Похідні арилоксисульфоніламіногідроксамової кислоти, фармацевтична композиція на їх основі, спосіб селективного інгібування матричної металпротеїнази-13 у ссавців та спосіб лікування

1 ПОХІДНІ арилоксисульфоніламшопдрок самової кислоти формули но1 R R 2 або їх фармацевтично прийнятні солі, в яких R1 є (Сі-Сє)алкілом, R2 є (Сі-Сє)алкілом, або R1 та R2 взяті разом з атомом вуглецю, до якого вони приєднані, утворюють кільце, що вибране з (С5-С7)циклоалкілу, 4-тетрапдропіранілу і 4піперидинілу, R3 являє собою водень або (С-і-Сб)алкіл, Y - замісник приєднаний до будь-якого атому вуглецю фенільного кільця, здатного нести додатковий зв'язок, незалежно вибраний з водню, фтору, хлору, трифторметилу, (Сі-Сє)алкокси, трифторметокси, дифторметокси і (Сі-Сє)алкілу 2 Сполука згідно з пунктом 1, в якій Y є воднем, фтором або хлором 3 Сполука згідно з пунктом 1, в якій Y є 4-фтором або 4-хлором 4 Сполука згідно з пунктом 1, в якій R1 та R2 взяті разом з атомом вуглецю, до якого вони приєднані, утворюють циклопентильне кільце 1 2 5 Сполука згідно з пунктом 3, в якій R та R взяті разом з атомом вуглецю, до якого вони приєднані, утворюють циклопентильне кільце 1 2 6 Сполука згідно з пунктом 1, в якій R та R взяті разом з атомом вуглецю, до якого вони приєднані, утворюють 4-тетрапдропіранільне кільце 7 Сполука згідно з пунктом 1, в якій R1 та R2 обидва є метилами 8 Сполука згідно з пунктом 3, в якій R1 та R2 обидва є метилами 9 Сполука згідно з пунктом 1, в якій R3 є воднем 10 Сполука згідно з пунктом 3, в якій R3 є воднем 11 Сполука згідно з пунктом 4, в якій R3 є воднем 12 Сполука згідно з пунктом 1, в якому згадану сполуку вибирають з групи, що вміщує етиловий естер 3-[[4-(4фторфенокси)бензолсульфоніл]-(1пдроксикарбамоілциклопентил)аміно]пропюновоі кислоти, 3-[[4-(4-фторфенокси)бензолсульфоніл]-(1пдроксикарбамоілциклопентил)аміно]пропюнову кислоту, етиловий естер 3-[[4-(4фторфенокси)бензолсульфоніл]-(1пдроксикарбамоіл-1-метилетил)аміно]пропюновоі КИСЛОТИ, І 3-[[4-(4-фторфенокси)бензолсульфоніл]-(1пдроксикарбамоіл-1-метилетил)-аміно]пропюнову кислоту 13 Фармацевтична композиція для (а) лікування артритів або раку та інших захворювань, що характеризуються активністю матричної металпротеїнази або (Ь) селективного інгібування матричної металпротешази-13 у ссавців, включаючи людину, яка містить ефективну при такому лікуванні або інгібуванні КІЛЬКІСТЬ сполуки згідно з пунктом 1 або и фармацевтично прийнятну сіль, та фармацевтично прийнятний носій 14 Спосіб селективного інгібування матричної металпротешази-13 у ссавців, включаючи людину, при якому призначають вказаному ссавцю ефективну КІЛЬКІСТЬ сполуки згідно з пунктом 1 або її фармацевтично прийнятної солі 15 Спосіб лікування артриту або раку та інших захворювань, що характеризуються активністю матричної металпротешази-13 у ссавців, включа О C O (О о> (О 61963 ючи людину, при якому призначають вказаному ссавцю ефективну при лікуванні таких станів кіль Даний винахід стосується похідних арилоксисульфоніламінопдроксамової кислоти Ці сполуки є селективними інгібіторами матричної металпротешази-13 і таким чином використовуються в лікуванні станів, вибраних з групи, яка складається з артритів, раку, утворення виразок тканин, рестенозу, захворювань периодонту, бульозного епідермолізу, втрата кісткової маси, розриви в місцях з'єднання штучних імплантатів, атеросклероз, розсіяний склероз, очний анпогенез (наприклад, макулярна дегенерація) та інших захворювань, що характеризуються активністю