Ячмінь з низьким вмістом гордеїнів та спосіб виробництва продукту харчування або напою на основі солоду

Реферат: Винахід належить до способу виробництва продукту харчування або напою на основі солоду, що включає змішування зерна ячменю або солоду, борошна або цільнозернового борошна, одержаних зі вказаного зерна щонайменше з одним іншим компонентом продукту харчування або напою, з одержанням харчового продукту, або напою на основі солоду, причому зерно одержане із рослини, яка є гомозиготною щонайменше за двома локусами для генетичних варіацій, які являють собою алель, в якому видалена більша частина або всі гени, що кодують B-гордеїн, в локусі Hor2, і мутантний алель у локусі Lys3 ячменю, що забезпечує знижений вміст щонайменше двох гордеїнів порівнянно із рослиною ячменю дикого типу, що містить повний набір функціональних гордеїнових генів, що кодують функціональні білки гордеїнів, так, що вказане зерно, солод, борошно або цільнозернове борошно містять близько 15 % або менше від вмісту гордеїнів у зерні від відповідної рослини ячменю дикого типу або в солоді, борошні або цільнозерновому борошні, одержаних аналогічним способом із зерна відповідної рослини ячменю дикого типу. UA 101480 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується способів одержання продуктів харчування або напоїв на основі солоду, придатних для споживання особою, яка страждає на целіакію. Зокрема, даний винахід стосується способів одержання продуктів харчування або напоїв на основі солоду з низьким вмістом гордеїнів. Також пропонуються рослини ячменю, що дають зерно, яке може застосовуватися у способах винаходу. Целіакія (глютенова ентеропатія) (CD, яка називається також целіакія-спру) є опосередкованим Т-клітинами аутоімунним захворюванням тонкої кишки, що викликається у сприйнятливих людей при споживанні в їжу визначених запасних білків, відомих загалом як проламіни, з пшениці (глютену, що складається з глютенінів і гліадинів), ячменю (гордеїнів) або жита (секалінів). Проламіни вівса (авеніни), очевидно, переносяться більшістю хворих на целіакію (Hogberg et al., 2004; Peraaho et al, 2004a), однак, у меншого числа хворих на целіакію вони можуть викликати позитивні реакції (Lundin et al. 2003; Peraaho et al. 2004b). CD зустрічається у приблизно 0,25-1 % населення, щонайменше, в Австралії, Північній і Південній Америці, Європі, Африці та Індії (Hovell et al. 2001; Fasano et al. 2003; Treem 2004), однак, дане захворювання, ймовірно, діагностується на недостатньому рівні. Збільшення інформованості з приводу симптомів і наслідків випадків CD, які не піддавалися лікуванню, в Австралії приводить до підвищення кількості випадків, що діагностуються, на 15 % щорічно. Приблизно 1-4 європейця і жителя західної Азії мають алелі HLA-DQ8 або -DQ2, які є необхідною, але не достатньою детермінантою CD (Treem 2004). При цьому лише у приблизно 1-20 людей з даними алелями розвивається CD. У наш час єдиним лікуванням є повна відмова від пшениці, ячменю і жита, оскільки рецидиви можуть бути викликані споживанням всього лише 10 міліграмів глютену на день (Biagi et al., 2004). У випадку невиявлення захворювання або відсутності лікування, CD призводить до серйозних наслідків для здоров'я, які можуть загрожувати життю, особливо у дітей першого року життя. CD викликає деформацію абсорбуючих ворсинок тонкої кишки і може приводити до руйнування ворсинок. У результаті поживні речовини погано всмоктуються, причому це може бути пов'язано з втратою ваги, втомою, мінеральною недостатністю, дерматитом і втратою нічного зору, а також інтенсивним кишковим розладом, який звичайно включає здуття, діарею і спазми. Особи з нелікованою CD піддаються підвищеному ризику розвитку раку, наприклад, 10кратному підвищенню ризику виникнення карциноми тонкої кишки, 3-6-кратному підвищенню ризику виникнення неходжкінської лімфоми і 28-кратному підвищенню ризику виникнення Тклітинної