Спосіб одержання біомаси та білка харчового призначення зморшка конічного (morchella conica)

Реферат: Спосіб одержання біомаси та білка харчового призначення заснований на використанні як продуцента гриба Morchella conica (Зморшка конічного), що включає приготування посівного матеріалу на агаризованому пивному суслі, приготування інокуляту на рідкому середовищі, культивування та стимуляцію росту продуцента. Згідно винаходу при приготуванні посівного матеріалу для стимуляції росту продуцента застосовують стимулятор росту "Емістим С" в -3 концентрації 0,2·10 мл/л середовища, після чого посівний матеріал використовують при приготуванні інокуляту на рідкому середовищі, культивування ведуть поверхнево на рідкому середовищі при опроміненні гриба на 12 годину культивування червоним переривчастим світлом з довжиною хвилі 630 нм з тривалістю імпульсу 1 мс, щільність потужності світла на 2 поверхні міцелію складає 0,5 мВт/см , тривалість експозиції 8 хв., потім гомогенізують, здійснюють процес ферментації на модифікованому середовищі глибинним методом при опромінюванні переривчастим червоним світлом з довжиною хвилі 630 нм інтенсивністю 10 -2 -1 мкмоль·м ·с протягом усього періоду ферментації. UA 102450 C2 (12) UA 102450 C2 UA 102450 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до біотехнології, може бути використаний у харчовій промисловості для виготовлення смакових приправ на основі грибної біомаси з високим вмістом білка і стійким грибним ароматом, у фармацевтичній промисловості для розробки біологічно активних добавок, і стосується способу одержання біомаси гриба, яка містить біологічно активні речовини, має імуностимулювальні, протипухлинні та протизапальні властивості. Відомий спосіб отримання плодових тіл видів роду Morchella (Пат. 4594809 США, A01G Va. Cultivation of morchella / Ower R. D., Mills G. L., Malachowski J. A. - № 728176; заявл. 29.04.85; опубл. 27.09.86, НКИ 47/1.1.-15 с; Пат. 4757640 США, A01G 04. Cultivation of morchella / Ower R. D., Mills G. L., Malachowski J. A. -№ 872823; заявл. 11.06.86; опубл. 27.09.88, НКИ 47/1.1.-21 с; Пат. 4866878 США, A01G 04. Cultivation of morchella / Ower R. D., Mills G. L., Malachowski J. A. № 217840; заявл. 12.07.88; опубл. 19.09.89, НКИ 47/1.1.-22 с). Авторами проведена робота з виявлення умов плодоношення Morchella spp. Особлива увага приділялась компонентному складу субстратів і умовам отримання склероціїв. Як інокулят поряд із звичайним зерновим міцелієм автори запропонували використовувати великі за розміром (1-5 см) склероції. Застосування як інокулюма саме склероціїв представляло дуже важливий аспект винаходу. Для отримання склероціїв R. Ower та співавт. запропонували два види субстратів, що мали різні живильні властивості: перший - органічний субстрат, багатий поживними речовинами, який складався із зерна злаків із різноманітними домішками органічних і мінеральних джерел вуглецю, азоту і вітамінів. Другий - з бідного на поживні речовини субстрату - вологого ґрунту або тирси дерев листяних порід. Обидва ці субстрати розташовували в два шари один над одним, не перемішували. Інокуляцію проводили вегетативним міцелієм, склероціями або міцелієм, що вирощували на рідких середовищах. Після кількох тижнів інкубації вегетативний міцелій повністю колонізував шар багатого субстрату, а в бідному шарі починали формуватись склероції. Поживні речовини з багатого шару субстрату по гіфам вегетативного міцелію переміщувались в склероції і накопичувались там у формі ліпідів. Після дозрівання склероціїв, коли їх розмір сягав 5 см, їх видаляли, та інокулювали в піддони з шаром тирси, крізь яку декілька діб пропускали воду. Через 10-12 діб, якщо всі умови вологості, температурного