матричної металпротеїнази Цей винахід також стосується способів використання цих сполук в лікуванні згаданих вище захворювань у ссавців, особливо людей, та до фармацевтичних композицій, що використовуються при цьому Існує ряд ферментів, які призводять до розриву структурних білків та які структурно подібні до металпротеїназ Металпротеїнази, що руйнують матрицю, такого типу як желатиназа, стромелізин та колагеназа, беруть участь в матричному розкладі тканини (наприклад, колапс колагену) та зумовлюють багато патологічних станів, які характеризуються аномаліями з'єднувальної тканини та метаболізмом базальної матриці мембран, таких, як артрит (наприклад, остеоартрит та ревматоїдний артрит), виразки тканин (наприклад рогівкова, епідермальна та шлункова виразки), аномальне загоєння ран, захворювання перюдонту, КІСТКОВІ захворювання (наприклад хвороба Педжета та остеопороз), метастаз пухлини або інвазія, а також ВІЛ-шфекція (J Leuk Вюі , 52 (2) 244-248,1992) 4 кість сполуки згідно з пунктом 1 або тично прийнятної солі фармацев ковий зв'язок, переважно від 1 до 2 замісників (більш переважно, один замісник, більш переважно, один замісник в 4 положенні) фенільного кільця, незалежно вибраний з водню, фтору, хлору, трифторметилу, (Сі-Сє)алкокси, трифторметокси, дифторметокси і (Сі-Сє)алкілу Термін "алкіл", що застосований тут, якщо не вказано інше, означає насичені моновалентні вуглеводневі радикали, що мають нерозгалужену, розгалужену або циклічну будову або їх комбінації Термін "алкокси", що застосований тут, означає О-алкільні групи, де "алкіл" визначений вище Представлений винахід також стосується фармацевтично прийнятних кислотно-адитивних солей сполук формули І Кислотами, які використовуються для одержання фармацевтично прийнятних кислотно-адитивних солей вищезгаданих основних сполук цього винаходу, є такі, що утворюють нетоксичні адитивні солі, тобто, солі, які містять фармакологічно прийнятні аніони, такі як пдрохлоридні, пдробромідні, пдройодидні, нітратні, сульфатні, бісульфаті, фосфатні, кислофосфатні, ацетатні, лактатні, цитратні, кислоцитратні, тартратні, бітартратні, сукцинатні, малеатні, фумаратні, глюконатні, сахаратні, бензоатні, метансульфонатні, етансульфонатні, бензолсульфонатні, п-толуолсульфонатні та памоатні (наприклад, 1,1-метилен-біс-(2-пдрокси-3-нафтоат)) солі Фактор некрозу пухлини, як визнають, зумовлює ряд інфекційних та аутоімунних захворювань (W Fiers, FEBS Letters, 1991, 285, 199) Крім того, було показано, що TNF - головний медіатор запальної реакції, що спостерігається при сепсисі та септичному шоку (СЕ Spooner et al , Clinical Immunology and Immunopathology, 1992, 62S11) Короткий зміст винаходу Представлений винахід стосується сполуки формули Винахід також стосується основно-адитивних солей формули І ХІМІЧНІ ОСНОВИ, ЩО можуть бути використані в якості реагентів для одержання фармацевтично прийнятних солей сполук формули І, що мають кислотну функцію і що утворюють нетоксичні основні солі з такими сполуками Такими нетоксичними основними солями є, але не обмежуються, наступними похідними від наступних фармацевтично прийнятних катіонів, таких як, катіони лужних металів (наприклад, калію і натрію) і катіонів лужноземельних металів (наприклад, кальцію і магнію), амонієвих або водорозчинних аміноадитивних солей, таких як, N-метилглюамш(меглумін) і низькоалканоіламонієвих і інших основних солей фармацевтично прийнятних органічних амінів R' R J або їх фармацевтично прийнятні солі, в яких R1 є (Сі-Сє)алкілом, R2 є (Сі-Сє)алкілом, або R1 та R2 взяті разом з атомом вуглецю до якого вони приєднані утворюють кільце, що вибране з (С5-С7)циклоалкілу, 4-тетрапдропіранілу і 4піперидинілу, R3 являє собою водень або (С-і-Сб)алкіл, Y - замісник приєднаний до будь якого атому вуглецю фенільного кільця, здатного нести додат Сполука формули І може мати хіральні центри і тому існувати в різноманітних енантюмерних формах Цей винахід стосується усіх оптичних ізомерів та стереоізомерів сполук формули І та їх сумішей Цей винахід також стосується фармацевтичних композицій, що вміщують проліки сполук формули І і способів лікування або попередження, що полягають у призначенні проліків сполук формули І Сполуки формули І маючи ВІЛЬНІ аміно, амідо, гідрокси або карбоксильні групи можуть бути перетворені у проліки Проліки включають сполуки, в яких амінокислотні залишки або поліпептидний ланцюг, що складається з двох або більшої КІЛЬКОСТІ (наприклад, двох, трьох або чотирьох) аміноки 61963 слотних залишків, які ковалентно приєднані за допомогою пептидних зв'язків ДО ВІЛЬНОЇ аміно, гідрокси або карбоксильної групи сполуки формули І АМІНОКИСЛОТНІ залишки включають 20 амінокислот, що зустрічаються в природі і позначаються за допомогою трьохлітерних позначень і також включають 4-пдроксипролін, пдроксилізин, демозин, ізодемозин, 3-метилпстидин, норвалін, бетааланін, гаммаамшомасляна кислота, цитрулін гомоцистешугомосерин, омітин і метіонін сульфон Проліки також включають сполуки, в яких карбонати, карбамати, аміди і алкілові естери ковалентно приєднані до вищезгаданих замісників формули І через карбонільний атом вуглецю бічного ланцюгу пролікарської форми Проліки також включають сполуки формули І, в яких пдроксамова кислота і карбонільний фрагмент, коли вони взяті разом утворюють групу формули о H N 1 •чг 2 в якій R , R і Y такі, як зазначено для формули І та U і V, незалежно, карбоніл, метілен, SO2 або SO3 і b знаходиться в інтервалі від одного до трьох, в якій кожна метиленова група, необов'язково, заміщена пдроксигрупою Переважними сполуками формули І є сполуки, в яких Y є воднем, фтором або хлором, переважно, 4-фтор або 4-хлор Іншими переважними сполуками формули І є сполуки, в яких R1 та R2 узяті разом з атомом вуглецю до якого вони приєднані, утворюють циклопентильне або 4-тетрапдропіранільне кільце Іншими переважними сполуками формули І є сполуки, в яких R1 та R2 обидва є метилами Іншими переважними сполуками формули І є сполуки, в яких R3 є воднем Особливо переважними сполуками формули І є наступні етиловий естер 3-[[4-(4фторфенокси)бензолсульфоніл]-(1пдроксикарбамоіл-циклопентил)аміно]пропюновоі кислоти, 3-[[4-(4-фторфенокси)бензолсульфоніл]-(1пдроксикарбамоілциклопентил)аміно]-пропюнова кислота, етиловий естер 3-[[4-(4фторфенокси)бензолсульфоніл]-(1пдроксикарбамоіл-1-метилетил)аміно]пропюновоі кислоти, і 3-[[4-(4-фторфенокси)бензолсульфоніл]-(1пдроксикарбамоіл-1-метилетил)-аміно]пропюнова кислота Іншими сполуками формули І є наступні 3-[[4-(4-фторфенокси)бензолсульфоніл]-(4пдроксикарбамоілтетрапдропіран-1-іл)амшо]пропюнова кислота, етиловий естер 3-[[4-(4фторфенокси)бензолсульфоніл]-(4пдроксикарбамоіл-тетрапдропіран-1 іл)амшо]пропюновоі кислоти, 3-[[4-(4-хлорфенокси)бензолсульфоніл]-(4пдроксикарбамоілтетрапдропіран-1-іл)амшо]пропюнова кислота, етиловий естер 3-[[4-(4хлорфенокси)бензолсульфоніл]-(4пдроксикарбамоіл-тетрапдропіран-1іл)амшо]пропюновоі кислоти, 3-[(4-пдроксикарбамоілтетраідропіран-4-іл)-(4феноксибензолсульфоніл)аміно]-пропюнова