Спосіб виробництва біомаси бета-каротину

Винахід відноситься до біотехнології, зокрема до способів одержання мікробіологічного бета-каротину, який використовується в медицині, харчовій промисловості і тваринництві. Відомий спосіб одержання бета-каротину [а.с. СРСР №1814660, С12Ρ23/00, С12Ν1/14, бюл. №17,1993, с.166], який включає використання у якості джерела редукуючих речовин (вуглецю) та ліпідів живильного середовища - рослинної олії і зеленої патоки, а у якості джерела азоту і розчинного фосфору - кукурудзяний екстракт у визначених співвідношеннях. Недоліком способу є тверда прив'язка складу живильного середовища до певних компонентів, а також низький вихід бета-каротину у виробленій біомасі (до 3,5%). У якості прототипу прийнято спосіб виробництва міцеліальної маси для одержання бета-каротину [патент Росії №2177506 С12Ρ23/00, С12Ν1/14, бюл. №36,2001, с.179], який передбачає використання штамів Blakeslea trispora KP 74+ і КР 86- у якості продуцентів, відходів та/або вторинних продуктів харчової промисловості у якості компонентів живильного середовища та біостимулятора каротиноутворення. Недоліком способу є низький вихід бета-каротину у виробленій біомасі (до 4,5%). В основі винаходу поставлена задача створення способу виробництва біомаси бета-каротину шляхом глибинного культивування високоактивних штамів Blakeslea trispora на живильному середовищі, яке регулює співвідношення основних компонентів та складається із широкого асортименту вихідних продуктів при дотриманні визначених технологічних параметрів, які сприяють максимальному накопиченню бетакаротину в біомасі (до 10%). Поставлена задача вирішується тим, що у способі виробництво біомаси бета-каротину ведуть шляхом глибинного культивування штамів Blakeslea trispora на живильному середовищі, основою якого є джерела органічного вуглецю та азоту з додаванням біостимулятора каротиноутворення та антиоксиданта, згідно винаходу, у якості продуцента використовують штами Blakeslea trispora TКCT (+) та ТКСТ (-), процес глибинного культивування ведуть при постійній температурі 33±2°С, при постійній аерації повітрям та постійному механічному перемішуванні до періоду встановлення постійної концентрації бета-каротину у біомасі, але не більш 84 годин, при цьому джерела органічного вуглецю та азоту вводять таким чином, що співвідношення вуглецю та азоту дорівнює 15:1-30:1; у якості біостимулятора каротиноутворення використовують побічні продукти подальшої переробки біомаси бета-каротину у кількості 0,15-0,3% від загального об'єму живильного середовища; у якості антиоксиданту використовують двукомпозиційну суміш аскорбінової кислоти та лецитину у співвідношенні 1:1-1:3, яку вводять у кількості 0,01-0,03% від загального об'єму живильного середовища; аерація повітрям здійснюється шляхом постійного збільшення подавання повітря протягом першої половини процесу глибинного культивування від 0,25 до 1 літра повітря за хвилину на 1 літр загального об'єму живильного середовища та штамів, які культивують, та шляхом постійного зменшення подавання повітря протягом другої половини процесу глибинного культивування від 1 до 0,1 літра повітря за хвилину на 1 літр загального об'єму живильного середовища та штамів, які культивують; механічне перемішування проводять зі швидкістю 150-200 обертів на хвилину. Використання у якості продуцентів бета-каротину високоактивних штамів Blakeslea trispora ТКСТ (+) і ТКСТ (-) сприяє максимальному використанню генетичної здатності даної культури до накопичення бетакаротину. Штами ТКСТ (+) і ТКСТ (-) мають родослівну від КІ(+) і КІ(-) та отримані шляхом селекції гриба за допомогою 20% діфеніламіну з наступною обробкою натрієвою сіллю нікотинової кислоти 1000-1300мкг/мл ХДеклараційний патент України №55331, С12Ρ17/00, С12Ρ23/00, С12Ν15/00,2003). Штами ТКСТ (+) і ТКСТ (-) депоновано в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України 11 листопада 2002 року, реєстраційний номер, наданий штаму Депозитарієм: Blakeslea trispora ІMB F-100022. Здійснення процесу глибинного культивування при постійній температурі 33±2°С забезпечує найбільш ефективний режим зростання культури, що дозволяє забезпечити максимальне накопичення бетакаротину. Вирощування штамів-продуцентів на живильному середовищі, компонентами якого є джерела органічного вуглецю і азоту в співвідношенні 15:1-30:1, дає можливість використання різноманітного асортименту вихідних матеріалів, що дозволяє реалізувати технологію в різних умовах і наявних ресурсів. У якості джерела органічного вуглецю можуть бути рослинні олії, різні види патоки, глюкоза або глюкозні сиропи і т.