Ячмінь зі зниженою активністю ліпоксигенази та напій, одержаний з нього

Реферат: Винахід належить до напою, який отриманий з рослини ячменю або її частини, де зазначений напій має менше ніж 50 % потенціалу T2N у порівнянні з потенціалом T2N напою, отриманого таким же чином з сорту ячменю Power, та де рослина ячменю або її частина містить першу мутацію, яка призводить до повної втрати функціонального ферменту ліпоксигенази LOX-1, і другу мутацію, яка призводить до повної втрати функціонального ферменту LOX-2. UA 106597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Всі патентні та непатентні посилання, процитовані в заявці, включені шляхом посилання в повному обсязі. Галузь винаходу Винахід відноситься до досягнень у галузі біотехнології рослин, що дозволяють виявити рослини ячменю та їх продукти, які є дефектними у синтезі двох ліпоксигеназних (LOX) ферментів, LOX-1 і LOX-2, та, таким чином, запропонувати нову сировину для різних типів використання. Вказана сировина, при застосуванні, наприклад, у виробництві напоїв, полегшує розгортання нових можливостей для виробництва більш характерних зберігаючи смак видів пива, які накопичують виражено низькі рівні сполуки з невластивим пиву присмаком транс-2ноненалю (T2N), з додатковою перевагою вмісту тільки низьких вмістів потенціалу T2N. Передумови створення винаходу Велика частина пива виробляється на основі ячменю (Hordeum vulgare, L.), який є однодольною зерновою рослиною, що вирощується в багатьох частинах світу. Він розводиться не тільки через його економічне значення як джерело промислової продукції, такої як пиво, але і як джерело кормів для тварин. На жаль, не доступні способи для підготовки трансгенних рослин ячменя, які повністю позбавлені експресії певного гена та відповідного білка. В цілому для ячменю, застосування антисмислової методики може бути використане для створення трансгенних рослин, які все ще експресують деякі з білків (див., наприклад, Robbins et al., 1998; Stahl et al., 2004; Hansen et al., 2007). Ефективні способи для підготовки конкретних мутацій з використанням химерних РНК/ДНК або сайт-спрямованого мутагенезу в рослинах ячменю також не були розроблені. Насправді, жодного прикладу успішного олігонуклеотид-спрямованого генного таргетингу в ячменю не було опубліковано. Iida і Terada (2005) відзначили, що олігонуклеотид-спрямований генний таргетинг прослідковувався в кукурудзі, тютюні і рисі, але не в ячменю, причому у всіх випадках з геном ALS у якості мішені. Частиною висновку дослідження було те, що додатково ще потрібно досліджувати, чи може стратегія з відповідними змінами бути застосована до генів, крім тих, які безпосередньо є селектабельними, наприклад, такими як гени ALS. Мішеневий мутагенез з використанням нуклеаз цинкових-пальців являє собою ще один інструмент, який може бути використаний в майбутньому для дослідження базової біології рослин або для модифікації сільськогосподарських культур (Durai et al., 2005; Tzfira and White, 2005; Kumar et al., 2006). У цьому випадку також мутагенез не розглядався або успішно не застосовувався у відношенні ячменю. Однак, мутанти ячменя можуть бути отримані неспецифічним мутагенезом з використанням хімічної обробки або опромінення, наприклад, шляхом обробки азидом натрію (NaN 3; фіг. 1). Приклад – зерна ячменю, мутагенізовані за допомогою NaN3, і піддані скринінгу на високий рівень вільних фосфатів, з метою виявлення мутантів з низьким вмістом фітатів (Rasmussen and Hatzack, 1998); в цілому були визначені 10 мутантів з 2000 підданих скринінгу зерен. Проте, ідентифікація конкретного мутанта після обробки NaN3 потребує ефективного способу скринінгу і далеко не завжди є успішною. У 1970 році молекула, що надає пиву присмак картону, була виділена та ідентифікована як T2N, леткий C9 алкеналь (Jamieson and Gheluwe, 1970). Так як граничний смаковий рівень для T2N у людини вкрай низький, як попередньо встановлено, становить приблизно 0,7 нМ або 0,1 ppb (частин на мільярд) (Meilgaard, 1975), продукти навіть з незначним рівнем цього альдегіду розглядаються як застарілі внаслідок невластивого даному продукту присмаку. Тим не менш, рівень T2N, як правило, є дуже низьким у свіжому пиві (Lermusieau et al., 1999), так що припускалось, що під час зберігання вільний T2N може вивільнятися з адуктів T2N (Nyborg et al., 1999). Цей погляд підтверджувався подальшим спостереженням, що потенціал T2N в суслі корелює з утворенням T2N після зберігання продукту (Kuroda et al., 2005). Зерна ячменю містять три ферменти LOX, відомих як LOX-1, LOX-2 і LOX-3 (van Mechelen et al., 1999). LOX-1 каталізує утворення 9-гідропероксиоктадекадиєнової кислоти (9-HPODE, див. фіг. 2 для часткового огляду LOX шляху) - прекурсору як T2N, так і тригідроксиоктадеценових кислот (скорочено THA) з лінолевої кислоти. LOX-2, головним чином, каталізує перетворення лінолевої кислоти в 13-HPODE, яка далі метаболізує до гексаналя, С6-альдегіда з високим порогом смакового сприйняття  0,4 мільйонних частин (ppm, проміле) (Meilgaard, див. вище). Дія LOX-3, ймовірно, не має відношення до даної заявки з двох причин: рівень експресії відповідного гена в зернах ячменю є дуже низьким, а специфічність продукту LOX-3 залишається незрозумілою. На підтримку вищезазначених даних, в декількох доповідях було відзначено, що T2N продукується за допомогою біохімічного шляху, що включає перетворення лінолевої кислоти в 9-HPODE, спочатку за допомогою дії LOX-1, а потім розщепленням 9-HPODE через дію 9 1 UA 106597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гідропероксидліази (див., наприклад, Kuroda et al., 2003, 2005; Noodermeer et al., 2001). Ймовірно, немає жодної кореляції між загальною активністю LOX в солоді і потенціалом ноненалю суслі. Тим не менш, припускалася значна кореляція між активністю LOX-1 і потенціалом T2N сусла, перш за все тому, що активність LOX-2 вважалась нижчою по відношенню до утворення потенціалу T2N в суслі (Kuroda et al., 2005). На фіг. 2, як зазначалося вище, показана частина шляху LOX, фокусуючись на біохімічних реакціях з лінолевої кислоти в T2N. Основна активність ферменту LOX-1 стосується перетворення лінолевої кислоти в 9-HPODE, яка є таким, що стоїть нижче за ходом реакції, метаболітом біохімічного шляху, що веде до утворення T2N. На відміну від цього, основна активність LOX-2 стосується перетворення лінолевої кислоти в 13-HPODE, яка відокремлюється від вищезазначеного біохімічного шляху до T2N. Слід зазначити, що ферменти LOX-1 і LOX-2 можуть використовувати ліноленову кислоту як субстрат, але ця активність виходить за рамки даної заявки, так як відповідні шляхи не ведуть до утворення T2N. Припускається, що LOX-1 сприяє основній активності LOX в солоді (див., наприклад, Kuroda et al., 2003). Було отримано кілька різних рослин ячменю, для яких характерне зниження або відсутність активності LOX-1. Наприклад, зерна ячменю і рослини ячменю, що мають низьку активність LOX-1 були розкриті в заявці РСТ WO 02/053721, Douma, A.C. et al. В WO 2005/087934 Breddam, K. et al. привернули увагу до двох різних мутантів ячменю, дефективних в активності LOX-1 – сплайсингового мутанту і мутанту з передчасним стоп-кодоном трансляції. Вони були визначені після розмноження і скринінгу мутованих рослин, як показано на фіг. 1. Хоча вищезгадані мутанти були визначені шляхом скринінгу NaN3-мутагенізованого ячменю, Hirota, N. et al. описали в ЕР 1609866 рослину ячменю без активності LOX-1, яка була ідентифікована шляхом скринінгу колекції місцевих сортів ячменю. Відомі кілька прикладів мутованих рослин, які синтезують низькі рівні LOX. Однак, не було описано жодної рослини ячменю, дефектної щодо кількох видів активності ліпоксигенази, наприклад, жодної рослини ячменю, дефектної щодо активності обох LOX-1 і LOX-2. Методи для надання можливості генетичної маніпуляції з рослинами часто є специфічними для конкретного виду рослини, і таким чином, незважаючи на це, деякі рослини рису, рослини сої або рослини Arabidopsis, як відомо, містять низький рівень LOX, методи підготовки таких рослин не можуть бути використані в генеруванні рослин ячменю з низькою чи відсутньою активністю LOX. Крім того, LOX мутанти одного виду рослини можуть мати різні властивості в порівнянні з LOX мутантами інших видів рослин. Короткий опис винаходу Сусло являє собою комплексну ключову рідину у виробництві напоїв на основі солоду, таких як пиво (див. фіг. 3, що надає огляд всього процесу приготування пива). Сусло, підготовлене з рослин ячменю з дефіцитом активності LOX-1, насправді характеризується значними рівнями потенціалу T2N, хоча вказані рівні нижчі, ніж в суслі, підготовленому з ячменю дикого типу. Так як вказаний потенціал в суслі корелює з T2N, що утворюється в пиві після зберігання (Kuroda et al., 2005), то відповідно існує потреба в рослинах ячменю, корисних у виробництві сусла зі значно зниженим рівнем потенціалу T2N. Були описані способи зниження активності LOX-1 шляхом термічної обробки. Тим не менш, термічна обробка, як правило, проводиться під час приготування солоду та/або приготування сусла, і, таким чином, продукти активності LOX могли накопичуватися в ячмені до проведення термічної обробки. Аналіз ячменю показав, що значна кількість продуктів активності LOX була представлена в ячмені, ще до приготування солоду (Wackerbauer і Meyna, 2002). Даний винахід забезпечує рослини ячменю з дефіцитом активності LOX-1 і LOX-2 і описує, що вказані рослини ячменю мають кілька виражених, неочікуваних переваг. Як вже зазначалося авторами вище, Kuroda et al. (див. вище) описували відсутність кореляції між активністю LOX в солоді та потенціалом T2N в суслі, і пояснювали це наявністю активності LOX-2. Kuroda et al. (2005) відповідно передбачали незначну роль LOX-2 по відношенню до формування потенціалу T2N. Дослідники пивоваріння неправильно тлумачили утворення вільного T2N і потенціалу T2N. Тому здається несподіваним, і можливо приголомшливим факт, коли даний винахід пропонує експериментальні докази для розкриття позитивного ефекту використання рослин ячменю з дефіцитом активності LOX-1 і LOX-2 для виробництва сусла, яке виявляє дуже низький рівень потенціалу T2N. Також було виявлено, що рівень вільного T2N в суслі, виготовленому з рослин ячменю з дефіцитом активності LOX-1 і LOX-2, був нижчим, ніж у суслі, виготовленому з нульLOX-1 ячменю. Одна з цілей даного винаходу полягає в забезпеченні напоїв, виготовлених з рослини 2 UA 106597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ячменю, або її частини, де вказаний напій містить дуже низький рівень потенціалу T2N і де вказана рослина ячменю, або її частина, включає в себе першу мутацію, яка призводить до повної втрати функції активності LOX-1, такої як повна втрата функціонального ферменту LOX1, і другу мутацію, яка призводить до повної втрати функції активності LOX-2, такої як повна втрата активного ферменту LOX-2. Винахід також спрямований на забезпечення рослин ячменю, корисних для підготовки напоїв відповідно до винаходу. Таким чином, винахід описує генерування рослин ячменю, або їх частин, що включають першу мутацію, яка призводить до повної втрати функції активності LOX1, такої як повна втрата функціонального ферменту LOX-1, і другу мутацію, яка призводить до повної втрати функції активності LOX-2, такої як повна втрата функціонального ферменту LOX2. Крім того, винахід пропонує рослинні продукти, що включають перероблену рослину ячменю, або її частину, причому вказана рослина містить першу мутацію, яка призводить до повної втрати функції активності LOX-1, такої як повна втрата функціонального ферменту LOX1, і другу мутацію, що призводить до повної втрати функції активності LOX-2, такої як повна втрата функціонального ферменту LOX-2. Без обмежень, вищезазначені рослинні продукти можуть являти собою, наприклад, композицію солоду чи композицію сусла, або напій (наприклад, напій на основі солоду, наприклад, пиво чи безалкогольні напої на основі солоду), або напій на основі ячменю або напій на основі суміші солоду і ячменю та необов'язково інших інгредієнтів. Продукти рослинного походження можуть також являти собою ячмінні сиропи, солодові сиропи, ячмінні екстракти та солодові екстракти. Крім того, винахід також відноситься до способів отримання напою, що характеризується дуже низьким рівнем потенціалу T2N, які передбачають стадії: (і) підготовки композиції, що включає рослину ячменю, або її частини, що включають першу мутацію, яка призводить до повної втрати функції активності LOX-1, такої як повна втрата функціонального ферменту LOX-1, і другу мутацію, що призводить до повної втрати функціонального LOX-2, такої як повна втрата активного ферменту LOX-2; (іі) переробки композиції (і) в напій; з отриманням напою, що характеризується дуже низьким рівнем потенціалу T2N. Винахід також стосується рослин ячменю, які додатково до першої мутації, що призводить до повної втрати функції активності LOX-1, і другої мутації, що призводить до повної втрати функції активності LOX-2, також містять одну або кілька додаткових корисних мутацій. Опис фігур На фіг. 1 показаний один приклад того, як можуть бути розмножені NaN 3-мутагенізовані зерна ячменю. Зерна генерації M0 ростуть до рослин, які розвивають зерна генерації M1. Вони можуть бути посіяні для розвитку в рослини M2. Далі, рослини М2 ростуть і дають зерна генерації M3. Зерна генерації M3 можуть пророщуватись, наприклад, для аналізу колеоптиля пророслих рослин M3. Крім того, квіти, отримані з зерен рослин M3, можуть бути використані в схрещуваннях з лініями або культиварами ячменю для отримання рослин генерації М4. Подібна фігура представлена у вигляді фіг. 1А в патентній заявці РСТ WO 2005/087934 на Breddam, K. et al. На фіг. 2 показано схематичне зображення біохімічного шляху для перетворення і деградації лінолевої кислоти в T2N. LOX-1 спочатку каталізує перетворення лінолевої кислоти в 9-HPODE, яка ферментативно деградує до цис-ноненаля. Ця сполука піддається спонтанній, хімічній ізомеризації в T2N. LOX-2 спочатку каталізує перетворення лінолевої кислоти в 13HPODE, яка може бути перетворена в 2-E-гексаналь (не показано). На фіг. 3 показаний спрощений, схематичний огляд переважного способу виробництва пива, що включає замочування зерен ячменю (1), отримання солоду (2), пічну сушку (3), подрібнення висушеного солоду (4), затирання (5), фільтрування (6), кип'ятіння сусла в присутності доданих висушених шишок хмелю (7), ферментацію в присутності дріжджів (8), витримку (дозрівання) пива (9), фільтрування пива (10), упакування, наприклад, упакування в пляшки, бляшанки або інше (11), та маркування (12). Окремі процеси можуть бути згруповані в секції, що передбачають отримання солоду (солодження) (1-3), приготування сусла (4-7), ферментацію (89), і отримання готового пива (10-12). Хоча ілюструється бажаний спосіб, можуть бути передбачені інші способи, для яких відсутні деякі з описаних стадій (наприклад, може бути опущене фільтрування або додавання шишок хмелю, або можуть додаватися додаткові стадії, такі, як додавання допоміжних речовин, цукру, сиропів або карбонату). На фіг. 4 представлені результати порівняння загальних активностей LOX в пророщених зернах генерації M3 (А), генерації M4 (В) і генерації М5 (С). Вказані активності були виміряні в екстрактах зародків, які були виділені з пророщених зерен подвійного нуль-LOX мутанта A689, 3 UA 106597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуль-LOX-1 мутанта D112 і нуль-LOX-1 лінії схрещування Ca211901. Аліквоти інактивованого нагрівом екстракту тих же зразків служили як експериментальний контроль [в C: нуль-LOX-1 вихідний мутант D112 (*), нуль-LOX-1 лінія схрещування Ca211901 (**)]. Показані також генотипи LOX-1 і LOX-2 аналізованих зразків рослин (wt: дикого типу). На фіг. 5 показані хроматограми аналізів ВЕРХ, що використовувалися для аналізу на утворення 9- і 13-HPODE в 48-годинних пророслих зародках ячменю. HPODE виявляли шляхом вимірювання оптичної щільності при 234 нм, причому результати представлені у відносних одиницях оптичної щільності (AU). Піки профілів елюювання, які відповідають 9- і 13-HPODE, показані стрілками. (А) Хроматограма стандартів 9- і 13-HPODE. (B) Хроматограма HPODE, що утворилися в екстрактах, виготовлених з пророслих зародків нуль-LOX-1 мутанта D112. (C) Хроматограма HPODE, що утворилися в екстрактах, виготовлених з пророслих зародків подвійного нуль-LOX мутанта A689, генерації M4. На фіг. 6 показані хроматограми аналізу ВЕРХ, що використовувалися для аналізу на утворення 9- і 13-HPODE в зародках 72-годинних мікро-осолоджених зерен. HPODE були виявлені шляхом вимірювання оптичної щільності при 234 нм, причому результати представлені у відносних одиницях оптичної щільності (AU). Піки профілів елюювання, які відповідають 9- і 13-HPODE, показані стрілками. (А) Хроматограма 9- і 13-HPODE, що утворилися в сорті Barke дикого типу. (B) Хроматограма HPODE, що утворилися в екстрактах зародків нуль-LOX-1 мутанта D112. (C) Хроматограма HPODE, що утворилися в екстрактах подвійного нуль-LOX мутанта A689, генерації М5. На фіг. 7 показані рівні вільного T2N, що утворюється в мікро-осолоджених зразках ячменю культивару Power дикого типу, нуль-LOX-1 мутанту D112, та трьох потенційних подвійних нульLOX лініях мутанту A689, генерації М5. Також включені генотипи LOX-1 і LOX-2 проаналізованих зразків ячменю (wt: дикого типу). На фіг. 8 показані рівні вільного T2N, що утворюється в зразках прокип'яченого сусла, виробленого з мікро-осолоджених зерен культивару Power дикого типу, нуль-LOX-1 мутанту D112 і подвійного нуль-LOX мутанту A689, генерації М5. Показані також LOX-1 і LOX-2 генотипи проаналізованих зразків ячменю (wt: дикого типу). На фіг. 9 показані рівні прекурсорів T2N в зразках прокип'яченого сусла, приготованого з мікро-осолоджених зерен культивару Power дикого типу, нуль-LOX-1 мутанту D112 і подвійного нуль-LOX мутанту A689, генерації М5. На фіг. 10 показані рівні прекурсорів T2N у пиві, виробленому в експерименті пивоваріння на 200 л з використанням культивару Power дикого типу, нуль-LOX-1 мутанту D112 і подвійного нуль-LOX мутанту A689. Показані генотипи LOX-1 і LOX-2 солодів, що використовуються (wt: дикого типу). На фіг. 11 показане порівняння рівнів вільного T2N в аліквотах зазначених зразків, узятих з 200-л прокип'ячених сусел, вироблених шляхом ячмінного пивоваріння, або нормального солодження і затирання. Показані також генотипи LOX-1 і LOX-2 сировини, що використовується (wt: дикого типу). На фіг. 12 показане порівняння рівнів прекурсорів T2N у зазначених аліквотах зразків, взятих з 200-л прокип'яченого сусла (див. фіг. 11), що виробляються або шляхом ячмінного пивоваріння або за допомогою звичайного солодження і затирання. Показані також генотипи LOX-1 і LOX-2 сировини, що використовується (wt: дикого типу). На фіг. 13 показані аспекти утворення T2N в пиві з великомасштабних 200-л досліджень пивоваріння, використовуючи зазначені культивари і мутанти ячменю як сировину. (А) Аналізи тільки пива, звареного з ячменю з акцентом на утворенні вільного T2N під час примусового старіння. Рівень порогу смакового відчуття T2N при 50 тисячних часток (ppt, ppt) позначається горизонтальною пунктирною лінією. В окремому експерименті було проведено порівняння рівнів прекурсорів T2N у свіжому пиві, звареному з ячменю і зразках звичайного пива. (В); на (С) показані рівнів вільного T2N в свіжому пиві (білі стовпчики) в порівнянні з рівнями після двох тижнів при температурі 37 °C (чорні стовпчики). Показані також генотипи LOX-1 і LOX-2 сировини, що використовується (wt: дикого типу). На фіг. 14 показане порівняння рівнів ТНА і співвідношень як в пиві, звареному з ячменю (А), і в пиві, виробленому з використанням звичайного солоду (B). 