Збагачена поліфенолом композиція з екстракту какаовели та спосіб її одержання

1. Спосіб одержання збагаченої поліфенолом композиції з какаовели, де вказаний спосіб включає: (1) забезпечення знежиреної какаовели; (2) екстракцію знежиреної какаовели водним розчином ацетону, що містить від приблизно 30 % до приблизно 80 % ацетону, для забезпечення рідкого екстракційного матеріалу какаовели; (3) оброблення екстракційного матеріалу какаовели для видалення суспендованої сухої речовини для забезпечення обробленого рідкого екстракційного матеріалу какаовели; (4) видалення ацетону з обробленого рідкого екстракційного матеріалу какаовели для забезпечення водного екстракційного матеріалу; (5) концентрування водного екстракційного матеріалу до від приблизно 1,5 % до приблизно 5 % сухої речовини для забезпечення концентрованого екстракційного матеріалу; (6) нанесення концентрованого екстракційного матеріалу на колонку для гель-фільтрації, що містить гель-фільтраційне середовище, придатне для відділення теоброміну від поліфенолів; (7) промивання колонки для гель-фільтрації водою для збирання збагаченої теоброміном композиції; і (8) елюювання з промитої водою колонки для гельфільтрації низькомолекулярним органічним розчинником для збирання збагаченої поліфенолом композиції, де збагачена поліфенолом композиція є по суті вільною від фітостеринів і теоброміну. 2. Спосіб за п. 1, де водний розчин ацетону містить від приблизно 40 % до приблизно 60 % ацетону. 3. Спосіб за п. 1, де водний розчин ацетону містить приблизно 50 % ацетону. 2 (19) 1 3 87477 4 тить гель-фільтраційне середовище, придатне для відділення теоброміну від поліфенолів; (7) промивання колонки для гель-фільтрації водою для видалення збагаченої теоброміном композиції; і (8) елюювання з промитої водою колонки для гельфільтрації низькомолекулярним органічним розчинником для збирання збагаченої поліфенолом композиції, де збагачена поліфенолом композиція є по суті вільною від фітостеринів і теоброміну. 14. Збагачена поліфенолом композиція за п. 13, де водний розчин ацетону містить від приблизно 40 % до приблизно 60 % ацетону. 15. Збагачена поліфенолом композиція за п. 13, де водний розчин ацетону містить приблизно 50 % ацетону. 16. Збагачена поліфенолом композиція за п. 13, де збагачену поліфенолом фракцію оброблено для концентрування поліфенолів у збагаченій поліфенолом композиції. 17. Збагачена поліфенолом композиція за п. 13, де екстракція на етапі (2) повторена від 2 до 5 разів, і рідкий екстракційний матеріал какаовели з кожної повторної екстракції об'єднано. 18. Збагачена поліфенолом композиція за п. 14, де екстракція на етапі (2) повторена від 2 до 5 разів, і рідкий екстракційний матеріал какаовели з кожної повторної екстракції об'єднано. 19. Збагачена поліфенолом композиція за п. 13, де какаовела одержана з обсмажених ферментованих какао-бобів. 20. Збагачена поліфенолом композиція за п. 13, де какаовела одержана з обсмажених неферментованих какао-бобів. 21. Збагачена поліфенолом композиція за п. 13, де какаовела одержана з необсмажених ферментованих какао-бобів. 22. Збагачена поліфенолом композиція за п. 13, де какаовела одержана з необсмажених неферментованих какао-бобів. Даний винахід стосується процесу екстракції какаовели для забезпечення збагаченої теоброміном фракції або композиції і збагаченої поліфенолом фракції або композиції. Як відомо, природні поліфеноли, одержані з рослин або рослинного матеріалу (наприклад, чаю, бобів какао, тощо), мають антиоксидантні властивості, а також приносять іншу потенційну користь для здоров'я. Так, останніми роками було виконане значне дослідження щодо способів одержання таких поліфенолів, включаючи поліфеноли какао, а також способів їхнього використання. Патент США 5 554 645 (10 вересня 1996р.) передбачає спосіб екстракції поліфенолів із порошку позбавлених оболонки, знежирених, висушених сублімацією какао-бобів із використанням розчинника ацетон-вода (70:30). Далі екстракт