Спосіб визначення бацилярних збудників харчових отруєнь та псування харчових продуктів за генами токсичності

Реферат: Спосіб визначення бацилярних збудників харчових отруєнь та псування харчових продуктів включає підготування дослідних зразків, виділення мікроорганізмів, виділення геномів ДНК попередньо виділених мікроорганізмів, проведення мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції з використанням прямих і зворотних праймерів і електрофорез продуктів мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції з використанням маркерів нуклеотидних фрагментів. Здійснюють мультиплексну полімеразну ланцюгову реакцію із системи, яка містить геноми декількох мікроорганізмів з використанням наступних пар праймерів: nheAF і nheAR по 0,15-0,25 мкМ; 29PpF і 179PpR по 0,15-0,22 мкМ; МАС 1 і МАС 2 по 0,1-0,2 мкМ. При цьому мультиплексну полімеразну ланцюгову реакцію проводять в наступній послідовності: первинна денатурація при 94-95 °C протягом 3-5 хв, далі - 30 циклів, кожен з яких включає денатурацію при 94 °C протягом 30-60 с, відпал при 51-56 °C протягом 30 с, первинну елонгацію при 72 °C протягом 30 с. Після цього здійснюють остаточну елонгацію при 72 °C протягом 3-5 хв. UA 122765 U (12) UA 122765 U UA 122765 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі гігієнічної безпеки харчових продуктів і продовольчої сировини та екологічної безпеки, а саме до визначення збудників псування харчових продуктів, що викликають харчові отруєння. Винахід може бути використаний в харчовій промисловості, молекулярній біології, медицині, мікробіології. Відомий спосіб виявлення різних видів токсичності (еметичної та ентеротоксичної) у штамів Bacillus cereus (В. cereus) (J.-B. Kim, J.-M. Kim, S.-Y. Kim et al., J. Food Protection, 2010, Vol 73, № 7, P. 1219-1224), що включає визначення за допомогою спеціальних тест-карток (Kit Vitek IIsystem або API 50 СНВ з API 20E test Kit). За допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) було детектовано ген синтетази еметичного токсину (ces) і гени ентеротоксинів (hbl та nhe). Використовували праймер 6 (5'-CCCGTCAGCA-3') для детекції В. cereus ATCC 14579 і В.cereus F4810/72 як позитивний контроль для еметичних токсинеметуючих штамів. Недоліком способу є визначення лише одного виду мікроорганізмів, причому однозначного висновку щодо можливості детекції ентеро- та еметичної токсичності виділених штамів В. cereus тільки за допомогою ПЛР аналізу не було зроблено. Автори рекомендували використання комплексних досліджень з застосуванням методів ПЛР, RAPD, біотестування на Нер-2 клітинах, визначення фенотипових характеристик біохімічними методами, тобто повний спектр досліджень, що не є раціональним та необхідним, особливо для моніторингу та визначення безпечності харчової продукції. Крім того, при ПЛР визначенні генів токсичності В. cereus були використані комплекси реагентів, а саме, декілька видів китів (Kit BDE-VIA, що включає праймери для визначення негемолітичного ентеротоксину nheA, nheB, nheC та BCET-RPLA для визначення гемолізину BL hblC, hblD, hblA), що ускладнює проведення дослідження, не дає можливості прискорити дослідження, оскільки саме виділення чистих культур та їх геномів є складним багаторівневим процесом. Відомий спосіб визначення токсигенних збудників харчових отруєнь групи Bacillus за допомогою мультиплексної композиції праймерів (F. Forgani, J.B. Kim, D.H.Oh //Int. J. of Food Microbiology, 2008, 124, P. 224-230), яка включала CytK, CER, nheA, nheB, nheC, entFM для визначення Nhe ентеротоксину різних видів бацил - В. cereus, В. subtilis, В. sphaericus, В. licheniformis, В. pumilus, В. badius, В. fusiformis. Недоліком цього способу є використання високої температури (від 72 °C до 94 °C) під час відпалу та ампліфікації (72 °C), що призводить до появи значної кількості варіабельних послідовностей рестрикційних фрагментів, які містяться між константними ДНКпослідовностями, мають хаотичний склад послідовностей, змінюють константну ДНКпослідовність, у великій кількості з'являються нерегульовані суміші рестрикційних фрагментів, що