п. У якості джерела органічного азоту може бути кукурудзяний або пшеничний екстракт, соєве борошно, казеїн, лактальбумін і т.п. Введення у живильне середовище біостимулятора каротиноутворення сприяє більшому накопиченню бета-каротину в біомасі, а факт того, що у якості біостимулятору каротиноутворення використовують побічні продукти подальшої переробки біомаси бета-каротину, введені у кількості 0,15%-0,3% від загального об'єму живильного середовища, говорить про безвідхідну технологію виробництва продукції, що містить каротин. Введення у живильне середовище антиоксиданту у кількості 0,01-0,03% від її загального об'єму, у якості якого використовується двукомпозиційна суміш аскорбінової кислоти і лецитина в співвідношенні - 1:1-3:1, сприяє кращому збереженню бета-каротину в процесі виробництва і наступного збереження готового продукту, тим самим, забезпечуючи його максимальний вміст у біомасі. Здійснення процесу глибинного культивування до періоду встановлення постійної концентрації бетакаротину, але не більш 84 годин, гарантує максимальну економічну доцільність процесу виробництва, при якому максимум можливого накопичення бета-каротину забезпечується при оптимальних витратах компонентів живильного середовища. Здійснення процесу глибинного культивування при постійній аерації повітрям, з розрахунку постійного збільшення подачі повітря потягом першої половини процесу глибинного культивування від 0,25 до 1 літра повітря за хвилину на 1 літр загального об'єму живильного середовища та штамів, які культивують, та шляхом постійного зниження подавання повітря протягом другої половини процесу глибинного культивування від 1 до 0,1 літра повітря за хвилину на 1 літр загального об'єму живильного середовища та штамів, які культивують, та при постійному механічному перемішуванні зі швидкістю 150-200 обертів за хвилину забезпечує найкраще постачання вирощуваної культури киснем, що сприяє її максимальному росту і накопиченню бета-каротину. Переваги запропонованого способу полягають у тому, що запропоновані технологічні рішення дозволяють збільшити в 2-3 рази накопичення і збереження бета-каротину у порівнянні з винаходами аналогами, відсутність хімічно синтезованої сировини в процесі глибинного культивування, а також можливість широкого варіювання наявних компонентів, які є сировинною основою живильного середовища для глибинного культивування біомаси. Зразки реалізації способу: Зразок 1. Попередньо визначаються з компонентами живильного середовища. Для даних технологічних умов найбільш прийнятними (з погляду вартості, наявності та технологічності) є соєва олія, зелена патока і кукурудзяний екстракт згущений. Аналіз даних продуктів демонструє наявність у їхньому складі наступної кількості органічного вуглецю й азоту: соєва олія - 77% вуглецю, зелена патока - 56% вуглецю, кукурудзяний екстракт згущений - 3% азоту. Відповідно до технологічного регламенту живильне середовище для глибинного культивування містило 0,2% азоту. Об'єму живильного середовища дорівнював 7000л. Тоді кількість азоту для даного об'єму відповідало 0,002x7000=14л. Враховуючі те, що кукурудзяний екстракт згущений містить 3% азоту, на об'єм 7000л його було введено в кількості 14х100%:3%=467л. Щоб забезпечити необхідне співвідношення компонентів, які містять вуглець та азот, по нижній межі 15:1, у живильне середовище вводили в 15 разів більше вуглецю, а саме 14x15=210л. Дану кількість вуглецю можна одержати шляхом додавання суміші із соєвої олії і зеленої патоки. Олія є визначним компонентом, кількість якого повинна складати не менш ніж 3% від загального об'єму живильного середовища. Для об'єму 7000л це складало 0,03х7000=210л. Дана кількість забезпечила наявність 0,77x210=162л вуглецю. В умовах даного приклада не