Пуринові інгібітори циклінозалежної кінази 2 та ікв-a

Це часткове продовження заявки №08/692012 на патент США, поданої 2 серпня 1996 року, що розглядається одночасно. Цей винахід належить до 2,6,9-тризаміщених пуринів, які, як було відкрито, є вибірковими інгібіторами кіназ клітинного циклу і, як такі, згадані сполуки є інгібіторами проліферації клітин. Згадані 2,6,9-тризаміщені пурини є придатними, наприклад, для лікування автоімунних захворювань, наприклад, ревматоїдного артриту, вовчака, діабету типу І, розсіяного склерозу і т.ін., для лікування раку, серцево-судинних хвороб, наприклад, рестенозу, реакції "трансплантату проти хазяїна", подагри, полікістозної хвороби нирок та інших проліферативних захворювань, патогенез яких залучає аномальну проліферацію клітин. Цей винахід має також відношення до 2,6,9-тризаміщених пуринів, які, як було відкрито, є активними та специфічними інгібіторами ІкВ-α кінази, яка попереджає передачу сигналу, індукованого активацією NF-κΒ та синтезом цитокінів in vitro та in vivo. Такі інгібітори, як очікується, інгібірують синтез цитокінів та адгезивних білків, синтез яких транскрипційно регулюється NF-кB. До молекул цього класу належать протизапальні цитокіни, наприклад, IL-1, IL-6, TNF (фактор некротизації пухлинних клітин) та адгезивні білки, (наприклад, ІСАМ (фактор міжклітинної адгезії-1), VCAM (фактор адгезії судинних клітин) та деякі інші), і які, як гадають, бувають залученими до патогенезу запальних захворювань. Таким чином, активний інгібітор ІкВ-α кінази є придатним для клінічного лікування хвороб, де для індукування хвороби необхідною є активація NF-кB. За останні декілька років, завдяки досягненням у галузі молекулярної та клітинної біології, було зроблено суттєвий внесок до розуміння механізмів проліферації клітин та специфічних випадків, які відбуваються під час проходження клітинами мітотичних циклів. Див., наприклад, "Progress in Cell Cycle Research", томі, редактори Л.Мейджер (L.Meijer), C.Гіде (S.Guidet), Г.І.Л.Танг (H.Y.L.Tung); видавництво Plenum Press, Нью-Йорк, 1995. Результати [згаданих досліджень показали, що проходження клітиною клітинного циклу контролюється сімейством серин/треонінкіназ, які називаються циклінзалежними кіназами. До складу цих ферментів входить (а) каталітичний білок, який називають циклінзалежною кіназою (CDK), який використовує АТФ, як субстрат та (b) регуляторний білок, який має назву циклін. Різні комбінації цикліну-CDK контролюють такі явища, як ріст, реплікація ДНК та поділ клітин. Одним з ключових членів сімейства ферментів CDK є CDK2. Було показано, що активність CDK2 є незамінною для досягнення клітинним циклом ссавців межі G1 (постмітотичний період)/S (синтентичний період). Мікровпорскування антитіл, спрямованих проти CDK2, блокує перехід диплоїдних фібробластів людини до S періоду клітинного циклу. Подібний ефект має експресія домінуючого негативного мутанту CDK2 у клітинах остеосаркоми людини. Дані згаданих досліджень, взяті разом, свідчать про те, що пригнічення активності клітинної CDK2 буде перешкоджати проходженню клітин через згаданий мітотичний цикл та індукувати зупинку росту перед S періодом. Відповідно до цієї точки зору, результати досліджень оломуцину (2-(гідроксиетиламіно)-6-бензиламіно-9-метилпурину) in vitro показали, що ця сполука є специфічним інгібітором CDK2 з ІС50, яка дорівнює, приблизно, 2,1мкг/мл (Дж. Веслі (J.Vesely) та інші; Eur. J.Biochem., 224, 771-786 (1994), Л.Мейджер (L.Meijer) "Chemical Inhibitors of Cyclin-Dependent Kinases", стор.351-356 у "Progress in Cell Cycle Research", том 1, редактори Л.Мейджер (L.Meijer), C.Гіде (S.Guidet), Г.І.Л.Танг (H.Y.L.Tung); видавництво Plenum Press, Нью-Йорк, 1995. Результати досліджень клітин ссавців у культурі in vi vo показали, що оломуцин пригнічує проліферацію клітин у приблизній концентрації 50мкг/мл. Відповідно до цього винаходу, ми одержали декілька сполук, біологічна активність яких є значно вищою за біологічну активність оломуцину. Результати досліджень in vivo з використанням клітин ссавців свідчать, що деякі з розкритих сполук інгібірують проліферацію клітин у концентраціях, що є значно нижчими за концентрацію оломуцину. Нещодавно було описано активність ІкВ-α кінази у цитоплазмі стимульованих ендотеліальних клітин пупкової вени людини (Беннетт (Bennett) та інші (1996), J.Biol. Chem. 271, 19680-19688). Деякі зі сполук за цим винаходом було ідентифіковано, як активні та специфічні інгібітори ІкВ-α кінази, які перешкоджають передачі сигналу, індукованого