очищували, застосовуючи гель-проникаючу хроматографію або високоефективну рідинну хроматографію для одержання поліфенолів, що складаються, по суті, з олігомерів 3-12. Міжнародна публікація патенту WO 00/45769 (10 серпня 2000р.) і відповідний патент США 6 576 275 (10 червня 2003р.) передбачають спосіб екстракції поліфенолів з какао та інших рослинних матеріалів для забезпечення поліфенольного матеріалу зі зменшеним вмістом пурину. Вихідні какаоматеріали, що включають, наприклад, свіжі какаобоби, знежирену суху речовину какао, какаопорошок, какао-порошок із низьким вмістом жирів, какаовелу, відходи какао або інші вихідні матеріали, що містять какао, переважно розмелюють до частинок розміром менше ніж 250мкм. Розмелений какао-матеріал далі екстрагують гідроксильним розчинником (наприклад, водою, нижчими спиртами та їхніми сумішами). Одержаний у результаті екстракт далі застосовують до адсорбційного матеріалу, що має високе співвідношення адсорбції поліфенол/пурин, принаймні приблизно 5/1. Придатні абсорбенти включають полівінілполіпіролі дон і хітозан, а також їхні похідні, модифікації та суміші. Потім поліфеноли видаляють з адсорбційного матеріалу, використовуючи десорбційний розчинник, такий як вода, спирт, що змішується з водою, суміші води і спирту, що змішується з водою, і суміші води та кетону, що змішується з водою. Матеріал, що містить поліфенол, далі може бути концентрований шляхом випарювання десорбційного розчинника. Хоча цей спосіб зменшує відносні кількості пуринів (тобто теоброміну і кофеїну), у зібраному матеріалі, що містить поліфенол, залишаються значні кількості пуринів. Патент США 6 159 451 (12 грудня 2000р.) передбачає спосіб вироблення фракції какаовели, яка має активність проти глюкозилтрансферази у запобіганні карієсу. У цьому способі до 1 частини висушеної какаовели додавали 4-10 частин 50% водного розчину ацетону, перемішували при нагріванні до 40-80°С зі зворотним холодильником протягом 4-6 годин з утворенням екстракту. Цю процедуру повторювали двічі. Далі екстракт концентрували і висушували, використовуючи вакуумну технологію. Потім одержаний у результаті екстракт додавали до адсорбційної смоли на основі стиролу, промивали 1-2 частинами 20% етанолу, супроводжуючи додаванням 1-2 частин 50% етанолу. Фракції після елюювання 50% етанолом збирали і концентрували при зниженому тиску при 40-50°С для забезпечення бажаної фракції, що має активність проти глюкозилтрансферази. Міжнародна публікація патенту WO 00/62631 (26 жовтня 2000р.) передбачає спосіб вироблення екстракту какао, що містить харчові волокна (особливо нерозчинні харчові волокна), про які повідомляється, що вони є корисними у лікуванні діабету. Термооброблену какаовелу екстрагують етанолом і потім центрифугують та далі фракціонують на супернатант і залишок. За повідомленнями, фракція залишку є корисною у лікуванні діа 5 бету. Повідомляється, що супернатант містить поліфеноли і може бути використаний у напоях. Європейська заявка на патент ЕР 1304047 (опублікована 23 квітня 2003р.) передбачає спосіб одержання екстракту какао-бобів або какаовели, який, за повідомленнями, інгібує супресію щілиноподібного з'єднання при міжклітинній взаємодії і синтез ДНК у ракових клітинах. Після видалення масла какао какаовелу екстрагували 50% ацетоном протягом 5 годин при 60°С зі зворотним холодильником. Екстракт центрифугували і супернатант збирали, фільтрували, концентрували і сушили сублімацією. Одержану в результаті фракцію какао вели адсорбували на полістирольній гідрофобній адсорбційній смолі і розділяли на фракції сумішами вода-ацетон або вода-метанол для одержання активної речовини. Європейська заявка на патент ЕР 1346640 (опублікована 24 вересня 2003р.) передбачає спосіб виготовлення екстракту какао з низьким вмістом жиру, що має високий рівень смакових речовин какао і/або попередників смакових речовин какао та високий рівень антиоксидантів (наприклад, поліфенолів). Цей спосіб включає вміщення насіння