9,12,13- і 9,10,13-ТНА утворюються частково невідомими реакціями шляхів LOX-1 і LOX-2, відповідно. На фіг. 15 наведена ілюстрація відносного розвитку з часом "паперового" присмаку (А) і присмаку "старості" (B) пива, отриманого варінням пива у масштабі 200 л, з використанням вихідних матеріалів культивару Power (чорні стовпчики), нуль-LOX-1 (сірі стовпчики) і подвійного нуль-LOX (білі стовпчики). Спеціалізована дегустаційна комісія з сенсорної оцінки якості пива оцінювала ці типи пива, використовуючи шкалу від 0 (немає стороннього присмаку) 4 UA 106597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 до 5 (надмірний сторонній присмак). На фіг. 16 показано, як утворюється піна в пиві, звареного з ячменю (А), і в пиві на основі солоду (B). В обох експериментах комерційне лагерне пиво служило в якості порівняння (товста пунктирна лінія), у порівнянні з пивом, отриманим з використанням як сировини культивару Power (тонка пунктирна лінія), нуль-LOX-1 (тонка безперервна лінія) і подвійний нуль-LOX (товста безперервна лінія). На фіг. 17 показана карта організації геному гена ячменю для LOX-2, що фокусується на ділянці, яка охоплює стартовий кодон (ATG) і стоп-кодон (ТАА). Було виявлено, що ця послідовність з 3229 п.н. (bp) складається з 6 екзонів (заповнені рамки) та 5 інтронів (лінії). Мутація, визначена в гені LOX-2 подвійного нуль-LOX мутанта A689 показана вертикальною стрілкою. Примітно, що подвійний нуль-LOX мутант A689 також містить передчасний стоп-кодон трансляції в гені LOX-1 (див. мутант D112, як показано на фіг. 15 з патенту США № 7420105). На фіг. 18 показано, як аналіз генотипу може бути використаний для визначення нуль-LOX мутантів. Основна увага стосується виявлення за допомогою SNP подвійної нуль-LOX рослини ячменю, тобто способу досягнення комбінованого виявлення мутації G→А в положенні 3474 гена LOX-1, і мутації G → А в положенні 2689 гена LOX-2. (А) Діаграма електрофорезу в агарозному гелі ПЛР фрагментів, ампліфікованих з зазначеною матричною ДНК за допомогою зазначених пар праймерів, тобто ген LOX-2 дикого типу може бути ампліфікований за допомогою праймерів FL1035 і FL1039, а мутантний ген нуль-LOX-2 може бути ампліфікований з використанням праймерів FL1034 і FL1039. (B) Діаграма для ілюстрації того, як ПЛР з парою праймерів FL820 і FL823 (що містить 3'-основу, комплементарну до нуль-LOX-1 специфічної мутації, як показано зірочкою) і парою праймерів FL1034 (що містить 3'-основу, комплементарну нуль-LOX-2 мутації, показаної зірочкою) і FL1039 може генерувати продукти ПЛР з 166 bp і 200 bp, відповідно, за умови наявності вказаних нуль-LOX мутацій. (C) Зображення результату після електрофорезу в агарозному гелі маркерної ДНК (доріжки 1 і 4), і зображення ПЛРампліфікованої ДНК подвійного нуль-LOX мутанту A689 з використанням вищезазначених комбінацій праймерів для визначення нуль-LOX-1- і нуль-LOX-2-мутацій (доріжка 2). Реакції ПЛР ячменю дикого типу не дали відповідних продуктів ПЛР (доріжка 3). На фіг. 19 показаний приклад аналізу за допомогою SNP рослинного потомства від схрещування рослин з подвійним нуль-LOX ячменем. (А) Схематичне представлення з використанням комбінацій праймерів, описаних в легенді до фіг. 18, зазначеної вище, тобто праймерів для виявлення на основі ПЛР нуль-LOX-1- і нуль-LOX-2-мутацій. Перша доріжка зліва з розподіленням смуг "а", як зазначено нижче доріжки - не містить конкретного продукту ПЛР для наявності цих двох мутацій [тобто, обидві ділянки матриці мали послідовності дикого типу (W)], а наступна доріжка з розподіленням смуг "b" ясно вказує ПЛР продукт, отриманий з нульLOX-1 мутантної рослини (М). Третя доріжка з розподіленням смуг "с" походить від нуль-LOX-2 рослини, а рослина в четвертій доріжці з розподіленням смуг "d" являє собою подвійну нульLOX рослину. (B) Електрофорез в агарозному гелі генотипів ячменю дикого типу, нуль-LOX-1-, нуль-LOX-2-, і подвійного нуль-LOX-генотипів ячменю. Аналіз розподілення смуг, у відповідності до аналізу, описаного вище для (A), показав, що доріжки 2, 6, 10, 12, 18 і 22 містили ампліфіковані продукти з рослин, що містять нуль-LOX-1 мутацію (позначена "b" нижче доріжок), а доріжки 1, 3, 9, 11, 19, 21 і 23 містили продукти з рослин, що містять нуль-LOX-2 мутацію (позначено "с" нижче доріжок). Доріжки 7, 15 і 17 містили продукти ПЛР з подвійних нуль-LOX рослин, що містять об'єднані LOX-1- і LOX-2-мутації генів (відмічені "d" нижче доріжок). І доріжки 4, 5, 8, 13, 14, 16 і 20 не містили продуктів ампліфікації з рослин, що не містять жодного з нульLOX-алелей (відмічені "а" нижче доріжок), тобто ці рослини були рослинами дикого типу по відношенню до досліджуваних послідовностей. Маркерна ДНК розділяється в доріжці, позначеній "MW". Детальний опис винаходу Визначення У цьому описі, фігурах і таблиці, які слідують далі, використовується низка термінів. Для забезпечення описів і пунктів формули винаходу, що охоплюють об'єм, який повинен надаватися такими термінами, забезпечені наступні визначення: В даному контексті термін "в однині" може означати один або декілька, в залежності від контексту, в якому він використовується. Термін "агрономічна риса" описує фенотипічну або генетичну рису рослини, що сприяє продуктивності чи економічному значенню зазначеної рослини. Такі риси включають стійкість до хвороб, комах-шкідників, вірусів, нематод, посухостійкість, високу стійкість до засоленості, врожайність, висоту рослин, дні до дозрівання, класифікацію зерен (тобто фракціонування розміру зерен), вміст азоту в зерні тощо. 5 UA 106597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "антисмислова нуклеотидна послідовність" означає послідовність, яка знаходиться в зворотній орієнтації до нормального кодування 5'-до-3' орієнтації цієї нуклеотидної послідовності. При присутні в рослинній клітині, антисмислова ДНК послідовність бажано знижує нормальну експресію цієї нуклеотидної послідовності для ендогенного гена і може порушити продукування відповідного нативного білка. В рослинах ячменю експресія антисмислових нуклеотидів в цілому тільки зменшує експресію, але не перешкоджає експресії вказаного нативного білка. Термін "ячмінь" у зв'язку з процесом виробництва пива і напоїв на основі ячменю, зокрема, при використанні для опису процесу отримання солоду, означає зерна ячменю. У всіх інших випадках, якщо не вказано інше, "ячмінь" означає рослину ячменю (Hordeum vulgare, L.), включаючи будь-які селекційні лінії або культивар або сорт, в той час як частина рослини ячменю може бути будь-якою частиною рослини ячменю, наприклад, будь-якою тканиною або клітиною. Термін "стійкість до хвороб" означає, що рослини уникають симптомів хвороби, що є результатом взаємодії рослина-патоген. Таким чином, патогени не мають можливості викликати хвороби в рослин і супутні симптоми хвороб. Альтернативно, симптоми хвороби, які викликаються даним патогеном, мінімізуються або зменшуються або навіть запобігаються. Використовуваний авторами термін "подвійна нуль-LOX мутація" відноситься до повної втрати функції активності LOX-1 і повної втрати функції активності LOX-2. Таким чином, "подвійна нуль-LOX мутація" може характеризуватися повною втратою функціонального LOX-1ферменту і повною втратою функціонального LOX-2-ферменту. Таким чином, "рослина ячменю з подвійною нуль-LOX-мутацією" являє собою рослину ячменю, що містить першу мутацію, яка призводить до повної втрати функції активності LOX-1, і другу мутацію, що призводить до повної втрати функції активності LOX-2. Таким чином "рослина ячменю з подвійною нуль-LOXмутацією" може бути охарактеризована повною втратою функціонального ферменту LOX-1 і повною втратою функціонального ферменту LOX-2. Аналогічно, "зерна з подвійною нуль-LOX мутацією" являють собою зерна, що містять першу мутацію, що призводить до повної втрати функції активності LOX-1, і другу мутацію, що призводить до повної втрати функції активності LOX-2 і т. д. таким чином, "зерна з подвійною нуль-LOX мутацією" можуть бути охарактеризовані повною втратою функціонального ферменту LOX-1 і повною втратою функціонального ферменту LOX-2. "Злакова" рослина, визначена в цьому документі як член сімейства рослин Graminae, що культивуються в першу чергу для отримання крохмалевмісного насіння або зерен. Злакові рослини включають, але не обмежуючись наведеними, ячмінь (Hordeum), пшеницю (Triticum), рис (Oryza), кукурудзу (Zea), жито (Secale), овес (Avena), сорго (Sorghum) і тритикале, гібрид жито-пшениця. Під терміном "кодуюча" чи "що кодує" у контексті вказаної нуклеїнової кислоти розуміють вміст інформації для трансляції у вказаний білок. Нуклеїнова кислота або полінуклеотид, що кодує білок, можуть містити послідовності, що не транслюються (наприклад, інтрони) в межах трансльованих ділянок цієї нуклеїнової кислоти, або може не мати таких проміжних послідовностей, що не транслюються, наприклад, у кДНК. Інформація, за допомогою якої кодується білок, описується з використанням кодонів. Використаний авторами термін "експресія" в контексті нуклеїнових кислот слід розуміти як транскрипція і накопичення смислових мРНК або антисмислових РНК, отриманих з фрагмента нуклеїнової кислоти. Термін "експресія", який використовується в контексті білків, відноситься до трансляції мРНК в поліпептид. Термін "ген" означає сегмент ДНК, який бере участь у продукуванні поліпептидного ланцюга, він включає ділянки, які передують кодуючій ділянці та слідують за нею (промотор і термінатор). Крім того, гени рослин зазвичай складаються з екзонів, які перериваються інтронами. Після транскрипції в РНК, інтрони видаляються шляхом сплайсингу для отримання зрілої матричної РНК (мРНК). "Сайти сплайсингу" між екзонами та ітронами, як правило, визначаються консенсусними послідовностями, які діють як сигнали сплайсингу для процесу сплайсингу, що складається з делеції інтрону з первинного транскрипту РНК, та приєднання або злиття кінців РНК на будь-якому боці вирізаного інтрону. У деяких випадках, альтернативні або відмінні патерни сплайсингу можуть генерувати різні білки з однієї і тієї ж ділянки ДНК. Нативний ген може позначатися як "ендогенний ген". Як використовується авторами, термін "гетерологічний" з посиланням на нуклеїнову кислоту означає нуклеїнову кислоту, яка походить з чужорідного виду, або, якщо вона походить з того ж самого виду, вона є суттєво модифікованою у порівнянні з нативною формою за складом та/або геномним локусом навмисним втручанням людини. 6 UA 106597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Термін "проростання", вжитий авторами, означає початок або поновлення росту зерном ячменю в різних композиціях, таких як звичайний ґрунт, що зустрічається в природі. Проростання може відбуватися також і в вегетаційних посудинах, поміщених в камери вирощування і т.п, наприклад, відбуватися на вологому фільтрувальному папері, поміщеному в стандартні лабораторні чашки, або під час солодження (виготовлення солоду) (наприклад, в резервуарах для замочування або апаратах для пророщування заводів з виготовлення солоду). Пророщування, зазвичай, включає в себе гідратацію зерен, набухання зерен та індукування росту зародку. Фактори навколишнього середовища, що впливають на проростання, включають вологість, температуру і рівні кисню. Спостерігається розвиток коренів і пагонів. Вжитий авторами термін "ізольований (виділений)" означає, що матеріал видалений зі свого первісного середовища. Наприклад, природний полінуклеотид або поліпептид, присутній в живому організмі, не є ізольованим, але той же полінуклеотид або поліпептид, ізольований від деяких або всіх співіснуючих матеріалів у природній системі є ізольованим (виділеним). Такі полінуклеотиди могли б бути частиною вектору та/або такі полінуклеотиди або поліпептиди могли б бути частиною композиції, і все ще бути ізольованими, оскільки такий вектор або композиція не є частиною природного середовища. Термін "зерно" включає в себе зернівку злаків, яку також називають внутрішнім сім'ям, нижньою квітковою лускою і верхньою квітковою лускою. У більшості сортів ячменю нижня квіткова луска та верхня квіткова луска прикріплені до зернівки і є частиною зерна після обмолоту. Однак, також зустрічаються голозернові сорти ячменю. У них зернівка не містить нижньої квіткової луски та верхньої квіткової луски і вивільняється при обмолоті, як у випадку пшениці. Терміни "зернівка" і "зерно" взаємозамінні в даному документі. "Розвиток зерна" відноситься до періоду, що починається з запліднення яйцеклітини клітиною пилку. Під час запліднення метаболічні запаси, наприклад, цукри, олігосахариди, крохмаль, фенольні сполуки, амінокислоти і білки депонуються, з націлюванням на вакуоль або без націлювання на вакуоль, в різні тканини в ендоспермі зерна (насіння), насіннєвий оболонці (тесті), алейроні і щитку, приводячи до збільшення зерна (насіння), наливу зерна (насіння) і процес закінчується зневодненням зерна (насіння). Термін "повна втрата функції" відноситься до відсутності конкретної ферментативної активності. Таким чином, рослини ячменю з "повною втратою функції" активності LОX-1 і LОX-2 є рослинами ячменю без активностей LОX-1 і LОX-2, які можна визначити. У контексті даного винаходу активності LОX-1 і LОX-2 визначають процедурою аналізу, що визначає утворення 9HPОDE і 13-HPОDE з лінолевої кислоти, навіть коли LОX-1 і LOX-2 можутьмати і інші активності. Переважно, утворення 9-HPОDE і 13-HPОDE з лінолевої кислоти визначають, як описано в прикладі 4 тут нижче. Ця активність повинна визначатися з використанням екстрактів білка проростаючих зародків. У контексті даного винаходу генерування піку хроматограми, що відповідає менше ніж 5 %, переважно менше ніж 3 % піку 9-HPОDE стандарту, показаного на фіг. 5А, та/або піку, що відповідає менше ніж 5 %, переважно менше ніж 3 % піку 13-HPОDE стандарту, показаного на фіг. 5А, при використанні лінолевої кислоти як субстрату, розглядається як активність LОX-1 і LОX-2, що не визначаються, при використанні аналізу, описаного в прикладі 4. Молекулярні підходи до одержання повної втрати функції активності LOX передбачають генерування мутацій, які або викликають повну відсутність транскриптів для зазначеного ферменту, повна відсутність відповідного кодованого ферменту, або мутацій, які повністю інактивують цей кодований фермент. Термін "активність LОX-1" відноситься до ферментативної активності ферменту LОX-1 ячменю. Конкретно, в контексті даного винаходу, "активність LОX-1" є каталізованим ферментами діоксигенуванням лінолевої кислоти в 9-HPОDE і в набагато меншому ступені в 13HPОDE. Навіть якщо фермент LОX-1 здатний каталізувати інші реакції, для цілей визначення активності LОX-1 відповідно до даного винаходу слід розглядати тільки активності утворення 9- і 13-HPОDE. фіг. 2 зображує біохімічний шлях, за яким лінолева кислота перетворюється на 9HPОDE. Термін "активність LОX-2" відноситься до ферментативної активності ферменту LОX-2 ячменю. Конкретно, в контексті даного винаходу, "активність LОX-2" є каталізованим ферментом діоксигенуванням лінолевої кислоти в 13-HPОDE і в набагато меншому ступені в 