заважає проведенню ампліфікації та ідентифікації. Найближчим аналогом є спосіб виявлення життєздатних В. cereus, які здатні продукувати токсини (Z. Zhang, L. Feng, Η. Xu, C. Liu, N.P.Shah, H. Wei //J. Dairy Sci, 2016, Vol. 99, No 2, P. 19), згідно з яким здійснюють аналіз токсичності харчових продуктів за допомогою ПЛР із використанням прямих і зворотних праймерів cytK, nheA, nblD. Був використаний типовий штам В. cereus ATCC14579, як ентеротоксинпозитивний мікроорганізм, що продукує три ентеротоксичні гени - cytK, nheA, hblD, який культивували за 37 °C на поживному середовищі протягом ночі. Після чого розділяли живі та мертві клітини обробкою пропідіум моноазідом (ПМА). Геномну ДНК лише живих бактерій екстрагували 3 наступним чином: 1 см зразка центрифугували при 12000 g, 2 хв при 4 °C і суспендували стерильною водою, з використанням спеціального набору реактивів (Kit, Qiagen, China) згідно інструкції. Очищену мікробну ДНК зберігали при мінус 20 °C для подальшого використання. Для мультиплексної ПЛР використовували загальний об'єм 20 мкл. До складу ПЛР системи включали: 3 мкл геномної ДНК, 10 мкл суміші 2xTaq (Novoprotein Scientific Inc, China), no 0,175 мкМ прямого та зворотного cytK праймера, по 0,25 мкМ прямого та зворотного nheA праймера, по 0,2 мкМ прямого та зворотного hblD праймера. Стерильною дистильованою водою доводили до 20 мкл, 2 мкл використовували для дослідження. Умови проведення ПЛР: початковий цикл 10 хв, 95 °C, наступні 35 циклів денатурації при 95 °C по 30 с (17,5 хв), ампліфікація при 52,2 °C 30 с, елонгація 72 °C 30 с, фінальна елонгація 72 °C 10 хв. Після ПЛР продукти ампліфікації були ідентифіковані за допомогою електрофорезу у 2 % агарозному гелі при Уф-опроміненні з використанням GoldView (China) барвника і відповідних маркерів нуклеотидних фрагментів. 3 Зразки продуктів інокулювали 22 КУО/г В. cereus ATCC14579 і змішували з 225 см поживного середовища і гомогенізували 2 хв та залишали для накопичення культури при 37 °C на 2-5 год. Після цього перемішували, додатково вводили інші збудники харчових отруєнь (колекційні культури St. aureus та Salmonella enteritidis), які інкубували окремо. 1 UA 122765 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Зразки центрифугували при 900 x g, 1 хв при 4 °C для видалення великих шматків продуктів, повторно центрифугували при 12000 x g, 5 хв при 4 °C. Після двократного промивання і суспендування у стерильній воді геном ДНК був екстрагований після попередньої обробки пропідіум моноазидом (ПМА), а потім підданий аналізу з використанням ПМА-мультиплекс ПЛР. Найближчий аналог і корисна модель, що заявляється, мають такі спільні ознаки: - підготування дослідних зразків; - виділення мікроорганізмів з дослідних зразків; - виділення геномів ДНК з виділених мікроорганізмів; - проведення мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції з використанням прямих і зворотних праймерів; - електрофорез продуктів мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції з використанням маркерів нуклеотидних фрагментів. Недоліки найближчого аналога: - використання мультиплексної композиції лише для живих мікроорганізмів не є достатньо показовим, оскільки токсини можуть перейти до сировини і продуктів із загиблих бактерій; - не дає змоги одночасного виявлення регламентованих мікроорганізмів, які, крім здатності викликати харчові отруєння, викликають псування продуктів (P.polymyxa, P.macercms); - не може комплексно характеризувати безпечність та якість продукту відносно наявності бацилярних контамінантів, оскільки спосіб дозволяє визначити їх лише частково. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб визначення бацилярних збудників харчових отруєнь та псування харчових продуктів, в якому шляхом проведення мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції системи, що містить геноми декількох мікроорганізмів, а також використання визначених пар праймерів та інших умов проведення мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції, забезпечити підвищення достовірності отриманих результатів та визначення одночасно декількох видів мікроорганізмів, а також можливість комплексно характеризувати безпечність та якість продукту відносно наявності бацилярних мікроорганізмів. Поставлена задача вирішується тим, що способом визначення бацилярних збудників харчових отруєнь та псування харчових продуктів, що передбачає підготування дослідних зразків, виділення мікроорганізмів, виділення геномів ДНК попередньо виділених мікроорганізмів, проведення мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції з використанням прямих і зворотних праймерів і електрофорез продуктів мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції з використанням маркерів нуклеотидних фрагментів, згідно з корисною моделлю, мультиплексну полімеразну ланцюгову реакцію здійснюють із системи, яка містить геноми декількох мікроорганізмів з використанням наступних пар праймерів: nheAF і nheAR по 0,15-0,25 мкМ; 29PpF і 179PpR по 0,15-0,22 мкМ; МАС 1 і МАС 2 по 0,1-0,2 мкМ, при цьому мультиплексну полімеразну ланцюгову реакцію проводять в наступній послідовності: первинна денатурація при 94-95 °C протягом 3-5 хв, далі - 30 циклів, кожен з яких включає денатурацію при 94 °C протягом 30-60 с, відпал при 51-56 °C протягом 30 с, первинну елонгацію при 72 °C протягом 30 с, після чого здійснюють остаточну елонгацію при 72 °C протягом 3-5 хв. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю заявлених ознак і досягненням заявленого технічного результату можна пояснити наступним. Філогенетичні зв'язки між живими організмами можуть бути простежені шляхом порівняння послідовностей генів ДНК або окремих ділянок рРНК. Особливо широко в таксономічних дослідженнях у бактерій використовуються послідовності генів малої (16S) субодиниці рРНК, оскільки вона має менш протяжний і тому менш мінливий ген в порівнянні з великою (23 S) субодиницею. При проведенні аналізу необхідністю є визначення концентрацій праймерів і їх конструювання таким чином, щоб вони були здатні розпізнавати кінці рестрикційних фрагментів. Для цієї мети необхідно модифікувати кінці рестрикційних фрагментів шляхом додавання до кінців олігонуклеотидних лінкерів (або адаптерів), оскільки ці фрагменти містять тільки декілька нуклеотидів, тобто від 2 до 8 нуклеотидів, що занадто мало для використання при побудові праймерів для ПЛР-амплифікації. Враховуючи використання мультиплексної композиції, можливо отримання псевдепозитивного або псевдонегативного результату внаслідок високої точності методу, тобто, внаслідок використання кількох дублюючих систем, одна з яких обов'язково знайде серед нуклеотидів зразок для ампліфікації. Можливі також зміни структури зразків під впливом високої температури, крім того, підвищена температура може призвести до повної руйнації зразка, утворення значної кількості фрагментів, які можуть заважати проведенню дослідження, а як наслідок - псевдонегативний або псевдопозитивний результат. 2 UA 122765 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Крім того, в харчових продуктах можуть міститися не тільки життєздатні бактерії, але й мертві клітини, токсини яких перейшли до складу продукту, внаслідок чого він став небезпечним для здоров'я людини, а визначення тільки життєздатних мікроорганізмів не дає повної характеристики безпечності досліджуваних об'єктів. В той же час, сама наявність у зразку частин гену В. cereus може свідчити про мікробіальну контамінацію продуктів і їх потенціальну небезпечність. Крім того, важливо під час одного дослідження визначити не один вид мікроорганізмів, а надати комплексну оцінку по кільком бацилярним контамінантам. Для підвищення ефективності кожного циклу необхідно оптимізувати ряд параметрів, у тому числі температуру відпалу. В ході ПЛР зразки інкубували при трьох різних температурах, що відповідають трьом етапам циклу: денатурація мішені, відпал і подовження праймера. Загальний режим відпалу розраховують за довжиною праймерів (у заявляемому способі 17-20 нуклеотидів). Початкове прогрівання в способі, що заявляється, 3-5 хв при 93-95 °C забезпечило повну денатурацію усіх молекул ДНК в зразку, і подальша