вистачало ще 210162=48л. Його доповнили за рахунок зеленої патоки. З огляду на той факт, що зелена патока містить 56% вуглецю, 48л, що залишилися, можна добрати, якщо додати 48x100:56=86л зеленої патоки. Загальний обсяг живильного середовища склав: 467+162+86=715л, з яких 467 л кукурудзяного екстракту згущеного, 162л соєвої олії і 86л зеленої патоки. Об'єм, що залишився, заповнили водою у кількості 6285л. У результаті, співвідношення живильного середовища в межах даного прикладу було таким: кукурудзяний екстракт - 6,7%, соєва олія - 2,3%, зелена патока - 1,2%, вода - 89,8%. Крім того, у ферментер для глибинного культивування до стерилізації середовища ввели біостимулятор каротиноутворення в кількості 0,15% від об'єму живильного середовища, що склало, виходячи з об'єму живильного середовища 7000л - 10,5л. У якості біостимулятору каротиноутворення використовували шрот, отриманий після проведення олійної екстракції вже готового продукту - висушеної біомаси бета-каротину. У живильне середовище також ввели антиоксидант у кількості 0,01% від загального об'єму живильного середовища. У якості антиоксиданту використовувалась двукомпозиційна суміш аскорбінової кислоти і лецитину у співвідношенні 1:1, При об'ємі живильного середовища 7000л, нижня межа антиоксиданту, який вводився, склала 0,7л, по 0,35л аскорбінової кислоти і лецитину, відповідно. Глибинне культивування проводили при температурі 33±2°С. Процес глибинного культивування вели при постійній аерації повітрям, з розрахунку постійного збільшення подачі повітря від 0,25 до 1 літра повітря за хвилину на 1 літр загального об'єму живильного середовища та штамів, які культивують, протягом першої половини процесу глибинного культивування, тобто перші 42 години, і від 1 до 0,1 літра повітря за хвилину на 1 літр загального об'єму живильного середовища та штамів, які культивують, протягом другої половини процесу глибинного культивування, тобто не більш ніж 42 наступні години. Загальний об'єм живильного середовища (7000л) та штамів, які культивують (1000л) у ферментері склав 8000л. Тому, подавання повітря у перші 42 години глибинного культивування забезпечило від 2000л повітря за хвилину з поступовим збільшенням до 8000л повітря за хвилину до кінця першого циклу, після чого поступово знижували подачу повітря до 800л за хвилину до кінця процесу глибинного культивування. Для забезпечення найкращого постачання повітря для усього об'єму живильного середовища процес глибинного культивування вели при постійному механічному перемішуванні зі швидкістю 150 обертів за хвилину. Періодично (4 рази на добу) відбирали проби на аналіз для оцінки відсоткового вмісту бета-каротину, проведення морфологічного і біохімічного контролю, рН і стерильності. За результатами вимірів вели аналіз динаміки накопичення бета-каротину в біомасі. Після 82 годин глибинного культивування 3 послідовні виміри показали той самий відсотковий вміст бета-каротину в біомасі. Після цього процес глибинного культивування припинили. Потім, отриману в результаті глибинного культивування культуральну рідину фільтрували, а біомасу бета-каротину висушували у вакуумній гребковій сушарці при температурі в масі не більш 60°С під вакуумом до залишкового вмісту вологи в продукті 7%. Відповідно до запропонованого способу зміст бета-каротину в біомасі склало 7%. Приклад 2. Приклад виконується аналогічно Прикладу 1, тільки: - Співвідношення вуглецю й азоту в живильному середовищі (загальна кількість 7000л) склало 30:1, а саме: екстракт кукурудзяний згущений - 6,7%, що склало 467кг, олія соєва - 2,3%, що склало 162кг, патока зелена - 6,6%, що склало 461кг, вода - 84,4%, що склало 5910кг. - Біостимулятор каротиноутворення вводили в кількості 0,3% від об'єму живильного середовища (7000л), що склало 21л. - Антиоксидант вводили в кількості 0,03% від загального об'єму живильного середовища (7000л), що склало 2,1л, відповідно 1,575л аскорбінової кислоти і 0,525л лецитіну з розрахунку співвідношення даних компонентів 3:1. - Процес глибинного культивування вели при постійному механічному перемішуванні зі швидкістю 200 оборотів за хвилину. Відповідно до запропонованого способу вміст каротину в біомасі склав 8%.