активацією NF-κΒ та синтезом цитокінів in vitro та in vivo. Згадана активація гетеродимерного фактору транскрипції NF-κΒ є складним процесом. У нестимульованих клітин, гетеродимер NF-κΒ (р50/р65) знаходиться у цитозолі, де утворює комплексну сполуку з пригнічувальною субодиницею ІкВα; згадана ІкВ-α зв'язується з NF-κΒ, маскуючи, таким чином, сигнал ядерної локалізації цього фактору та запобігаючи його переміщенню до ядра. У разі стимулювання клітин за допомогою різноманітних сигналів (наприклад, ліпополісахариду), ІкВ-α швидко фосфорилюється, уніквітинується та розщеплюється протеосомою. Розщеплення ІкВ-α надає можливість переміщення NF-κΒ до ядра, де він активує транскрипцію ряду генів запальної реакції. Результати цих спостережень дозволяють висунути припущення про те, що ІкВ-α кіназа є привабливою мішенню для ідентифікування інгібіторів, які могли б бути придатними при лікуванні запальних захворювань, де для індукування хвороби необхідною є активація NF-кB. Ціллю цього винаходу є надання 2,6,9-тризаміщених пуринових сполук, які пригнічують циклінзалежну кіназу 2. Наступною ціллю цього винаходу є надання 2,6,9-тризаміщених пуринових сполук, які є придатними для інгібірування проліферації клітин. Цей винахід також надає фармацевтичну композицію, до складу якої входить 2,6,9-тризаміщена пуринова сполука та фармацевтично прийнятний носій. Цей винахід, додатково, надає спосіб інгібірування проліферації клітин, який включає введення ссавцю, який цього потребує, ефективної кількості 2,6,9-тризаміщеної пуринової сполуки. За одним з варіантів втілення, цей винахід представляє собою А 2,6,9-тризаміщену пуринову композицію, яка має наведену далі формулу: де X - аміно, оксо, тіо або сульфонова складова; R1 - галоген або R1'-X, де X - аміно, оксо, тіо або сульфонова складова. X, у переважному варіанті, - аміно. R1' - нижчий алкіл, заміщений нижчий алкіл, циклоалкіл, заміщений циклоалкіл, циклогетероалкіл, заміщений циклогетероалкіл, арил, заміщений арил, гетероцикл, гетарил, заміщений гетарил, аралкіл, гетероаралкіл, гетероалкіл, алкілалкеніл, алкілалкініл, алкілциклоалкіл або алкілциклогетероалкіл, кожен з яких має від 1 до 20 атомів вуглецю; R2' - водень, нижчий алкіл, заміщений нижчий алкіл, циклоалкіл, заміщений циклоалкіл, арил, заміщений арил, гетероцикл, гетарил, заміщений гетарил, аралкіл, гетероаралкіл, гетероалкіл, алкілалкеніл, алкілалкініл, алкілциклоалкіл або алкілциклогетероалкіл; R3 - галоген, гідроксил, тіо, алкокси, алкілтіо, нижчий алкіл, -NR 4R5 або компонент, який має формулу: де m=1-3, n=1-3, о=1-3; Y=карбоніл, -NR4R5, гідроксил, тіол, алкокси, алкілтіо, та де кожен R4 та R5 (незалежно) вибирають з групи, до складу якої входить водень, нижчий алкіл, заміщений нижчий алкіл, алкокси, аміно, амідо, карбоксил, циклоалкіл, заміщений циклоалкіл, гетероцикл, циклогетероалкіл, заміщений циклогетероалкіл, ацил, арил, заміщений арил, арилокси, гетарил, заміщений гетарил, аралкіл, гетероаралкіл, алкілалкеніл, алкілалкініл, алкілциклоалкіл, алкілциклогетероалкіл або ціано; який має від 1 до 20 атомів вуглецю та, у переважному варіанті, від 2 до 6 атомів вуглецю. Додатково, коли Υ - карбоніл, R'4 у згаданій композиції не існує. R4" та R5" можуть бути єдиним атомом кисню, та R 4'" та R5'" можуть бути єдиним атомом кисню. R4 та R5, у переважному варіанті, є однаковим або різним заміщеним нижчим алкілом, який має від 2 до 6 атомів вуглецю та, у переважному варіанті, СН2СН2ОН, СН2НС(СН3)ОН та їх суміші. Існ ують деякі обмеження у об'ємі R1 R1', R2, R3, коли R3 є 2-гідроксиетиламіно та R2 є метил, R1'-X не може бути аміно, 3метил-2-бутеніламіно, бензиламіно або 3-гідроксибензиламіно. Коли R3 є 2-гідроксиетиламіно та R2 є ізопропіл, R1'-X не є бензиламіно, 3-гідроксибензиламіно або 3-метилбутиламіно. Коли R3 є 2гідроксиетиламіно та R2 є 2-гідроксиетил, R1' -X не може бути бензиламіно. Коли R 3 вибирають з групи, до складу якої входить 2-пропанол-2-метиламіно та 2-диметиламіноетиламіно, та R2 є метил, у такому разі R1'-X не може бути бензиламіно. За іншим варіантом втілення, цей винахід є способом інгібірування проліферації клітин у ссавців, який включає введення терапевтично ефективної кількості сполуки за п.1 згаданому ссавцю. Згаданий спосіб є придатним для лікування порушень проліферації клітин, наприклад, ревматоїдного артриту, вовчаку, діабету типу І, розсіяного склерозу, раку, рестенозу, реакції "трансплантат проти хазяїна" та подагри. Ще за іншим варіантом втілення, цей винахід є фармацевтичною