режиму та аерації були витримані, починали з'являтися зачатки плодових тіл.1 Недоліком цього способу є довготривалість та складність отримання склероціїв та плодових тіл. Проте, незважаючи на детальний опис, технологію R. Ower не вдалося відтворити наступним дослідникам, бо вона залишала чимало неясних моментів, особливо пов'язаних з отриманням склероціїв. Тому відомостей щодо штучного культивування Morchella у великих обсягах за цією технологією немає. У США фірма "Terri Farm" в 1993 р. купила права на технологію культивування Morchella, яка була розроблена R. Ower та співавторами, але одержані на основі цього методу плодові тіла грибів значно відрізнялись за своїми морфологічними ознаками, а також смаковими та ароматичними властивостями від грибів цього виду, зібраних у природних умовах. У низці публікацій (Kuo M. Morels. - Michigan: University of Michigan Press, 2005.-205p. Режим доступу: http://www.mushroomepert.om/morels/ when where.html.; Pilz D., McLain R., Alexander S. Ecology and management of morels harvested from the forests of Western North America. - New York: USDA, 2007.-161 p.) висловлюється думка, що невдалі спроби з відтворення технології R. Ower пов'язані з тим, що цей метод був розроблений лише для американського виду Morchella rufobrunnea, який трапляється у субтропічній зоні Американського континенту. Відомий спосіб одержання біомаси глибинним способом видів Morchella angusticeps, М. сопгса, М. crassipes, M. esculenta, M. semilibera (Gilbert F. A. The submerged culture of Morchella // Mycologia.-1960. - Vol. 52, № 2. - P. 201-209). Автори отримували від 10-15 г/л біомаси, яка містила від 18-20 % білка. Найбільш близькими за технічною сутністю є способи одержання біомаси харчового призначення глибинним методом видів роду Morchella, зокрема М. hortensis, M. esculenta, M. crassipes (Sugihara T. F., Humfeld H. Submerged culture of the mycelium of various species of mushrooms // Applied of Microbiology.-1954. - Vol. 2, № 1. - P. 170-172;; Litchfield J. H., Overbeck R. C, Davidson A. Factors affecting the growth of Morchella mushroom mycelim in submerged culture // Journal of Agricultural and Food Chemistry.-1963. - Vol. 11, № 2. - P. 158-162; Litchfield J. H. The mass cultivation of Morchella species in submerged culture and their potential uses as sources of protein //Global Impacts of Applied Microbiology.-1964. - Vol. 1, № 2. - P. 327-337; Hamid A., Shah F. H., Qadeer M. A. Production of mushroom mycelium from industrial wastes // Pakistan Journal of Biochemistry.-1972. - № 5. - P. 57-60). Для вирощування глибинного міцелію зморшків використовували як синтетичні, так і комплексні живильні середовища, що містили промислові 1 UA 102450 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 відходи харчової й паперової промисловості, насамперед фруктові соки, молочну сироватку, гарбузовий та кукурудзяний екстракти, крохмаль, сульфітні луги. Тривалість процесу одержання біомаси 20 діб. У літературі є відомості щодо успішного використання комплексного середовища С і синтетичного Д, на яких врожай сухої біомаси М. esculenta, М. crassipes, M. hortensis в глибинній культурі становив 15 г/л. Найбільш близьким за результатом, що досягається, є спосіб одержання біомаси М. esculenta та М. crassipes у глибинній культурі на живильних середовищах з різними джерелами вуглецевого та азотного живлення. На оптимізованому рідкому середовищі з глюкозою та кукурудзяним екстрактом максимальний вихід біомаси у відібраних штамів становив понад 18 г/л на 16-ю добу культивування. Вміст білка дорівнював від 20-25 %. Дослідники встановили оптимальні для росту культур умови температурного режиму, аерації, кислотності середовища (Litchfield J. Н., Overbeck R. С, Davidson A. Factors affecting the growth of Morchella mushroom mycelim in submerged culture // Journal of Agricultural and Food Chemistry.