9HPОDE. Навіть якщо фермент LОX-2 здатний каталізувати інші реакції, для цілей визначення активності LОX-1 відповідно до даного винаходу слід розглядати тільки активності утворення 13- і 9-HPОDE. фіг. 2 зображує біохімічний шлях, за яким лінолева кислота перетворюється на 13-HPОDE. Термін "солодовий напій" або термін "напій на основі солоду" відноситься до напоїв, виготовлених з використанням солоду, переважно напоїв, виготовлених способом, що 7 UA 106597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 передбачає стадію інкубування солоду з гарячою водою. Солодовий напій може бути, наприклад, пивом або мальтинами. Термін "ферментований солодовий напій" відноситься до солодових напоїв, які були ферментовані, тобто інкубувались з дріжджами. "Солодження" є особливою формою проростання зерен ячменю, яка відбувається при контрольованих умовах середовища, що включають резервуари для замочування і солодоростильні апарати заводу з приготування солоду. У відповідності зі способом даного винаходу приготування солоду починається під час замочування та/або після того, як зерна ячменю були замочені. Цей спосіб приготування солоду може бути зупинений висушуванням зерен ячменю, наприклад, в способі з використанням пічного сушіння. У випадку коли солод не піддавався пічному сушінню, його називають "свіжепророслий (зелений) солод". Вважається, що композиція, виготовлена з ячменю з подвійною нуль-LOX-мутацією, містить солод з подвійною нуль-LOX-мутацією, такий як чистий солод з нуль-LOX-мутацією або будь-яка суміш солоду, що містить солод з подвійною нуль-LOX-мутацією. Солод може бути перероблений, наприклад, розмелюванням і, відповідно, називатися "розмеленим солодом" або "солодовим борошном". "Затирання" є інкубацією розмеленого солоду у воді. Затирання переважно виконують при конкретній температурі і у конкретному об'ємі води. Температура і об'єм води є важливими, тому що вони впливають на швидкість зменшення активності ферментів, що походять з цього солоду, і, відповідно, особливо на величину гідролізу крохмалю, який може мати місце; може бути також важливим дія протеаз. Затирання може відбуватися в присутності добавок, під якими мають на увазі будь-яке джерело вуглеводів, відмінних від солоду, таких як, але не тільки, ячмінь (у тому числі ячмінь з подвійною нуль-LOX-мутацією), сиропи з ячменю, або кукурудзи, або рису у вигляді або цілих зерен, або перероблених продуктів, таких як крупки або крохмаль. Усі з вищезгаданих добавок можуть бути використані переважно в якості додаткового джерела екстракту (сиропи звичайно вводять під час кип'ятіння сусла). Ці вимоги відносно переробки добавки на пивоварному заводі залежать від стану і типу використовуваної добавки й, зокрема, від температур клейстеризації та розрідження крохмалю. Якщо температура клейстеризації вище, чим температура для звичайного оцукрювання солоду, то крохмаль клейстеризують і розріджують перед додаванням до затору. "Мутації" включають делеції, інсерції, заміни, трансверсії і точкові мутації у кодуючих і некодуючих областях гену. Делеції можуть бути делеціями всього гену або тільки частини цього гену, де некодуючою областю переважно є або область промотору, або область термінатора, або інтрони Точкові мутації можуть стосуватися до змін однієї основи або пари основ і можуть приводити до стоп-кодонів, мутацій "зсуву рамки" або замін амінокислот. Соматичні мутації є мутаціями, які зустрічаються тільки в певних клітинах або тканинах рослини і не успадковуються в наступному поколінні. Мутації зародкової лінії можуть бути виявлені в будь-якій клітині рослини і є наслідуваними. З посиланням на фіг. 1 тут, яка дає загальне уявлення, яким чином зерна мутованого ячменя можуть розмножуватися в програмі селекції, зерна генерації М3 та їх безпосередньо розмножені зерна, або будь-якої наступної генерації, у тому числі їх рослини, можуть бути названі "вихідними мутантами". Далі, усе ще з посиланням на фіг. 1 тут, термін "генеалогічна лінія" має відношення до зерен генерації М4 і будь-якої наступної генерації, у тому числі до їх рослин, які можуть бути результатом схрещування з рослиною-культиваром або бути результатом схрещування з іншою генеалогічною лінією з окремою, специфічною ознакою. Термін "нуль-LOX" має відношення до присутності мутації в LOX-кодуючому гені, що викликає повну втрату функції кодованого ферменту LOX (або LОX-1, або LОX-2). Мутації, які генерують кодони передчасної термінації (нонсенс-кодони) у гені, що кодує LOX, представляють тільки один механізм, за допомогою якого може бути отримана повна втрата функції активності LOX. Молекулярні підходи до одержання повної втрати функції ферменту LOX передбачають генерування мутацій, які викликають повну відсутність транскриптів для зазначеного ферменту, або мутацій, які викликають повну інактивацію цього кодованого ферменту. "нуль-LOX" з посиланням на рослину має відношення до рослини, що має повну втрату функції описаного ферменту LOX. "Функціонально пов'язані" є терміном, використовуваним для посилання на асоціацію двох або більше фрагментів нуклеїнової кислоти на єдиному полінуклеотиді, так що на функцію одного з них впливає інший фрагмент. Наприклад, промотор функціонально пов'язаний з кодуючою послідовністю, коли він здатний впливати на експресію цієї кодуючої послідовності, тобто ця кодуюча послідовність перебуває під транскрипційним контролем цього промотору. Кодуючі послідовності можуть бути функціонально пов'язані з регуляторними послідовностями в смисловій або антисмисловій орієнтації. 8 UA 106597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "ПЛР" або "полімеразна ланцюгова реакція" добре відома кваліфікованим у даній області фахівцям у якості способу, використовуваного для ампліфікації конкретних Днк-сегментів (патенти США № 4683195 і 4800159, Mullis, К.В. et al.). "Рослина" або "рослинний матеріал" включає клітини рослин, протопласти рослин і культури клітин тканин рослин, з яких можуть бути регенеровані рослини ячменю, у тому числі калуси рослин, і клітини рослин, які є інтактними в рослинах, або частини рослин, такі як зародки, пилок, сім'япочки, квітки, зерна, листи, коріння, кінчики корінь, пильовики або будь-яка частина або будь-який продукт рослини. Під терміном "продукт рослини" мається на увазі продукт, отриманий з переробки рослини або частини рослини. Таким чином, зазначений продукт рослини може бути, наприклад, солодом, суслом, ферментованим або неферментованим напоєм, кормовим або харчовим продуктом. У цьому контексті "рекомбінантний" при посиланні на білок є білком, який походить з чужорідного виду або, якщо він походить з того ж самого виду, є модифікованим з його нативної форми в композиції навмисним втручанням людини. "Дегустаційна комісія фахівців з оцінки якості пива" у контексті даної заявки є комісією фахівців, добре навчених дегустації і опису присмаків пива, зі спеціальним фокусуванням на альдегідах, "паперовому" присмаку і присмаку "старості". Хоча існують ряд аналітичних інструментів для оцінювання компонентів присмаку, відносне значення компонентів, що впливають на смак, важко оцінювати аналітично. Однак, такі комплексні властивості можуть бути оцінені фахівцями з оцінки смаку. Їхнє безперервне тренування включає випробування якості і оцінювання проб стандартного пива. Під терміном "сайт сплайсингу" маються на увазі зв'язки між екзонами і інтронами гену. Так, сайт сплайсингу може бути межею, що йде від екзона до інтрона (яку називають "донорним сайтом сплайсингу") або межею, що відокремлює інтрон від екзона (яку називають "акцепторним сайтом"). Сайт сплайсингу в рослинах зазвичай містить консенсусні послідовності. 5'-кінець інтрона зазвичай складається з консервативного динуклеотиду GT (GU у мРНК), а 3-кінець інтрона зазвичай складається з консервативного динуклеотиду AG. Таким чином, 5'-сайт сплайсингу містить 5'-кінець інтрона, а 3'-сайт сплайсинга містить 3'-кінець інтрона. Переважно, у контексті даного винаходу сайт сплайсингу інтрона є або 5'-сайтом сплайсингу, що складається з найбільш 5'(лівих)-динуклеотидів інтрона (який зазвичай є GT), або 3'-сайтом сплайсингу, що складається з найбільш 3'(правих)-динуклеотидів цього інтрона (який зазвичай є AG). Якщо немає інших вказівок, "T2N" позначає транс-2-ноненаль (T2N) у вільній формі. T2N називають іноді 2-Е-ноненалем. Під терміном "потенціал T2N" описані хімічні речовини, які здатні вивільняти T2N або перетворюватися в T2N в одній або декількох реакціях. У даному контексті потенціал T2N визначається як концентрація T2N, що вивільняється в розчин, наприклад, сусло або пиво, під час інкубування впродовж 2 годин при 100 °C, pН 4,0. Практично, визначають початкову концентрацію T2N, після чого цей розчин інкубують впродовж 2 годин при 100 °C, pН 4,0, з наступним визначенням концентрації T2N. Відмінність між початковою і кінцевою концентрацією T2N називають потенціалом T2N. Теплова, кислотна обробка викликає вивільнення T2N з потенціалу T2N, наприклад, з "адуктів T2N", де цей останній термін використовується для опису T2N, кон'югованого з одним або декількома речовинами, що включають, але не обмежуються ними, білок (білки), сульфіт, залишок клітин, клітинні стінки і т.п. Зазвичай адукти T2N per se не сприймаються людьми як присмаки. Однак T2N, що вивільняється з зазначених адуктів T2N, може приводити до появи присмаку. "Культура тканини" позначає композицію, що містить ізольовані клітини того самого або різних типів, або колекцію таких клітин, організованих у частині рослини, у тому числі, наприклад, протопласти, калуси, зародки, пилок, пильовики і т.п. "Трансформація" позначає введення ДНК в організм таким чином, що ця ДНК підтримується або у вигляді позахромосомного елемента (без інтеграції і стабільного спадкування), або у вигляді хромосомного інтегранта (з генетично стабільним спадкуванням). Якщо немає іншої вказівки, способом, використовуваним тут для трансформації Е. coli, був спосіб на основі СаCl 2 (Sambrook and Russel, supra). Для трансформації ячменя може виконуватися Agrobacteriumопосередкована трансформація переважно, як описано або Tingay et al. (1997), або Wang et al. (2001), за тим винятком, що як хазяїн можуть бути використані альтернативні культивари. "Трансген" є геном, який був уведений у геном процедурою трансформації. У даному контексті "трансгенна" включає посилання на клітину, яка була модифікована введенням гетерологічної нуклеїнової кислоти, або на клітину, яка зроблена з модифікованої в 9 UA 106597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 такий спосіб клітини. Так, наприклад, трансгенні клітини експресують гени, які не виявляються в ідентичній формі в нативній формі клітини, або експресують нативні гени, які у іншому випадку ненормально експресуються, недостатньо експресуються або взагалі не експресуються, у результаті навмисного втручання людини. Термін "трансгенні" у даному контексті в посиланні на рослини, зокрема рослини ячменю, не включають зміни клітини способами традиційної селекції рослин, наприклад, мутагенезом на основі NaN 3 або подіями, що зустрічаються природно, без навмисного втручання людини. "Дикий ячмінь", Hordeum vulgare ssp. spontaneum, розглядається як попередник (прабатько) сучасних культивованих форм ячменя. Передбачається, що транзиція ячменя з дикого в культивований стан збігається з окультуренням цієї рослини в "місцеві сорти ячменя". Вони є генетично більш близькоспоріднені з сучасними культиварами, ніж з диким ячменем. Термін ячмінь "дикого типу" має відношення до рослини ячменю, генерованої рутинним чином. Переважно, цей термін має відношення до рослини ячменю, з якої були зроблені рослини ячменю даного винаходу, тобто вихідні рослини. Зерна ячменя дикого типу зазвичай доступні, наприклад, з виробляючих насіння сільськогосподарських господарств у вигляді "культиварів" або "сортів", тобто тих генетично подібних зерен, які перебувають у списку національних організацій селекції рослин. Незважаючи на доступність декількох нуль-LOX-1культиварів ячменя (наприклад, культиварів Chamonix і Charmay), але для цілі кращого розуміння даного винаходу, усі нуль-LOX-1-мутантні, нуль-LOX-2-мутантні рослини та рослини з подвійною нуль-LOX-мутацією вважаються тут мутантними рослинами, а не рослинами дикого типу. Позначення "культивар" і "сорт" використовуються тут взаємозамінно. Під терміном "сусло" мають на увазі рідкий екстракт солоду, такого як розмелений солод, або зелений солод, або розмелений зелений солод. У пивоварстві з використанням ячменя сусло може бути також виготовлене інкубуванням екстракту неосолодженого ячменя з сумішшю ферментів, яка гідролізує компоненти ячменя. Крім зазначених отриманих з солоду або ячменя екстрактів, цей рідкий екстракт може бути виготовлений з солоду і додаткових компонентів, таких як додатковий крохмалевмісний матеріал, частково перетворений у ферментовані цукри. Це сусло зазвичай одержують затиранням, з наступним необов'язковим "промиванням дробини", у процесі екстракції залишкових цукрів та інших сполук з виснажених зерен після затирання з гарячою водою. Промивання дробини зазвичай проводять у фільтраційному чані, заторному фільтрі або іншому апараті для забезпечення можливості відділення екстрагованої води від виснажених зерен. Сусло, отримане після затирання, зазвичай називають "першим суслом", тоді як сусло, отримане після промивання дробини, зазвичай називають "другим суслом". Якщо не зазначено, термін "сусло" може бути використаний для першого сусла, другого сусла або комбінації обох. Під час одержання пива сусло зазвичай кип'ятять разом з висушеними шишками хмелю. Сусло, яке не кип'ятилося з висушеними шишками хмелю, може також називатися "незброженим (солодким) суслом", тоді як сусло, прокип'ячене з висушеними шишками хмелю, може називатися "прокип'яченим суслом". Рослина ячменя Ячмінь відноситься до сімейства рослин. "Дикий ячмінь", Hordeum vulgare ssp. spontaneum, вважається попередником (прабатьком) сучасних культивованих форм ячменя. Передбачається, що транзиція ячменя з дикого в культивований стан збігається з радикальною зміною частот зустрічальності алелей у численних локусах. Рідкі алелі і нові мутаційні події, були позитивно селекційовані фермерами, які швидко встановили нові ознаки в окультурених популяціях рослин, називаних "місцевими сортами ячменя". Вони є генетично більш близькоспорідненими з сучасними культиварами, ніж з диким ячменем. До пізнього дев'ятнадцятого сторіччя, місцеві сорти ячменя існували у вигляді гетерогенних сумішей інбредних ліній і гібридних сегрегатів, що включали невелике число рослин, що мали походження від випадкових схрещувань у більш ранніх генераціях. Більшість цих місцевих сортів були замінена в просунутих сільських господарствах чистолінійними культиварами. Проміжні або високі рівні генетичної різноманітності, характеризують місцеві сорти, що залишилися. Спочатку сорти "сучасного ячменя" представляли селекційні сорти з місцевих сортів. Пізніше їх одержували з послідовних циклів схрещувань між установленими чистими лініями, такими як лінії різного географічного походження. В остаточному підсумку, результатом було помітне звуження генетичної основи в багатьох, можливо всіх, просунутих сільських господарствах. У порівнянні з місцевими сортами сучасні культивари ячменя мають численні поліпшені властивості (Nevo, 1992; von Bothmer et al., 1992), наприклад, одну або кілька, але без обмеження, з наступних: (i) Покриті або голі зерна; (ii) Спокій насіння; 10 UA 106597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (iii) Стійкість до хвороб; (iv) Стійкість до умов навколишнього середовища (наприклад, посухи або pН ґрунту); (v) Співвідношення лізину та інших амінокислот; (vi) Вміст білка; (vii) Вміст азоту; (viii) Вуглеводний склад; (ix) Вміст і склад гордеїнів; (x) Вміст (1-3,1-4)-β-глюкана та арабіноксилану; (xi) Врожай; (xii) Нерухомість соломи; (xiii) Висота рослини. У даному винаході термін "рослина ячменя" включає будь-яку рослину ячменя. Таким чином, цей винахід має відношення до будь-якої рослини ячменю, що містить першу мутацію, що призводить до повної втрати функції активності LОX-1, і другу мутацію, що призводить до повної втрати функції активності LОX-2. Таким чином, цей винахід має відношення до будь-якої рослини ячменю, що містить першу мутацію, яка призводить до повної втрати функціонального ферменту LОX-1, і другу мутацію, яка призводить до повної втрати функціонального ферменту LОX-2. Однак, кращими рослинами ячменя для застосування з даним винаходом є сучасні культивари або чисті лінії ячменя. Культивар ячменя, який повинен бути використаний з даним винаходом, може, наприклад, бути вибраний з групи, що складається з Sebastian, Celeste, Lux, Prestige, Saloon, Neruda, Harrington, Klages, Manley, Schooner, Stirling, Clipper, Franklin, Alexis, Blenheim, Ariel, Lenka, Maresi, Steffi, Gimpel, Cheri, Krona, Camargue, Chariot, Derkado, Prisma, Union, Beka, Kym, Asahi 5, KOU A, Swan Hals, Kanto Nakate Gold, Hakata No. 2, Kirin – choku No. 1, Kanto late Variety Gold, Fuji Nijo, New Golden, Satukio Nijo, Seijo No. 17, Akagi Nijo, Azuma Golden, Amagi Nijpo, Nishino Gold, Misato golden, Haruna Nijo, Scarlett та Jersey бажано з групи, що складається з Haruna Nijo, Sebastian, Celeste, Lux, Prestige, Saloon, Neruda та Power, бажано з групи, що складається з Harrington, Klages, Manley, Schooner, Stirling, Clipper, Franklin, Alexis, Blenheim, Ariel, Lenka, Maresi, Steffi, Gimpel, Cheri, Krona, Camargue, Chariot, Derkado, Prisma, Union, Beka, Kym, Asahi 5, KOU A, Swan Hals, Kanto Nakate Gold, Hakata No. 2, Kirin – choku No. 1, Kanto late Variety Gold, Fuji Nijo, New Golden, Satukio Nijo, Seijo No. 17, Akagi Nijo, Azuma Golden, Amagi Nijpo, Nishino Gold, Misato golden, Haruna Nijo, Scarlett and Jersey бажано з групи, що складається з Haruna Nijo, Sebastian, Tangent, Lux, Prestige, Saloon, Neruda, Power, Quench, NFC Tipple, Barke, Class та Vintage. У одному варіанті здійснення даного винаходу рослина ячменя є, відповідно, сучасним культиваром ячменя (переважно культиваром, вибраним з групи культиварів ячменя, описаних тут вище), що містять першу мутацію, що призводить до повної втрати функції активності LОX-1, такої як повна втрата функціонального ферменту LОX-1, і другу мутацію, яка призводить до повної втрати функції активності LОX-2, такої як повна втрата функціонального ферменту LОX2. У цьому варіанті здійснення бажано, щоб ця рослина ячменя не була місцевим сортом ячменя. Ця рослина ячменя може бути в будь-якій підходящій формі. Наприклад, рослина ячменя відповідно до даного винаходу може бути життєздатною рослиною ячменя, висушеною рослиною, гомогенізованою рослиною або розмеленим зерном ячменя. Ця рослина може бути зрілою рослиною, зародком, зерном, що проросло, осолодженим зерном, розмеленим осолодженим зерном або т.