кислота, етиловий естер 3-[(4пдроксикарбамоілтетраідропіран-4-іл)-(4феноксибензол-сульфоніл)амшо]пропюновоі кислоти, 3-[[4-(4-фторфенокси)бензолсульфоніл]-(4пдроксикарбамоілпіперидин-1-іл)-аміно]пропюнова кислота, 3-[[4-(4-хлорфенокси)бензолсульфоніл]-(1пдроксикарбамоіл-1-метилетил)-аміно]пропюнова кислота, етиловий естер 3-[[4-(4хлорфенокси)бензолсульфоніл]-(1 пдроксикарбамоіл-1-метилетил)аміно]пропюновоі кислоти, 3-[[4-(4-фторфенокси)бензолсульфоніл]-(1пдроксикарбамоілциклогексил)-аміно]пропюнова кислота, 3-[(1-пдроксикарбамоілциклопентил)-(4феноксибензолсульфоніл)аміно]-пропюнова кислота, та 3-[[4-(4-хлорфенокси)бензолсульфоніл]-(1пдроксикарбамоілциклопентил)-аміно]пропюнова кислота Представлений винахід також стосується фармацевтичної композиції для (а) лікування станів, вибраних з групи, яка складається з артритів, раку, утворення виразок тканини, рестенозу, захворювань периодонту, бульозного епідермолізу, втрата кісткової маси, розриви в місцях з'єднання штучних імплантатів, атеросклероз, розсіяний склероз, очний анпогенез (наприклад, макулярна дегенерація) та інших захворювань, що характеризуються активністю матричної металпротеїнази, або (Ь) селективного інгібування матричної металопротеїнази-13 у ссавців, включаючи людину, яка містить деяку КІЛЬКІСТЬ сполуки формули І або и фармацевтично прийнятну сіль, що ефективна при такому лікуванні та фармацевтично прийнятний носій Представлений винахід також стосується способу селективного інгібування матричної металпротешази-13 у ссавців, включаючи людину, який полягає у призначенні вказаному ссавцю ефективної КІЛЬКОСТІ сполуки формули І або її фармацевтично прийнятної солі Представлений винахід також стосується способу лікування станів, вибраних з групи, яка складається з артритів, раку, утворення виразок тканини, рестенозу, захворювань периодонту, бульозного епідермолізу, втрата кісткової маси, розриви в місцях з'єднання штучних імплантатів, атеросклероз, розсіяний склероз, очний анпогенез (наприклад, макулярна дегенерація) та інших захворювань обумовлених активністю матричної металпротешази-13 у ссавців, включаючи людину, який полягає в призначенні вказаному ссавцю деякої КІЛЬКОСТІ сполуки формули І або и фармацевтично прийнятної солі, ефективної при лікуванні таких станів Детальний опис винаходу 61963 Наступні схеми реакцій розкривають одержання сполук представленого винаходу Якщо не вка2 3 зано інше Y, R , R та R в схемах реакцій та в наступному обговоренні, є такими, як визначено вище VI I ^ ^ . ^ H ^-. s a 3 H1 O ч «*О-° Схема 1 стосується одержання сполук формули І з сполук формули VII Пояснення до Схеми 1, амінокислотну сполуку формули VII, в якій R16 є бензилом, перетворювали у відповідну сполуку формули VI взаємодією з реакційно функціональним похідним арилсульфонової кислоти формули Ci-SO. в присутності основи такої, як триетиламш в полярному розчиннику такому, як тетрапдрофуран, 1,2-діметоксиетан, діоксан, вода або ацетонітрил, переважно 1,2-діметоксиетан Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі, протягом часу від приблизно 10 хвилин до приблизно 24 годин, переважно приблизно 60 хвилин Арилсульфоніламшосполуку формули VI, в 16 якій R є бензилом, перетворювали у відповідну 16 сполуку формули V, в якій R є 3третбутилдиметилсиланілоксипропанілом взаємодією з третбутил(3-галопропокси)диметилсиланом, переважно з йод похідним, в присутності основи такої, як карбонат калію, карбонат цезію, гексаметилдисилазид калію або гідрид