Консорціум мікроорганізмів lactobacillus plantarum, leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides, lactococcus lactis ssp. lactis, lactococcus garvieae, enterococcus faecium для виробництва сиру бринзи

Реферат: Консорціум мікроорганізмів Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides, Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus garvieae, Enterococcus faecium для виробництва сиру бринзи. UA 100822 U (12) UA 100822 U UA 100822 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Корисна модель належить до мікробіології та біотехнології, а саме до консорціуму мікроорганізмів для використання їх у виробництві сирів, і може бути застосована на молокопереробних підприємствах різних форм власності для виробництва бринзи. В Україні для виробництва бринзи використовують імпортні заквашувальні препарати, які характеризуються різним складом мікробіальних культур. Натомість немає бактеріального препарату, склад якого був би найбільш наближеним до природного складу культур молочних бактерій домінуючих у сирому овечому молоці. Відомий консорціум мікроорганізмів (патент РФ на винахід № 2454460), який складається з штамів Bifidobacterium bifidum 791, Bifidobacterium iongum в-379м, Lactobacillus acidophilus nk-1, Sterptococcus thermophilus 132, використовується для виробництва кисломолочних продуктів. Недоліком відомого винаходу є те, що запропонований консорціум мікроорганізмів не підходить для сквашування розсольного сиру бринзи. Найбільш близьким до корисної моделі, що заявляється є спосіб виготовлення бринзи (Спосіб виготовлення овечої бринзи в умовах високогір'я Українських Карпат, патент України № 83013) включає внесення бактеріальної закваски, до складу якої входять культури Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis, Streptococcus termophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, які використовуються для різних продуктів, в тому числі кисломолочних. Недоліком способу є те, що бактеріальна флора заквашувального препарату не відображає складу природної мікрофлори сирого овечого молока, що бере безпосередню участь у процесі виробництва сиру. Заявлений консорціум мікроорганізмів створений для виробництва бринзи у промислових умовах, сформований на основі ідентифікованої природної мікрофлори овечої бринзи, виготовленої у непромислових умовах Карпатського регіону України. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити консорціум молочнокислих мікроорганізмів для виробництва бринзи, ідентичної за мікробіологічним складом до бринзи, виготовленої із сирого овечого молока в домашніх умовах Карпатського регіону України. Технічний результат досягають тим, що для виробництва сиру бринзи створений консорціум мікроорганізмів Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus garvieae, Enterococcus faecium. Технічний результат заявленої корисної моделі зумовлений використанням для виготовлення бринзи із овечого молока консорціуму мікроорганізмів виділені із бринзи, що виготовляється у домашніх умовах Карпатського регіону України та ідентифікованих на молекулярно-генетичному рівні методом секвенування гену 16S рРНК, які відповідають за його специфічні сенсорні, органолептичні та пробіотичні властивості. Консорціум включає штами молочнокислих бактерій Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides, Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus garvieae, Enterococcus faecium з наступним співвідношенням культур: Lactococcus lactis ssp. lactis50-55 % Lactobacillus plantarum15-20 % Enterococcus faecium15 % Leuconostoc mesenteroides 10 % ssp. mesenteroidesLactococcus garvieae5% Із усіх ідентифікованих молочнокислих мікроорганізмів виділених із бринзи, що виготовляється у непромислових умовах, відібрано найкращі культури за технологічними і біологічними властивостями, а саме активністю сквашування молока, органолептичним показникам, адгезивними властивостями та антагонізму до патогенної мікрофлори. Оскільки мікроорганізми були дослідженні на молекулярно-генетичному рівні, то в складі суміші мікроорганізмів є присутні Enterococcus faecium та Leuconostoc mesenteroides mesenteroides ssp. mesenteroides, які визнані безпечними і нешкідливими мікроорганізмами такими міжнародними організаціями, як IDF (International Dairy Federation) (http://www.fil-idf.org) і EFFCA (European Food and Feed Cultures Association) (http://www.effca.com). Enterococcus faecium становлять досить велику частину від загальної кількості мікроорганізмів, виділених із домашньої бринзи. При аналізі мікрофлори різних національних продуктів, особливо сирів, в країнах з найбільш розвиненими традиціями сироваріння у Франції та Італії, поряд з іншими бактеріями часто виявляються ентерококи. Причому, з національних сирів, в більшій кількості ізолюють не мезофільні, а термофільні коки, в основному Streptococcus thermophilus, Streptococcus macedonicus, Enterococcus. ssp… Найпоширенішими у відсотковому відношенні видами ентерококів, виділеними з кисломолочних продуктів (в 1 UA 100822 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 основному сирів), є види Е. faecium, E. faecal is і E.durans. Багатьма авторами описується позитивна роль при використанні ентерококів в технологіях сироваріння. Наголос ставиться на те, що штами ентерококів, виділені з таких сирів, як правило, володіють антагоністичними