від індукованого пероксидом водню лізису клітин Оскільки пероксид водню убиває клітини завдяки утворенню великої КІЛЬКОСТІ вільних радикалів кисню, сполука "В" здатна захищати нейрони при любих захворюваннях, коли нейрональне пошкодження пов'язане з вільними радикалами кисню Тому сполуки формули І можуть успішно використовуватись при хворобі Паркінсона, амютрофічному латеральному склерозі (ALS), хвороби Хантінгтона та при різному слабкому розумінні змішаного походження /Life Sciences, 56, 1151-1171 (1995)/ Тести in vivo Захисний ефект на мітохондріальний геном похідних пдроксамової кислоти формули І тестували in vivo на пацюках Пацюків Vistar оброблювали щоденно AZT (З'-азидотимідином, виробник Sigma Chemicals Inc) у дозі 50мг/кг на протязі 14 днів Певні тестові групи оброблювали AZT у комбінації зі сполукою "В" (щоденна доза 40мг/кг) Проводили різні виміри під часта після обробки 1) ЕКГ Schiller AT-6 використовували для моніторингу кардіологічної функції тварин, на всіх чотирьох кінцівках Параметри ЙОГ оцінювали, використовуючи стандартний метод, що описаний у технічній літературі /Kawai, С , Takatsu, T New EnglJMed, 293, 592 (1975), Angelakos, E T , Bernardim, P J Appl Physiol , 18,261-263 (1963)/ Ми визначили інтервали RR, PR, TQ та точки депресій J Отримані результати показані у Таблиці 5, де значення представлені як середні 5 вимірів ± стандартне відхилення Таблиця 5 Ефект сполуки "В" на індуковані відхилення кардіологічних функцій (кардюмюпатій) Обробка RR PR QT(ms) J(mm) Перед оброб- 1 7 4 ± 1 2 5 3 ± 2 _01±01 7 0 ± 2 кою Обробка напротязі 14 днів з щоденною 284±16 82±3 112±9 1,1±0,1 дозою 50мг/кг AZT Обробка на протязі 14 днів з щоденною 1 6 1 ± 2 4 4 7 ± 6 7 6 ± 5 дозою 50мг/кг AZT та 40мг/кг сполуки"В" 13 57712 14 дили також сполуку "В" в щоденній дозі 40мг/кг AZT, параметри серця повертались до нормальноДані Таблиці 5 демонструють, що, як наслідок го рівня, що свідчить про те, що сполук "В" захивпливу обробки AZT у порівнянні з контрольною щає серце від відхилень, що індуковані AZT групою, частота серцевих скорочень у тварин була значно збільшена (RR) та також були збільшені 2) Визначали дихальну активність тварин Для інтервали PQ Далі значення QT значно збільшуцього визначали активності NADH цитохром С валось та на піках І та VL, які представляють осоксидоредуктази, цитохром оксидази та цитрат новну мускульну масу лівого шлунку, були винайсинтази методами, що описані у технічній літерадеш значні точки депресії J (більше 0,1mV) Ці турі(8ішіе§і, Balazs et al , Clm Chim Acta , 192, 9параметри характеризують мюкардіальну ішемію, 18, (1990)/ (NADH нікотинової кислоти аденін дищо розвивається, або порушення поглинання киснуклеотид, відновлена форма) Отримані резульню Проте, у випадках, коли до AZT пацюкам ввотати показані в Таблиці 6 Таблиця 6 Вплив сполук "А" та "В" на зниження дихальної активності, що індуковане Обробка Контрольна група AZT AZT+сполука" В" Цитохром оксид аза НАОН цитохром С оксидоредукЦитрат синтаза одиниць/гр вологої ткатаза нини 14 7±1 6 11 6±0,7 292± 28 8 7±2 9 5 ±0 2 242±19 11 8±1 З 10 5±1 271 ±11 В Таблиці 6 добре продемонстровано, що обробка AZT значно знижує активність дихальних комплексів у мітохондріях серця У цьому випадку, AZT істотно знижує продукцію окисної енергії у серці, що може привести до стану, коли серце не здатне ВІДПОВІДНИМ чином здійснювати його основну функцію (див Таблицю 5, дані ЕКТ) Окрім того, знижена ємність мітохондріального дихання може привести до порушення мітохондріального метаболізму, що в свою чергу може привести до наступних ушкоджень серця Коли AZT вводили тваринам зі сполукою "В", його ефект, що знижує дихальну активність, практично зникав, та значення дихальної активності були близькими до норми Цей вплив був здійснений протестованими сполуками формули І, які значно знижували індуковані AZT пошкодження мітохондріальної мембрани шляхом захисту дихальних комплексів 3) Досліджували пошкодження мітохондріального геному Пошкодження мітохондріального геному визначали за