денатурація в кожному циклі ампліфікації займала менше години. Температура відпалу визначає жорсткість умов гібридизації праймерів з мішенню і, відповідно, специфічність ампліфікації. Вона залежить від довжини праймера, його первинної структури (відсотків GC-пар) і іонної сили ПЛР-буфера. Висока іонна сила буфера і високий вміст GC-пар в праймерному олігонуклеотиді збільшують ефективну температуру відпалу. Варіювали температурою відпалу праймерів від 48 °C до 60 °C. При низькій температурі відпалу праймерів спостерігали велику кількість неспецифічних ампліконів. При верхній границі температури відпалу не вдалося отримати специфічні продукти ампліфікації. Температура 51-56 °C стала найбільш прийнятною для відпалу праймерів. Всього було використано 3 пари видоспецифічних праймерів: - nhe A-F (довжина 17), nhe A-R (довжина 19) для ентеротоксигенного гена nhe А, який характерний для усіх ентеротоксигенних представників виду Bacillus cereus; - 29PpF, 179PpR (довжина по 20) для специфічної ділянки 16S рРНК виду Paenibacillus polymyxa; - МАС 1, МАС 2 (довжина по 20) для специфічної ділянки 16S рРНК виду Paenibacillus macerans. Підвищення чутливості і достовірності досягається за рахунок оптимізації складу використаних пар праймерів (nhe AF та nhe AR, 29PpF та 179PpR, МАСІ та МАС 2), що дозволяє збільшити специфічність отримуваних ПЛР-продуктів, спрощення відбувається за рахунок використання одного режиму (замість двостадійності) під час початкової денатурації та одного режиму під час елонгації. Крім того, використані параметри дозволяють скоротити час дослідження. Технічним результатом даного способу є: – швидке визначення наявності бацилярних контамінантів харчових продуктів; – підвищення достовірності отриманих результатів завдяки підбору умов відпалу та кількості проведення циклів реплікації ПЛР; – спрощення процесу визначення регламентованих у харчових продуктах мікроорганізмів; – зменшення часу проведення досліджень; – можливості здійснення визначення під час скрінінгових досліджень. Спрощення досягається за рахунок: – можливість одночасного виявлення трьох регламентованих видів мікроорганізмів; – використання трьох пар праймерів (nhe AF та nhe AR, 29PpF та 179PpR, МАС 1 та МАС 2, пара - прямий - F і зворотний - R), які реагують на наявність генів токсичності; – використання оптимальних параметрів відпалу (t 51-56 °C, τ - час 30 с); – зменшення кількості циклів реплікації до 30. Ступінь токсичності зразків харчових продуктів, що можуть бути визначені запропонованим способом, визначається якісно, оскільки сама наявність в продукті В. cereus вже свідчить про серйозну небезпеку для здоров'я, оскільки генетично запрограмованою особливістю В. cereus є здатність виділяти комплекс характерних токсинів, відповідальних за прояв діарейного та еметичного синдромів. Використання у складі композиції праймерів на гени токсичності В. polymyxa, В. macerans дозволяє в одній пробі визначити бацилярні збудники харчових отруєнь та псування харчових продуктів. Для імітації інфікування і пошуку бактерій і їх ДНК в зразках консервованої продукції використали типові і колекційні штами мікроорганізмів з колекції культур кафедри мікробіології, вірусології і біотехнології Одеського національного університету імені І.І. Мечникова і Одеської національної академії харчових технологій, а саме: - Bacillus cereus ATCC 11778; - В. cereus ATCC 10702; 3 UA 122765 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 - В. cereus УКМ В 5650; - В. cereus УКМ В 5671; T - Paenibacillus polymyxa В 5760 ; T - Р. macerans В5803 ; - G. stearothermophilis BKM-B-718, Для виявлення чутливості ПЛР при ідентифікації ентеротоксигенних бактерій групи В. cereus були застосовані ряд десятиразових розведень суміші добових культур штамів В. cereus (В. cereus ATCC 11778, В. cereus ATCC 10702, В. cereus УКМ В 5650, В. cereus УКМ В 5671) в рідині з консервованої продукції. Усі застосовані розведення були протитровані для виявлення кількості КУО в рідині. 