композицією, до складу якої входить композиція, яку було наведено перед тим, у суміші з одним або декількома фармацевтичними наповнювачами. Ще за іншим варіантом втілення, цей винахід є композицією, придатною для лікування грибкових інфекцій (грибів) у людей, тварин та рослин. На Фігурі 1 наведено діаграму середньої площини неоінтими сонної артерії пацюка, обробленої сольовим носієм та сполукою 3, одержаною за Прикладом 2, де незаштрихований стовпчик представляє собою необроблений розтин сонної артерії, у той час як заштрихований стовпчик представляє собою оброблений розтин згаданої сонної артерії. Цей винахід має відношення до 2,6,9-тризаміщеної пуринової сполуки, яка має наведену далі формулу: де R1 - галоген або R1'-X, де Χ - аміно, оксо, тіо або сульфонова складова. X, у переважному варіанті, - аміно. R1' може бути нижчим алкілом, заміщеним нижчим алкілом, циклоалкілом, заміщеним циклоалкілом, циклогетероалкілом, заміщеним циклогетероалкілом, арилом, заміщеним арилом, гетероциклом, гетарилом, заміщеним гетарилом, аралкілом, гетероаралкілом, гетероалкілом, алкілалкенілом, алкілалкінілом, алкілциклоалкілом або алкілциклогетероалкілом, кожен з яких має від 1 до 20 атомів вуглецю. R1', у переважному варіанті, є СН2-арил, СН2-заміщений арил, 4-метоксибензил, 4-хлорбензил, 4-нітробензил, 4-(2піридиніл)бензил, арил, заміщений арил, 3-тіометоксифеніл або 4-тіометоксифеніл. R2 може бути воднем, нижчим алкілом, заміщеним нижчим алкілом, циклоалкілом, заміщеним циклоалкілом, арилом, заміщеним арилом, гетероциклом, гетарилом, заміщеним гетарилом, аралкілом, гетероаралкілом, заміщеним гетероаралкілом, гетероалкілом, алкілалкенілом, алкілалкінілом, алкілциклоалкілом або алкілциклогетероалкілом, де вуглеводневі складові мають від 1 до 20 атомів вуглецю. R2, у переважному варіанті, ізопропіл. R3 - галоген, гідроксил, тіо, алкокси, алкілтіо, нижчий алкіл, -NR 4R5 або компонент, який має формулу: де m=1-3, n=1-3, о=1-3; Y=карбоніл, -NR4R5, гідроксил, тіол, алкокси, алкілтіо, та де кожен R4 та R5 вибирають з групи, до складу якої входить водень, нижчий алкіл, заміщений нижчий алкіл, алкокси, аміно, амідо, карбоксил, циклоалкіл, заміщений циклоалкіл, гетероцикл, циклогетероалкіл, заміщений циклогетероалкіл, ацил, арил, заміщений арил, арилокси, гетарил, заміщений гетарил, аралкіл, гетероаралкіл, алкілалкеніл, алкілалкініл, алкілциклоалкіл, алкілциклогетероалкіл або ціано, який має від 1 до 20 атомів вуглецю та, у переважному варіанті, від 2 до 6 атомів вуглецю. Додатково, коли Υ - карбоніл, R'4 у згаданій композиції не існує. R4" та R5 " може бути єдиним атомом кисню, та R 4'" та R5'" може бути єдиним атомом кисню. R4 та R5, у переважному варіанті, є однаковим або різним заміщеним нижчим алкілом, який має від 2 до 6 атомів вуглецю та включає -СН2СН2ОН та -СН2СН(СН3)ОН. Існують деякі обмеження у об'ємі R1, R1', R2 та R3. Коли R3 є 2-гідроксиетиламіно та R2 є метил, R1'-X не може бути аміно, 3-метил-2-бутеніламіно, бензиламіно або m-гідроксибензил-аміно. Коли R3 є 2гідроксиетиламіно та R2 є ізопропіл, R1'-X не може бути бензиламіно, m-гідроксибензиламіно або 3метилбутиламіно. Коли R3 є 2-гідроксиетиламіно та R2 є 2-гідроксиетил, R1'-X не може бути бензиламіно. Коли R3 є 2-пропанол-2-метиламіно або 2-диметиламіноетиламіно, та R2 є метил, R1'-X не може бути бензиламіно. Далі наведено визначення деяких термінів, які використано у цьому описі. Згаданий термін "галоген" означає атоми фтору, брому, хлору або йоду. Згаданий термін "гідроксил" означає групу -ОН. Згаданий термін "тіол" або "меркапто" означає групу -SH. Згаданий термін "нижчий алкіл" означає циклічну алкільну групу з розгалуженим або прямим ланцюгом, який складається з одного-десяти атомів вуглецю. Як додаткові приклади до пояснення цього терміну, наводяться такі групи, як метил, етил, n-пропіл, i-пропіл, n-бутил, t-бутил, i-бутил (або 2-метилпропіл), циклопропілметил, i-аміл, n-аміл, гексил і т.