п. Частини рослин ячменя можуть бути будь-якою підходящою частиною цієї рослини, такою як зерна, зародки, листи, стебла, коріння, квітки або їх фракції. Фракція може бути, наприклад, сегментом зерна, зародка, листа, стебла, кореня або квітки. Частини рослин ячменя можуть бути також фракцією гомогенату або фракцією розмеленої рослини або зерна ячменя. У одному варіанті здійснення даного винаходу частини рослин ячменя можуть бути клітинами зазначеної рослини ячменю, переважно життєздатними клітинами, які можуть бути розмножені in vitro у культурах тканини. Зокрема, зазначеними клітинами у одному варіанті можуть бути клітини, які не здатні дозрівати в цілу рослина ячменя, тобто клітини, які не є репродуктивним матеріалом. Втрата функції активності LOX Даний винахід має відношення до рослин ячменя, або їх частини, або їх продуктам з рослин, що мають першу і другу мутацію, причому ця перша мутація призводить до повної втрати функції активності LОX-1, а ця друга мутація приводить до повної втрати функції активності LОX-2. Так, наприклад, перша мутація призводить до повної втрати функціонального ферменту 11 UA 106597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 LOX-1, а друга мутація призводить до повної втрати функціонального ферменту LОX-2. Повна втрата функції активності LОX-1 (така як повна втрата функціонального ферменту LОX-1), і повна втрата функції активності LОX-2 (така як повна втрата функціонального ферменту LОX-2), можуть незалежно бути засновані на різних механізмах. Наприклад, повна втрата функції однієї або обох з активності LОX-1 і активності LОX-2 може бути викликана дисфункцією білків у рослині ячменя, тобто дисфункцією білку LОX-1 та/або LОX-2, наприклад, мутованого білка LОX-1 без можливої для визначення 9-HPODE-твірної активності (наприклад, визначуваної, як описано в прикладі 4), та/або мутованого білка LОX-2 без можливої для визначення 13-HPODE-твірної активності (наприклад, визначуваної, як описано в прикладі 4). Повна втрата функції однієї або обох з активності LОX-1 і активності LОX-2 може бути викликана втратою білка LОX-1 та/або LOX-2. Очевидно, що втрата білка LОX-1 буде призводити до втрати функціонального ферменту LОX-1, і що втрата білка LОX-2 буде призводити до повної втрати функціонального ферменту LОX-2. Таким чином, ця рослина ячменя може переважно не містити білка LОX-1 та/або LОX-2, або містити тільки дуже мало, більш переважно не містити детектованого білка LОX-1 та/або LОX-2. Білок LОX-1 та/або LОX-2 може бути детектований будь-яким відомим підходящим способом, відомим кваліфікованому в даній галузі фахівцеві. Однак переважно цей білок (ці білки) детектують способами, у яких білок LОX-1 детектують специфічними антитілами до LОX-1 і LОX-2, такими як поліклональні антитіла до LОX-1 і LОX-2. Зазначені способи можуть бути, наприклад, Вестерн-блотингом або ELISA. Зазначені антитіла можуть бути моноклональними або поліклональними. Однак, переважно зазначені антитіла мають поліклональну природу, розпізнаючи кілька різних епітопів у білку LОX-1 і LОX-2, відповідно. Білок LОX-1 та/або LОX-2 може бути також детектований опосередковано, наприклад, способами, що визначають активність LОX-1, або способами, що визначають активність LOX-2. У одному кращому варіанті здійснення даного винаходу білок LОX-1 детектують з використанням способів, описаних загалом у прикладі 4 міжнародної заявки на патент WО 2005/087 934. Білок LОX-2 може бути детектований подібним чином з використанням антитіл, що зв'язуються з LOX-2. Повна втрата функції однієї або обох з активності LОX-1 і активності LОX-2 може бути також результатом відсутності експресії або дуже низької експресії, переважно відсутністю експресії транскрипту LОX-1 та/або транскрипту LОX-2. Кваліфікованому фахівцеві буде зрозуміло, що відсутність транскрипту LОX-1 або LОX-2 також буде призводити до відсутності трансльованого білка LОX-1 або LОX-2, відповідно. Альтернативно, повна втрата функції однієї або обох з активності LОX-1 і активності LОX-2 (наприклад, загальна втрата функціональних ферментів LОX-1 і LОX-2) може бути також результатом експресії аберантного транскрипту LОX-1 та/або аберантного транскрипту LОX-2. Аберантний транскрипт LОX-1 та/або LOX-2 може бути викликаний аберантним сплайсингом цього транскрипту, наприклад, внаслідок мутації в сайті сплайсингу. Таким чином, рослини ячменю даного винаходу можуть нести мутацію в сайті сплайсингу, такому як 5'-сайт сплайсингу або 3'-сайт сплайсингу, наприклад, у одному або двох найбільш 5'(лівих)-нуклеотидах інтрона або у одному або двох найбільш 3'(правих)-нуклеотидах інтрона. Один приклад мутанта з аберантним сплайсингом транскрипту LOX-1 описаний як мутант А618 в WО 2005/087934. Експресія транскриптів, що кодують LOX-1 або LOX-2, може бути, наприклад, детектована Нозерн-блотингом або ОТ-ПЛР-експериментами. Повна втрата функціональних ферментів LOX-1 і LОX-2 рослин ячменя даного винаходу обумовлена мутаціями. Таким чином, рослини ячменю даного винаходу зазвичай несуть мутацію в гені LОX-1. Зазначена мутація може знаходитися в регуляторних областях, наприклад, у промоторі або інтронах, або зазначена мутація може знаходитися в кодуючій області. Подібним чином, рослини ячменю даного винаходу зазвичай несуть мутацію в гені LОX-2. Зазначена мутація може знаходитися в регуляторних областях, наприклад, у промоторі або інтронах, або зазначена мутація може знаходитися в кодуючій області. Таким чином, причина повної втрати функціональних ферментів LOX-1 та/або LOX-2 може бути також детектована ідентифікацією мутацій у гені, що кодує LOX-1, або в гені, що кодує LОX-2. Мутації в гені, що кодує LОX-1, можуть бути, наприклад, детектовані секвенуванням зазначеного гена. Переважно, після ідентифікації мутації повну втрату функції підтверджують тестуванням на активності LOX-1 та/або LOX-2. Термін "білок LОX-1" охоплює повнорозмірний білок LОX-1 ячменя, представлений в SEQ ID NО:3 WО 2005/087934 або в SEQ ID NО:7 WО 2005/087934, або його функціональний гомолог. Активний центр LОX-1 розташований у С-кінцевій частині цього ферменту. Зокрема, очікується, що амінокислотні залишки 520-862, або їх частини, що складають цю область, є релевантними відносно активності LОX-1. Таким чином, у одному варіанті здійснення нуль-LOX-ячмінь переважно містить ген, який кодує мутовану форму LОX-1, позбавлену декількох або всіх з 12 UA 106597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 амінокислот 520-862 LОX-1. Зазначений мутований LОX-1 може бути також позбавлений інших амінокислотних залишків, які присутні в LОX-1 дикого типу. Відповідно, ячмінь з двома нуль-LOX-мутаціями даного винаходу може містити укорочену форму LOX-1, яка є нефункціональною, наприклад, укорочену на N- або С-кінці форму. Переважно, зазначена вкорочена форма містить не більше 800, більш переважно не більше 750, навіть більш переважно не більше 700, ще більш переважно не більше 690, навіть більш переважно не більше 680, ще більш переважно не більше 670 послідовних амінокислот LOX-1, наприклад, не більше 665, наприклад, не більше 650, наприклад, не більше 600, наприклад, не більше 550, наприклад, не більше 500, наприклад, не більше 450, наприклад, не більше 425, наприклад, не більше 399 послідовних амінокислот LOX-1 SEQ ID NО:3 WO 2005/087934. Переважно, зазначена вкорочена форма містить тільки N-кінцевий фрагмент LOX-1, переважно якнайбільше 800, більш переважно якнайбільше 750, навіть більш переважно якнайбільше 700, ще більш переважно якнайбільше 690, навіть більш переважно якнайбільше 680, ще більш переважно якнайбільше 670, навіть більш переважно якнайбільше 665 N-кінцевих амінокислот SEQ ID NО:3 WО 2005/087934, наприклад, не більше 665, наприклад, не більше 650, наприклад, не більше 600, наприклад, якнайбільше 550, наприклад, якнайбільше 500, наприклад, якнайбільше 450, наприклад, якнайбільше 425, наприклад, якнайбільше 399 N-кінцевих амінокислот SEQ ID NО:3 WO 2005/087934. У одному дуже бажаному варіанті здійснення ця вкорочена форма може складатися з амінокислот 1-665 SEQ ID NО:3 WО 2005/087934. У одному кращому варіанті здійснення даного винаходу рослина ячменя даного винаходу містить LОX-1-кодуючий ген, який транскрибується в мРНК, яка містить нонсенс-кодон або стопкодон вище за ходом транскрипції (ліворуч) від стоп-кодону мРНК LОX-1 дикого типу. Такий нонсенс-кодон називають тут передчасним нонсенс-кодоном. Переважно, усі LОX-1-кодуючі гени, транскрибуємі в мРНК зазначеної рослини, містять передчасний нонсенс-кодон або стопкодон. Цей нонсенс-кодон або стоп-кодон розташований переважно при якнайбільше 800, більш переважно при якнайбільше 750, навіть більш переважно при якнайбільше 700, ще більш переважно при якнайбільше 690, навіть більш переважно при якнайбільше 680, ще більш переважно при якнайбільше 670, навіть більш переважно при якнайбільше 665 кодонах нижче за ходом транскрипції (праворуч) від стартового кодону. Ця послідовність геномної ДНК дикого типу, що кодує LOX-1, представлена в SEQ ID NО:1 WО 2005/087934 або SEQ ID NО:5 WO 2005/087934. У одному кращому варіанті здійснення рослина ячменя даного винаходу містить ген, що кодує LОX-1, де пре-мРНК, що транскрибується з зазначеного гена, містить послідовність, що відповідає SEQ ID NО:2 WO 2005/087934. У одному дуже бажаному варіанті здійснення ген, що кодує мутантний LОX-1 рослини ячменю з двома нуль-LOX-мутаціями цього винаходу, містить нонсенс-мутацію, причому зазначена мутація відповідає заміні G→A у положенні 3574 SEQ ID NО:1 WO 2005/087934. Термін "білок LOX-2" охоплює повнорозмірний білок LОX-2 ячменя, представлений в SEQ ID NО:5 даної публікації, або його функціональний гомолог. Активний центр LОX-2 розташований у С-кінцевій частині LOX-2. Зокрема, очікується, що амінокислотні залишки 515-717, або їх частини, що складають цю область є релевантними відносно активності LОX-2. На підставі дослідження кристалічної структури LОX-1 сої, очікувані ділянки послідовності щілини активного центру ферменту LOX-2 ячменя представлені амінокислотними залишками 515-525 і 707-717. Трансльований, мутований білок LOX-2, тобто вкорочена на С-кінці форма LОX-2 подвійного нуль-LOX-мутанта ячменя А689, містить максимально 684 залишки а, отже, буде позбавлена ділянки другої послідовності щілини активного центру, роблячи його неактивним. Відповідно до одного варіанту здійснення даного винаходу ячмінь з подвійною нуль-LОX-мутацією даного винаходу переважно містить ген, що кодує мутантну форму LОX-2, яка позбавлена декількох або всіх з амінокислот 515-717 LОX-2, переважно позбавлена декількох або всіх амінокислот 707-717, навіть більш переважно позбавлена всіх амінокислот 707-717. Зазначений мутантний LOX-2 може бути також позбавлений інших амінокислотних залишків, які присутні в LOX-2 дикого типу. Таким чином, ячмінь з подвійною нуль-LОX-мутацією може містити вкорочену форму LOX-2, яка є нефункціональною, таку як укорочена на N-кінці або на С-кінці форма. Переважно, зазначена вкорочена форма містить не більше 800, більш переважно не більше 750, навіть більш переважно не більше 725, ще більш переважно не більше 700, навіть більш переважно не більше 690, ще більш переважно не більше 684 послідовних амінокислот LOX-2 SEQ ID NО:5 даної публікації. Переважно, зазначена вкорочена форма містить тільки N-кінцевий фрагмент LOX-2. Таким чином, переважно зазначена вкорочена форма містить якнайбільше 800, більш 13 UA 106597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 переважно якнайбільше 750, навіть більш переважно якнайбільше 725, ще більш переважно якнайбільше 700, навіть більш переважно якнайбільше 690, ще більш переважно якнайбільше 684 N-кінцевих амінокислот SEQ ID NО:5 даної публікації. У одному дуже бажаному варіанті здійснення ця вкорочена форма може складатися з амінокислот 1-684 SEQ ID NО:5 даної публікації. У одному кращому варіанті здійснення даного винаходу рослина ячменя даного винаходу містить ген, що транскрибується у мРНК LОX-2, де зазначена мРНК містить нонсенс-кодон або стоп-кодон вище за ходом транскрипції (ліворуч) від стоп-кодону мРНК LОX-2 дикого типу. Такий нонсенс-кодон називають тут передчасним нонсенс-кодоном. Переважно, усі LОX-2кодуючі гени зазначеної рослини, що транскрибуються в мРНК зазначеної рослини, містять передчасний нонсенс-кодон або стоп-кодон. Цей нонсенс-кодон або стоп-кодон розташований переважно при якнайбільше 800, більш переважно при якнайбільше 750, навіть більш переважно при якнайбільше 725, ще більш переважно при якнайбільше 700, навіть більш переважно при якнайбільше 690, ще більш переважно при якнайбільше 684 кодонах нижче за ходом транскрипції (праворуч) від стартового кодону. Ця послідовність геномної ДНК дикого типу, що кодує LOX-2, представлена в SEQ ID NО:1 даної публікації. У одному дуже бажаному варіанті здійснення даного винаходу ген, що кодує мутований LOX-2 рослини ячменю з двома нуль-LОX-мутаціями, містить нонсенс-мутацію, причому зазначена мутація відповідає заміні G→A у положенні 2689 SEQ ID NО:1. Рослина ячменя відповідно до даного винаходу може бути отримана будь-яким підходящим способом, відомим кваліфікованому фахівцеві, переважно одним зі способів, описаних загалом тут нижче в розділі "Одержання ячменя з подвійною нуль-LОX-мутацією". У одному варіанті здійснення даного винаходу переважно, щоб рослина ячменя з подвійною нуль-LOX-мутацією згідно з даним винаходом мала фізіологію росту рослини і розвиток насіння, подібні з фізіологією росту і розвитком насіння ячменя дикого типу. Таким чином, переважно, щоб рослина ячменя з нуль-LОX-мутацією була подібною до ячменю дикого типу відносно висоти рослин, кількості пагонів на одну рослину, початку цвітіння та/або кількості насіння на колос. Переважно також, щоб рослина ячменя з подвійною нуль-LOX-мутацією була подібною до ячменю дикого типу, зокрема, подібною до культивару Barke відносно висоти рослини, дати колосіння, стійкості до хвороб, полягання, розкриття колосся, часу дозрівання і урожаю. У даному контексті, термін "подібні" повинен розумітися як ті ж самі ±10 % у випадку чисел. Ці параметри можуть бути визначені, як описано тут далі в прикладі 5. У одному дуже бажаному варіанті здійснення даного винаходу рослиною ячменя є рослина ячменя, насіння якого були депоновано 4 грудня 2008 року за назвою "Barley, Hordeum vulgare L.; Line A689" with American Type Culture Collection (ATCC), Patent Depository, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110, United States (номер депозиту PTA-9640). Таким чином, рослина ячменя даного винаходу може бути лінією А689 (ATCC Patent Deposit Designation: PTA-9640) або будь-якою рослиною ячменя, що є нащадком цієї лінії. Одержання мутантів ячменю Рослина ячменю відповідно до даного винаходу може бути отримана за будь-яким підходящим способом, відомим особі з кваліфікацією у даній галузі. Переважно, рослини ячменю даного винаходу одержують за способом, що передбачає стадії мутагенізації рослин ячменю або їх частин, наприклад, зерен ячменю, що характеризуються повною втратою функції активності LОX-1, такої як повна втрата функціонального ферменту LOX-1, та повною втратою функції активності LOX-2, такої як повна втрата функціонального ферменту LOX-2. У одному кращому варіанті здійснення рослина ячменю може бути отримана за способом, що передбачає мутагенізацію рослини ячменю або його частин, наприклад, зерен ячменю, де зазначені рослини ячменю несуть мутацію, що викликає повну втрату функціонального ферменту LОX-1. Такі рослини ячменю описані, наприклад, у міжнародній заявці на патент WО 2005/087934. У одному аспекті, що представляє інтерес, даний винахід має відношення до нового та дуже ефективного способу скринінгу, який дозволяє виконувати ідентифікацію рослини ячменю, що несе мутацію, яка викликає повну втрату активності LОX-2. Цей новий відтворений спосіб скринінгу уможливлює ідентифікацію рослин ячменю з відсутністю активності LОX-2 або з дуже низькою активністю LОX-2. Цей новий спосіб