-1963. - Vol. 11, № 2. - P. 158-162; Litchfield J. H. Submerged culture of mushroom mycelium // Microbial technology.-1967. - P. 327-337). Недоліками перелічених способів є тривалість процесу одержання біомаси і відносно невисокий вихід кінцевого продукту. В основу винаходу способу отримання біомаси та білка харчового призначення поставлена задача удосконалення способу, у якому шляхом нового використання фотосенсорних властивостей гриба Morchella соnicа, нових режимів підготовки процесу ферментації, порядку здійснення операцій і режиму їхнього ведення, забезпечується скорочення тривалості отримання і збільшення виходу біомаси та білка харчового призначення. Для забезпечення вирішення задачі спосіб отримання біомаси та білка харчового призначення зморшка конічного передбачає використання як продуцента їстівного гриба Morchella соnicа (зморшок конічний), що включає приготування посівного матеріалу на агаризованому пивному суслі, приготування інокуляту на рідкому середовищі, культивування та стимуляцію росту продуцента. Новим в способі є те, що при приготуванні посівного матеріалу для стимуляції росту продуцента застосовують стимулятор росту "Емистим С", який являє собою набір органічних речовин на основі продуктів життєдіяльності грибів-епіфітів з кореневої системи лікарських . 3 рослин женьшеню і обліпихи, в концентрації 0,2 10- мл/л середовища; а при приготуванні інокуляту на рідкому середовищі, культивування ведуть поверхнево на рідкому середовищі при опроміненні гриба на 12 годину культивування червоним переривчастим світлом (довжина хвилі 2 630 нм) з тривалістю імпульсу 1 мс, щільність потужності світла на поверхні міцелію 0,5 мВт/см , тривалість експозиції 8 хв., а потім гомогенізують; здійснюють процес ферментації на модифікованому середовищі глибинним методом при опромінюванні переривчастим червоним -2 -1 світлом (довжина хвилі 630 нм) інтенсивністю 10 мкмоль м с протягом усього періоду ферментації. Нові операції і режими здійснення способу застосування виявлених емпіричним шляхом фотосенсорних властивостей гриба Morchella сопіса дозволяють поліпшити технічні характеристики способу отримання: на 6 діб скорочується тривалість отримання біомаси та білка харчового призначення і вихід кінцевого продукту збільшується на 54,02 %. Сутність винаходу, що заявляється, пояснюється прикладами (табл. 1). В наведених нижче прикладах поставлена задача вирішувалася шляхом спеціальної підготовки інокуляту гриба й активації стимулятором росту та світлом у спеціально підібраних режимах біосинтетичної активності гриба. У результаті цього відбувається збільшення швидкості росту і кількості накопичення біомаси і білка харчового призначення. Посівний міцелій вирощували на агаризованому пивному суслі (8° за Балінгом), яке містило стимулятор росту . 3 "Емистим С" в концентрації 0,2 10- мл/л середовища, у чашках Петрі 5 діб. Для одержання інокулята в рідке живильне середовище (рН 6,0-7,0) такого складу (г/л): Глюкоза КН2РО4 К2НРО4 MgSO47H2O Пептон ферментативний Дріжджовий екстракт Вода дистильована 25 г/л 1,0 г/л 1,0 г/л 0,25 г/л 3,0 г/л 2 г/л до 1,0 л 2 UA 102450 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 стерильно поміщали нарізані спеціальним свердлом агарові диски (діаметр 1 см) з активізованим міцелієм гриба, вирощеним вищевказаним способом на чашках Петрі, з розрахунку 5 дисків на 100 мл середовища. Культивування проводили поверхневим способом за температури 26 С. Через 12 годин культивування гриба поверхню середовища опромінювали червоним переривчастим світлом (довжина хвилі 630 нм) з тривалістю імпульсу 1 мс, щільністю потужності світла на поверхні міцелію 0,5 мВт/см, тривалість експозиції 8 хв. для стимуляції росту продуценту. Далі отриману біомасу гриба разом із культуральною рідиною поміщали в стерильний гомогенізатор і гомогенізували до одержання однорідної суспензії. Отриманим інокулятом (в кількості 5 %) засівали рідке ферментаційне середовище вищевказаного складу. Культивування вели глибинним способом у колбах Ерленмейєра об'ємом 750 мл, які містили 150 мл середовища на круговий качалці при 180 об/хв. при опроміненні переривчастим червоним світлом (довжина хвилі 630 нм) інтенсивністю 10 мкмоль· -2 -1 м ·с протягом усього періоду ферментації. Приклад 1. Контроль 1. Посівний міцелій вирощували на агаризованому пивному суслі (8° за Балінгом) у чашках Петрі. Для одержання інокуляту в рідке живильне середовище (рН 6,0-7,0) означеного вище складу стерильно поміщали нарізані спеціальним свердлом агарові диски (діаметр 5 мм) з міцелієм гриба, вирощеним вищевказаним способом на чашках Петрі, з розрахунку 5 дисків на 100 мл середовища. Культивування проводили поверхневим способом за температури 26 °C. Далі отриману біомасу гриба разом з культуральною рідиною поміщали в стерильний гомогенізатор і гомогенізували до одержання однорідної суспензії. Отриманим інокулятом (в кількості 5 %) засівали рідке ферментаційне середовище вищевказаного складу. Культивування вели глибинним способом у колбах Ерленмейєра об'ємом 750 мл, які містили 150 мл середовища на круговий качалці при 180 об/хв. Тривалість одержання посівного міцелію - 7 діб; інокуляту - 7 діб; ферментація -6 діб, весь період одержання біомаси - 20 діб. Кількість накопичення біомаси - 14,2 г/л. Вміст харчового білка в біомасі - 23,3 % від а.с.м. Приклад 2. Дослід 1. Біотехнологічний процес одержання біомаси проводять так само, як і в контролі (приклад 1), лише посівний міцелій гриба вирощували на агаризованому середовищі із . 3 додаванням "Емистиму С" у кількості 0,2 10- мл/л. Тривалість одержання посівного міцелію - 5 діб; інокуляту-6 діб; ферментація - 6 діб, весь період одержання біомаси - 17 діб. Кількість накопичення біомаси - 14,8 г/л. Вміст харчового білка в біомасі - 24,39 % від а.с.м. Збільшення кількості біомаси - 4,37 %, збільшення вмісту харчового білка в біомасі - 4,68 % від а.с.м. Приклад 3. Дослід 2. Біотехнологічний процес одержання біомаси проводять так само, як і в контролі (приклад 1), лише посівний міцелій гриба, вирощували на агаризованому середовищі із . 3 додаванням "Емистиму С" у кількості 0,2 10- мл/л., а культуру гриба у процесі одержання інокулюму на рідкому середовищі опромінювали на 12 год. культивування (довжина хвилі 630 2 нм, тривалість імпульса 1 мс, щільність потужності світла на поверхні міцелію 0,5 мВт/см , експозиція 8 хв). Тривалість одержання посівного міцелію - 5 діб; інокулюму - 5 діб; ферментація - 5 діб, весь період одержання біомаси 15 діб. Кількість накопичення біомаси - 16,25 г/л. Вміст харчового білка в біомасі - 27,53 % від а.с.м. Збільшення кількості міцеліальної маси - 14,4 %, збільшення вмісту харчового білка в біомасі - 18,15 % від а.с.м. Приклад 4. Дослід 3. Біотехнологічний процес одержання біомаси проводять так само, як і в контролі (приклад 1), лише посівний міцелій гриба вирощували на агаризованому середовищі із . 3 додаванням "Емистиму С" у кількості 0,2 10- мл/л., а культуру гриба у процесі одержання інокулюму на рідкому середовищі опромінювали на 12 год. культивування (довжина хвилі 630 2 нм, тривалість імпульсу 1 мс, щільність потужності світла на поверхні міцелію 0,5 мВт/см , експозиція 8 хв) і протягом усього процесу ферментації опромінювали переривчастим червоним -2 -1 світлом (довжина хвилі 630 нм) інтенсивністю 10 мкмоль м с . Тривалість одержання посівного міцелію - 5 діб; інокулюму - 5 діб; ферментація -4 доби, весь період одержання біомаси - 15 діб. Кількість накопичення біомаси - 21,87 г/л. Вміст харчового білка в біомасі - 33,5 % від а.