1 2 3 4 5 6 7 Вивчалися наступні концентрації бацил в рідині з консервів: 10 , 10 , 10 , 10 , 10 , 10 , 10 , 8 3 10 КУО/см . Точне визначення контамінації мікроорганізмами досягається вже при розведенні 10 КУО/см. Для швидкого виділення і очищення ДНК бактеріальних клітин використовували набір F1021 (SureFast® PREP Bacteria, CONGEN Biotechnologie GmbH, Germany). Склад суміші для проведення ПЛР: 10хПЛР буфер - 2 мкл, 50 мМ MgCl2-0,8 мкл, 2,5 мМ дНТФ - 1,6 мкл, Taqполімераза (5 Од/мкл) - 0,4 мкл. Очищену мікробну ДНК зберігали при мінус 20 °C для подальшого використання. Цикли ПЛР: первинна денатурація - 94-95 °C 3-5 хв, ЗО циклів денатурації 94 °C 30-60 с, відпал при 51-56 °C 30 с, елонгація при 72 °C 30 с, фінальна елонгація 72 °C, 3-5 хв (табл. 1). Реакцію проводили в ампліфікаторі BioRad (США). Для мультиплексної ПЛР використовували загальний об'єм 20 мкл. До складу ПЛР системи включали: 3-5 мкл геномної ДНК, 10 мкл суміші Taq-полімераза (5 Од/мкл, Латвія), прямого та зворотного праймерів: nheA по 0,15-0,25 мкМ, 29PpF та 179PpR по 0,15-0,22 мкМ, МАС 1 та МАС 2 по 0,1-0,2 мкМ. Стерильною дистильованою водою доводили до 20 мкл, 2 мкл використовували для дослідження. Як негативний контроль використали деіонізовану воду для контролю чистоти реактивів. Візуальну оцінку розміру утворених ампліконів проводили з використанням маркерів молекулярної маси. Електрофорез продуктів ПЛР з використанням відповідних маркерів нуклеотидних фрагментів проводили в агарозному гелі з масовою концентрацією агарози 1,5-2 %. ДНК 3 забарвлювали бромістим етидієм (0,5 мкг/см ) і фотографували гель відеосистемою (BioRad, США) під УФ-опроміненням (довжина хвилі 312 нм). Для розробки способу визначення в харчових зразках регламентованих бацилярних контамінантів моделювали інфікування штамами В. cereus з колекцій культур кафедри біохімії, мікробіології та фізіології харчування ОНАХТ і мікробіології, вірусології та біотехнології ОНУ імені І.І. Мечникова, а також штамами бацил, ізольованих з промислово поширених в Україні видів рослинної сировини і продуктів їх переробки. Зразки консервів та рослинної сировини 8 було інокульовано добовою культурою кожного із тест-штамів (~10 КУО) у співвідношенні 1:1. Для видалення залишків органічних речовин здійснювали попередню обробку проб рослинної продукції центрифугуванням 1-3 хв при 900-3000 об/хв та подальшу фільтрацію через нітроцелюлозні мембранні фільтри "Millipore" d 0,22 мкм або повторне центрифугування протягом 3-5 хв при 7000-9000 об/хв. Для швидкого виділення і очищення ДНК бактеріальних клітин використовували набір F1021 (SureFast® PREP Bacteria, CONGEN Biotechnologie GmbH, Germany). Далі геноми мікробних ДНК піддавали аналізу з використанням мультиплекс ПЛР. Запропонований спосіб дозволяє швидко виявити потенційно небезпечні об'єкти, які містять контамінанти мікробіологічного походження, що важливо для визначення безпечності харчових продуктів і продовольчої сировини та безпеки екології людини, а також моніторингу якості харчових систем. Спосіб здійснюється в наступному порядку. 1. Підготовка дослідного зразка. Дослідний зразок готують шляхом змивання зі свіжої сировини (огірки, морква, перець солодкий тощо або інших плодів) або шляхом її подрібнення і центрифугування для відділення шматків сировини. 2. Виділення мікроорганізмів. Змив або над осадову рідину фільтрують через нітроцелюлозні мембранні фільтри, наприклад, "Millipore", що затримують мікроорганізми або повторно центрифугують 3-5 хв при 7000-9000 об/хв. 3. Виділення геномів ДНК мікроорганізмів. 4 UA 122765 U 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 До фільтру з виділеними мікроорганізмами додають 1 см лізуючого буферу для розчинення 3 клітинних стінок мікроорганізмів, або осад з мікроорганізмами ресуспендують в 1 см лізуючого буферу. Далі виділення геномів мікроорганізмів проводять згідно інструкції до набору F1021 (SureFast® PREP Bacteria, CONGEN Biotechnologie GmbH, Germany). 