натрію, переважно, гексаметилдисилазид калію Реакційну суміш перемішували в полярному розчиннику такому, як диметилформамід або І\І-метилпіролідин-2-он при кімнатній температурі, протягом часу від приблизно 2 годин до приблизно 48 годин, переважно приблизно 18 годин Сполуку формули V перетворювали в похідне карбонової кислоти формули IV взаємодією з ефіратом трифтористогобору для одержання проміжного спирту, наступним окисленням і захистом шляхом естерифікацм Зокрема, реакцію з ефіратом трифтористогобору проводили в інертному розчиннику такому, як метиленхлорид, хлороформ, переважно метиленхлорид, при кімнатній температурі, протягом від приблизно 15 хвилин до приблизно 4 годин, переважно приблизно 1 годину Окислення спирту здійснювали використовуючи триоксид хрому у водному розчині сірчаної кислоти (реагент Джонса) приблизно при 0°С, від приблизно однієї до приблизно 6 годин, переважно приблизно 2 години Захист карбонової кислоти здійснювали обробляючи вільну кислоту алкілуючим агентом таким, як R3-L, в якому L група, що відходить така, як йод, бром, мезилат або тозилат, переважно йод, з основою такою, як карбонат калію або карбонат цезію, переважно карбонат калію, в полярному розчиннику такому, як диметилформамід, N-метил пірол ід ин-2-он або тетрапдрофуран, переважно диметилформамід, протягом від приблизно 1 до приблизно 24 годин, переважно 16 годин, при кімнатній температурі Сполуку формули IV перетворювали у сполуку формули III видаленням R16 захисної групи шляхом гідрування, використовуючи паладій на вугіллі в розчиннику такому, як метанол або етанол, протягом від приблизно ЗО хвилин до приблизно 48 годин, переважно 16 годин, при температурі від приблизно 20°С до приблизно 25°С, наприклад при кімнатній температурі Карбоксильну функцію сполуки формули III перетворювали у сполуку формули II з пдроксамовоі функцією, в якій R16 є бензилом, шляхом реакції активованої сполуки формули III з бензилпдроксиламіном Сполука формули III була активована шляхом обробки и гексафторфосфатом (бензтриазол-1-ілокси)трис(диметиламіно)фосфонію в присутності основи, при кімнатній температурі, в полярному розчиннику В попередньо згаданій 61963 10 солей, наприклад, солей, що містять фармацевтиреакції час и проведення знаходився в інтервалі чно прийнятний аніон такий, як пдрохлоридний, від приблизно 15 хвилин до приблизно 4 годин, пдробромідний, пдройодидний, нітратний, сульпереважно 1 година Активоване похідне сполуки фатний або бісульфатний, фосфатний абокислоформули III перетворювали in situ у сполуку форфосфатний, ацетатний, лактатний, цитратний або мули II реакцією з пдрохлоридом бензилпдроксикислоцитратний, тартратний або кислотартратний, ламіну Реакцію з пдрохлоридом бензилпдроксисукцинатний, малеатний, фумаратний, глюконатламіном здійснювали протягом від приблизно 1 ний, сахаратний, бензоатний, метансульфонатний години до приблизно 5 днів, переважно протягом і памоатний [наприклад, 1,1'-метиленбіс(216 годин, при температурі від приблизно 40°С до пдрокси-3-нафтоатна)]сіль приблизно 80°С, переважно при 60°С Придатними основами є N-метилморфолш або дизопропілетиСполуки формули І, які також є кислими по 3 ламін, переважно дизопропілетиламш Придатним природі, наприклад, коли R є воднем, здатні утворозчинником є N.N-диметилформамід або Nрювати основні солі з різноманітними фармацевметилпіролідин-2-он, переважно N,Nтично прийнятними катіонами Прикладами таких солей є солі лужних металів або лужноземельних диметилформамід металів і особливо, солі