какао у розчин оцтової кислоти, нагрівання суміші, видалення насіння та концентрування розчинених сухих речовин із розчину. Патент США 6 627 232 (30 вересня 2003р.) передбачає спосіб вибіркової екстракції тетраметрів, пентаметрів і проціанідинових олігомерів какао з вищою молекулярною масою з частково знежиреної або повністю знежиреної сухої речовини какао, приготованої з какао-бобів, які не були обсмажені. В одному втіленні цей спосіб включає етапи: (а) екстракції сухої речовини какао етилацетатом; (b) виділення екстрагованої сухої речовини какао; (с) екстракції виділеної, екстрагованої сухої речовини какао розчинником, вибраним із групи, що складається з ацетону, етанолу та їхніх сумішей з до 50% води за об'ємом; і (d) відділення сухої речовини какао від екстракту какао етапу (с) для одержання екстракту проціанідину. Публікація патенту США US 2004/0096566 (20 травня 2004p.) передбачає спосіб одержання поліфенолів із какао-бобів. Свіжі боби (які не були попередньо оброблені або знежирені) обробляли для видалення оболонки і пом'якшення, розтирали у присутності розчинників, настоювали з розчинником від кількох годин до кількох днів, фільтрували і промивали тим самим розчинником, і розчинник видаляли дистиляцією під вакуумом для одержання бажаного залишку. Хоча ці способи в цілому здатні забезпечити поліфеноли з різних частин какао-бобів, все ще бажаним було б забезпечити способи, в яких можуть бути одержані збагачена поліфенолом фракція і збагачена теоброміном фракція, так що можуть бути використані більше компонентів. Крім того, було б бажаним забезпечити такі фракції, використовуючи те, що звичайно вважають відходами (а саме, какаовелу). Даний винахід передбачає такі способи. Даний винахід стосується процесу виробництва з какаовели збагаченої теоброміном композиції 87477 6 і збагаченої поліфенолом композиції, зазначений процес включає: (1) забезпечення знежиреної какаовели; (2) екстракцію знежиреної какаовели водним розчином ацетону, що містить від приблизно 30% до приблизно 80% ацетону, для забезпечення екстракційного матеріалу какаовели; (3) оброблення екстракційного матеріалу какаовели для видалення суспендованої сухої речовини, щоб забезпечити оброблений екстракційний матеріал какаовели; (4) видалення ацетону з обробленого екстракційного матеріалу какаовели для забезпечення водного екстракційного матеріалу; (5) концентрування водного екстракційного матеріалу до від приблизно 1,5% до приблизно 5% сухої речовини для забезпечення концентрованого екстракційного матеріалу; (6) нанесення концентрованого екстракційного матеріалу на колонку для гель-фільтрації, що містить гель-фільтраційне середовище, придатне для відділення теоброміну від поліфенолів; (7) промивання колонки для гель-фільтрації водою для збирання збагаченої теоброміном фракції; (8) елюювання з промитої водою колонки для гель-фільтрації низькомолекулярним полярним органічним розчинником для збирання збагаченої поліфенолом фракції, де збагачена поліфенолом фракція є по суті вільною від фітостеринів і теоброміну; (9) концентрування збагаченої теоброміном фракції для одержання збагаченої теоброміном композиції; і (10) концентрування збагаченої поліфенолом фракції для одержання збагаченої поліфенолом композиції. Переважні гель-фільтраційні середовища для використання у даному винаході включають гель-фільтраційні середовища типу Sephadex™ від Amersham Biosciences (частина GE Healthcare); особливо переважним є Sephadex™ LH-20. Низькомолекулярним полярним органічним розчинником є переважно метанол. Какаовела, що використовується у даному винаході, може бути одержана з обсмажених або необсмажених какаобобів і/або з ферментованих або неферментованих какао-бобів. Фігура 1 є загальною блок-схемою, що ілюструє даний винахід. Фігура 2 є детальною блок-схемою, що ілюструє переважне втілення даного винаходу. Як показано на фігурі 1, одержують знежирену какаовелу. Какаовела може бути одержана з ферментованих або