ін. Згаданий термін "заміщений нижчий алкіл" означає нижчий алкіл, опис якого було наведено щойно перед тим, який включає одну або декілька таких груп, як гідроксил, тіол, алкілтіол, галоген, алкокси, аміно, амідо, карбоксил, циклоалкіл, заміщений циклоалкіл, гетероцикл, циклогетероалкіл, заміщений циклогетероалкіл, ацил, карбоксил, арил, заміщений арил, арилокси, гетарил, заміщений гетарил, аралкіл, гетероаралкіл, алкілалкеніл, алкілалкініл, алкілциклоалкіл, алкілциклогетероалкіл та ціано. Ці групи можуть приєднуватись до будь-якого атому вуглецю нижчої алкільної складової. Згаданий термін "алкілалкеніл" означає групу -R-CR'=CR'"R"", де R-нижчий алкіл або заміщений нижчий алкіл, R', R'", R"" можуть, незалежно, бути воднем, галогеном, нижчим алкілом, заміщеним нижчим алкілом, ацилом, арилом, заміщеним арилом, гетарилом або заміщеним гетарилом, як визначено далі. Згаданий термін "алкілалкініл" означає групи -RC=CR', де R – нижчий алкіл або заміщений нижчий алкіл, R' - водень, нижчий алкіл, заміщений нижчий алкіл, ацил, арил, заміщений арил, гетарил або заміщений гетарил, як визначено далі. Згаданий термін "алкокси" означає групу -OR, де R - нижчий алкіл, заміщений нижчий алкіл, ацил, арил, заміщений арил, аралкіл, заміщений аралкіл, гетероалкіл, гетероарил алкіл, циклоалкіл, заміщений циклоалкіл, циклогетероалкіл або заміщений циклогетероалкіл, як визначається. Згаданий термін "алкілтіо" означає групу -SR, -S(O)n=1-2-R, де R - нижчий алкіл, заміщений нижчий алкіл, арил, заміщений арил, аралкіл або заміщений аралкіл, як визначено у цьому описі. Згаданий термін "ацил" означає групи -C(O)R, де R - водень, нижчий алкіл, заміщений нижчий алкіл, арил, заміщений арил і т.ін., як визначається у цьому описі. Згаданий термін "арилокси" означає групи -ОАr, де Аr - арил, заміщений арил, гетероарил або заміщена гетероарильна група, як визначається у цьому описі. Згаданий термін "аміно" означає групу NRR', де R та R' можуть, незалежно, бути воднем, нижчим алкілом, заміщеним нижчим алкілом, арилом, заміщеним арилом, гетарилом або заміщеним гетарилом, як визначається у цьому описі або ацилом. Згаданий термін "амідо" означає групу -C(O)NRR', де R та R' можуть, незалежно, бути воднем, нижчим алкілом, заміщеним нижчим алкілом, арилом, заміщеним арилом, гетарилом або заміщеним гетарилом, як визначається у цьому описі. Згаданий термін "карбоксил" означає групу -C(O)OR, де R може бути, незалежно, воднем, нижчим алкілом, заміщеним нижчим алкілом, арилом, заміщеним арилом, гетарилом та заміщеним гетарилом, як визначається у цьому описі. Згаданий термін "арил" або "Аr" означає ароматичну карбоциклічну групу, яка має, як мінімум, одне ароматичне кільце (наприклад, феніл або дифеніл), або численні сконденсовані кільця, з-посеред яких, як мінімум, одне кільце є ароматичним (наприклад, 1,2,3,4-тетрагідронафтил, нафтил, антрил або фенантрил). Згаданий термін "заміщений арил" означає арил, факультативно заміщений однією або декількома функціональними групами, наприклад, галогеном, нижчим алкілом, нижчим алкокси, алкілтіо, ацетиленом, аміно, амідо, карбоксилом, гідроксилом, арилом, арилокси, гетероциклом, гетарилом, заміщеним гетарилом, нітро, ціано, тіолом, сульфамідо і т.ін. Згаданий термін "гетероцикл" означає насичену, ненасичену або ароматичну карбоциклічну групу, яка має одне кільце (наприклад, морфоліно, піридил або фурил) або численні сконденсовані кільця (наприклад, нафтопіридил, хіноксаліл, хінолініл, індолізиніл або бензо[b]тієніл) та, як мінімум, один гетероатом, наприклад, N, О або S у згаданому кільці, який може, факультативно, бути незаміщеним або заміщеним, наприклад, галогеном, нижчим алкілом, нижчим алкокси, нижчим алкілтіо, ацетиленом, аміно, амідо, карбоксилом, гідроксилом, арилом, арилокси, гетероциклом, гетарилом, заміщеним гетарилом, нітро, ціано, тіолом, сульфамідо і т.ін. Згаданий термін "гетероарил" або "гетар" означає гетероцикл, у якому, як мінімум, одне гетероциклічне кільце є ароматичним. Згаданий термін "заміщений гетероарил" означає гетероцикл, факультативно, моно або полізаміщений однією або декількома функціональними групами, наприклад, галогеном, нижчим алкілом, нижчим алкокси, нижчим алкілтіо, ацетиленом, аміно, амідо, карбоксилом, гідроксилом, арилом, арилокси, гетероциклом, заміщеним гетероциклом, гетарилом, заміщеним гетарилом, нітро, ціано, тіолом, сульфамідо і т.ін. Згаданий термін "аралкіл" означає групу -R-Ar, де Аr - арильна група та R - нижчий алкіл або заміщена нижча алкільна група. Арильна група може, факультативно, бути незаміщеною або заміщеною, наприклад, галогеном, нижчим алкілом, алкокси, алкілтіо, ацетилен, аміно, амідо, карбоксилом, гідроксилом, арилом, арилокси, гетероциклом, заміщеним гетероциклом, гетарилом, заміщеним гетарилом, нітро, ціано, тіолом, сульфамідо і т.ін. Згаданий термін "гетероалкіл" означає групу -R-Het, де Het-гетероциклічна група та R - нижча алкільна група. Гетероалкільні групи можуть, факультативно, бути незаміщеними або заміщеними, наприклад, галогеном, нижчим алкілом, нижчим алкокси, алкілтіо, ацетиленом, аміно, амідо, карбоксилом, арилом, арилокси, гетероциклом, заміщеним гетероциклом, гетарилом, заміщеним гетарилом, нітро, ціано, тіолом, сульфамідо і т.