скринінгу передбачає застосування пророслих зародків як вихідного матеріалу. Цікаво, що автори даного винаходу виявили, що застосування зрілих зародків як вихідного матеріалу для скринінгу на активність LОX-2 є менш кращим, основаним на скринінгу такої великої кількості зрілих зародків, як 21000, які не виявляли LОX-2мутанту ячменю (ячменю з однієї мутацією). Таким чином, однією важливою ознакою цього нового способу скринінгу є використання 14 UA 106597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пророслих зародків як вихідного матеріалу для детектування активності LOX-2. Таким чином, однієї метою даного винаходу є забезпечення способів одержання рослин ячменю з подвійною нуль-LОX-мутацією, що передбачають стадії (i) забезпечення рослини ячменю або його частин з повною втратою функції активності LOX1, наприклад, повною втратою функціонального ферменту LОX-1; та (ii) мутагенізації зазначеної рослини ячменю, та/або клітин ячменю, та/або тканини ячменю, та/або зерен ячменю, та/або зародків ячменю із зазначеної рослини ячменю з одержанням за допомогою цього генерації М0 ячменю; та (iii) розмноження зазначених рослин, зерен та/або зародків ячменю впродовж щонайменше 2 генерацій з одержанням за допомогою цього генерації Мх рослин ячменю, де х є цілим числом ≥2; та (iv) одержання зародків з рослин ячменю Мх; та (v) пророщення зазначених зародків; та (vi) визначення активностей LОX-1 та LОX-2 у зазначених пророслих зародках, або їх частинах; та (vii) відбору рослин з повною втратою активності LОX-1 та активності LОX-2 у цих пророслих зародках; та (viii) аналізу на мутацію у гені LОX-1 та гені LОX-2; та (ix) відбору рослин, що несуть мутацію у гені LОX-1 та гені LОX-2; з одержанням за допомогою цієї рослини ячменю, що несе мутації у генах LОX-1 та LОX-2, що викликають повну втрату активності LОX-1 та повну втрату активності LОX-2. Вищевказаною рослиною ячменю з повною втратою активності LОX-1 може бути, наприклад, будь-яка з рослин ячменю з повною втратою активності LОX-1, описаних у WО 2005/087934, переважно мутант D112 або потомство рослин цього мутанту. Стадія (ii) у вищевказаному переліку може містити у собі мутагенізацію живого матеріалу, вибраного з групи, що складається з рослин ячменю, клітин ячменю, тканини ячменю, зерен ячменю та зародків ячменю, переважно вибраного з групи, що складається з рослини ячменю, зерен ячменю та зародків ячменю, більш переважно зерен ячменю. Мутагенез може виконуватися за будь-яким підходящим способом. У одному варіанті здійснення мутагенез виконують інкубуванням рослини ячменю або його частини, наприклад, зерен ячменю або окремих клітин з ячменю, з мутагенізуючим агентом. Зазначений агент відомий кваліфікованому у даній галузі фахівцеві, що включає, наприклад, але не тільки, азид натрію (NaN3), етилметансульфонат (EMS), азидогліцерин (AG, 3-азидо-1,2-пропандіол), метилнітрозосечовину (MNU) та малеїновий гідразид (МН). У іншому варіанті здійснення мутагенез виконують опроміненням, наприклад УФ, рослини ячменю або його частини, такої як зерно. У кращих варіантах здійснення даного винаходу мутагенез виконують відповідно до будь-якого зі способів, описаних загалом тут нижче у розділі "Хімічний мутагенез". Необмежуючий приклад протоколу підходящого мутагенезу представлено у прикладі 2. Переважно мутагенез виконують таким чином, що очікувана частота зустрічальності бажаних мутантів дорівнює щонайменше 0,5, наприклад, у діапазоні 0,5-5, наприклад, у діапазоні 0,9-2,3 на 10000 зерен, при скринінгу ячменю генерації М3. У кращому варіанті здійснення мутагенез виконують на зернах ячменю. Ці зерна, піддані дії мутагену, називають генерацією МО (див. також фіг. 1). Активність LOX може бути визначена у пробі з зародку ячменю, що проростає, переважно у рідкому екстракті з зародку ячменю, що проростає. Зазначена проба, така як зазначений екстракт, може бути виготовлена з будь-якої підходящої частини зазначеного зародку, що проростає. Зазвичай проба ячменю повинна бути гомогенізована з використанням будь-якого підходящого способу перед готуванням екстракту зазначеної проби та визначенням активності LOX-2. Зокрема, готують екстракт білку з зародку, що проростає, або його частини та визначають активність LOX з використанням зазначеного екстракту білку. Гомогенізація може, наприклад, виконуватися з використанням механічних сил, наприклад, струшуванням або перемішуванням, наприклад, струшуванням у присутності бусин, таких як скляні бусини або бусини зі скляного піску. У одному кращому варіанті здійснення зародок, що проростає, є генерацією Мх, де х є цілим числом ≥2; переважно х є цілим числом у діапазоні 2-10, більш переважно у діапазоні 3-8. У одному дуже бажаному варіанті здійснення активність LOX визначають у зародках, що проростають, генерації М3, або пробі, отриманій з таких зародків. У цьому варіанті здійснення переважно зерна мутагенізованого ячменю генерації М0 вирощують для одержання рослин ячменю, які схрещують для одержання зерен генерації M1. Цю процедуру повторюють, поки 15 UA 106597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зерна генерації М3 є доступними (див. також фіг. 1). Визначення активності LОX може проводитися з використанням будь-якого підходящого аналізу, переважно одним зі способів, описаних загалом тут далі. Зокрема, цей аналіз переважно забезпечує дані щодо діоксигенування лінолевої кислоти у 9-HPODE та 13-HPОDE ферментами LОX-1 та LОX-2. Таким чином, зазвичай аналіз буде включати стадії (i) забезпечення екстракту білку, виготовленого з зародку ячменю, що проростає, або його частини; та (ii) забезпечення лінолевої кислоти; та (iii) інкубування зазначеного екстракту білку з зазначеною лінолевою кислотою; та (iv) детектування діоксигенування лінолевої кислоти у 9-HPОDE та 13-HPОDE. Стадія (iv) цього способу переважно передбачає визначення рівня 9-HPОDE та 13-HPОDE у зазначених зародках, що проростають, переважно у екстракті білкуз зазначених зародків, що проростають. Ця стадія може передбачати пряме або непряме визначення рівнів 9-HPОDE та 13-HPОDE. Може бути визначений загальний рівень усіх HPODE, та у цьому випадку переважно виконують специфічні вимірювання 9-HPОDE та 13-HPODE для підтвердження. Одним способом міг би бути, наприклад, спосіб, у якому екстракти білку з зародків, що проростають, інкубують з лінолевою кислотою як субстратом для утворення 9-HPОDE та 13-HPОDE. Потім зазначені HPODE можуть бути детектовані різними способами. Один спосіб може передбачати генерування детектуємої сполуки, такої як барвник. Наприклад, цей спосіб може бути окисним зв'язуванням 3-диметиламинобензойної кислоти та 3-метил-2-бензотіазолінонгідразону у присутності гемоглобіну, що каталізується утвореними HPODE, з утворенням барвника індаміну, який може бути виміряний при А595 з використанням спектрофотометру. Один приклад такого способу описано у прикладах 1 та 2 далі тут. З використанням цього аналізу зчитування абсорбції, менше 0,2 А595-одиниць, вважається показником відсутності активностей LОX-1 та LOX-2. Однак більш точним способом для визначення активностей LОX-1 та LОX-2 є інкубування екстракту білку з зародків, що проростають, з лінолевою кислотою з наступним визначенням вмістів 9-HPОDE та 13-HPODE. Вмісти 9-HPОDE та 13-HPОDE можуть бути визначені, наприклад, з використанням аналізу на основі ВЕРХ. Діоксигенування лінолевої кислоти з утворенням 9-HPОDE та 13-HPODE може вимірюватися прямо або опосередковано. З даним винаходом може бути використаний будьякий підходящий спосіб детектування. У одному варіанті здійснення даного винаходу детектують гідропероксиди лінолевої кислоти. 9-HPОDE та 13-HPODE можуть бути детектовані безпосередньо, наприклад, хроматографічними способами, такими як ВЕРХ, як описано у прикладі 4. Даний винахід розкриває, що деякі аспекти процедури для екстракції білку з зародків, що проростають, мають велике значення. Так, білок переважно екстрагують з використанням кислотного буферу, переважно буфера з pН у діапазоні 2-6, більш переважно у діапазоні 3-5, навіть більш переважно у діапазоні 3,5-5, ще більш переважно у діапазоні 4-5, навіть більш переважно pН 4,5. Буфер, використовуваний для екстракції, переважно готують на основі органічної кислоти, більш переважно він є буфером на основі молочної кислоти. Найбільш переважно, цей екстракт білку готують з використанням буферу, що містить 100 мМ молочну кислоту. Деякі варіанти даного винаходу описують способи для детектування нуль-LOX-1- та нульLOX-2-рослин, які передбачають реакцію 9-HPODE та 13-HPODE з барвником, наприклад, 3метил-2-бензотіазолінонгідразоном. Переважно, зазначений барвник, наприклад, 3метилбензотіазолінонгідразон, додають до екстракту білку після додавання лінолевої кислоти. Переважно, цей барвник додають впродовж щонайменше 1 хвилини, більш переважно щонайменше 5 хвилин, навіть більш переважно впродовж 10 хвилин, наприклад, у діапазоні 160 хвилин, наприклад, у діапазоні 5-30 хвилин, наприклад, у діапазоні 10-20 хвилин після контактування цього екстракту білку з лінолевою кислотою. Кращі способи для відбору рослин ячменю відповідно до даного винаходу докладно описані тут далі у прикладі 2. Процедура відбору може бути пристосована для процедур аналізу на основі мікротитраційних планшетів або інших відомих повторюваних високопродуктивних форматів аналізів для забезпечення швидкого скринінгу численних проб. Переважно щонайменше 5000, наприклад, щонайменше 7500, наприклад, щонайменше 10000, наприклад, щонайменше 15000, наприклад, щонайменше 20000, наприклад, щонайменше 25000 мутагенізованих рослин ячменю аналізують на активності LOX-1 та LOX-2. Визначення мутації у гені, що кодує LOX-1, може виконуватися за декількома різними способами. Наприклад, ген LОX-1 може бути секвенований повністю або частково, та ця 16 UA 106597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовність може порівнюватися з SEQ ID NО:1 WO 2005/087934 або SEQ ID NО:5 WO 2005/087934. При пошуку на специфічну мутацію може бути застосований SNP-аналіз. Кваліфікований фахівець зможе сконструювати застосовні праймери для детектування конкретної специфічної мутації, такої як мутація, що приводить до передчасного стоп-кодону у кодуючій послідовності для LOX-1 (наприклад, будь-якого з передчасних стоп-кодонів, описаних тут вище). Один приклад того, як можна виконувати SNP-аналіз, описано у прикладі 10 тут нижче, з праймерами, які застосовні для детектування мутації G→A у положенні нуклеотиду 3474 гену LOX-1. Визначення мутації у гені, що кодує LOX-2, може виконуватися за декількома різними способами. Наприклад, ген LOX-2 може бути секвенований повністю або частково, та ця послідовність може порівнюватися з SEQ ID NО:1 даної публікації. При пошуку на специфічну мутацію може бути застосований SNP-аналіз. Кваліфікований фахівець зможе сконструювати застосовні праймери для детектування конкретної специфічної мутації, такої як мутація, що приводить до передчасного стоп-кодону у LОX-2-кодуючій послідовності (наприклад, будь-якого з передчасних стоп-кодонів, описаних тут вище). Один приклад того, як можна виконувати SNPаналіз, описано у прикладі 10 тут нижче, з праймерами, які застосовні для детектування мутації G→A у положенні нуклеотиду 2689 гену LОX-2. У даний винахід включено також те, що стадії (viii) та (ix) способу одержання рослини ячменю з подвійною нуль-LOX-мутацією, як докладно описане у цьому розділі вище, можуть виконуватися перед стадіями (vi) та (vii), та у цьому випадку цей спосіб буде містити стадії (i), (ii), (iii), (iv), (v), (viii), (ix), (vi) і (vii) у цьому порядку. Зокрема, це могло б мати місце при пошуку на специфічну мутацію, наприклад, у рослинах-нащадках уже ідентифікованих рослин ячменю з подвійною нуль-LОX-мутацією. Після ідентифікації рослини ячменю з подвійною нуль-LOX-мутацією, яка містить конкретну мутацію у гені LОX-1 та конкретну мутацію у гені LОX-2 (таку як кожна з вищевказаних мутацій), додаткові рослини ячменю з ідентичними мутаціями можуть бути генеровані загальноприйнятими способами розмноження, такими як способи, добре відомі кваліфікованому у даній області фахівцеві. Наприклад, зазначена рослина ячменю з подвійною нуль-LOXмутацією може бути назад схрещена з іншим культиваром ячменю. Після відбору застосовних рослин ячменю з загальною втратою функцій LОX-1 та LОX-2 можуть виконуватися необов'язково один або декілька додаткових скринінгів. Наприклад, відібрані мутанти можуть бути додатково розмножені, та рослини нових генерацій можуть бути протестовані на повну втрату функціональних ферментів LОX-1 та LОX-2. Після відбору застосовних рослин ячменю вони можуть бути піддані розмноженню, наприклад, загальноприйнятому розмноженню. Способи розмноження описані тут нижче у розділі "Розмноження рослин". Продукти з рослин Даний винахід має відношення до напоїв або інших продуктів з рослин з низькими рівнями потенціалу T2N, отриманим з рослин ячменю з подвійною нуль-LOX-мутацією або їх частин. Таким чином, даний винахід має відношення до продуктів рослинного походження (продуктів з рослин), які можуть бути композиціями, що містять вищеописані рослини ячменю, або їх частини, або композицій, отриманих з зазначених рослин ячменю, або їх частин, таких як продукти рослин, отримані з зазначених рослин ячменю, або їх частин. Оскільки зазначені рослини ячменю позбавлені активностей LОX-1 та LОX-2, ці композиції зазвичай містять дуже низькі рівні потенціалу T2N. Приклади застосовних композицій, що містять рослини ячменю або виготовлені з рослин ячменю, що мають першу мутацію, яка призводить до повної втрати функції активності LОX-1, такої як повна втрата функціонального ферменту LОX-1, та другу мутацію, яка призводить до повної втрати функції активності LОX-2, такої як повна втрата функціонального ферменту LОX-2, описані тут нижче. Зазначені композиції переважно містять (i) менше 60 %, навіть більш переважно менше 50 %, ще більш переважно менше 40 %, наприклад, менше 30 %, переважно менше 20 %, більш переважно менше 10 %, вільного T2N; та/або (ii) менше 60 %, навіть більш переважно менше 50 %, ще більш переважно менше 40 %, наприклад, менше 30 %, переважно менше 25 % потенціалу T2N; у порівнянні з подібною композицією, виготовленою у такий же спосіб з рослин ячменю дикого типу, переважно з культивару Power. Конкретне зменшення T2N може різнитися залежно від типу цієї композиції. Вищезгадані зменшення T2N є особливо релевантними для композицій, коли ця композиція вибрана з групи, що складається з солоду, сусла та витриманих напоїв. Крім того, зазначені композиції переважно містять 17 UA 106597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (i) менше 80 %, переважно менше 70 %, навіть більш переважно менше 60 %, наприклад, менше 50 % вільного T2N; та/або (ii) менше 80 %, переважно менше 70 %, навіть більш переважно менше 60 %, наприклад, менше 50 % потенціалу T2N; у порівнянні з подібною композицією, виготовленою у такий же спосіб з мутанту ячменю D112, описаного у WO 2005/087934. Даний винахід відноситься у одному аспекті до зерен ячменю, що мають першу мутацію, яка призводить до повної втрати функції активності LОX-1 (наприклад, повної втрати функціонального ферменту LОX-1), та другу мутацію, яка призводить до повної втрати функції активності LОX-2 (наприклад, повної втрати функціонального ферменту LОX-2). Даний винахід відноситься також до композицій, що містять зазначені зерна, та до композицій, виготовлених з зазначених зерен, а також продуктів рослинного походження, виготовлених з таких зерен. Було описано, що активність ліпоксигеназ у зернах ячменю може бути зменшена процесом вимочування, у якому ячмінь може бути підданий високим температурам та/або обробці молочною кислотою. Така обробка може мати інші побічні ефекти, такі як зменшення бажаних ферментативних активностей, наприклад, активності фітази. Крім того, така обробка зменшує активність ліпоксигенази тільки з моменту, коли робиться теплова обробка, та, отже, вона не впливає на попереднє накопичення продуктів ліпоксигенази. Таким чином, у одному варіанті продукти рослинного походження відповідно до даного винаходу готують з використанням способу, у якому зерна ячменю не піддають вимочуванню при температурі щонайменше 70 °C. Переважно також ці продукти рослинного походження відповідно до даного винаходу готують з використанням способу, у якому зерна ячменю не піддають вимочуванню при температурі щонайменше 57 °C у присутності молочної кислоти. У одному аспекті цей винахід має відношення до композицій солоду, виготовлених з зерен з подвійною нуль-LOX-мутацією за допомогою солодження. Під терміном "солодження" слід розуміти пророщення замочених зерен ячменю, що відбувається при контрольованих умовах навколишнього середовища (наприклад, як проілюстровано на фіг. 3, у стадіях 2 та 3). Зазначені композиції солоду переважно містять менше 30 %, більш переважно менше 20 %, навіть більш переважно менше 10 % вільного T2N у порівнянні з композицією солоду, отриманою у такий же спосіб з ячменю дикого типу, переважно з культивару Power. Більш переважно, зазначені композиції солоду містять менше 60 %, більш переважно менше 50 % вільного T2N у порівнянні з композицією солоду, отриманою у такий же спосіб з нуль-LOX-1мутанту ячменю D112, описаного у WO 2005/087934. Крім того, зазначені композиції солоду переважно містять менше 60 %, переважно менше 50 %, більш переважно менше 40 %, навіть більш переважно менше 30 %, більш переважно менше 20 %, навіть більш переважно менше 10 % потенціалу T2N у порівнянні з композицією солоду, отриманою у такий же спосіб з ячменю дикого типу, переважно з культивару Power. Більш переважно зазначені композиції солоду містять менше 60 %, більш переважно 50 % потенціалу T2N у порівнянні з композицією, отриманою у такий же спосіб з нуль-LOX-1 мутанту ячменю D112, описаного у WO 2005/087934. Солодження є процесом контрольованого замочування та пророщення, з наступним сушінням зерна ячменю, переважно пічним сушінням зерна ячменю. Перед сушінням замочені зерна ячменю та зерна, що проростають, називають "зеленим солодом", який може також представляти продукт рослинного походження (продукт рослини) відповідно до даного винаходу. Ця послідовність подій є важливою для синтезу численних ферментів, які викликають модифікацію зерна, процеси, які головним чином деполімеризують клітинні стінки мертвого ендосперму для мобілізації нутрієнтів зерна та активації інших деполімераз. У процесі сушіння, що слідує далі, продукуються смак та колір внаслідок хімічних реакцій побуріння. Хоча первинним застосуванням солоду є застосування для виробництва напоїв, він може бути також використаний у інших промислових процесах, наприклад, як джерело ферментів у хлібопекарській промисловості або як ароматизатор та барвник у харчовій промисловості, такий як солод або солодове борошно, або безпосередньо у вигляді солодового сиропу і т.