с.м. Збільшення кількості біомаси -54,01 %, збільшення вмісту харчового білка в біомасі - 43,77 % від а.с.м. Приклад 5. Дослід 4. Біотехнологічний процес одержання біомаси проводять так само, як і в контролі (приклад 1), лише посівний міцелій гриба вирощували на агаризованому середовищі із . 3 додаванням "Емистиму С" у кількості 0,2 10- мл/л, а культуру гриба протягом усього процесу ферментації опромінювали переривчастим червоним світлом (довжина хвилі 630 нм) -2 -1 інтенсивністю 10 мкмоль м с . 3 UA 102450 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Тривалість одержання посівного міцелію - 5 діб; інокулюму - 6 діб; ферментація -6 діб, весь період одержання біомаси - 17 діб. Кількість накопичення біомаси - 20,94 г/л. Вміст харчового білка в біомасі - 29,17 % від а.с.м. Збільшення кількості біомаси -47,47 %, збільшення вмісту харчового білка в біомасі - 25,19 % від а.с.м. Приклад 6. Дослід 5. Біотехнологічний процес одержання біомаси проводять так само, як і в контролі (приклад 1), тільки культуру гриба у процесі одержання інокулюму на рідкому середовищі опромінювали на 12 год. культивування (довжина хвилі 630 нм, тривалість імпульсу 1 мс, щільність потужності світла на поверхні міцелію 0,5 мВт/см, експозиція 8 хв) Тривалість одержання посівного міцелію - 7 діб; інокулюму - 5 діб; ферментація - 6 діб, весь період одержання біомаси - 18 діб. Кількість накопичення біомаси -16,7 г/л, Вміст харчового білка в біомасі - 25,34 % від а.с.м. Збільшення кількості біомаси -13,17 %, збільшення вмісту харчового білка в біомасі - 8,76 % від а.с.м. Приклад 7. Дослід 6. Біотехнологічний процес одержання біомаси проводять так само, як і в контролі (приклад 1), лише культуру гриба опромінювали протягом усього процесу ферментації -2 -1 переривчастим червоним світлом (довжина хвилі 630 нм) інтенсивністю 10 мкмоль·м ·с . Тривалість одержання посівного міцелію - 7 діб; інокулюму - 7 діб; ферментація -5 діб, весь період одержання біомаси - 19 діб. Вміст біомаси віл культуральної рідини - 15.76 г/л, % збільшення біомаси - 1,11. Вміст харчового білка в біомасі - 26,07 % від а.с.м., збільшення вмісту харчового білка в біомасі - 11,89 % від а.с.м. Приклад 8. Дослід 7. Біотехнологічний процес одержання біомаси проводять так само, як і в контролі (приклад 1), тільки культуру гриба у процесі одержання інокулюму на рідкому середовищі опромінювали на 12 год. культивування (довжина хвилі 630 нм, тривалість імпульсу 2 1 мс, щільність потужності світла на поверхні міцелію 0,5 мВт/см , експозиція 8 хв) і протягом усього процесу ферментації опромінювали переривчастим червоним світлом (довжина хвилі -2 -1 630 нм) інтенсивністю 10 мкмоль м с . Тривалість одержання посівного міцелію - 7 діб; инокулюма - 6 діб; ферментація - 5 діб, весь період одержання біомаси - 18 діб Вміст біомаси в 1 л культуральної рідини -20,99 г/л, % збільшення біомаси - 47,8. Вміст харчового білка в біомасі - 28,11 % від а.с.м., збільшення вмісту харчового білка в біомасі - 20,64 % від а.с.м. Приклад 9. Дослід 8. Біотехнологічний процес одержання біомаси проводять так само, як і в Прикладі 4 Досліді 3. Відмінністю є тільки те, що інокулюм гриба вирощують не поверхнево на рідкому середовищі, а глибинним способом у колбах Ерленмейєра об'ємом 750 мл з 150 мл середовища на круговий качалці при 180 об/хв. Тривалість одержання посівного міцелію - 7 діб; інокулюму - 5 діб; ферментація - 6 діб, весь період одержання біомаси - 18 діб. Вміст біомаси віл культуральної рідини - 19.77 г/л, % збільшення біомаси - 39,23. Вміст харчового білка в біомасі - 28,96 % від а.