ін. Згаданий термін "гетероарилалкіл" означає групу -R-HetAr, де HetAr -гетероарильна група та R - нижчий алкіл або заміщений нижчий алкіл. Гетероарилалкільні групи можуть, факультативно, бути незаміщеними або заміщеними, наприклад, галогеном, нижчим алкілом, заміщеним нижчим алкілом, алкокси, алкілтіо, ацетиленом, арилом, арилокси, гетероциклом, заміщеним гетероциклом, гетарилом, заміщеним гетарилом, нітро, ціано, тіолом, сульфамідо і т.ін. Згаданий термін "циклоалкіл" означає двовалентну циклічну або поліциклічну алкільну гр упу, до складу якої входить від 3 до 15 атомів вуглецю. Згаданий термін "заміщений циклоалкіл" означає циклоалкільну групу, яка включає один або декілька замісників, наприклад, галоген, нижчий алкіл, заміщений нижчий алкіл, алкокси, алкілтіо, ацетилен, арил, арилокси, гетероцикл, заміщений гетероцикл, гетарил, заміщений гетарил, нітро, ціано, тіол, сульфамідо і т.ін. Згаданий термін "циклогетероалкіл" означає циклоалкільну груп у, де один або декілька атомів вуглецю кільця заміщено гетероатомом (наприклад, N, О, S або Р). Згаданий термін "заміщений циклогетероалкіл" означає циклогетероалкільну гр упу, визначення якої наведено у цьому описі, до складу якої входить один або декілька замісників, наприклад, галоген, нижчий алкіл, нижчий алкокси, алкілтіо, ацетилен, аміно, амідо, карбоксил, гідроксил, арил, арилокси, гетероцикл, заміщений гетероцикл, гетарил, заміщений гетарил, нітро, ціано, тіол, сульфамідо і т.ін. Згаданий термін "алкілциклоалкіл" означає групу-R-циклоалкіл, де циклоалкіл є циклоалкільною групою, a R - нижчий алкіл або заміщений нижчий алкіл. Циклоалкільні групи можуть бути, факультативно, незаміщеними або заміщеними, наприклад, галогеном, нижчим алкілом, нижчим алкокси, алкілтіо, ацетиленом, аміно, амідо, карбоксилом, гідроксилом, арилом, арилокси, гетероциклом, заміщеним гетероциклом, гетарилом, заміщеним гетарилом, нітро, ціано, тіолом, сульфамідо і т.ін. Згаданий термін "алкілциклогетероалкіл" означає групу-R-циклогетероалкіл, де R - нижчий алкіл або заміщений нижчий алкіл. Циклогетероалкільні групи можуть бути, факультативно, незаміщеними або заміщеними, наприклад, галогеном, нижчим алкілом, нижчим алкокси, алкілтіо, аміно, амідо, карбоксилом, ацетиленом, гідроксилом, арилом, арилокси, гетероциклом, заміщеним гетероциклом, гетарилом, заміщеним гетарилом, нітро, ціано, тіолом, сульфамідо і т.ін. У разі, якщо до складу кінцевої 2,6,9-тризаміщеної пуринової сполуки за цим винаходом входить основна група, може бути одержана сіль згаданої сполуки, яку одержують шляхом додання кислоти. Солі згаданих сполук за цим винаходом, які одержують доданням кислоти, одержують стандартним шляхом у відповідному розчиннику з вихідної сполуки та надлишку кислоти, наприклад, але без обмеження ними, хлористоводневої, бромисто-водневої, сірчаної, фосфорної, оцтової, малеїнової, бурштинової або метансульфонової. Особливо придатною є хлористоводнева сіль. Якщо згадана кінцева 2,6,9-тризаміщена пуринова сполука вміщує кислотну гр упу, можуть бути одержані катіонні солі згаданої сполуки. У типовому випадку, вихідну кислотну сполуку обробляють надлишком лужного реактиву, наприклад, але без обмеження ними, гідроксиду, карбонату або алкоксиду, до складу якого входить відповідний катіон, наприклад, але без обмеження ними, Na+, K+, Са+2 та NH4+. Певні зі згаданих сполук утворюють внутрішньокомплексні солі або цвітер-іони, які також можуть бути прийнятними. Згадані сполуки за цим винаходом є придатними для пригнічення проліферації клітин у ссавців, у тому числі, людей. 2,6,9-тризаміщені пурини є придатними, наприклад, для лікування автоімунних захворювань, наприклад, ревматоїдного артриту, вовчака, діабету типу І, розсіяного склерозу і т.