неферментованих бобів, кожні з яких могли бути необсмаженими або обсмаженими; оболонка, використана в процесі екстракції за даним винаходом, може бути цілою, розламаною, розмеленою або їхнім поєднанням. Така знежирена какаовела може бути приготована з використанням загальноприйнятих методик; наприклад, какаовела може бути знежирена шляхом екстракції з використанням гексану або іншого низькомолекулярного неполярного або малополярного розчинника (наприклад, пентану, етилового ефіру, петролейного ефіру, тощо); неполярний розчинник 7 гексан звичайно є переважним. Не бажаючи бути обмеженими теорією, вважають, що знежирення какаовели сприяє видаленню фітостеринів перед наступним етапом екстракції, а також забезпечує поліпшене розділення на пізніших стадіях процесу. Знежирену какаовелу екстрагують водним розчином ацетону. Як правило, цей водний розчин ацетону містить від приблизно 30% до приблизно 80% ацетону, переважно від приблизно 40% до приблизно 60% ацетону, і більш переважно, приблизно 50% ацетону. Далі суспендовану суху речовину видаляють з матеріалу, екстрагованого водним ацетоном, використовуючи загальноприйняті методики (наприклад, фільтрування, декантацію, центрифугування, тощо). Принаймні частину ацетону (як правило, приблизно 80% або більше, і переважно, від приблизно 95% до, по суті, 100%) видаляють, використовуючи загальноприйняті методики (наприклад, перегонку, перегонку під вакуумом, тощо) для одержання водного екстракційного матеріалу. Одержаний у результаті водний екстракційний матеріал далі піддають гельфільтрації, використовуючи гель-фільтраційне середовище, придатне для відділення як теоброміну, так і поліфенолів. Переважні гельфільтраційні середовища для використання у даному винаході включають гель-фільтраційні середовища типу Sephadex™ (як правило, одержані з тривимірного зшитого полісахариду декстрану) від Amersham Biosciences (частина GE Healthcare); особливо переважним є Sephadex™ LH-20. Гельфільтраційну колонку, що містить водний екстракційний матеріал, спочатку промивають водою для видалення збагаченої теоброміном фракції; збагачену теоброміном фракцію збирають. З гельфільтраційної колонки далі проводять елюювання низькомолекулярним полярним органічним розчинником для видалення збагаченої поліфенолом фракції; потім збагачену поліфенолом фракцію збирають. Придатні низькомолекулярні полярні органічні розчинники включають, наприклад, метанол, етанол, етилацетат, ацетон, тощо; як правило, переважним є метанол. Збагачена поліфенолом фракція є, по суті, вільною від фітостеринів і теоброміну. Для цілей даного винаходу вираз "по суті, вільна від фітостеринів" означає, що вона включає збагачені поліфенолом композиції, де принаймні приблизно 90%, переважно, приблизно 95%, і найбільш переважно, по суті, 100% (тобто залишаються лише сліди) фітостеринів, присутніх у вихідній какаовелі, були видалені. Подібним чином, для цілей даного винаходу вираз "по суті, вільна від теоброміну" означає, що вона включає збагачені поліфенолом композиції, де принаймні приблизно 90%, переважно, приблизно 95%, і найбільш переважно, по суті, 100% (тобто залишаються лише сліди) теоброміну, присутнього у вихідній какаовелі, були видалені. Як зазначено вище, какаовела, що використовується у даному винаході, може бути одержана з обсмажених або необсмажених какао-бобів і/або з ферментованих або неферментованих какаобобів. Як правило, вищий вихід поліфенолів очікують з неферментованої оболонки у порівнянні з 87477 8 ферментованою оболонкою, а також з обсмаженої оболонки у порівнянні з необсмаженою оболонкою. Фігура 2 ілюструє переважне втілення даного винаходу. У цьому втіленні знежирену какаовелу екстрагують багато разів водним розчином ацетону. Як правило, цей водний розчин ацетону містить від 30% до приблизно 80% ацетону, переважно від приблизно 40% до приблизно 60% ацетону, і більш переважно, приблизно 50% ацетону. Для цілей даного винаходу вираз "багато разів" означає принаймні дві