властивостями по відношенню до патогенної мікрофлори травного тракту людини. Ентерококи відіграють важливу роль в процесі виробництва кисломолочних продуктів. їх відносять до не стартових культур молочнокислих бактерій "nonstarter lactic acid bacteria" (NSLAB), які ідентифіковані при виготовленні різноманітних сирів з сирого або пастеризованого молока, в основному на півдні Європи. Чисельність ентерококів в сирі типу "Медітеріан" може коливатись 4 6 5 7 в діапазоні від 10 до 10 КУО/г, а в повністю дозрілому сирі від 10 до 10 КУО/г. Таким чином, використання ентерококів при виготовленні національних кисломолочних продуктів, в основному сирів, може бути обґрунтовано їх важливими технологічними і біологічними властивостями, що дасть можливість отримати продукт із заданими технологічними та смаковими характеристиками. Lactococcus lactis subsp. lactis є класичним представником молочнокислих коків, що широко використовується при виробництві кисломолочних продуктів, кисловершкового масла та сирів. Культуру використовують у багатоштамових заквасках спільно із Lactococcus cremoris, Lactococcus diacetylactis і видами роду Leuconostoc. Штами лактокока продукують антибіотик нізин, який згубно діє на більшість штамів стрептококів, стафілококів, клостридій та актиноміцетів. Поширеність Lactococcus garvieae в бринзі домашнього виробництва Карпатського регіону України може бути пов'язана із типовістю цього продукту. В більшості випадків, штами цих мікроорганізмів володіють не високою кислотоутворюючою здатністю. Включення штамів Lactococcus garvieae у консорціум для виробництва бринзи в промислових умовах є збереженням типового природного бактеріального населення мікроорганізмів і їх відповідальності за типові сенсорні властивості традиційного сиру. Штами Lactococcus garvieae можна вважати важливою частиною мікробіального складу бринзи, пов'язаного із природньою ферментацією. Штами LactobaciUus plantarum, які включені у консорціум є пробіотичними культурами, які дослідженні та описані закордонними науковцями. Тим не менш, є представниками природньої мікрофлори бринзи і володіють цінними біологічними властивостями. Один із штамів LactobaciUus plantarum впливає на зниження рівня холестеролу в крові, інший є універсальним представником молочнокислих бактерій, які зустрічаються в діапазоні екологічних ніш і володіє високою здатністю виживання під час транзиту через ШКТ людини та ссавців, а також високою колонізуючою здатністю. Оскільки, ці штами є характерними для бринзи Карпатського регіону, тому рекомендовані для включення їх у консорціум для виробництва бринзи в промислових умовах. Отже, створений консорціум мікроорганізмів із штамів LactobaciUus plantarum, Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides, Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus garvieae, Enterococcus faecium, підібраних у оптимальних співвідношеннях забезпечую виготовлення сиру бризи у промислових умовах, аналогічного за мікробіологічним складом та органолептичними властивостями до бринзи виготовленої із сирого овечого молока в домашніх умовах високогір'я Українських Карпат. При проведенні патентно-інформаційного пошуку заявником і авторами знайдено технічне рішення (Спосіб виготовлення овечої бринзи в умовах високогір'я Українських Карпат, патент України № 83013) яке містить найбільшу кількість суттєвих ознак, спільних із заявленим рішенням: включає використання культури Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis, Streptococcus termophilus, LactobaciUus delbrueckii subsp. bulgaricus для сквашування бринзи. Але наявність зазначених ознак, спільних з прототипом, не забезпечує досягнення технічного результату, що забезпечує заявлений спосіб. Технічних рішень, які б за сукупністю ознак повністю співпадали із заявленим - не виявлено. Це дозволяє зробити висновок про відповідність заявленого технічного рішення критерію винаходу (корисної моделі) "новизна". Заявлений консорціум мікроорганізмів LactobaciUus plantarum, Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides, Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus garvieae, Enterococcus faecium для виробництва сиру бринзи є власною селекцією авторів. Отже, заявлене технічне рішення не випливає явним чином з рівня техніки, що дозволяє зробити висновок про відповідність його критерію винаходу (корисної моделі) "винахідницький рівень". Корисна модель належить до мікробіології та біотехнології, а саме до консорціуму мікроорганізмів для використання їх у виробництві сирів, і може бути застосована на 2 UA 100822 U 5 10 15 20 25 30 молокопереробних підприємствах різних форм власності для виробництва бринзи, а тому відповідає критерію винаходу (корисної моделі) "промислова придатність". Таким чином, заявлене технічне рішення є новим, промислово придатним, має винахідницький рівень, тобто відповідає всім умовам патентоспроможності винаходу (корисної моделі) згідно статті 7 розділу II Закону України "Про охорону прав на винаходи, корисні моделі" № 1771-III, 2000. Реалізацію заявленого способу здійснюють таким чином: Ідентифіковані на молекулярно-генетичному рівні методом секвенування гену 16S рРНК культури мікроорганізмів отримані із бринзи, непромислового виробництва, висівають на спеціальні поживні середовища МІ7 та MRS. Молочнокислі коки активно розмножуються на поживному середовищі