ін., для лікування раку, серцево-судинних хвороб, наприклад, рестенозу, реакції "трансплантату проти хазяїна", подагри, полікістозної хвороби нирок та інших проліферативних захворювань, патогенез яких залучає аномальну проліферацію клітин. Згаданий спосіб лікування включає парентеральне або пероральне введення ефективної кількості обраної сполуки за цим винаходом, у переважному варіанті, диспергованої у фармацевтичному носії. Терапевтично придатні кількості згаданої композиції за цим винаходом, як правило, складають від приблизно 0,01мг/кг до приблизно 100мг/кг, однак вони будуть легко визначатись фахівцем у цій галузі у залежності від шляху введення, віку та стану пацієнта. Терапевтично придатні кількості згаданої композиції за цим винаходом можуть вводитись від одного до десяти разів на день у разі гострого або хронічного захворювання. Ніякі неприйнятні токсикологічні ефекти не очікуються у разі, якщо сполуки за цим винаходом вводяться у відповідності до цього винаходу. Згадані сполуки за цим винаходом є придатними також як протизапальні та протигрибкові засоби. Як такі, згадані композиції за цим винаходом є придатними для лікування протизапальних та грибкових інфекцій у людей, тварин та грибкових інфекцій у рослин. Фармацевтичні композиції, до складу яких входять згадані сполуки за цим винаходом та/або їх похідні, можуть виготовлятись у вигляді розчинів або ліофілізованих порошків для парентерального введення. Порошки можуть відновлюватись шляхом додання придатного розчинника або іншого фармацевтично прийнятного носія перед використанням. У разі застосування у рідкій формі згадані композиції за цим винаходом, у переважному варіанті, включають до складу забуференого ізотонічного водного розчину. Прикладами придатних розріджувачів є нормальний ізотонічний фізіологічний розчин, стандартний 5% розчин декстрози у воді та забуферений розчин ацетату натрію або амонію. Такі рідкі лікарські форми є придатними для парентерального введення, однак їх можна використовувати також для перорального введення. Може виникнути необхідність додання до фармацевтичних композицій, які включають сполуки за цим винаходом, наповнювачів, наприклад, полівінілпіролідинону, желатини, гідроксицелюлози, аравійської камеді, поліетиленгліколю, маніту, хлориду натрію, цитрату натрію або будь-якого іншого наповнювача, відомого фа хівцю у цій галузі. У альтернативному варіанті згадані фармацевтичні сполуки можуть інкапсулюватись, таблетуватись або виготовлятись у формі емульсії або сиропу для перорального введення. Фармацевтично прийнятні тверді або рідкі носії можуть додаватись для підсилення або стабілізування згаданої композиції або для полегшення виготовлення згаданої композиції. До рідких носіїв належать, але ними не обмежуються, сироп, арахісова олія, оливкова олія, гліцерин, фізрозчин, спирти та вода. До твердих носіїв належать крохмаль, лактоза, сульфат кальцію, дигідрат, teffa alba, стеарат магнію або стеаринова кислота, тальк, пектин, аравійська камедь, агар або желатина. Згадані носії можуть включати також матеріал уповільненого виділення, наприклад, але без обмеження ними, моностеарат гліцерину або дистеарат гліцерину, самостійно або у суміші з воском. Кількість твердого носія змінюється але, у переважному варіанті, становить від приблизно 20 мг до приблизно 1 граму на стандартну дозу. Фармацевтичні дозовані форми виготовляють за допомогою традиційних способів, наприклад, але без обмеження ними, помелом, змішуванням, гранулюванням та пресуванням, за потребою, до таблетованих форм; або помелом, змішуванням та заповненням твердих желатинових капсульованих форм. У разі використання рідкого носія, згадана лікарська форма буде мати вигляд сиропу, еліксиру, емульсії або водної/неводної суспензії. Така рідка лікарська форма може вводитись безпосередньо або заливатись до м'якої желатинової капсули. Наведені далі Приклади служать для ілюстрування цього винаходу. Згадані Приклади ні у якому разі не призначені для обмеження обсягу цього винаходу, але мають на меті лише демонстрацію того, яким чином одержувати та використовувати згадані сполуки за цим винаходом. У згаданих Прикладах усі температури наведено у градусах за Цельсієм. Скорочення RT означає кімнатну температуру. ПРИКЛАД 1 Сполуки за цим винаходом можна одержувати традиційними способами органічної хімії. Наведена далі на реакційній схемі послідовність реакцій є загальним способом, придатним для одержання сполук за цим винаходом. 2,6-дихлорпурин розчиняють у бутанолі і додають відповідний R1 амін. Після нагрівання впродовж декількох годин одержану реакційну суміш охолоджують і одержують сполуку 1. До сполуки 1 додають спочатку гідрид натрію, потім R2 і одержують сполуку 2. До сполуки 2 додають R3 у розчині з Nметилпіролідиноном. Одержану суміш нагрівають впродовж відповідного часу з наступним очищенням та одержанням необхідної сполуки. butanol - бутанол; N-methylpyrrolidinone - N-метилпіролідинон; Вказану далі сполуку було одержано за способом, опис якого було наведено перед тим. Одержання 2-хлор-6-(4-метоксибензиламіно)пурину (1). 