екстракції, переважно приблизно від 2 до 5 екстракцій, і більш переважно, приблизно від 2 до 3 екстракцій. Переважно, кожну екстракцію виконують зі свіжим (тобто таким, який не був раніше використаний для екстракції) водним розчином ацетону. Рідкі екстракти переважно об'єднують і далі обробляють, щоб видалити суспендовану суху речовину, використовуючи загальноприйняті методики (наприклад, фільтрування, декантацію з центрифугуванням або без нього, тощо). Принаймні частину ацетону (як правило, приблизно 80% або більше, і переважно, від приблизно 95% до, по суті, 100%) видаляють, використовуючи загальноприйняті методики (наприклад, перегонку, перегонку під вакуумом, тощо) для одержання водного екстракційного матеріалу. Одержаний у результаті водний екстракційний матеріал далі піддають гель-фільтрації, використовуючи гель-фільтраційне середовище, придатне для відділення як теоброміну, так і поліфенолів. Переважні гель-фільтраційні середовища для використання у даному винаході включають гельфільтраційні середовища типу Sephadex™ (як правило, одержані з тривимірного зшитого полісахариду декстрану) від Amersham Biosciences (частина GE Healthcare); особливо переважним є Sephadex™ LH-20. Гель-фільтраційну колонку, що містить водний екстракційний матеріал, спочатку промивають водою для видалення збагаченої теоброміном фракції; збагачену теоброміном фракцію збирають. З гель-фільтраційної колонки далі проводять елюювання низькомолекулярним полярним органічним розчинником, переважно метанолом, для видалення збагаченої поліфенолом фракції; потім збагачену поліфенолом фракцію збирають. Зібрану збагачену теоброміном фракцію можна використовувати як збагачену теоброміном композицію або, якщо це бажано, концентрувати для одержання збагаченої теоброміном композиції. Таке концентрування можна проводити, використовуючи загальноприйняті методики, такі як, наприклад, сушіння сублімацією, термічне сушіння, кристалізація, методи розподілу рідин з використанням хлороформу або дихлорметану, тощо; як правило, переважним є сушіння сублімацією. Зібрану збагачену поліфенолом фракцію можна використовувати як збагачену поліфенолом композицію або, якщо це бажано, концентрувати для одержання збагаченої поліфенолом композиції. Таке концентрування можна проводити, спочатку видаляючи принаймні частину метанолу, використовуючи загальноприйняті методики (наприклад, випарювання, перегонку під вакуумом, тощо), з подальшим видаленням принаймні части 9 87477 ни води за допомогою загальноприйнятих методик (наприклад, сушіння сублімацією, термічного сушіння, кристалізації, розподілу рідин, тощо), з переважним використанням сушіння сублімацією. Зараз винахід буде проілюстрований конкретними прикладами, які описують переважні втілення даного винаходу. Вони не призначені обмежувати обсяг винаходу. Якщо не зазначене інше, всі співвідношення та відсотки по всьому даному патентному описі наведені за масою. Усі патенти та інші публікації, обговорювані у цьому патентному описі, включені тим самим за допомогою посилання. Приклад 1 Цей приклад ілюструє виділення з какаовели збагаченої поліфенолом фракції і збагаченої теоброміном фракції. Какаовелу одержували з необсмажених ферментованих какао-бобів у звичайний спосіб. Якщо це бажано, у такий самий спосіб можна використовувати обсмажену або необсмажену какаовелу з ферментованих або неферментованих какао-бобів. Какаовелу (60г) екстрагували гексаном (200мл) протягом 6 годин в екстракторі Сокслета. Після сушіння під вакуумом знежирені оболонки суспендували з 50% водним розчином ацетону (350мл) при 70°С протягом 45 хвилин у колбі, оснащеній холодильником. Після центрифугування і декантації екстракту залишок далі екстрагували 50% водним розчином ацетону (200мл); процедуру екстракції/відділення повторювали до 4 разів. Екстракти об'єднували і концентрували до Фракція 50% ацетон Водний елюат МеОН елюат Маса (г/100г какаовели) 15,0 12,7 1,37 10 приблизно половини об'єму за допомогою