д. У одному аспекті даний винахід має відношення до способів одержання зазначеної композиції солоду. Ці способи передбачають переважно стадії (i) забезпечення зерен ячменю з подвійною нуль-LOX-мутацією; (ii) замочування зазначених зерен; (iii) проростання замочених зерен при заздалегідь заданих умовах; (iv) сушіння зазначених зерен, що проростають; з одержанням за допомогою цього композиції солоду з повною втратою активності LОX-1 та активності LОX-2. Наприклад, цей солод може бути отриманий за будь-яким зі способів, описаних Briggs et al. (1981) і Hough et al. (1982). Однак, з даним винаходом може бути 18 UA 106597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використаний будь-який інший підходящий спосіб одержання солоду, такий як способи одержання солодів спеціального асортименту, у тому числі, але не тільки, способи обсмажування солоду. Необмежуючі приклади описано у прикладах 6 та 8. Солод може бути додатково оброблений, наприклад, здрібнюванням (помел). Таким чином, продукт рослинного походження відповідно до даного винаходу може бути будь-яким типом солоду, таким як необроблений солод або здрібнений солод або солодове борошно. Здрібнений солод та його борошно містять хімічні компоненти солоду та мертвих клітин, які позбавлені здатності повторного проростання. У іншому аспекті продукти рослинного походження відповідно до даного винаходу містять сироп, такий як сироп ячменю або сироп солоду ячменю або навіть складаються з такого сиропу. Продукт рослинного походження може бути також екстрактом ячменю або солоду. У іншому аспекті цей винахід має відношення до типів продуктів рослин, які є композиціями сусла, виготовленими з композицій солоду, зроблених з зерен з подвійною нуль-LОX-мутацією. Зазначені солоди можуть бути виготовлені тільки з зерен з подвійною нуль-LOX-мутацією або з сумішей, що містять також інші зерна. Цей винахід відноситься також до композицій сусла, виготовлених з використанням ячменю з подвійною нуль-LOX-мутацією або його частин, окремо або у суміші з іншими компонентами. Зазначені композиції сусла переважно містять менше 30 %, більш переважно менше 20 %, навіть більш переважно менше 10 % вільного T2N у порівнянні з композицією сусла, виготовленою у такий же спосіб з ячменю дикого типу, переважно з культивару Power. Більш переважно, зазначені композиції сусла містять менше 60 %, більш переважно менше 50 % вільного T2N у порівнянні з композицією сусла, виготовленою у такий же спосіб з мутанту ячменю D112, описаного у WO 2005/087934. Крім того, зазначені композиції сусла переважно містять менше 40 %, більш переважно менше 30 %, навіть більш переважно менше 25 % потенціалу T2N у порівнянні з композицією сусла, виготовленою у такий же спосіб з ячменю дикого типу, переважно з культивару Power. Більш переважно, зазначені композиції сусла містять менше 60 %, більш переважно менше 50 % потенціалу T2N у порівнянні з композицією сусла, виготовленою в такий же спосіб з мутанту ячменю D112, описаного у WО 2005/087934. Зазначене сусло може бути першим, та/або другим, та/або наступними суслами. Ця композиція сусла може бути незбродженим (солодким) суслом, прокип'яченим суслом або їх сумішшю. Ця композиція сусла може бути також ячмінним суслом. Зазвичай композиція сусла має високий зміст аміноазоту та ферментуємих вуглеводів, причому останні є в основному мальтозою. На фіг. 3, стадії 4-6 ілюструють звичайний спосіб готування сусла з солоду. Звичайне сусло готують об'єднанням та інкубуванням солоду та води, тобто у процесі затирання. Під час затирання ця композиція солод/рідина може бути доповнена додатковими багатими вуглеводами добавками, наприклад, добавками (ад'юнктами) з розмеленого ячменю, розмеленої кукурудзи або розмеленого рису. Неосолоджені зернові добавки зазвичай містять мало або не містять активних ферментів, що робить важливим доповнення ферментами солоду або екзогенними ферментами для забезпечення ферментів, необхідних для перетворення цукру. Звичайно, готування сусла починається розмелом солоду, таким чином, щоб вода могла мати доступ до часток зерен у фазі затирання. Зазначене затирання є по суті продовженням процесу солодження, з ферментативною деполімеризацією субстратів. Під час затирання здрібнений солод інкубують з рідкою фракцією, такою як вода. Температуру інкубації зазвичай або підтримують постійною (ізотермічне затирання), або поступово збільшують. У кожному разі розчинні речовини, продуковані у солодженні та затиранні, вивільняються у зазначену рідку фракцію. Наступне фільтрування робить розділення сусла та твердих часток, що залишилися, які називають також "дробиною". Зазначене сусло може також називатися "першим суслом". Після промивання дробини та фільтрування може бути отримане "друге сусло". Наступні сусла можуть бути отримані повторенням цієї процедури. Необмежуючі приклади процедур, що підходять для приготування сусла, описані Briggs et al. (supra) і Hough et al. (supra). Було описано, що ліпоксигеназна активність може бути зменшена тепловою обробкою цих ферментів. Було описано, що сусло може бути оброблене нагріванням для зменшення ліпоксигеназної активності та/або що затирання виконують при високих температурах. Однак, крім зменшення ліпоксигеназної активності, теплова обробка може мати інші, шкідливі дії, такі як зменшення інших ферментативних активностей. Крім того, теплова обробка зменшує ліпоксигеназну активність тільки з моменту, коли робиться теплова обробка та, отже, вона не впливає на попереднє накопичення ліпоксигеназних продуктів. Таким чином, у одному варіанті здійснення сусло відповідно до даного винаходу готують з використанням способу, у якому початкова температура затирання не перевищує 70 °C, 19 UA 106597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 переважно не перевищує 69 °C, так, наприклад, початкова температура затирання може перебувати у діапазоні 50 °C-69 °C, такому як діапазон 55 °C-69 °C, наприклад, у діапазоні 55 °C-65 °C. Краще сусло відповідно до даного винаходу не піддають температурам 70° або більш високим температурам впродовж більше 25 хвилин, переважно не більше 10 хвилин, більш переважно не більше 15 хвилин під час затирання. Якщо температури затирання є занадто високими, це буде впливати на ферментативну активність у заторі та може зменшувати, або навіть усувати, бажані ферментативні активності, що буде приводити до зміненої якості цього сусла. Перше, друге та наступні сусла можуть бути об'єднані та після цього піддані кип'ятінню. Це непрокип'ячене сусло, або чисте перше сусло, або об'єднане сусло, називають також "солодким суслом"; після кип'ятіння воно може називатися "прокип'яченим суслом". Якщо це сусло повинне використовуватися у виробництві пива, перед кип'ятінням часто додають висушені шишки хмелю. Композиція сусла може бути також виготовлена інкубуванням рослин ячменю з подвійною нуль-LOX-мутацією або їх частин, таких як неосолоджені зерна ячменю з подвійною нуль-LОXмутацією, зокрема, розмелені, неосолоджені зерна ячменю з подвійною нуль-LOX-мутацією, або їх частини, з одним або декількома підходящими ферментами, такими як композиції ферментів або композиції сумішей ферментів, наприклад, Cereflo, Ultraflo або Ondea Pro (Novozymes). Спосіб одержання напою з виготовленого у такий спосіб сусла може також називатися "варінням пива з ячменю", а його композиція сусла може називатися "ячмінним суслом", або "звареним з ячменю суслом". Композиція сусла може бути також виготовлена з використанням суміші солоду та неосолоджених рослин ячменю, або їх частин, або тільки з неосолодженого ячменю, необов'язково доповненого одним або декількома підходящими ферментами під час зазначеного приготування, зокрема, амілазами, глюканазами [переважно (1-4)- та/або (1-3,1-4)β-глюканазою], та/або ксиланазою (такою як арабіноксалаза), та/або протеазами, або сумішами ферментів, що містять один або декілька з вищезгаданих ферментів, наприклад, додаванням суміші ферментів Ondea Pro (Novozymes). У одному конкретному варіанті здійснення даного винаходу композиція сусла відповідно до даного винаходу є ячмінним суслом, таким як прокип'ячене ячмінне сусло, тобто суслом, виготовленим інкубуванням неосолоджених (та переважно розмелених) зерен ячменю з подвійною нуль-LOX-мутацією з водою, переважно затиранням та промиванням дробини. Таке ячмінне сусло характеризується надзвичайно низькими рівнями T2N та потенціалу T2N. Так, зазначене ячмінне сусло краще містить менше 50 %, більш переважно менше 40 %, навіть більш переважно менше 30 % вільного T2N у порівнянні з композицією ячмінного сусла, виготовленого у такий же спосіб з ячменю дикого виду, переважно з культивару Power. Більш переважно зазначені композиції сусла містять менше 70 %, більш переважно менше 60 % вільного T2N у порівнянні з композицією сусла, виготовленого у такий же спосіб з мутанту ячменю D112, описаного у WO 2005/087934. Крім того, зазначене ячмінне сусло краще містить якнайбільше 0,15 ppb вільного T2N, коли зазначене сусло доведене до°p (градуса густини Плато) у діапазоні 13-16, переважно у діапазоні 14-15, більш переважно до 14,5°p. Крім того, зазначене ячмінне сусло краще містить менше 50 %, більш переважно менше 40 %, навіть більш переважно менше 30 % потенціалу T2N у порівнянні з композицією ячмінного сусла, виготовленого у такий же спосіб з ячменю дикого виду, переважно з культивару Power. Зазначене ячмінне сусло краще містить менше 50 %, більш переважно менше 40 %, навіть більш переважно менше 30 % прекурсору T2N у порівнянні з композицією ячмінного сусла, виготовленого у такий же спосіб з ячменю дикого виду, переважно з культивару Power. Даний винахід відноситься також до продуктів рослинного походження, які можуть бути харчовими композиціями, кормовими композиціями та композиціями ароматичних сировинних матеріалів, які містять рослини ячменю з подвійною нуль-LOX-мутацією або їх частини. Харчові композиції, наприклад, можуть бути, але не обмежуються ними, солодженими або неосолодженими зернами ячменю, ячмінним борошном, хлібом, дробленою ячмінною крупою, зерновими сумішами, що містять ячмінь, корисними для здоров'я продуктами, такими як напої, що містять ячмінь, ячмінні сиропи, та композиції зернових пластівців, розмеленого або екструдованого ячменю. Кормові композиції включають, наприклад, композиції, що містять зерна ячменю та/або ячмінні борошна. Композиції ароматичного сировинного матеріалу описані тут нижче. Цей винахід відноситься також до сумішей композицій цього винаходу. Наприклад, цей винахід у одному аспекті має відношення до композиції, виготовленої з використанням суміші (i) композиції, що містить рослину ячменю або її частину, що містять першу мутацію, яка призводить до повної втрати функції активності LОX-1, наприклад, повної втрати 20 UA 106597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 функціонального ферменту LОX-1, та другу мутацію, яка призводить до повної втрати функції активності LОX-2, наприклад, повної втрати активного ферменту LОX-2; та (ii) композиції солоду, виготовленої з зерен з подвійною нуль-LОX-мутацією. У кращому аспекті даний винахід має відношення до напоїв, більш переважно солодових напоїв, навіть більш переважно ферментованих напоїв, таких як ферментовані солодові напої, переважно алкогольних напоїв, таких як пиво, що мають стабільні органолептичні якості, де зазначений напій виготовлений з використанням ячменю з подвійною нуль-LOX-мутацією або його частин. Таким чином, у одному кращому варіанті здійснення даного винаходу цей напій переважно готують ферментацією ячменю з подвійною нуль-LOX-мутацією або його частин, або їх екстрактів, наприклад, ферментацією сусла з солоду з подвійною нуль-LOX-мутацією, окремо або у комбінації з іншими інгредієнтами. Однак в інших варіантах здійснення даного винаходу цей напій є неферментованим напоєм, наприклад, суслом, отриманим з солоду ячменя з подвійною нуль-LOX-мутацією. У даний винахід включено також те, що зазначений напій може бути виготовлений з неосолоджених рослин ячменя, або їх частин. Цей напій може бути також неалкогольним напоєм, таким як безалкогольне пиво або інші типи неалкогольних напоїв, такі як безалкогольні солодові напої, такі як мальтина. Однак, переважно зазначений напій готують з композиції солоду, отриманого з зерен ячменя з подвійною нуль-LОX-мутацією. Більш переважно, зазначеним напоєм є пиво. Цей напій може бути будь-яким типом пива, відомим особі з кваліфікацією в даній галузі. У одному варіанті здійснення це пиво є, наприклад пивом лагер. Це пиво краще варять з використанням композиції солоду, що містить пророслий ячмінь з подвійною нуль-LOX-мутацією, більш переважно зазначене пиво варять з використанням композиції солоду, виготовленої винятково з пророщеного ячменя з подвійною нуль-LОX-мутацією. Однак ця композиція солоду може також містити інші компоненти, наприклад, інші пророслі або непророслі зернові рослини, такі як ячмінь дикого типу, нуль-LОX-ячмінь, пшениця та/або жито, або непророслі вихідні матеріали, які містять цукру, або композиції, отримані з осолоджених або неосолоджених вихідних матеріалів, у тому числі композиції сиропу. Однак переважно весь ячмінь, такий як весь осолоджений та/або неосолоджений ячмінь, та/або пророслий, та/або непророслий ячмінь, використовуваний для приготування зазначеного пива, є переважно ячменем з подвійною нульLOX-мутацією. У кращому варіанті здійснення напій відповідно до даного винаходу є пивом, яке було отримано з сусла, виготовленого з висушеного пічним сушінням солоду, переважно затиранням і, необов'язково, промиванням дробини. Таке пиво може також називатися тут "осолодженим". Однак, напій відповідно до даного винаходу може бути також отриманий з ячмінного сусла. Таке пиво називають "ячмінним пивом". У одному кращому варіанті здійснення напій відповідно до даного винаходу містить менше 50 %, переважно менше 40 %, більш переважно менше 35 %, наприклад, менше 30 % потенціалу T2N у порівнянні з потенціалом T2N напою, виготовленого таким же чином з ячменя дикого типу, переважно з культивару Power. Напій відповідно до даного винаходу переважно містить також менше 70 %, переважно менше 60 %, наприклад, менше 50 % потенціалу T2N у порівнянні з напоєм, виготовленим у такий же спосіб з нуль-LОX-мутанту ячменя, переважно з мутанта ячменя D112, описаного в WO 2005/087934. Напої відповідно до даного винаходу переважно містять також якнайбільше 2 ppb, більш переважно якнайбільше 1,5 ppb, наприклад, якнайбільше 1 ppb потенціалу T2N, якщо°p (градус густини Плато) у вихідному екстракті, на якому заснований цей напій, доводять до величини в діапазоні 10-12°p, більш переважно до 11°p. У одному кращому варіанті здійснення напій відповідно до даного винаходу містить менше 50 %, переважно менше 40 %, більш переважно менше 35 %, наприклад, менше 30 % прекурсору T2N у порівнянні з прекурсором T2N напою, виготовленого в такий же спосіб з ячменя дикого типу, переважно з культивару Power. Напій відповідно до даного винаходу також містить переважно менше 70 %, переважно менше 60 %, наприклад, менше 50 % прекурсору T2N у порівнянні з напоєм, виготовленим у такий же спосіб з мутанта ячменя D112, описаного в WО 2005/087934. Напої відповідно до даного винаходу переважно містять також якнайбільше 2 ppb, більш переважно якнайбільше 1,5 ppb, наприклад, якнайбільше 1 ppb потенціалу T2N, якщо°p у вихідному екстракті, на якому заснований цей напій, доводять до величини в діапазоні 10-12°p, більш переважно до 11°p. У одному конкретному варіанті здійснення даного винаходу цей напій є ячмінним пивом, яке містить менше 50 %, переважно менше 40 %, більш переважно менше 35 % потенціалу T2N у порівнянні з потенціалом T2N ячмінного пива, виготовленого в такий же спосіб з ячменя дикого 21 UA 106597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 типу, переважно з культивару Power. У цьому варіанті здійснення зазначене ячмінне пиво відповідно до даного винаходу містить