4. Проведення мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції. Готують систему загальним об'ємом 20 мкл, яка містить 3-5 мкл геномів ДНК виділених мікроорганізмів, 10 мкл суміші для проведення ПЛР: 10х ПЛР буфер (реакційний буфер для проведення ампліфікації, оптимізований для високоспецифічної ПЛР, позначення 10х - коефіцієнт розведення іншими компонентами реакційної суміші, що вносяться) 2 мкл, розчин MgCl2 з молярною концентрацією 0,05 міль/л - 0,8 мкл, розчин дНТФ з молярною концентрацією 0,0025 моль/л - 1,6 мкл, розчин Taq-полімерази з ферментативною активністю 5 Од/мкл - 0,4 мкл (усі реагенти фірми Fermentas, Латвія), трьох пар прямих та зворотних праймерів, а саме: nheAY-nheAR по 0,150,25 мкМ, 29PpF-179PpR по 0,15-0,22 мкМ, МАС 1 - МАС 2 по 0,1-0,2 мкМ. Стерильною водою доводять до 20 мкл. З отриманої системи відбирають 2 мкл, які використовують для подальшого проведення мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції. Спочатку проводять первинну денатурацію при 94-95 °C протягом 3-5 хв, далі - 30 циклів, кожен з яких включає денатурацію при 94 °C протягом 30-60 с, відпал при 51-56 °C протягом 30 с, первинну елонгацію при 72 °C протягом 30 с, потім здійснюють остаточну елонгацію при 72 °C протягом 3-5 хв. 5. Електрофорез продуктів мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції. Електрофорез здійснюють з використанням відповідних маркерів нуклеотидних фрагментів в агарозному гелі з масовою концентрацією 1,5-2,0 %. ДНК забарвлюють бромистим етидієм 3 (0,5 мкг/см ) і фотографують гель відеосистемою, наприклад, BioRad (США) під УФопроміненням при λ=312ΗΜ. За результатами електрофорезу по електрофореграмі визначають наявність або відсутність регламентованих мікроорганізмів. Приклади, які ілюструють здійснення способу. Приклад 1 ілюструє дослідження наявності мікроорганізмів В. cereus АТСС 11778, Р. T Т 7 5 polymyxa В 5760 , P.macerans В5803 в модельному розчині із вмістом мікроорганізмів 10 -10 3 кл/см . Суспензію вказаних культур перемішували і здійснювали фільтрацію через нітроцелюлозні мембранні фільтри "Millipore" d 0,22 мкм. Для швидкого виділення і очищення ДНК бактеріальних клітин використовували набір F1021 (SureFast® PREP Bacteria, CONGEN Biotechnologie GmbH, Germany). Далі геноми мікробних ДНК піддавали аналізу з використанням мультиплекс ПЛР. До складу ПЛР системи включали: 3 мкл геномної ДНК, 10 мкл суміші 2xTaq Fermentas (Латвія), прямого та зворотного праймерів: nheA по 0,225 мкМ, 29PpF та 179PpR по 0,22 мкМ, МАС 1 та МАС 2 по 0,2 мкМ. Стерильною дистильованою водою доводили до 20 мкл, 2 мкл використовували для дослідження. Електрофореграма продуктів ПЛР з ДНК колекційних штамів бацил з парою специфічних олігонуклеотидних праймерів до гена nhe А наведена на кресл., де зображено Електрофореграма продуктів ПЛР, виділених з рослинної сировини і консервів, зі специфічними олігонуклеотидними праймерами, зразок 1. Відомості зведені в табл. (зразок 1). Приклад 2. Об'єкт дослідження - свіжа морква, яка була модельно контамінована В. cereus T АТСС 11778, Р. polymyxa В 5760, Р. macerans В 5803 . Брали наважку подрібненої свіжої моркви в кількості 25 г, заливали у співвідношенні 1:9 стерильною водою, перемішували, центрифугували 2 хв при 2000 об/хв. для видалення твердих шматків моркви, потім надосадову рідину повторно центрифугували при 3 хв при 8000 об/хв. 3 Осад з мікроорганізмами ресуспендували в 1 см лізуючого буферу. Далі виділення геномів мікроорганізмів проводили згідно інструкції до набору F1021 (SureFast® PREP Bacteria, CONGEN Biotechnologie GmbH, Germany). Очищену мікробну ДНК зберігали при мінус 20 °C для подальшого використання. Для мульплексної ПЛР використовували загальний об'єм 20 мкл. Далі геном ДНК об'ємом 2 мкл був підданий аналізу з використанням мультиплекс ПЛР. Умови проведення та результати наведені в табл. (зразок 2), на кресл. (смуга 2). На електрофореграмі наявні 3 смуги, які відповідають визначеним ампліконам розмірами 100 п.о. (P. macerans), 150 п.