с.м., збільшення вмісту харчового білка в біомасі - 24,29 % від а.с.м. Приклад 10. Дослід 9. Біотехнологічний процес одержання біомаси проводять так само, як і в Прикладі 4 Досліді 3. Відмінністю є тільки те, що культуру гриба у процесі одержання інокулюму на рідкому середовищі опромінювали на 24 год. культивування (довжина хвилі 630 2 нм, тривалість імпульсу 1 мс, щільність потужності світла на поверхні міцелію 0,5 мВт/см , експозиція 8 хв) Тривалість одержання посівного міцелію - 5 діб; інокулюму - 6 діб; ферментація - 5 діб, весь період одержання біомаси - 16 діб. Вміст біомаси в 1 л культуральної рідини -20,13 г/л, % збільшення біомаси - 41,76. Вміст харчового білка в біомасі - 27,18 % від а.с.м., збільшення вмісту харчового білка в біомасі - 16,65 % від а.с.м. Результати представлені в таблицях. Таблиця 1 Варіанти обробки міцелію при одержанні біомаси и білка На агаризованому середовищі, Опромінення ("Емистим С" . 3 0,2 10- мл/л) Тривалість Білок, Біомаса, г/л У процесі Протягом усього процесу, а.с.б. доба одержання процесу інокуляту на ферментації рідкому переривчастим середовищі, 12 червоним світлом година (довжина хвилі 630 культивування нм) інтенсивністю 4 % % збільшення Варіанти біомаси UA 102450 C2 (довжина хвилі 630 10 мкмоль м-2с-1 нм, тривалість протягом усього імпульсу 1 мс, періоду щільність ферментації. потужності світла на поверхні міцелію 0,5 мВт/см2, експозиція 8 хв) -(7) -(7) -(6) 20 14,2 +(5) -(6) -(6) 17 14,82 +(5) +(5) -(5) 15 16,25 +(5) +(5) +(4) 14 21,87 +(5) -(6) +(6) 17 20,94 -(7) +(5) -(6) 18 16,07 -(7) -(7) +(5) 19 15,76 Примітка: - у дужках тривалість етапу одержання, білка та харчового білка, доба; обробка не проводилась 23,3 Контроль 1 24,39 4,37±0,55 Дослід 1 27,53 14,4±0,99 Дослід 2 33,5 54,02±2,17 Дослід 3 29,17 47,47±2,66 Дослід 4 25,34 13,17±1,21 Дослід 5 26,07 10,10±1,33 Дослід 6 (+) - обробка проводилась; (-) Таблиця 2 Тривалість вирощування на агаризованому середовищі, доба Тривалість одержання інокуляту, доба Тривалість ферментації (одержання біомаси міцелію), доба Тривалість усього процесу одержання біомаси міцелію, доба Температура культивування Загальний вихід біомаси міцелію, г/л Загальний білок, % від АСБ Примітка: (-) - обробка не проводилась Новий спосіб одержання Прототип 1 біомаси міцелію 5 5 4 14 18-20 25 °C 25 °C 22,87 15 33,5 Прототип 2 16 26 °C 18 20-25 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 Спосіб одержання біомаси та білка харчового призначення з гриба Morchella conica (Зморшка конічного), що включає приготування посівного матеріалу на агаризованому пивному суслі, приготування інокуляту на рідкому середовищі, культивування та стимуляцію росту продуцента, який відрізняється тим, що при приготуванні посівного матеріалу для стимуляції росту -3 продуцента застосовують стимулятор росту "Емістим С" в концентрації 0,2·10 мл/л середовища, після чого посівний матеріал використовують при приготуванні інокуляту на рідкому середовищі, культивування ведуть поверхнево на рідкому середовищі при опроміненні гриба на 12 годину культивування червоним переривчастим світлом з довжиною хвилі 630 нм з 2 тривалістю імпульсу 1 мс, щільність потужності світла на поверхні міцелію складає 0,5 мВт/см , тривалість експозиції 8 хв., потім гомогенізують, здійснюють процес ферментації на модифікованому середовищі глибинним методом при опромінюванні переривчастим червоним -2 -1 світлом з довжиною хвилі 630 нм інтенсивністю 10 мкмоль·м ·с протягом усього періоду ферментації. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5