допомогою методу ПЛР (ПЛР полімеразна ланцюгова реакція) Були відібрані праймери шляхом ампліфікування набору від компоненту І цитохром оксидази до цитохрому В, щоб визначити делецм (Праймери були придбані у Ransonhill Bioscience Co) Використаний метод був описаний в публікації Sumegi, Balasz et al /В В А (1996)/, публікація знаходилась на стадії видання Використовуючи ПЛР праймери в ампліфікації району з 4929 до 16298 мітохондріального геному, було показано, що райони 0 5 та 1 5 тисяч пар основ (т п о) значно ампліфіковані у пацюків, що оброблені AZT У той же час, ампліфікації таких коротких ділянок у тварин контрольної групи не спостерігалось Вірогідно, що непошкоджений геном не ампліфікує короткі ділянки ДНК, як в цих тестах, коли праймери розташовані на більш, ніж 11,3 т п о один від одного Факт, що такі короткі ділянки ДНК ампліфікуються в оброблених AZT пацюків показує, що внаслідок обробки AZT, ділянки розміром 10т п о делетовані з мітохондріально го геному, та саме в таких пошкоджених геномах праймери стають ближче один до одного, як 0 51 5т п о Як наслідок, ділянка ДНК може бути ампліфікована Ампліфікація таких ділянок ДНК показує пошкодження мітохондріального геному, яке є частковою або повною делеціею генів, що кодують підгрупи І, II та III цитохром оксидази, генів, що кодують АТФ 6 та 8, генів, які кодують Комплекс І або NADH убіхінон оксидоредуктазу 2, 4, 4L, 5 та 6, та цитохром В Коли AZT вводили тваринам в комбінації зі сполукою "В", ампліфікація вищезгаданих коротких ділянок ДНК значно знизилась, та певні фрагменти ДНК не могли бути визначені Це означає, що сполука "В" захищала вищезгадані гени від індукованих AZT пошкоджень або, принаймні, значно знижувала ці пошкодження Необхідно ВІДМІТИТИ, що штучні пошкодження, які індуковані AZT, вищезгаданим генам також можуть з'являтися як ефект ішемічної кардюміопатм або кардюмюпатм людей похилого віку Вплив сполук формули І на спадкові мітохондріальні кардюміопатм Були проведені тести' з використанням пацюків зі спадковою мітохондріальною міопатією, що оброблені щодобовою дозою 40мг/кг сполуки "В" на протязі 14 днів Функцію серця пацюків оцінювали по ЕКГ Отримані дані ЕКГ контрольної групи та групи, що оброблена сполукою "В", вказані у Таблиці 7 Значення представлені як середнє З вимірювань± стандартне відхилення Таблиця 7 Вплив сполуки "В" на функцію серця пацюків зі спадковою мітохондріальною кардюмюпатією Обробка Контрольна група Сполука "В" RR 2 0 4 ± 2 0 169±21 PR 5 4 ± 5 43±7 QT(ms) 9 2 + 8 71 ±7 J(mm) л 0 ± 0 1 -0 3+0 1 15 57712 Були проведені тести на пацюках зі спадковою кардюмюпатією, які мали порушення функції серця Цей факт добре можна побачити з Таблиці 7 Ці кардюмюпатичні пацюки є ВІДМІННОЮ моделлю ішемічної кардюміопатм та кардюміопатм людей похилого віку Як наслідок впливу 14-добовоі обробки сполукою "В", функції серця тварин значно покращились, та параметри ЕКГ повернулись до нормального рівня Ці тести вказують, що ПОХІДНІ пдроксамової кислоти формули І здатні захищати мітохондріальний геном проти різних пошкоджень У випадку використаних тваринних моделей, вони, фактично, усунули індуковані AZT пошкодження серця, і це може мати велике значення в медицинській науці, Комп'ютерна верстка О Воробей 16 приймаючи за увагу, що на даний час більш, ніж сто тисяч людей у СВІТІ отримують лікування AZT Іншою важливою якістю цих сполук є те, що у випадку кардюміопатм, що розвивається (коли мітохондріальні пошкодження подібні до таких ішемічної кардюміопатм та кардюміопатм людей похилого віку), вони усувають відхилення функції серця та відновлюють нормальні параметри ЕКГ Ґрунтуючись на вищезгаданих тестах можна сказати, що фармацевтичні композиції винаходу, які містять в якості активного інгредієнту сполуку формули І, здатні захищати мітохондріальний геном або мітохондрм від пошкоджень, більш того, за їх допомогою можна лікувати захворювання і пошкодженнями такого типу, що вже розвинулись Підписано до друку 05 08 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна