Ензиматично-хімічний метод визначення вмісту l-аргініну в харчових продуктах та алкогольних напоях

Реферат: Спосіб визначення L-аргініну в харчових продуктах та алкогольних напоях ґрунтується на ензиматичному розщепленні L-аргініну до продукту, що визначається в наступній хімічній реакції. Для гідролізу L-аргініну використовується аргініндеіміназа Mycoplasma hominis, виділена із клітин рекомбінантного штама Escherichia coli BL-21 (pET3d-ADI). Генерований в аргініндеіміназній реакції амоній утворює з о-фталевим альдегідом продукт, який визначається флуориметрично або спектрофотометрично. UA 108773 U (12) UA 108773 U UA 108773 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до харчової промисловості та може використовуватись у виноробстві, медицині та фармакології. У наш час на виноробство - цю високоприбуткову галузь харчової індустрії, працюють багато науково-дослідних установ та агропромислових об'єднань, які мають за мету забезпечити належну якість продукції (або її покращення) та розширення асортименту. Саме тому виноробство потребує на кожному етапі процесу виробництва алкогольних напоїв досконалих методів аналізу, що неможливе без використання найсучасніших приладів. Основними недоліками традиційних методів аналізу, які застосовуються для контролю якості харчових продуктів, зокрема вин, є недостатні селективність та чутливість, потреба у високовартісному та/або громіздкому обладнанні і висококваліфікованому персоналі для його обслуговування, а також значна складність і тривалість аналітичної процедури. Досконалих методів кількісного аналізу цільових аналітів - складових вин - досі не існує, тому створення нових селективних, чутливих та економічно вигідних аналітичних підходів є надзвичайно актуальним завданням аналітичної біотехнології. Амінокислота L-Аргінін (α-аміно-δ-гуанідино-валеріанова кислота) - попередник L-орнітину, L-цитруліну, L-глутатіону, γ-аміномасляної кислоти, спермітину та інших сполук - одна із найбільш поширених амінокислот, що міститься у виноградному соку і вині та тісно пов'язана з рівнем етилкарбамату (уретану) у напоях [1-4]. Встановлено, що канцерогенний етилкарбамат (ЕК), кінцевий продукт перетворення L-Аргініну (Arg) до сечовини та конденсації останньої з етанолом, може генеруватись у винах під дією мікроорганізмів [4-8]. Іншим попередником канцерогенного ЕК у винах є цитрулін, який утворюється в процесі метаболізму Arg за використання аргініндеімінази (АДІ) під впливом молочно-кислих бактерій [47]. Занепокоєння у зв'язку з присутністю ЕК у кріплених винах викликано двома аспектами. Поперше, кріплення більшості видів червоних вин відбувається приблизно всередині бродіння, тобто в період, коли вміст сечовини в суслі є максимальним. По-друге, довготривалий додатковий нагрів, передбачений технологіями створення вин типу Мадера, підвищує швидкість утворення ЕК із сечовини. Таким чином, утворення ЕК або його сполук є технологічно обумовленим процесом [9]. Досліджено, що якщо концентрація Arg в соку перевищує 1000 мг/л (5,0 мМ), то потенційна концентрація ЕК у вині буде вища за 15 мкг/л. У США такий рівень ЕК є гранично допустимою нормою, тоді як у Канаді та Чехії легалізована норма ЕК у вині становить 30 мкг/л [3, 9]. Існує два підходи до того, як запобігти критичному рівню ЕК в вині та забезпечити його високу якість: проводити моніторинг ЕК на всіх стадіях виробництва вина або аналізувати попередники ЕК, зокрема Arg, у вихідній сировині (фруктових соках) та в ході технологічного процесу [5]. На сьогодні визначення концентрації ЕК у винах та соках здійснюють за допомогою дорогих приладів, основаних на методах високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) або газової хроматографії (ГХ), поєднаних із мас-спектрометрією (МС) або тандемною мас-спектрометрією (МС/МС): ГХ/МС, ГХ/МС/МС, ВЕРХ/МС/МС [5]. Більшість аналізів виконується в автоматичному інжекторному проточному режимі. Визначення вмісту Arg зазвичай проводиться методами іонообмінної хроматографії, флуориметрії, спектрофотометрії, капілярного електрофорезу, полярографії, лазерної флуоресцентної спектроскопії, ВЕРХ та ін. [5, 10]. Метод ВЕРХ є достатньо чутливим і відтворюваним, проте він вимагає дорогого обладнання, органічних розчинників високої якості та дорогих дериватизуючих реагентів, що робить відповідні аналізи дорогими для рутинного клінічного аналізу. Крім цього, час підготовки та аналізу зразка є тривалим і складає від моменту дериватизації до одержання кількісних даних 1-2 доби. Тому подальше створення надійних економічно вигідних високоселективних та чутливих методів визначення Arg в харчовій промисловості, у виноробстві зокрема, є надзвичайно актуальним завданням. Таким вимогам відповідають ензиматичні методи. На основі проведення патентно-інформаційних досліджень авторами роботи встановлено, що на сьогодні в галузі аналітичної біотехнології існує обмежена кількість даних щодо розробки ензиматичних методів визначення Arg. При цьому, існуючі ензиматичні тест-системи є переважно мультиферментними (за використання від 2-х до 5-ти ферментів) із спектрофотометричним детектуванням кінцевого продукту реакції [11-13]. Принцип визначення Arg мультиензимним методом за використання трьох ферментів (аргінази, уреази та глутаматдегідрогенази) представлен на Фіг. 1 [12]. Метод ґрунтується на спектрофотометричному моніторингу швидкості перетворення + + кінцевого продукту реакцій NADH (або NADPH) у NAD (або NADP , відповідно), із врахуванням 1 UA 108773 U -1 5 -1 коефіцієнта молярної екстинції NADH (6,22 мМ ·см ). На основі наведеної схеми (Рис. 1) TM розроблено цілу низку серійних аналітичних наборів для визначення Arg (Sigma, Enzytec , Elisa, Megazyme та ін). У попередніх дослідженнях нами запропоновано біосенсорні підходи [14-17] та ензиматичнохімічні методи визначення Arg із спектрофотометричним та флуориметричним детектуванням кінцевого продукту [18-22]. Однак усі вони базуються на використанні двох ферментів рекомбінантної аргінази І печінки людини та уреази. У Таблиці 1 наведено порівняльну характеристику відомих та запропонованих нами раніше ензиматичних методів визначення Arg у харчових продуктах та крові. 10 Таблиця 1 Порівняльна характеристика ензиматичних методів визначення Arg Метод 1 Лінійнійний діапазон, Чутливість, μΜ Джерела μΜ інформації: Фермент 2 ОФА- ФЛ, λзб=364 нм, λем=415 нм 3 ОФА- СФ, Λ=340 нм 4 ДМО-СФ, =480 нм ДМО-ФЛ, зб=380 нм, ем=510 нм ОФА-СФ, =362 нм ОФА-ФЛ, зб=364 нм, ем=425 нм Мультиензимний, СФ, =340 нм Мультиензимний, СФ, =340 нм Мультиензимний, СФ, =555 нм АДІ 0,35-24 0,25 Поточна заявка, [18] АДІ 0,7-50 0,55 Поточна заявка, [18] Аргіназа 7-100 5,0 [10, 19] Аргіназа 0,06-200 0,045 [10, 20] Аргіназа-уреаза 0,9-60,0 0,85 [10, 21] Аргіназа-уреаза 0,09-6,0 0,080 [22] до 470 2,0 [11] 2,9-100 2,1 [12] до 100 [13] Аргіназа, уреаза, глутаматдегідрогеназа Аргіназа, уреаза, глутаматдегідрогеназа АДІ, аргініносукцинатсинтаза; піруватфосфатдикіназа; піруват оксидаза, пероксидаза хрону 1 ОФА - о-фталевий альдегід; ФЛ - флуориметрична детекція кінцевого продукту реакції; 3 СФ - спектрофотометрична детекція кінцевого продукту реакції; 4 ДМО - 2,3 - бутандіонмонооксим. 2 15 20 Аналізуючи існуючі на сьогодні ензиматичні методи визначення Arg (Таблиця 1), можна зробити висновок, що переважна їх більшість потребує використання каскаду із кількох ферментів та екзогенних кофакторів, що додатково підвищує вартість методів та ускладнює процедуру аналізу. Переважна кількість існуючих методів визначення концентрації головних компонентів вин є складними: потребують значних витрат часу, дорогого обладнання. Аналіз літературних потоків засвідчує, що більшість методів має низку недоліків, а саме, недостатню селективність до цільового аналіту, спричинену позитивною реакцією на гуанідинові сполуки (хімічні методи), громіздкість та велика вартість апаратури, необхідність додаткової пробопідготовки та високої кваліфікації персоналу (фізико-хімічні методи), потреба у додаткових реагентах або ферментах (ензиматичні підходи). 2 UA 108773 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Нові методи визначення Arg, що ґрунтуються на використанні аргініно-гідролізуючих ферментів (АДІ, аргінази та ін.), можуть суттєво спростити систему моніторингу рівня канцерогенного етилкарбамату у алкогольних напоях, соках та інших харчових продуктах, одержаних в результаті процесів ферментації. Ензиматичні методи можуть стати основою при створенні нових скринінгових тест-систем для моніторингу Arg в біологічних рідинах, зокрема крові, які на даний час відсутні в арсеналі засобів вітчизняної клінічної діагностики. Під час підготовки заявки на пропоновану корисну модель авторами не було виявлено повідомлень про ензиматичні методи визначення концентрації Arg в винах та соках за використання аргініндеімінази (АДІ) та о-фталевого альдегіду (ОФА). В основу запропонованої корисної моделі поставлено задача створення такого ензиматичного методу аналізу вмісту Arg, який дозволяє підвищити точність визначення цільового аналіту за рахунок високої чутливості та селективності, суттєво знижує матеріальні затрати, є простим та швидким у виконанні в порівнянні із відомими мультиферментними підходами. Поставлена задача розв'язується шляхом ензиматично-хімічного визначення вмісту Arg у напоях (винах та соках) за використання високоселективного до Arg фермента - аргініндеімінази (далі - АДІ), виділеної із клітин рекомбінантного штаму Escherichia coli BL-21 (pET3d-ADІ), що містить оптимізований ген аргініндеімінази Mycoplasma hominis [23]. Очистку АДІ із отриманого концентрату денатурованих "тілець включення" проводили за допомогою аніонної та гідрофобної хроматографії на сорбентах QAE-сефароза та феніл-сефароза, відповідно. Фракції елюатів збирали за допомогою колектора фракцій. Ступінь очищення цільових ферментів від баластних білків характеризували, визначаючи його активність та концентрацію в кожній фракції елюату та електрофоретично. Електрофорез проводили в 12 % SDS-ПААГ за методом Леммлі, білки зафарбовували Кумасі R-250. Внаслідок досліджень одержано препарат АДІ, близький до -1 -1 гомогенності, із питомою активністю 27 мкмоль хв. мг білка (активність визначена при 37 °C). Препарат АДІ зберігається без втрати активності при 4 °C у 20 мМ ФБ, рН 7,2, що містить 1 Μ NaCl, упродовж 20 місяців. Запропонований та опрацьований на реальних зразках вин і соків ензиматично-хімічний АДІОФА метод із спектрофотометричною або флуориметричною детекцією кінцевого продукту реакції (продукту взаємодії амонію з ОФА) має низку переваг порівняно із відомими методами: відсутність складного обладнання, економічний ефект завдяки використанню лише одного фермента (АДІ) без кофакторів, селективність визначення цільового аналіту та широкий діапазон тестованих концентрацій Arg, можливість здійснення процедури аналізу у автоматичному режимі за використання планшетного аналізатора. Ще одною перевагою АДІОФА методу є те, що в ролі хромогенної системи використано дешевий нетоксичний реагент, що дозволяє знизити собівартість методу та забезпечити простоту проведення аналізу. Суть пропонованої корисної моделі пояснюється за допомогою графічних матеріалів. На фіг. 1 представлено схему реакцій ензиматичного перетворення Arg за послідовної дії трьох ферментів (аргінази, уреази та глутаматдегідрогенази). На фіг. 2 наведено схему перебігу реакцій розробленого ензиматично-хімічного методу за використання АДІ і ОФА, а саме: загальну схему реакцій при визначенні Arg ензиматичним методом "АДІ-ОФА" із спектрофотометричним та флуорометричним детектуванням утвореного амонію. На фіг. 3 представлено калібрувальні графіки для визначення концентрації Arg та діапазон лінійності ензиматично-хімічного "АДІ-ОФА" методу із спектрофотометричною та флуориметричною детекцією утвореного продукту, а саме: аналітичні характеристики розробленого ензиматично – хімічного "АДІ-ОФА" методу, залежність інтенсивності флуоресценції (А) та оптичної густини (Б) утвореного продукту реакції від концентрації Arg у реакційній суміші, у вставках: калібрувальні графіки. На фіг. 4 представлено визначення вмісту загального і ендогенного амонію у соку "Садочок" мультифруктовий методом множинних внесень стандарту: ОФА-ФЛ (А, Б) та ОФА-СФ (В, Г). CNH4  55 та C Arg t - концентрації внесених до проб стандартів - NH4Cl та Arg, відповідно; C a та C e a - обчислені концентрації ендогенного (А, В) та загального амонію (Б, Г) у вихідних пробах. Аналітичні характеристики ензиматично-хімічного "АДІ-ОФА" методу представлено на Фіг. 3 та у Таблиці 1. Як видно з Фіг. 3, оптимізовані умови проведення визначення Arg розробленим методом забезпечують лінійність в діапазоні 0,35-24 мкМ Arg для ОФА-ФЛ (Фіг. 3 А) та 0,7-50 мкМ Arg для ОФА-СФ (Фіг. 3 Б). Для визначення концентрації Arg у напоях, зразки вин та соків обробляли аргініндеіміназою для розщеплення ендогенного Arg до амонію та цитруліну. Утворений амоній в присутності 3 UA 108773 U 5 10 15 20 25 30 35 сульфіту в лужному середовищі вступає у хімічну реакцію з ОФА з утворенням продукту - 2,3дигідро-1H-ізоіндолу-1-тіолу (Фіг. 2), який детектується флуориметрично при хвилі емісії 415 нм та хвилі збудження 360 нм або спектрофотометрично при 340 нм. Внаслідок ензиматичної реакції з 1 моль Arg утворюється 1 моль амонію, тож вміст ендогенного Arg визначають за різницею концентрацій амонію у дослідному зразку: загального (після ензиматичного гідролізу) та ендогенного (без додавання АДІ). Хід аналізу зразків напоїв на вміст Arg запропонованим методом (у варіанті множинних внесень стандарту) включає наступні послідовні стадії: 1. Розведення дослідних зразків. Зразки напоїв (вин та соків) перед початком аналізу попередньо розводять 20 мМ K, Na-фосфатним буфером, рН 6,5 (ФБ), що містить 1 мМ ЕДТА. Для хімічної стадії зразки розводять в 125 та 400 разів, для ензиматичної стадії реакції - в 50 та 100 разів. 2. Ензиматична реакція. До 0,1 мл розведеної у 50-100 разів проби вносять 0,025 мл розчину АДІ (300 Од./мл) та інкубують упродовж 20 хв при 37 °C. "Сліпу" пробу готують додаванням відповідної кількості АДІ до 0,1 мл ФБ. 3. Хімічна реакція. До 0,125 мл дослідної та "сліпої"" проби додають 2,5 мл хімічного реагенту, перемішують та інкубують на водяній лазні при 60 °C протягом 15 хв у щільно закритих пробірках. Для приготування хімічного реагенту 0,2 г ОФА розчиняють у 5 мл 95 % етанолу, змішують із 100 мл 0.1 Μ боратного буферу, рН 10 та додають натрію сульфіт до 0,16 мМ [24]. Хімічний реагент зберігають на темноті при кімнатній температурі. 4. Детекція продукту хімічної реакції. Проби аналізують проти "сліпої" проби: на флуорометрі ("Thermo Scientific", США) при довжині хвилі емісії 415 нм із хвилею збудження 360 нм або на спектрофотометрі ("Shimadzu UV1650 PC", Японія) при 340 нм. 5. Розрахунки. Концентрацію Arg у кінцевому зразку визначають методом множинних внесень стандарту за наступною схемою: А). Визначення ендогенного амонію у вихідному зразку за використання параметрів лінійної регресії відповідних калібрувальних графіків (Фіг. 4 А і В), беручи до уваги фактори розведення (рівняння 1); обчислення середнього значення концентрації амонію проводили за значеннями концентрацій для двох розведень: A Ca   N B (1), де Ca - концентрація ендогенного амонію, A та B - параметри лінійної регресії, N - фактор розведення дослідної проби, його вказано на графіку. Б). Обробка дослідної проби АДІ із наступним обчисленням загального вмісту іонів амонію (рівняння 1) у кінцевій пробі графічним методом (Фіг. 4 Б і Г), беручи до уваги фактори розведення та визначення середнього значення концентрації амонію. В). Визначення концентрації ендогенного Arg у дослідній пробі відповідно до рівняння 2:  CArg  Cta  Cea де C Arg  , (2) - концентрація ендогенного Arg, визначена за різницею між вмістом загального C  та ендогенного амонію C . заг 40 45 a e a У таблиці 2 наведено результати досліджень по визначенню концентрацій Arg у винах "Моушен Кадет" (Франція), "Бастардо" (Україна), соки "Садочок" виноградно-яблучний та мультифруктовий (Україна). Слід зазначити, що одержані значення концентрацій Arg задовільно корелюють із показниками ензиматичних методів за використання аргінази, запропонованих нами раніше [16, 18], а також даним інших авторів [25-27]. Таким чином, отримані значення концентрацій Arg демонструють, що запропонований ензиматично-хімічний "АДІ-ОФА" метод із флуориметричною та спектрофотометричною детекцією є функціонально придатним для точного та селективного аналізу концентрації Arg у напоях (винах та соках) і може бути використаний в виноробстві для попередження контролю рівня канцерогенного етилкарбамату. 50 4 UA 108773 U Таблиця 2 Концентрації Arg у напоях, встановлені різними методами Метод Зразок АДІ-ОФА [Поточна заявка, 18] ФЛ СФ 1 KB , KB, CL-Arg CL-Arg % % Вино "Моушен 2.05±0.04 кадет" Вино 2.50±0.04 "Бастардо" Сік "Садочок" виноградно2.16±0.01 яблучний Сік "Садочок" *2.59±0.03 мультифрут CL-Arg Аргіназа-ДМО [16] ФЛ СФ KB, CL-Arg % KB, % 1.90 1.85±0.040 2.2 1.97±0.01 1.01 1.96±0.05 2.01 1.80 ND 2.55±0.04 1.20 2.36±0.06 1.70 0.50 2.20±0.03 1.40 2.06±0.04 2.43 1.99±0.03 2.01 1.20 *2.65±0.03 1.10 2.50±0.04 1.70 ND 1 KB - коефіцієнт варіації, % 5 10 15 20 25 30 35 Джерела інформації: 1. Ough С.S., Stevens D., Almy J. (1989). Am. J. Enol. Vitic. 40, 219-220. 2. Mira De Orduna R., Liu S.Q. et al. (2000). FEMS Microbiol. Let. 183, 31-35. 3. Spayd S., Wample R., Evans R. et al. (1994). Am. J. Enol. Vitic. 45, 34-42. 4. Conacher H.B.S., Page B.D. (1986). Proceedings of Euro Food Tox II. Switzerland: European Society of Toxicology. 237-242. 5. Jiao Z., Dong Y., Chen Q. (2014). Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 13 (4), 611-626. 6. Uthurry C.A., Lepe J.A.S., Lombardero J., Del Hierro, G.J.R. (2006/2007). Food Chem. 94, 262270. 7. Liu S.Q., Pritchard G.G., Hardman M.J., Pilone G.J. (1996). J. Appl. Bacteriol. 81,486-492. 8. Wu P., Cai C, Yang D. et al. (2014). J. Food Nutrit. Res. 2 (12), 872-875. 9. Alexander, J., Auounsson, G., Benford, D. et al. (2007). EFSA J. 551, 1-44. 10. Гайда Г., Стасюк Н., Гончар Μ. (2014). Biotechnologia Acta. 7 (1), 31-39. 11. Mira О.R. J. (2001). Agric. Food Chem. 49 (2), 549-552. 12. https://www.nzytech.com/products-services/analytical-test-kits/ak00171/ 13. Kameya Μ., Asano Υ. (2014). Enz. Microb. Technol. 57 (10), 36-41. 14. Stasyuk N., Smutok O., Gayda G. et al. (2011). J. Mat. Sci. Eng. 4, 515-521. 15. Stasyuk N., Smutok O., Gayda G. et al. (2012). B&B. 204, 515-521. 16. Stasyuk N., Gayda G., B. Gonchar M. (2014). Sensors&Actuators. B. Chem. 204,515-521. 17. Gayda G., Stasyuk N., Klepach H., Gonchar M. In: "Living Organisms and Bioanalytical Approaches for Detoxification and Monitoring of Toxic Compounds"-2015. - Lviv-Rzeszow. Eds.: A. Sibirny et al., 73-88. 18. Stasyuk N., Gayda G., Fayura L. et al. (2016). Food chemistry. 201, 320-326. 19. Стасюк Н.Є., Гайда Г.З., Гайда А.В., Гончар М.В. (2012) Ukrainica Biorganica Acta. 1,31-37. 20. Stasyuk Ν., Gaida G., Gonchar M. (2013). Appl. Biochem. Microbiol. 49, 529-534. 21. Стасюк Η.Є., Басе С.Р., Гайда Г.З. та ін. (2015). Scientific Journal "ScienceRise", 6/1(11), 43-48. 22. Stasyuk N.Ye., Gayda G.Z., Yepremyan H.S., Gonchar M.V. (2016). Spectrochimica Acta, Part A. Submitted. 23. Fayura L.R., Boretsky Y.R., Pynyaha Y.V. et al. (2013). J. Biotechnol.,167 (4), 420-426. 24. Goyal, S.S., Rains D.W., Huffaker R.C. (1988). Anal. Chem. 60 (2), 175-179. 25. Austin K.T., Butzke C.E. (2000). Am. J. Enol. Vitic. 51, 227-232. 26. Stines A.P., Grubb J., Gockowiak H. et al. (2000). Australian J. Grape and Wine Res. 6(2), 150-158. 27. Li H., Liang X., Feng L. et al. (2008). J. Food Drug Anal. 16 (3), 53-58. 40 5 UA 108773 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Спосіб визначення L-аргініну в харчових продуктах та алкогольних напоях, що ґрунтується на ензиматичному розщепленні L-аргініну до продукту, що визначається в наступній хімічній реакції, який відрізняється тим, що для гідролізу L-аргініну використовується аргініндеіміназа Mycoplasma hominis, виділена із клітин рекомбінантного штама Escherichia coli BL-21 (pET3dADI), при цьому генерований в аргініндеіміназній реакції амоній утворює з о-фталевим альдегідом продукт, який визначається флуориметрично або спектрофотометрично. 6 UA 108773 U Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 7