також переважно менше 50 %, переважно менше 40 %, більш переважно менше 35 % прекурсору T2N у порівнянні з прекурсорами T2N ячмінного пива, виготовленого в такий же спосіб з ячменя дикого типу, переважно з культивару Power. У цьому варіанті здійснення ячмінне пиво відповідно до даного винаходу містить також переважно якнайбільше 2 ppb, більш переважно якнайбільше 1,5 ppb, наприклад, якнайбільше 1,2 ppb потенціалу T2N. Крім того, у цьому варіанті здійснення ячмінне пиво відповідно до даного винаходу містить також переважно якнайбільше 2 ppb, більш переважно якнайбільше 1,5 ppb, навіть більш переважно якнайбільше 1,2 ppb прекурсору T2N, якщо°p у вихідному екстракті, на якому заснований цей напій, доводять до величини в діапазоні 10-12°p, більш переважно до 11°p. У іншому конкретному варіанті здійснення даного винаходу цей напій є пивом, отриманим з солоду, де зазначене пиво містить менше 50 %, переважно менше 40 %, більш переважно менше 30 % потенціалу T2N у порівнянні з потенціалом T2N пива, виготовленого в такий же спосіб з ячменя дикого типу, переважно з культивару Power. У цьому варіанті здійснення зазначене пиво відповідно до даного винаходу містить також переважно менше 50 %, переважно менше 40 %, більш переважно менше 30 % прекурсору T2N у порівнянні з прекурсорами T2N пива, виготовленого в такий же спосіб з ячменя дикого типу, переважно з культивару Power. У цьому варіанті здійснення пиво відповідно до даного винаходу також містить переважно якнайбільше 2 ppb, більш переважно якнайбільше 1,5 ppb, навіть більш переважно якнайбільше 1 ppb потенціалу T2N. Крім того, у цьому варіанті здійснення ячмінне пиво відповідно до даного винаходу містить також переважно якнайбільше 2 ppb, більш переважно якнайбільше 1,5 ppb, навіть більш переважно якнайбільше 1 ppb прекурсору T2N, якщо°p у вихідному екстракті, на якому заснований цей напій, доводять до величини в діапазоні 10-12°p, більш переважно до 11°p. Термін "органолептичні якості" позначає якості, які сприймаються нюховими і смаковими відчуттями. Їх аналізує, наприклад, навчена спеціалізована дегустаційна комісія. Переважно, ця дегустаційна комісія навчена конкретно розпізнаванню альдегідних присмаків, таких як присмак T2N. Зазвичай ця дегустаційна комісія буде складатися з 3-30 членів, наприклад, з 5-15 членів, переважно з 8-12 членів. Ця дегустаційна комісія може оцінювати присутність різних присмаків, таких як паперовий присмак, присмак окисненого продукту, присмак старості і присмак хліба. Що стосується даного винаходу, переважно, щоб були зменшені, зокрема, паперовий присмак та/або присмак старості. Спосіб визначення "органолептичних якостей" напою описано в прикладі 6 у міжнародній заявці на патент WО 2005/087 934. Інший кращий спосіб визначення "органолептичних якостей" напою описано в прикладах 8 і 9 тут далі. У кращих варіантах здійснення стабільні органолептичні якості є, щонайменше частково, результатом низьких рівнів T2N або потенціалу T2N. Переважно напої відповідно до даного винаходу характеризуються наявністю меншого паперового присмаку в порівнянні з подібним напоєм, виготовленим у такий же спосіб з рослини ячменю, що містить активність LОX-1 і LОX-2, після зберігання впродовж щонайменше 10 місяців у діапазоні 15-25 °C, наприклад, близько 20 °C. Переважно зазначений паперовий присмак рівний менше 90 %, більш переважно менше 80 %, наприклад, менше 70 % згідно з оцінкою навченої дегустаційної комісії. Переважно також напої даного винаходу мають зменшений паперовий присмак у порівнянні з подібним напоєм, виготовленим з ячменя дикого типу, після зберігання при підвищених температурах. При визначенні властивості "паперового присмаку" навченою спеціалізованою дегустаційною комісією, як описано вище, і оцінюванні по шкалі 0-5, де 0 позначає відсутність, а 5 позначає крайній ступінь присмаку. Переважно, щоб напої даного винаходу мали одну або більш, переважно щонайменше дві, наприклад, щонайменше три, наприклад, з усіх наступних оцінок у відношенні паперового присмаку (i) оцінку у відношенні паперового присмаку щонайменше на 0,5, переважно щонайменше на 0,7, більш переважно щонайменше на 1,0 більш низьку, ніж ця оцінка у відношенні паперового присмаку напою, виготовленого в такий же спосіб з ячменя дикого типу, переважно з культивару Power після інкубування при 37 °C впродовж одного тижня; (ii) оцінку у відношенні паперового присмаку щонайменше на 0,5, переважно щонайменше на 0,7, більш переважно щонайменше на 1,0 більш низьку, ніж ця оцінка у відношенні паперового присмаку напою, виготовленого в такий же спосіб з ячменя дикого типу, переважно з культивару Power після інкубування при 37 °C впродовж двох тижнів; (iii) оцінку у відношенні паперового присмаку щонайменше на 0,5, переважно щонайменше на 0,7, більш переважно щонайменше на 1,0 більш низьку, ніж ця оцінка у відношенні 22 UA 106597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 паперового присмаку напою, виготовленого в такий же спосіб з ячменя дикого типу, переважно з культивару Power після інкубування при 37 °C впродовж трьох тижнів; (iv) оцінку у відношенні паперового присмаку якнайбільше 90 %, переважно саме. більше 80 %, більш переважно якнайбільше 7 0 %, навіть більш переважно якнайбільше 60 %, ще більш переважно якнайбільше 50 % оцінки у відношенні паперового присмаку напою, виготовленого в такий же спосіб з ячменя дикого типу, переважно з культивару Power після інкубування при 37 °C впродовж одного тижня; (v) оцінку у відношенні паперового присмаку якнайбільше 90 %, переважно якнайбільше 80 %, більш переважно якнайбільше 70 %, навіть більш переважно якнайбільше 60 %, ще більш переважно якнайбільше 50 % оцінки у відношенні паперового присмаку напою, виготовленого в такий же спосіб з ячменя дикого типу, переважно з культивару Power після інкубування при 37 °C впродовж двох тижнів; (vi) оцінку у відношенні паперового присмаку якнайбільше 90 %, переважно якнайбільше 80 %, більш переважно якнайбільше 70 %, навіть більш переважно якнайбільше 60 %, ще більш переважно якнайбільше 50 % оцінки у відношенні паперового присмаку напою, виготовленого в такий же спосіб з ячменя дикого типу, переважно з культивару Power після інкубування при 37 °C впродовж трьох тижнів. Говорять, що напій має "стабільні органолептичні якості", коли зазначений напій містить дуже низькі рівні вільного T2N, навіть після зберігання. Таким чином, однієї метою даного винаходу є забезпечення напоїв (таких як пиво зі стабільними органолептичними якостями), виготовлених з використанням рослин ячменя з подвійною нуль-LОX-мутацією. Такі напої переважно містять дуже низькі рівні потенціалу T2N, переважно менше 50 %, переважно менше 40 %, більш переважно менше 35 %, наприклад, менше 30 %, наприклад, менше 20 %, наприклад, менше 10 % потенціалу T2N у порівнянні з напоєм, виготовленим у такий же спосіб з ячменя дикого типу, переважно з культивару Power, після зберігання впродовж щонайменше 1 тижня, переважно щонайменше 2 тижнів, більш переважно щонайменше 3 тижнів, навіть більш переважно впродовж щонайменше 4 тижнів, наприклад, у діапазоні 1-3 місяців, наприклад, у діапазоні 3-6 місяців, наприклад, у діапазоні 6-12 місяців, наприклад, впродовж більше одного, року. Крім того, напої відповідно до даного винаходу переважно містять дуже низькі рівні T2N, переважно менше 50 %, переважно менше 40 %, більш переважно менше 35 %, навіть більш переважно менше 30 %, наприклад, менше 25 % вільного T2N у порівнянні з напоєм, виготовленим у такий же спосіб з ячменя дикого типу, переважно з культивару Power, після зберігання впродовж щонайменше 1 тижня, переважно щонайменше 2 тижнів, більш переважно щонайменше 3 тижнів, навіть більш переважно впродовж щонайменше 4 тижнів, при температурі в діапазоні 30-40 °C, переважно при 37 °C, наприклад, у діапазоні 1-3 місяців, наприклад, у діапазоні 3-6 місяців, наприклад, у діапазоні 6-12 місяців, наприклад, впродовж більше одного року при температурі в діапазоні 20-30 °C. Зокрема, напої відповідно до даного винаходу переважно містять дуже низькі рівні T2N, переважно менше 50 %, переважно менше 40 %, більш переважно менше 35 % вільного T2N у порівнянні з напоєм, виготовленим у такий же спосіб з ячменя дикого типу, переважно з культивару Power, після зберігання впродовж 2 тижнів при 37 °C. Напої відповідно до даного винаходу містять також переважно менше 50 ppt (частин на трильйон), навіть більш переважно менше 40 ppt, навіть більш переважно менше 30 ppt вільного T2N після зберігання впродовж 2 тижнів при 37 °C. Переважно зазначене зберігання виконують у присутності рівня сульфіту, що не перевищує 10 ppm (частин на мільйон), переважно рівня сульфіту в діапазоні 1-10 ppm, більш переважно в діапазоні 1-8 ppm, більш переважно в діапазоні 2-6 ppm, ще більш переважно в діапазоні 3-5 ppm, наприклад, 4 ppm сульфіту. Напої відповідно до даного винаходу переважно також містять менше 80 %, переважно менше 75 %, наприклад, менше 60 % вільного T2N у порівнянні з напоєм, виготовленим у такий же спосіб з LОX-1-ячменем, переважно з мутанта ячменя D112, описаного в WО 2005/087934, після зберігання впродовж 2 тижнів при 37 °C. Переважно зазначене зберігання виконують у присутності рівня сульфіту, що не перевищує 10 ppm, переважно рівня сульфіту в діапазоні 1-10 ppm, більш переважно в діапазоні 1-8 ppm, більш переважно в діапазоні 2-6 ppm, ще більш переважно в діапазоні 2-4 ppm. Ці напої (такі як пиво, наприклад, ячмінне пиво) відповідно до даного винаходу особливо переважно також містять дуже низькі рівні T2N, переважно менше 50 %, переважно менше 40 %, більш переважно менше 35 %, навіть більш переважно менше 30 %, ще більш переважно менше 25 % вільного T2N у порівнянні з напоєм, виготовленим у такий же спосіб з ячменя дикого типу, переважно з культивару Power, після зберігання впродовж 8 тижнів при 37 °C. Крім 23 UA 106597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 того, ці напої (такі як пиво, наприклад, ячмінне пиво) краще містять якнайбільше 50 ppt, навіть більш переважно якнайбільше 40 ppt, ще більш переважно якнайбільше 30 ppt, навіть більш переважно якнайбільше 20 ppt вільного T2N після зберігання впродовж 8 місяців при 37 °C. Переважно зазначене зберігання виконують у присутності рівня сульфіту, що не перевищує 10 ppm, переважно рівня сульфіту в діапазоні 1-10 ppm, більш переважно в діапазоні 1-8 ppm, більш переважно в діапазоні 1-6 ppm, ще більш переважно в діапазоні 2-4 ppm, наприклад, 3 ppm сульфіту. Напої відповідно до даного винаходу переважно також містять менше 70 %, переважно менше 60 %, навіть більш переважно менше 55 % вільного T2N у порівнянні з напоєм, виготовленим у такий же спосіб з LОX-1-ячменя, переважно з мутанта ячменя D112, описаного в WO 2005/087934, після зберігання впродовж 8 тижнів при 37 °C. Переважно зазначене зберігання виконують у присутності рівня сульфіту, що не перевищує 10 ppm, переважно рівня сульфіту в діапазоні 1-10 ppm, більш переважно в діапазоні 1-8 ppm, більш переважно в діапазоні 2-6 ppm, ще більш переважно в діапазоні 2-4 ppm. Крім того, однієї метою даного винаходу є забезпечення напоїв, таких як пиво, зроблене з використанням рослин ячменю з подвійною нуль-LOX-мутацією, що переважно містять менше 70 %, переважно менше 60 %, наприклад, менше 50 % T2N та/або потенціалу T2N, більш переважно менше 70 %, переважно менше 60 %, наприклад, менше 50 % вільного T2N, у порівнянні з напоєм, виготовленим таким же чином з мутанта ячменя D112, як описано в WO 2005/087 934, після зберігання впродовж щонайменше 1 тижня, переважно щонайменше 2 тижнів, більш переважно щонайменше 3 тижнів, навіть більш переважно впродовж щонайменше 4 тижнів при температурі в діапазоні 30-40 °C, переважно при 37 °C, наприклад, у діапазоні 1-3 місяців, наприклад, у діапазоні 3-6 місяців, наприклад, в діапазоні 6-12 місяців, наприклад, впродовж більше одного року при температурі в діапазоні 20-30 °C. Зокрема, напої (такі як пиво, наприклад, ячмінне пиво) відповідно до даного винаходу переважно містять дуже низькі рівні T2N, переважно 7 0 %, переважно менше 60 %, більш переважно менше 55 %, навіть більш переважно менше 52 % вільного T2N, у порівнянні з напоєм, виготовленим у такий же спосіб з ячменя дикого типу, переважно з культивару Power, після зберігання впродовж 8 тижнів при 37 °C. Переважно зазначене зберігання виконують у присутності рівня сульфіту, що не перевищує 10 ppm, переважно рівня сульфіту в діапазоні 1-10 ppm, більш переважно в діапазоні 1-8 ppm, більш переважно в діапазоні 1-6 ppm, ще більш переважно в діапазоні 2-4 ppm, наприклад, 3 ppm сульфіту. Переважно, напій відповідно до даного винаходу містить також у діапазоні 1-10 ppm сульфіту, більш переважно в діапазоні 2-8 ppm, більш переважно в діапазоні 3-7 ppm, ще більш переважно в діапазоні 4-6 ppm сульфіту. Напої відповідно до цього винаходу, переважно містять якнайбільше 0,07, переважно якнайбільше 0,06, більш переважно якнайбільше 0,05, навіть більш переважно якнайбільше 0,04, наприклад, якнайбільше 0,03 ppb вільного T2N після зберігання впродовж щонайменше 1 тижня, переважно щонайменше 2 тижнів, більш переважно щонайменше 3 тижнів, навіть більш переважно впродовж щонайменше 4 тижнів, наприклад, у діапазоні 1-3 місяців, наприклад, у діапазоні 3-6 місяців наприклад, у діапазоні 6-12 місяців, наприклад, впродовж більше одного року після зберігання при температурі в діапазоні 15 °C40 °C, переважно в діапазоні 30 °C-37 °C, більш переважно при 37 °C. У одному кращому варіанті здійснення даного винаходу напої відповідно до даного винаходу містять якнайбільше 0,03 ppb, переважно якнайбільше 0,025 ppb, краще якнайбільше 0,02 ppb вільного T2N після зберігання впродовж 4 тижнів при 37 °C у присутності сульфіту в діапазоні 4-6 ppm. Напої зі стабільними органолептичними якостями відповідно до даного винаходу переважно містять низькі рівні потенціалу T2N, переважно менше 40 %, більш переважно менше 30 %, навіть більш переважно менше 25 % потенціалу T2N у порівнянні з подібним напоєм, виготовленим у такий же спосіб з рослини ячменю дикого типу, переважно з культивару Power. У одному варіанті здійснення цей винахід має відношення до напоїв, таких як пиво, з низькими рівнями тригідроксиоктадеценових кислот (які також називають ТНА), зокрема, до напоїв з низькими рівнями 9,12,13-ТНА і 9,10,13-ТНА. ТНА відрізняються гірким смаком (Baur and Grosch, 1977; Baur et al., 1977) а, отже, вважаються небажаними. Бажано також, щоб рівень 9,12,13-ТНА і 9,10,13-ТНА був таким низьким, як це тільки можливо, переважно більш низьким, ніж 1,3 ppm, наприклад, більш низьким, ніж 1 ppm. Однак, загальна концентрація 9,12,13-ТНА і 9,10,13-ТНА в отриманому з солоду напої, такому як пиво, залежить також від кількості солоду, використовуваного для одержання зазначеного конкретного напою. Таким чином, зазвичай міцне пиво буде містити більше 9,12,13-ТНА і 9,10,13-ТНА, ніж більш легке, що робить більш високий загальний рівень 9,12,13-ТНА і 9,10,13ТНА прийнятним у більш міцному пиві. Таким чином, напій відповідно до даного винаходу 24 UA 106597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 містить переважно більш низький рівень 9,12,13-ТНА і 9,10,13-ТНА, ніж напій, виготовлений у такий же спосіб з ячменя дикого типу, переважно з культивару Power. Зокрема, напій відповідно до даного винаходу переважно має рівень 9,12,13-ТНА, який рівний якнайбільше 50 %, переважно якнайбільше 40 %, більш переважно якнайбільше 30 % у порівнянні з цим рівнем у напої, виготовленому в такий же спосіб з ячменя дикого типу, переважно з культивару Power. Крім того, напій відповідно до даного винаходу переважно має рівень 9,10,13-ТНА, який рівний якнайбільше 70 %, переважно якнайбільше 60 % у порівнянні з цим рівнем напою, виготовленого тим же самим способом з ячменя дикого типу, переважно з культивару Power. Такі напої можуть бути отримані з використанням ячменя з подвійною нуль-LОX-мутацією. У одному варіанті здійснення даного винаходу ці напої мають поліпшену якість піни. Це має значення, коли цей напій є пивом. Таким чином, однієї метою даного винаходу є забезпечення напоїв, таких як пиво, з чудовою якістю піни. Переважно, напої даного винаходу утворюють на 10 % більше, переважно щонайменше на 20 % більше, ще більш переважно щонайменше на 25 % більше піни за 60-80 хвилин, переважно за 80 хвилин, у порівнянні з напоєм, виготовленим у такий же спосіб з ячменя дикого типу, з культивару Power. Зазначений утворення піни визначають, як описано в прикладі 9 тут нижче. Цей винахід відноситься також до способів одержання зазначеного напою. Ці способи переважно передбачають стадії (i) забезпечення композиції солоду, що містить пророслі зерна з подвійною нуль-LOXмутацією; (ii) переробки зазначеної композиції солоду в напій; з одержанням таким чином напою з більш стабільними органолептичними якостями. У одному кращому варіанті здійснення цей напій є пивом. У цьому випадку стадія переробки переважно передбачає приготування сусла із зазначеної композиції солоду, наприклад, будьяким з описаних тут вище способів, і ферментування зазначеного сусла. Загалом, алкогольні напої, такі як пиво, можуть бути виготовлені з осолоджених та/або неосолоджених зерен ячменя. Солод, разом з висушеними шишками хмелю і дріжджами, сприяє смаку і кольору пива. Крім того, солод функціонує як джерело ферментованого цукру і ферментів. Схематичне представлення загального