М17, а молочнокислі палички на середовищі MRS. Мікроорганізми при температурі 30 °C до 24 годин культивування досягають концентрації в 1 мл lg 8,2-9,1. Культури збагачують шляхом 2-3 кратного пересіву і культивують при температурі 30 °C. Довготривале зберігання чистих культур молочнокислих бактерій проводиться у поживному бульйоні М17 для лактококів і MRS для молочнокислих паличок і 50 % гліцерином. Поживний бульйон в об'ємі 0,5 мл, що містить культури бактерій, змішують із гліцерином і заморожують до -80 °C. Ефективність та переваги заявленого способу підтверджені прикладами конкретного виконання способу. Експериментальні дослідження по здійсненню заявленого способу проводились на ПРАТ "Галичина" та в лабораторії кафедри технології молока і молочних продуктів Львівського національного університету ветеринарної медицини та біотехнологій імені С.З. Гжицького. Суспензію 22-24-годинної культури заявленого консорціуму штамів молочнокислих бактерій вносили у стерильне овече молоко в об'ємі 5 % до об'єму молока, перемішували і культивували 16-18 годин при температурі 30 °C до утворення згустку. Закваска разом з молокозсідальним ферментом забезпечує утворення сирного згустку. Саме мікрофлора заквашувальних культур визначає специфічні фізико-хімічні, органолептичні властивості, забезпечує безпеку споживання та збереження якісних характеристик впродовж зберігання. Наступні технологічні операції відбуваються за традиційною технологією виробництва бринзи. У таблиці 1 і 2 представлені деякі технологічні властивості використаних штамів молочнокислих бактерій. Таблиця 1 Технологічні властивості штамів молочнокислих бактерій, що використовуються у складі консорціуму. Показники Ріст та розвиток при температурі 10 °C Ріст та розвиток при температурі 40 °C Ріст та розвиток при температурі 45 °C Ріст та розвиток при NaCl 2 % Ріст та розвиток при NaCl 4 % Ріст та розвиток при NaCl 6,5 % Leuconostoc Lactococcus mesenteroides Lactococcus Enterococcus Lactobacillus plantarum lactis subsp. ssp. garvieae faecium lactis mesenteroides + + + + + +/ + + + + + + + + + + +/ + + + +/ + + 3 UA 100822 U 5 За здатністю мікроорганізмів розвиватись при певних температурах, оптимальною для культивування мікроорганізмів було обрано температуру 30 °C. Важливим критерієм відбору штамів молочнокислих бактерій для виробництва бринзи є стійкість мікроорганізмів до різних концентрацій солі. Оскільки, обов'язковим технологічним процесом виробництва бринзи є її соління в розсолі або перетиранням із сіллю. Для створення консорціуму, відібрано штами із високими показниками солестійкості від 4 % до 6,5 %. Таблиця 2 Значення титрованої кислотності молока, сквашеного штамами молочнокислих бактерій, що використовуються у складі консорціуму (°Т±1,2) Час ферментації, год. 3 6 12 24 48 10 15 Lactobacillus plantarum 40 56 91 102 109 Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides 30 37 58 93 97 Lactococcus lactis subsp. lactis Lactococcus Enterococcus garvieae faecium 40 58 97 109 110 15 32 48 69 80 34 39 80 104 107 Штам Lactococcus lactis subsp. lactis характеризується найвищою кислотоутворюючою здатністю. Поряд із ним високими технологічними властивостями, щодо продукування молочної кислоти характеризувалися штами Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium та Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides. Найменшою кислотоутворюючою здатністю характеризується штам Lactococcus garvieae. Включення представника цього виду мікроорганізмів у консорціум є обов'язковим, оскільки він є одним із домінуючих представників природної молочнокислої мікрофлори бринзи. Підрахунок кількості молочнокислих паличок у готовому продукті проводили на середовищі MRS, а молочнокислих коків на середовищі МІ7. Кількість молочнокислих мікроорганізмів в сумі досягала lg 7,1. У таблиці 3 подані результати досліджень органолептичних показників виготовленої бринзи. 20 Таблиця 3 Органолептичні показники готового продукту Смак і запах 30 Колір Кисломолочний, у міру солоний, злегка гострий 25 Консистенція, зовнішній вигляд Однорідна, ніжна, м'яка Білий, злегка жовтуватий, однорідний по всій масі Як видно із наведених вище даних, бринза, що виготовлена із застосуванням заявленого консорціуму у якості закваски, до складу якого входили Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus garvieae, Enterococcus faecium дозволяє зробити висновок про задовільний санітарний стан нового продукту і його нешкідливість для здоров'я споживачів. Окрім, цього штами Lactobacillus plantarum, що використані у консорціумі є пробіотичними культурами. Виготовлення бринзи в промислових умовах із вищезгаданим консорціумом є моментом збереження природного бактеріального населення мікроорганізмів традиційного овечого сиру бринзи, яка виготовляється у непромислових умовах Карпатського регіону України, роль яких безпосередньо пов'язана із природною ферментацією молока. Таким чином, результати досліджень, одержані у прикладі конкретного виконання способу підтверджують його ефективність. 35 4 UA 100822 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Консорціум мікроорганізмів Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides, Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus garvieae, Enterococcus faecium для виробництва сиру бринзи. Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5