о. (P. polymyxa), 617 п. о. (В. cereus). Приклад 3. Об'єкт дослідження - консервований горошок. Рідину з консервів заздалегідь контамінували В. cereus ATCC 11778, P. polymyxa В 5760, P. macerans В 5803 шляхом додавання типових культур перелічених мікроорганізмів у кількості 10-10 кл/см при співвідношенні 1:1, перемішували, потім центрифугували 2 хв при 1500 об/хв для видалення 5 UA 122765 U 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 залишків органічних речовин. Потім 5 см рідини з певним розведенням інокульованих клітинами бактерій, фільтрували крізь мембранні фільтри нітроцелюлози "Millipore" d 0,22 мкм. Фільтр після фільтрації використали для виділення ДНК з використанням експрес-набору, як в попередніх прикладах. ПЛР - аналіз здійснювали аналогічно прикладу 2. Умови проведення та результати наведені в табл., кресл. (зразок 3). Приклад 4. Об'єкт дослідження - болгарський перець. Здійснювали змиви з поверхні T продукту, які контамінували мікроорганізмами В. cereus ATCC 11778, P. polymyxa В 5760 , P. і macerans В 5803 . Далі дослідження здійснювали аналогічно прикладу 2. Умови проведення та результати наведені в табл., кресл. (зразок 4). Приклад 5. Об'єкт дослідження - баклажани. Сировину подрібнювали, перемішували зі стерильною водою при співвідношенні 1:1, потім для видалення залишків органічних речовин здійснювали центрифугування 2 хв при 3000 об/хв та фільтрацію через нітроцелюлозні мембранні фільтри "Millipore" d 0,22 мкм. Для швидкого виділення і очищення ДНК бактеріальних клітин використовували набір F1021 (SureFast® PREP Bacteria, CONGEN Biotechnologie GmbH, Germany). Далі геноми мікробних ДНК піддавали аналізу з використанням мультиплекс ПЛР. Для мультиплексної ПЛР використовували загальний об'єм 20 мкл. Умови проведення та результати наведені в табл., результати електрофорезу наведені на кресл. (зразок 5) Знайдено амплікон розміром 100 п. о. (P. macerans). Приклад 6. Здійснювали аналогічно прикладу 2, але як досліджувану сировину брали томати, гомогенізували, здійснювали центрифугування 3 хв при 2000 об/хв для видалення твердих залишків томатів, потім - повторне центрифугування протягом 5 хв при 7000 об/хв. Далі аналіз проводили аналогічно прикладу 2. Умови проведення та результати наведені в табл. (зразок 6). Як свідчить дані електрофореграми, продуктів ампліфікації з досліджуваними розмірами не виявлено (кресл., зразок 6). Приклад 7. Об'єкт дослідження - кабачки, контаміновані мікроорганізмами В. cereus АТСС 11778, Р. polymyxa В 5760, P. macerans В 5803. Дослідження здійснювали аналогічно прикладу 2. Умови проведення та результати наведені в табл., кресл. (зразок 7). Приклад 8. Здійснювали аналогічно прикладу 2, але досліджували харчоконцентрати, а саме, "Суп гороховий", змішували зі стерильною водою у співвідношенні 1:2, здійснювали центрифугування 4 хв при 2000 об/хв для видалення твердих залишків харчоконцентратів, потім - повторне центрифугування протягом 2 хв при 9000 об/хв. Аналіз ПЛР проводили аналогічно прикладу 2. Умови проведення та результати наведені в табл., кресл. (зразок 8). З електрофореграми видно, що знайдені продукти ампліфікації розмірами 100 п. о. (P. macerans), 617 п. о. (В. cereus). Приклад 9. Здійснювали аналогічно прикладу 2, але досліджували суміш прянощів, екстракцію проводили стерильною водою у співвідношенні 1:2, здійснювали центрифугування 1 хв при 900 об/хв для видалення твердих залишків харчоконцентратів, потім фільтрацію крізь нітроцелюлозні мембранні фільтри "Millipore" d 0,22 мкм. Далі аналіз проводили аналогічно прикладу 2. Умови проведення та результати наведені в табл., кресл. (зразок 9). З електрофореграми видно, що знайдені продукти ампліфікації розмірами розмірами 100 п. о. (P. macerans), 150 п. о. (P. polymyxa), 617 п. о. (В. cereus). Приклади 10-14 ілюструють дослідження наявності мікроорганізмів в різних консервах з ознаками псування. Умови проведення мультиплексної ПЛР і результати дослідження наведені в табл. і на кресл. На електрофореграмі (зразок 15) наведені маркери молекулярної маси, зразок 16 негативний контроль (відсутність ампліконів підтверджується контролем на реактиви для проведення ПЛР). 