процесу одержання пива показане на фіг. 3, тоді як докладні описи прикладів підходящих способів для одержання солоду і пивоварства можуть бути знайдені, наприклад, у публікаціях Briggs et al. (1981) і Hough et al. (1982). Численні, способи для аналізів ячменя, солоду і продуктів пива, які регулярно модернізуться, є доступними, але не обмежуються ними, наприклад, в American Association of Cereal Chemists (1995), American Society of Brewing Chemists (1992), European Brewery Convention (1998), та Institute of Brewing (1997). Загальновизнаним є те, що для конкретного варіння пива використовують численні специфічні процедури, з найбільш важливими варіаціями, які стосуються вподобань місцевих споживачів. Будь-який такий спосіб приготування пива може бути використаний з даним винаходом. Необмежуючі приклади описано в прикладі 8 і прикладі 9. Композиція солоду вищеописаного напою такого як пиво, солодові напої або неферментоване сусло, може бути отримане, наприклад, будь-яким з описаних тут вище способів. Сусло може бути виготовлене із зазначеної композиції солоду, як описано тут вище. Перша стадія одержання пива з сусла переважно включає кип'ятіння зазначеного сусла. Під час кип'ятіння можуть бути додані інші інгредієнти, наприклад, висушені шишки хмелю, які забезпечують типові гіркі і ароматичні характеристики пива. Кип'ятіння сусла викликає також агрегацію між поліфенолами і денатурованими білками, які в основному осаджуються під час наступної фази охолодження сусла. Після охолодження сусло переносять у ферментаційні чани, що містять дріжджі. Переважно, зазначеними дріжджами є хлібопекарські дріжджі, Saccharomyces carlsbergensis. Це сусло буде ферментуватися впродовж будь-якого підходящого періоду часу, зазвичай в діапазоні 1-100 днів. Під час ферментаційного процесу, що триває кілька днів, цукор перетворюється в спирт і CO 2 одночасно з розвитком деяких смакових речовин. Потім це пиво може додатково оброблятися, наприклад, охолоджуватися. Воно може бути відфільтроване та/або витримане в лагер-танку, у процесі, який розвиває приємний запах і менше дріжджовий смак. Можуть бути також додані добавки. Крім того, може бути доданий CO 2. Нарешті, пиво може бути пастеризоване та/або відфільтроване перед упакуванням (наприклад, за допомогою розливу в пляшки або в банки для пива). Незважаючи на успіхи в галузі виробництва пива, було б кращим зменшення рівнів T2N і потенціалу T2N у пиві. Таким чином, залишається потреба в нових вихідних матеріалах, 25 UA 106597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зокрема ячменю і солоду, які сприяють зменшенню присмаків у готовому пиві. Таким чином, однієї ціллю даного винаходу є забезпечення таких рослин ячменю і солоду. Доступні різні способи для визначення, чи отримана рослина ячменя або продукт рослини з рослини ячменю, що несе мутації в генах для LOX-1 і LOX-2, що викликають повну втрату функціонального ферменту LOX-1 і повну втрату функціонального ферменту LOX-2. Продукти рослин будуть зазвичай містити щонайменше деяку кількість геномної ДНК з рослини, використовуваної для їх одержання. Так, солод буде містити більші кількості геномної ДНК, але навіть екстракти ячменю і солоду, такі як сусло, можуть містити геномну ДНК або її фрагменти з зазначеного ячменя або солоду. Напої на основі ячменя, такі як пиво, також можуть містити геномну ДНК або її фрагменти з зазначеної рослини. За допомогою аналізу ДНК у продукті рослини можна встановити, чи несе рослина, з якої отриманий продукт рослини, мутації в генах LОX-1 і LОX-2, що викликають повну втрату функціонального ферменту LОX-1 і повну втрату функціонального ферменту LОX-2. Зазначені мутації могли б бути, наприклад, будь-якою з мутацій у генах LОX-1 і LОX-2, описаних тут вище в розділі "Втрата функції активності LOX". Геномна ДНК може бути аналізована будь-яким застосовним способом, таким як секвенування, або способами на основі ампліфікації, у тому числі способами на основі ПЛР. Якщо передбачаються конкретні мутації в гені LОX-1 та/або гені LОX-2, то може бути використаний аналіз поліморфізмів, наприклад, SNP-аналіз. Такий аналіз може виконуватися, як описано тут нижче в прикладі 10. Кваліфікований фахівець буде здатний адаптувати специфічний SNPаналіз, описаний у цих прикладах, для застосування з іншими мутаціями або іншим вихідним матеріалом. Якщо вищезгадані продукти рослинного походження одержують тільки з рослин ячменя, що несуть мутації в генах для LOX-1 і LOX-2, що викликають повну втрату функціонального ферменту LОX-1 і повну втрату функціонального ферменту LOX-2, то присутність vs. відсутності мРНК LOX-1 і мРНК LОX-2 та/або білка LОX-1 і білка LОX-2 ячменя може бути також показником того, чи отриманий зазначений продукт рослини з рослини ячменю з подвійною нуль-LОXмутацією. Випробування цього продукту рослини може також виконуватися з використанням Вестерн-аналізу або іншого аналізу білків або за допомогою ОТ-ПЛР, або з використанням Нозерн-блот-аналізу, або за допомогою інших аналізів мРНК. Такі аналізи особливо застосовні, коли продуктом рослини є солод. Хімічний мутагенез Для генерування рослин ячменю з подвійною нуль-LOX-мутацією відповідно до цього винаходу, тобто рослин, що містять першу мутацію, яка призводить до повної втрати функціонального ферменту LОX-1, і другу мутацію, яка призводить до повної втрати функціонального ферменту LОX-2, готують дуже велику кількість мутантів ячменя будь-яким підходящим способом мутагенезу, наприклад, з використанням хімічного мутагенезу зерен ячменя. Відомо, що цей спосіб вводить мутації випадково. Мутагенез ячменя може виконуватися з використанням будь-якого мутагенізуючого хімікату. Однак, його виконують переважно обробкою зерен, даючи зернам, що вижили, проростати, з наступним аналізом рослин-нащадків. Генерація рослин, що виростають з цих мутагенізованих зерен, яку називають М0, містить гетерозиготні химери для будь-якої конкретної мутації. Рослини-нащадки, зібрані після самозапилення, називають генерацією M1, у якій конкретна мутація розщеплюється у відповідні гетерозиготи і гомозиготи (див. фіг. 1). Обробка зерен NaN3 не є еквівалентною обробці окремої клітини, тому що ці зерна після обробки будуть містити деяку кількість немутованих клітин і різноманітність клітин, що мають ДНК-мутації. Оскільки мутації в ряді поколінь клітин, які не приводять до зародкової лінії, будуть загублені, завданням є націлювання мутагену на невелику кількість клітин, які розвиваються в репродуктивні тканини, що сприяють розвитку генерації M1. Для оцінювання загальної ефективності мутацій можна підрахувати альбіно-химери і альбіно-рослини в генераціях М0 і M1. Оцінювання кількості мутантів як функції рослин, що виживають, дає наближену оцінку ефективності мутацій, тоді як оцінювання кількості мутантів як функції обробленого насіння визначає комбінацію як ефективності мутації, так і вбивання зерен. Примітно, що клітини мають механізми гарантії якості фактично в кожній стадії експресії генів, можливо, для пом'якшення ефектів пошкоджуючих мутацій. Одним добре дослідженим прикладом в еукаріотах є нонсенс-опосередковуваний розпад мРНК, називаний NMD, який запобігає синтезу потенційно шкідливих, передчасно вкорочених білків (Maquat and Carmichael, 2001; Wu et al., 2007). В NMD, кодон термінації ідентифікований як передчасний за його положенням щодо розташованих нижче (праворуч) за ходом транскрипції від дестабілізуючих елементів. Мутації, які генерують кодони передчасної термінації (нонсенс) (РТС), іноді збільшують рівні альтернативно сплайсованих транскриптів, які пропускають агресивні мутації, 26 UA 106597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зберігаючи тим самим потенційно функцію білка (Mendell and Dietz, 2001). Селекція рослин У одному варіанті здійснення даного винаходу ціллю є забезпечення агрономічно застосовних рослин ячменя, що містять ознаку подвійної LОX-мутації. Розвиток сільськогосподарської культури часто є тривалим і важким процесом, який починається з введення цієї нової ознаки. Однак, на підставі бачення перспективи селекціонера, ця стадія майже завжди приводить до рослини, яка має менш бажаний загальний профіль агрономічних ознак, ніж профіль існуючих комерційних сортів. Окрім ознаки подвійної нуль-LОX-мутації, є додаткові фактори, які також можуть розглядатися в галузі генерування комерційного сорту пивоварного ячменя, наприклад, врожай і розмір зерен, та інші параметри, які пов'язані з продуктивністю солодження або продуктивністю варіння пива. Оскільки було показано, що численні, якщо не всі, релевантні ознаки перебувають під генетичним контролем, даний винахід забезпечує також сучасні, гомозиготні, високоврожайні пивоварні культивари, які можуть бути отримані зі схрещувань з рослинами ячменя з подвійною нуль-LOX-мутацією, які описані в даній публікації. Зерна таких рослин ячменя забезпечують новий вихідний матеріал, що має низьку здатність генерування потенціалу T2N, тобто солод, отриманий з таких зерен, переважно має менше 50 % потенціалу T2N у порівнянні з солодом, одержуваним з LОX-1-мутанта ячменя D112, описаного в WO 2005/087934. Кваліфікований селекціонер, що виводить сорти ячменю, буде здатний селекціонувати і розвивати рослини ячменю, які після схрещувань з ячменем з подвійною нульLOX-мутацією будуть приводити до кращих культиварів. Альтернативно, селекціонер ячменя може використовувати рослини даного винаходу для подальшого мутагенезу для генерування культиварів, що походять з ячменя з подвійною нуль-LОX-мутацією. Одним способом для гарантії, що ознака подвійної нуль-LOX-мутації зберігається в лініяхнащадках, є SNP-аналіз гена LOX-1 і гена LOX-2. Переважно, визначають також активності LOX1 і LOX-2. Рослини ячменю за даним винаходом можуть вводитися в будь-яку підходящу програму селекції. Іншою ціллю даного винаходу є забезпечення сільськогосподарських елітних рослин ячменю, що містять ознаку подвійної нуль-LОX-мутації. Таким чином, цей винахід має відношення також до способів одержання нової рослини ячменю з подвійною нуль-LOXмутацією схрещуванням першої батьківської (вихідної) рослини з другою батьківською (вихідною) рослиною, де ця перша або друга рослини є ячменем з подвійною нуль-LОXмутацією. Додатково, як перша, так і друга батьківські рослини можуть походити з сорту ячменя з подвійною нуль-LОX-мутацією. Таким чином, будь-які такі способи, що використовують сорт ячменя з подвійною нуль-LOX-мутацією, є частиною цього винаходу: самозапилення, зворотне схрещування, схрещування з популяціями і т.п. Усі рослини, отримані з використанням сорту ячменя з подвійною нуль-LOX-мутацією в якості батька, підпадають під обсяг цього винаходу, у тому числі рослини, розвинені з сортів, отриманих з сорту ячменя з подвійною нуль-LОXмутацією. Ячмінь з подвійною нуль-LOX-мутацією може бути також використаний для генетичної трансформації в таких випадках, у яких екзогенну ДНК вводять у рослину і експресують у рослині або тканині рослини з подвійною нуль-LОX-мутацією. Способи зворотного схрещування можуть бути використані з даним винаходом для введення в інший культивар ознаки подвійної нуль-LОX-мутації мутованої рослини ячменю, наприклад, культивар Scarlett або культивар Jersey, обидва з яких є сучасними, високоврожайними культиварами ячменя з високопродуктивним солодженням. У одному стандартному протоколі зворотного схрещування, вихідний сорт, що представляє інтерес, тобто батьківська рослина, з якою гібрид схрещується знову, схрещують з іншим сортом (не повторюваною батьківською рослиною), що несе мутантні гени LOX, які представляють інтерес, що підлягають переносу. Потім отримані від цього схрещування рослини-нащадки з подвійною нуль-LOX-мутацією схрещують з повторюваною батьківською рослиною, причому цей процес повторюють, поки не одержують рослину ячменя, у якої по суті всі з характеристик, зазначених цим повторюваним батьком, виявляються в генерованій рослині, разом з ознакою подвійної нуль-LOX-мутації неповторюваної батьківської рослини. Зрештою, останню генеровану, отриману зворотним схрещуванням рослину самозапилюють з одержанням рослини-нащадка з подвійною нуль-LOX-мутацією чистолінійного розведення. Один шлях прискорення цього процесу розведення рослин передбачає початкове розмноження генерованих мутантів з використанням культури тканини і способів регенерації. Таким чином, іншим аспектом даного винаходу є забезпечення клітин, які після росту і диференціювання продукують рослини ячменю, що мають ознаку подвійної нуль-LOX-мутації. 27 UA 106597 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Наприклад, селекція може включати традиційні схрещування, одержання фертильних отриманих з пильовиків рослин або використання культури мікроспор. Продукти LОX-шляху У різних варіантах здійснення даний винахід має відношення до рослин ячменю та їх продуктів, що містять низькі рівні потенціалу T2N. Ферменти LOX каталізують діоксигенування поліненасичених жирних кислот системою цис-1,цис-4-пентадієну. У ячмені C18 поліненасичені Δ9,12 Δ9,12,15 жирні кислоти лінолева кислота (18:2 ) та α-ліноленова кислота (18:3 ) є основними субстратами LOX. Ліпоксигеназний шлях метаболізму жирних кислот ініціюється додаванням молекулярного кисню у положенні C-9 (в основному каталізуємим LOX-1) або положенні C-13 (в основному каталізуємим LOX-2) ацильного ланцюгу, з одержанням відповідних 9- та 13-HPODE [9- та 13-гідропероксиоктадекатриєнові кислоти (НРОТЕ) є продуктами, коли субстратом є αліноленова кислота, але НРОТЕ не функціонують як прекурсори для T2N]. У гідропероксидліазному відгалуженні шляху LOX, як 9-, так і 13-HPODE можуть розщеплюватися до оксокислот та альдегідів з коротким ланцюгом (див. фіг. 2). Зокрема, 9-HPОDE може розщеплюватися з утворенням цис-ноненалю, який перетворюється у T2N, тоді як 13-HPОDE є прекурсором 2-Е-гексеналю. Таким чином, не очікувалося, що 13-HPODE, головний продукт LOX-2-каталізуємого діоксигенування лінолевої кислоти, є компонентом, розташованим вище за ходом реакції, у шляху, що приводить до утворення затхлого присмаку T2N. Зрозуміло, що даний винахід охоплює вплив на продукування нижче за ходом процесу метаболітів каталізу LOX-1 та LOX-2, які не продукуються як прямий продукт каталізуємої LOX-1 та LOX-2 реакцією, але є результатом наступної серії реакцій. Вони включають у себе спонтанні, індуковані факторами або каталізуємі ферментами ізомеризації та перетворення. Таким чином, продукування цих метаболітів, що утворюються нижче за ходом процесу, могло б змінюватися модуляцією експресії інших компонентів цього шляху, наприклад, гідропероксидліази (HPL). Потенціал Т2Н Важливою метою даного винаходу є зменшення або елімінація потенціалу T2N. Таким чином, метою даного винаходу є зменшення утворення прекурсорів T2N та альдегідних адуктів. Хоча кілька хімічних реакцій, що відносяться до набуття затхлості пива, є неясними, генерування вільного T2N з потенціалу T2N визнається головною причиною появи затхлого присмаку у пивних продуктах (Kuroda et al., supra). Таким чином, метою даного винаходу є забезпечення напоїв з низьким рівнем потенціалу T2N, а також напоїв з низьким рівнем прекурсорів T2N. Більша частина потенціалу T2N переноситься з сусла у готове пиво, у яке може вивільнятися вільний T2N (Liegeois et al., 2002), причому умови кислотності та температури, є важливими факторами у цьому процесі. З посиланням на даний винахід, потенціал T2N визначається, як описано тут вище у визначеннях. Щоб уникнути плутанини, значення "потенціалу T2N" у даному контексті є таким, як описане тут вище у визначеннях. Хімічні речовини, які мають здатність вивільнення T2N або перетворення у T2N, називаються тут "прекурсорами T2N", та прекурсори T2N, обумовлені або вимірювані альтернативними способами, іншими, ніж спосіб визначення потенціалу T2N, називаються "прекурсорами T2N". Прекурсори T2N можуть бути, зокрема, визначені обробкою проби спочатку таким чином, що по суті всі (переважно всі) з її хімічних речовин, які здатні вивільняти T2N або перетворюватися у T2N, дійсно вивільняють T2N та/або перетворюються у T2N, відповідно. Після цього визначають рівень T2N. Зерна ячменю даного винаходу не містять активності LOX-1 та LOX-2. Цікаво, що такі зерна ячменю містять дуже малий потенціал T2N. Таким чином, пиво, отримане з використанням зерен ячменю з подвійною нуль-LOXмутацією, мають не тільки дуже низький рівень T2N, але також дуже низький рівень потенціалу T2N. У обсязі даного винаходу знаходяться зерна ячменю з подвійною нуль-LOX-мутацією, які дають отримані з пива продукти, які містять дуже низькі рівні потенціалу T2N, переважно менше 40 %, більш переважно менше 30 %, навіть більш переважно менше 25 % рівня потенціалу подібного отриманого з пива продукту, одержуваного тим же самим чином з ячменю дикого типу (переважно культивару Power). Таким чином, зазначений отриманий з пива продукт переважно містить менше 60 %, більш переважно менше 50 % потенціалу T2N подібного отриманого з пива продукту, отриманого у такий же спосіб з мутанту ячменю D112, описаного у WO 2005/087 934. Продукти рослини, отримані з зерен ячменю з подвійною нуль-LOX-мутацією, також переважно мають дуже низький рівень прекурсорів T2N. У обсязі даного винаходу знаходяться продукти рослинного походження, виготовлені з зерен ячменю з подвійною нуль-LOX-мутацією, причому зазначені продукти рослинного походження містять менше 40 %, більш переважно 28