натрію і калію Всі ці солі Сполуку формули II перетворювали в сполуку одержуються з використанням загальноприйнятих І видаленням пдроксиламінозахисної групи Видаметодик ХІМІЧНІ ОСНОВИ, ЩО використовуються в лення пдроксиламшозахисної групи здійснювали якості реагентів для одержання фармацевтично гідруванням бензильної захисної групи, викорисприйнятних солей цього винаходу утворюють нетовуючи в якості каталізатору паладій на сульфаті токсичні основні солі з описаними тут кислими барію в полярному розчиннику, при температурі сполуками формули І Цими нетоксичними основвід приблизно 20°С до приблизно 25°С, наприними солями є ПОХІДНІ від фармацевтично прийняклад, при кімнатній температурі, протягом часу від тних катіонів, таких як, натрій, калій, кальцій і магприблизно 1 години до приблизно 5 годин, переній та ш Ці СОЛІ ДОСИТЬ легко одержуються важно приблизно 3 години шляхом обробки відповідної сполуки, що містить Сполуки формули VII та VIII є комерційно докислотну функцію, водним розчином, що містить сяжними або можуть бути одержані за методиками бажаний фармацевтично прийнятний катіон, надобре відомими середньому спеціалісту в цій гаступним випарюванням одержаного розчину до лузі суха, переважно при пониженому тиску АльтернаФармацевтично прийнятні солі кислих сполук тивно, вони можуть бути одержані змішуванням винаходу - це солі, які утворені основами, а саме, нижчоспиртового розчину кислотної сполуки і алкатіонні солі, такі, як солі лужних та лужноземелькоголяту бажаного лужного металу разом, і випаних металів, таких як натрій, ЛІТІЙ, калій, кальцій, рюванням одержаного розчину до суха за тим ж магній, а також амонійні солі, такі, як солі амонію, самим способом, що описаний вище В деяких триметиламонію, диметиламонію та сіль випадках, краще використовувати стехіометрично трис(пдроксиметил)метиламонію еквівалентні КІЛЬКОСТІ реагентів для забезпечення Аналогічно кислотно-адитивні солі, таких, як повного протікання реакції і максимізацм виходу мінеральні кислоти, органічні карбонові та органічпродукту ні сульфонові кислоти, наприклад соляна кислота, метансульфонова кислота, малеїнова кислота, Здатність сполук формули І або їх фармацевтакож можуть містити основні групи, такі, як піритично прийнятних солей (в подальшому також згадил, що складають частину структури даних як ММР-13 селективних сполук представленого винаходу) інгібувати матричну Сполуки формули І, що є основними за прирометалпротешазу-13 (колагеназу 3) та, ВІДПОВІДНО, дою, здатні утворювати велику КІЛЬКІСТЬ різних проявляти ефективність при лікуванні захворюсолей з різними неорганічними та органічними вань, що характеризуються матричною металпрокислотами Хоча ці солі повинні бути фармацевтитешазою-13 підтверджується наступними виконачно прийнятними для призначення тваринам, на ними in vitro тестами практиці часто бажано спочатку виділити сполуку формули І з реакційної суміші у вигляді фармацевБІОЛОГІЧНІ тести тично прийнятої солі, і потім просто перетворити Інгібування Людської Колагенази (ММР-1) останню в сполуку у вигляді вільної основи обробЛюдську рекомбінантну колагеназу активували кою лужним реагентом і потім перетворити вказатрипсином, використовуючи наступне співвіднону вільну основу в фармацевтично прийнятну кисшення Юмкг трипсину на ЮОмкг колагенази Трилотно-адитивну сіль Кислотно-адитивні солі псин та колагеназу культивували при кімнатній активних основних сполук цього винаходу легко температурі протягом 10 хвилин, потім додавали одержуються