2,6-дихлорпурин (4,06г, 21,5ммоль) суспендували у n-бутанолі (150мл) та додавали 4-метоксибензиламін. Одержаний розчин спочатку просвітлювався, потім, через декілька хвилин, знову ставав каламутним. Згаданий розчин нагрівали при 120°С впродовж 2 годин, після чого охолоджували. Згаданий n-бутанол випарювали з наступним суспендуванням одержаного залишку у суміші води та діетилового ефіру. Додавали розчин 2N NaOH (1,3мл, 26ммоль) і одержаний розчин перемішували впродовж 10 хвилин перед фільтруванням. Одержаний відфільтрований осад промивали водою та невеликою порцією ефіру, після чого сушили під вакуумом. Одержану залишкову рідину витримували впродовж ночі, наступного дня збирали додаткову кількість кристалів і промивали їх діетиловим ефіром. Вихід=71%. Одержання 2-хлор-6-(4-метоксибензиламіно)-9-ізопропілпурину (2). 2-хлор-6-(4-метоксибензиламіно)пурин суспендували у сухому диметилформаміді (5мл) та обробляли 60% дисперсією гідриду натрію (82мг, 2,06ммоль). Одержану суспензію перемішували впродовж 30 хвилин. За цей час згадана суспензія перетворилась на прозорий розчин світло-жовтого/зеленого кольору. Впродовж 5 хвилин додавали 2-йодопропан (0,280мл, 1,7екв.) і одержаний розчин перемішували впродовж 2 днів. Додавали воду і одержаний розчин екстрагували етилацетатом. Одержаний органічний шар випарювали з одержанням згаданого продукту ізопропілпурину (Вихід=508мг, 89%). Одержання 2-діетаноламіно-6-(4метоксибензиламіно)-9-ізопропілпурину, (3). Пурин (1,65г, 4,98ммоль) розчиняли у диметилсульфоксиді (12мл) та діетаноламіні (4мл), нагрівали при 140°С впродовж 2-3 днів, потім при 160°С впродовж 1 дня. Одержаний розчин охолоджували і додавали насичений водою бутанол (100мл). Після цього згаданий розчин промивали водою (3´50мл) і випарювали з одержанням масла брунатного кольору. Одержаний залишок хроматографували на силікагелі з елююванням спочатку етилацетатом, потім 3% розчином метанолу у е тилацетаті з одержанням згаданого продукту (вихід=730мг, 37%) у вигляді масла блідо-жовтого кольору. Ви хід=37%. 1 H-NMR(δ CDCI3): 7,29 (br s, 1Н), 7,25 (d, 2H), 6,94 (br s, 1H), 6,83 (d, 2H), 5,43 (br s, 5000кюрі/ммоль, компанія New England Nuclear Corp., Бостон, Массачусетс), та інкубували при кімнатній температурі впродовж 15 хвилин. Згадану реакцію було припинено шляхом додання 10мкл буферу для зразку для проведення електрофорезу у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію (SDS-PAGE) та кип'ятіння впродовж 3 хвилин перед відокремленням за допомогою SDS-PAGE (10-20% градієнту Редігель (Readygel), компанія BioRad). Після електрофорезу згаданий гель фіксували (50% метанолу, 10% оцтової кислоти) впродовж 15 хвилин, тричі (впродовж 5 хвилин кожного разу) промивали дистильованою Н 2О та обробляли 5% гліцерином впродовж 15 хвилин з наступним висушуванням та експонуванням на плівці для авторадіографії (Х-ОМАТ XAR-5 Kodak). Аналіз кінази ν гелі: Ізоферменти ІкВ-α випробували на активність за допомогою модифікованих попередньо опублікованих методів (11, 19, 20). Стисло, подвійні зразки згаданого комплексу ΙκΒ-αглутатіонсефарози 4В на кульках одержували, як було описано перед тим, і відокремлювали за допомогою 12% гелю SDS-PAGE, який було полімеризовано у присутності 15мкг/мл GST-ΙκΒ-α. Після електрофорезу згаданий гель двічі (кожного разу впродовж 30 хвилин) обережно промивали за допомогою 50мМ Трисбуферу-НСІ, рН8,0, 5мМ β-меркаптоетанолу; 20% ізопропанолу з метою видалення додецилсульфату натрію. Після цього білки у гелі було денатуровано шляхом інкубування впродовж 45 хвилин у 100мл 50мМ Трисбуферу-НСІ, рН8,0; 5мМ β-меркаптоетанолу; 0,04% Твій 40. Після цього згаданий гель розрізали навпіл для відокремлення подвійних зразків; одну половину інкубували у 10мл тільки реакційного буферу, а іншу - у 10мл реакційного буфер у, до складу якого входило 10мкг/мл 2-діетаноламіно-6(4-феніланіліно)-9-ізопропілпурину (сполука 6 Прикладу 2), впродовж 1 години при кімнатній температурі з наступним доданням 10мккюрі [у32 Р]АТФ та додатковим інкубуванням впродовж 1 години при кімнатній температурі. Після цього згадані гелі було піддано численним промивкам (кожна 100мл 5% трихлороцтової кислоти з 1% пірофосфатом натрію та тривалістю 15 хвилин), доки 1мл промивний розчин не забезпечив майже фонової радіоактивності. Після цього згадані гелі було висушено та експоновано на плівку для авторадіографії. Одержання 2-діетаноламіно-6-(4-фенілбензиламіно)-9-ізопропілпуринової. активованої епоксидом, афінної до сефарози 6В матриці. Ліофілізовану, активовану епоксидом сефарозу 6В (компанія Pharmacia LKB, Піскатавей, Нью-Джерсі) було