6 UA 122765 U Таблиця Результати дослідження наявності В. cereus, P. polymyxa, P. macerans у складі консервованої продукції та овочів № з/п 1 Досліджувані зразки В. cereus, P. polymyxa, P. macerans Умови проведення циклів ПЛР 94 °C, 3 хв → (94 °C, 30с →51 °C, 30 с → 72 °C, + 30 с) 30 циклів → 72 °C, 4 хв 94 °C, 5 хв → (94 °C, 30с → 53 °C, 30 с → 72 °C, 30 с) 30 циклів → 72 °C, 4 хв консервований 94 °C, 5 хв → (94 °C, 30 с → 52 °C, 30 с → 3 горошок* 72 °C, 30 с) 30 циклів → 72 °C, 5 хв перець солодкий 94 °C, 4 хв → (94 °C, 60с -→56 °C, 30 с → 72 °C, 4 болгарський* 30 с) 30 циклів → 72 °C, 3 хв 94 °C, 5 хв → (94 °C, 60 с →54 °C, 30 с → 72 °C, 5 баклажани 30 с) 30 циклів → 72 °C, 5 хв 94 °C, 4 хв → (94 °C, 60с →53 °C, 30 с → 72 °C, 6 томати 30 с) 30 циклів → 72 °C, 3 хв 94 °C, 5 хв → (94 °C, 60 с →52 °C, 30 с → 72 °C, 7 кабачки* 30 с) 30 циклів → 72 °C, 3 хв харчокон94 °C, 5 хв → (94 °C, 60 с → 55 °C, 30 с → 8 центрати 72 °C, 30 с) 30 циклів → 72 °C, 5 хв 94 °C, 5 хв → (94 °C, 30 с →54 °C, 30 с → 72 °C, 9 суміш прянощів 30 с) 30 циклів → 72 °C, 4 хв консерви з ознаками псування «Гриби 94 °C, 5 хв → (94 °C, 60 с → 56 °C, 30 с → 10 натуральні 72 °C, 30 с) 30 циклів → 72 °C, 3 хв відварені» 95 °C, 3 хв → (94 °C, 30 с → 52 °C, 30 с → 11 «Сік морквяний» 72 °C, 30 с) 30 циклів → 72 °C, 5 хв «Сік морквяно94 °C, 4 хв → (94 °C, 30 с → 53 °C, 30 с → 12 яблучний» 72 °C, 30 с) 30 циклів → 72 °C, 3 хв 95 °C, 3 хв → (94 °C, 30 с → 51 °C, 30 с → 13 «Ікра кабачкова» 72 °C, 30 с) 30 циклів → 72 °C, 4 хв «Ікра 94 °C, 4 хв → (94 °C, 60 с → 53 °C, 30 с → 14 баклажанна» 72 °C, 30 с) 30 циклів → 72 °C, 5 хв 2 Вид гена 29Рр, nheA МАС 179Рр морква* + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Примітка: * зразки, контаміновані мікроорганізмами В. cereus, P. polymyxa, P. macerans 5 10 15 На кресл. Електрофореграма продуктів ПЛР, виділених з рослинної сировини і консервів, зі специфічними олігонуклеотидними праймерами: 1. В. cereus, P. polymyxa, P. macerans (позитивний контроль); 2. В. cereus, P. polymyxa, P. macerans (модельно контамінований зразок з моркви); 3. В. cereus, P. polymyxa, P. macerans (модельно контамінований зразок з консервованого горошку); 4. В. cereus, P. polymyxa, P. macerans (модельно контамінований зразок із солодкого болгарського перцю); 5. P. macerans (з баклажанів); 6. Негативний результат (зразок з томатів); 7. В. cereus, P. polymyxa, P. macerans (модельно контамінований зразок з кабачків); 8. В. cereus, P. macerans (зразок харчоконцентратів); 9. В. cereus, P. polymyxa, P. macerans (зразок суміші прянощів "Хмелі-сунелі"); 10. В. cereus, P. polymyxa, P. macerans (зразок консервів "Гриби натуральні відварені"); 11.5. cereus, P. macerans (зразок "Сік морквяний"); 12. P. polymyxa, P. macerans (зразок "Сік морквяно-яблучний"); 13. P. macerans (з консервів "Ікра кабачкова"); 7 UA 122765 U 14. P. polymyxa, P. macerans (з консервів "Ікра баклажанна") 15. маркери молекулярної маси (pBR322 / BsuRl, Fermentas); 16. негативний контроль ПЛР. 5 10 15 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб визначення бацилярних збудників харчових отруєнь та псування харчових продуктів, що включає підготування дослідних зразків, виділення мікроорганізмів, виділення геномів ДНК попередньо виділених мікроорганізмів, проведення мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції з використанням прямих і зворотних праймерів і електрофорез продуктів мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції з використанням маркерів нуклеотидних фрагментів, який відрізняється тим, що мультиплексну полімеразну ланцюгову реакцію здійснюють із системи, яка містить геноми декількох мікроорганізмів з використанням наступних пар праймерів: nheAF і nheAR по 0,15-0,25 мкМ; 29PpF і 179PpR по 0,15-0,22 мкМ; МАС 1 і МАС 2 по 0,1-0,2 мкМ, при цьому мультиплексну полімеразну ланцюгову реакцію проводять в наступній послідовності: первинна денатурація при 94-95 °C протягом 3-5 хв, далі - 30 циклів, кожен з яких включає денатурацію при 94 °C протягом 30-60 с, відпал при 51-56 °C протягом 30 с, первинну елонгацію при 72 °C протягом 30 с, після чого здійснюють остаточну елонгацію при 72 °C протягом 3-5 хв. Комп’ютерна верстка О. Рябко Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 8