обробкою основної сполуки, як прап'ятикратний надлишок сполуки (50мкг/10мкг трипвило, еквівалентною КІЛЬКІСТЮ прийнятної мінерасині) інгібітору трипсину сої льної чи органічної кислоти в середовищі водного Готували ЮмМ ВИХІДНІ розчині інгібіторів в дирозчинника або приданого органічного розчинника, метилсульфоксиді та потім розбавляли, використакого як метанол чи етанол Обережним випаротовуючи наступну схему вуванням розчинника легко одержували бажану тверду сіль Двадцять п'ять мікролітрів кожної концентрації Кислоти, що використовувались для одержанвносили у ВІДПОВІДНІ лунки 96-лунковоі мікрофтоня фармацевтично прийнятних кислотнорованої кювети в трьох серіях Після додавання адитивних солей сполук цього винаходу є солями, ензиму та субстрату кінцева концентрація інгібітоутвореними з нетоксичних кислотно-адитивних ру була 1 4 розведення Позитивні контрольні тес 12 11 61963 ти (ензим, без інгібітору) здійснювали в лунках D1Позитивні контрольні лунки містили ензим та D6 та тести порівняння (без ензиму, без інгібітору) субстрат без інгібітору та порівняльні лунки містипроводили в лунках D7-D12 ли лише субстрат Колагеназу розводили до 400нг/мл і потім доІС50 визначали, як відсоток інгібування людсьдавали 25мкл до ВІДПОВІДНИХ лунок мікрофторовакої колагенази (ММР-1) Якщо встановлено, що ноі кювети Кінцева концентрація колагенази у ІС50 є меншим ніж О.ОЗмкМ, то інгібітори випробовипробуванні - 100нг/мл вували при кінцевих концентраціях О.ЗмкМ, О.ОЗмкМ, О.ООЗмкМ та О.ОООЗмкМ Субстрат (DNP-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-AlaLys(NMA)-NH2) одержували як 5мМ напівпродукт в Сполуки представленого винаходу проявлядиметилсульфоксиді та потім розводили до 20мкМ ють неочикуванну селективну активність по віднобуфером випробування Тест починали додаваншенню до матричної металпротешази-13 (колагеням 50мкл субстрату в лунку мікрофторованої кюнази 3) порівняно з матричної металпротешазою-1 вети з кінцевої концентрації ЮмкМ (колагеназою 1) Зокрема, сполуки формули І в 100 разів є більш ефективними до матричної меФлуоресцентні дані (ЗбОнм збудження, 460нгм талпротешази-13 (колагенази 3) ніж до матричної випромінювання) знімались на початку відліку часу металпротешази-1 (колагенази 1) і мають ICso меі потім через кожні 20 хвилин Випробування пронше ніж ЮнМ до матричної металпротешази-13 водили при кімнатній температурі з типовим часом (колагенази 3) Таблиця 1 показує деякі сполуки, випробування 3 години що демонструють неочикуванну селективність Графік, флуоресценція від часу, будували як сполук винаходу для порівняльного зразка, так і для зразків, що містили колагеназу (дані трикратних вимірювань усереднювали) Точку часу, яка забезпечує хороший сигнал (порівняльна) та точку, що знаходиться на ЛІНІЙНІЙ частині кривої (зазвичай біля 120 хвилин), вибирали так, щоб визначити значення ІС50 Нульовий час використовували в якості поріНО-so,вняльного для кожної сполуки при кожній концентR1 R! рації, та ці значення віднімали від 120 хвилинних даних Результати показували, як залежність конММР1 ММР13 Приклад R R R ' центрації інгібітору від % контролю (флуоресценІС (НМ) ІСя(нМ) ція інгібітору поділена на флуоресценцію самої 1 цлклопентил етил 4 фторфеиокои 100 09 колагенази х 100) ICso визначали з концентрації 1 етип 4-фторфенокси 09 цикпопентш 100 інгібітору, яка дає сигнал, який становить 50% від цлкпспентил 4-фторфенокси 12 ведень 3S0 г _ "~2 ціікпопеитот водень 4 фторфеиокси контрольного 1 Ж Якщо встановлено, що ICso є