обрано для реакції зв'язування завдяки її здатності до утворення ефірного зв'язку між гідроксилвміщувальним лігандом та епоксидною групою на сефарозі. Згаданий гель набухали за інструкціями виробника, 100мг сполуки 6 Прикладу 2 розчиняли у 1мл зв'язувального розчину (1,2:1 (у об'ємному відношенні):0,1N NaOH) та змішували з 0,5мл набухлого гелю при рН10-11 впродовж 72 годин при кімнатній температурі з обережним перемішуванням. Надлишкові реактивні групи було блоковано 1Μ етаноламіном впродовж 4 годин при температурі 50°С і гелеву суспензію виливали до 1мл хроматографічної шприц-колонки. Смолу активізували трьома поперемінними циклами промивання буферами (по двадцять об'ємів колонки кожного: 0,1Μ ацетату, 0,5Μ NaCl, рН4,0 та 0,1Μ Трис-буфер у-НСІ, 0,5Μ NaCl, рН 8,0) та реакційним буфером (двадцять об'ємів колонки: 20мМ ГЕПЕС, рН7,3, 10мМ MgCl2, 15мМ β-гліцерофосфату, 0,5мМ ортованадату натрію, 0,5мМ етиленбістетраоцтової кислоти). Згадані колонки зберігали при температурі 4°С у реакційному буфері, до складу якого входило 0,5% азиду натрію та регенерували перед кожним використанням за допомогою поперемінного промивання буферами з низьким та високим рН, як описувалось перед тим. Активований лізат клітин HUVEC (500мкг білку у 1мл реакційного буферу) п'ять разів послідовно пропускали над сефарозною матрицею CVT-1545 зі збереженням наскрізної течії (незв'язаного матеріалу). Після цього згадану матрицю тричі промивали 1мл реакційного буферу (промивка 1-3), потім тричі реакційним буфером, до складу якого входило 0,5Μ NaCl (елюат 1-3). Аліквотні проби (20мкл з 1мл) кожного зразку випробували на здатність до фосфорилювання на комплексі GST-ІкВ-сефароза на кульках та аналізували за допомогою SDS-PAGE, як описувалось перед тим. Аналіз афінности збагаченої ІкВ-α кінази. Згадані змішані 0,5Μ NaCl елюати зі згаданої афінної матриці було використано, як джерело ферменту для розробки фільтрувального аналізу ІкВ-α кінази. До складу кожної реакційної суміші входила афіннозбагачена ІкВ-α кіназа (1мкг білку), 10нг GST-ΙκΒ-α кінази та 0,5мккюрі [у32 Р]АТФ (>5000кюрі/ммоль, компанія New England Nuclear Corp., Бостон, Массачусетс) у 20мкл реакційного буферу. Згадану реакційну суміш інкубували впродовж 15 хвилин при кімнатній температурі і реакцію припиняли доданням 2мкл 0,5Μ етилендіамінтетраоцтової кислоти. Реакційні суміші наносили на фосфоцелюлозні диски (компанія Gibco BRL Life Technologies, Гейтерсбург, Мериленд) і згадані фільтри тричі промивали 0,15Μ фосфорної кислоти з обережним струшуванням впродовж 15 хвилин (до десяти фільтрів було промито 300мл 0,15Μ фосфорної кислоти). Після третьої промивки згадані фільтри сушили на повітрі, вносили до сцинтиляційної рідини та піддавали рідинній сцинтиляційній спектрометрії. Аналіз електрофоретичного зсуву. За допомогою методу екстрагування буфером з високим вмістом солі було одержано ядерні екстракти. 10пмоль двониткового NF-κΒ конценсусного олігонуклеотиду (5'AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3') компанія Promega) було помічено на 5' кінцевій ділянці 5мккюрі[у-32Р]АТФ (>5000кюрі/ммоль, компанія New England Nuclear Corp., Бостон, Массачусетс) шля хом інкубування Т4 полінуклеотидкіназою впродовж 1 години при 37°С. Невключені нуклеотиди було видалено шляхом пропускання згаданої реакційної суміші через 1 мл обертальну хроматографічну колонку Sephadex G-5. Реакції зв'язування здійснювали при кімнатній температурі впродовж 1 години; до складу реакційної суміші входило 10мкг ядерного екстрагованого білку, 1мкг ДНК з молок лососевих та 5´104 імпульсів на хвилину 32Рміченого конценсусного олігонуклеотиду у присутності або відсутності неміченого олігонуклеотиду, об'єм якого перевищував об'єм попередньо згаданого у п'ятдесят разів. ДНК-білкові комплекси розчиняли електрофорезом до 8% неденатурованого поліакриламідного гелю; згадані гелі сушили на фільтрувальному папері та надавали їм видимої форми шляхом авторадіографування. Таблиця 8 Ферментативна активність окремих представників цього винаходу Ri'-X 4-фенілбензиламіно 4-фенілбензиламіно 4-фенілбензиламіно 4-броманіліно 4-(3-метоксифеніл)бензиламіно 4-(4-метоксифеніл)бензиламіно 3-(4-нітрофеніл)аніліно 4-тіометоксианіліно 4-(2-піридиніл)бензиламіно R2 ізопропіл ізопропіл ізопропіл ізопропіл ізопропіл ізопропіл ізопропіл ізопропіл ізопропіл R3 діетаноламіно діетиламіно етаноламіно діетаноламіно діетаноламіно діетаноламіно діетаноламіно діетаноламіно діетаноламіно ICso(mkM) ферменту 1,1 >2,4 2,5 14 >10 11 2,2 12,4 4,5