ротаційного випарника. Одержаний у результаті концентрований водний розчин висушували за допомогою сушіння сублімацією. Вміст поліфенолу вимірювали за допомогою методу ФолінаЧокалтеу (дивіться, наприклад, Singleton et al., Am J. Enol. Vit., 37, 144-158 (1965)). Були одержані такі результати: Кількість екстракцій 1 2 3 4 5 Висушений сублімацією концентрований екстракт, одержаний з об'єднання усіх п'яти екстракцій, наносили на гель-проникаючу колонку Sephadex LH-20 (діаметр 4,5см, довжина 30см). Колонку промивали водою для виходу збагаченої теоброміном фракції, яку одержували у сухому стані за допомогою сушіння сублімацією. Потім використовували метанол для елюювання збагаченої поліфенолом фракції, яку далі сушили шляхом випарювання метанолу і сушіння сублімацією для одержання твердої збагаченої поліфенолом композиції або залишку. Поліфеноли (% фракції) (г/100г какаовели) 12,7 1,90 5,9 0,75 56,3 0,77 Цей приклад ясно показує, що, використовуючи даний винахід, з какаовели можна одержати збагачену теоброміном фракцію (тобто водний елюат) і збагачену поліфенолом фракцію (тобто метанольний елюат). Крім того, цей приклад також показує, що збагачена поліфенолом фракція є, по суті, вільною від теоброміну (а також від кофеїну). Після елюювання метанолом поліфеноли залишаються на колонці (приблизно 1,90-0,750,77=0,38 г/100г какаовели); додатковий вихід поліфенолів можна одержати, якщо це є бажаним, шляхом додаткового елюювання метанолом із колонки і оброблення елюату, як зазначено вище. Антиоксидантну здатність метанольної збагаченої поліфенолом фракції оцінювали, використовуючи метод ТЕАС (тролоксового еквівалента антиоксидантної здатності) (Re et al., Free Radical Відносний вміст поліфенолу (%) в екстракті 49 28 9 7 7 Теобромін (мг/100г какаовели) 660 665 2 Кофеїн (мг/100г какаовели) 65 60 2 Biology & Medicine, 26, 1231-1237 (1999)). Була виявлена антиоксидантна здатність 1,8мкмоль тролоксу/мг. Ця антиоксидантна здатність є суттєво вищою, ніж та, яку типово виявляють для промислових зразків екстрактів розмарину, винограду та ягід бузини (0,83, 0,76 і 0,42мкмоль тролоксу/мг, відповідно). Приклад 2 Цей приклад ілюструє модифікацію методики, використаної у прикладі 1. По суті, була використана така ж методика, як у прикладі 1, за винятком того, що після промивання водою елюювання з колонки проводили 50% водним розчином метанолу, супроводжуючи чистим метанолом. Елюати сушили, як описано у прикладі 1. Були одержані такі результати: Були одержані такі результати: Фракція Водний елюат 50% МеОН елюат 100% МеОН елюат Вихід (г/100г какаовели) 12,7 0,98 0,32 Поліфеноли (% фракції) 5,31 39,2 54,4 11 87477 Приклад 3 Цей приклад ілюструє виділення твердого препарату з високим вмістом теоброміну із збагаченої теоброміном фракції. Збагачену теоброміном фракцію одержували, як у прикладі 1. Промивну воду збирали і доводили до невеликого об'єму (до точки, де помутніння ставало видимим). Додавали невелику кількість активованого вугілля і суміш фільтрувати. Крізь залишок пропускали гарячу воду, і промивні води збирали та додавали до фільтрату. Об'єм розчину зменшували до 100мл і переносили його у ділильну лійку. Додавали промивні води у хімічній склянці і дихлорметан (50мл), суміш струшували (3-4 рази), давали змогу відсто Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко 12 ятися і нижню фазу (хлорований розчинник) відкидали. Етапи додавання дихлорметану, струшування, відстоювання і розділення повторювали тричі. Далі видаляли дихлорметан шляхом сушіння над сульфатом натрію, останній видаляли за допомогою фільтрування, і шляхом випарювання на ротаційному випарнику одержували збагачений теоброміном продукт. Вміст теоброміну у твердому препараті, як визначено за допомогою ВЕРХ, складав приблизно 84%. Препарат подібної твердої композиції, приготований з використанням як розчинника хлороформу, а не дихлорметану, містив приблизно 64% теоброміну. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601