лімфоми кишечнику. CD також представляє 3-кратне підвищення ризику розвитку діабету I типу (Peters et al., 2003; Verkarre et al., 2004). Також повідомляли про п'ятикратне підвищення частоти психічної депресії у пацієнтів з целіакією (Pynnonen et al., 2004). Молекулярна основа целіакії у наш час досить добре вивчена (Sollid 2002; Hadjivassiliou et al. 2004) і являє собою реакцію на визначену послідовність амінокислот у проламінах. Погано перетравлені пептиди проламінів, багаті на пролін і глутамін, відповідають субстратному мотиву, з яким у слизовій оболонці кишечнику взаємодіє тканинна трансглутаміназа (tTG) людини, яка дезамідує ключові залишки глутаміну. Негативно заряджена глутамінова кислота, що утворюється у результаті, дозволяє дезамідованому проламіну зв'язуватися зі специфічним класом молекул HLA (DQ2 або DQ8) (Kim et al. 2004). Стимулюється проліферація специфічних + клонів Т-клітин, так званих DQ2 (8)/Т-клітин, що несуть CD4 , направлених на ендотелій кишечнику, які секретують лімфокіни, що викликають атрофію кишкових ворсинок або вироблення антитіл (Hadjivassiliou et al. 2004). Вказані клони Т-клітин досягають максимальної концентрації у периферичній крові хворих на целіакію приблизно через шість днів після харчової провокації (Anderson et al. 2000). Токсичність очищених білків при целіакії, таким чином, може бути точно і специфічно визначена шляхом вимірювання їх здатності стимулювати Т-клітини до вироблення IFN-γ - цитокіну, який є основним у патогенезі ентеропатії, що спостерігається при целіакії. Тому ймовірно, що захворювання викликається імунною системою хазяїна, яка реагує на проламіни, формуючи потужну імунну відповідь, як якби вони були скоріше патогеном, ніж алергеном. Глютен пшениці складається з багатьох сотень різних, але споріднених білків, включаючи мономерні гліадини і полімерні глютеніни. Гліадини складають приблизно половину глютенової фракції, при цьому α-гліадини складають більше 50 % гліадинів (Wieser et al., 1994; Gellrich et al., 2003). До нашого часу більшість даних стосовно токсичності при целіакії була зосереджена на α-гліадині - першому клонованому і повністю відсеквенованому проламіні (Kasarda et al., 1984). Токсичність α-гліадину пшениці при целіакії значною мірою визначається одним залишком глутаміну у межах ключового епітопу довжиною 17 амінокислот (Arentz-Hansen et al., 2000; Anderson et al., 2000; Shan et al., 2002). Були ідентифіковані природні і синтетичні пептиди, що несуть точкові мутації у даній області, які не були токсичними (Vader et al., 2003). Таким 1 UA 101480 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 чином, здається можливим, що можуть бути ідентифіковані інші нетоксичні, але функціональні проламінові молекули. У даний момент практичний прогноз токсичності при целіакії обмежується невеликою фракцією проламінів, які були описані по амінокислотній послідовності або нуклеотидній послідовності генів, що кодують їх. Ячмінь являє собою диплоїдну злакову культуру, яку широко вирощують у зонах з більш прохолодним кліматом для виробництва напоїв і продуктів харчування. Білки насіння ячменю поділяються на альбумін, глобулін, проламін (гордеїн) і глютелін в залежності від їх розчинності у воді, розчині солі, водному розчині спирту, а також у лужних або кислотних розчинах, відповідно. Приблизно половина запасних білків насіння в ячмені присутня у проламіновій фракції. Дані проламіни, передусім, є запасними білками, які служать як джерела вуглецю, азоту або сірки для зростання і розвитку після проростання. Гордеїн складає приблизно 40 % білка насіння, хоча це залежить від забезпечення рослини азотом у процесі зростання. Локуси, що кодують проламіни ячменю, були характеризовані головним чином завдяки їх внеску в якість ячмінного солоду, а також у піноутворення і каламутність у виробництві пива. В ячмені присутні чотири класи проламінів - В, С, D і γ-гордеїни, що кодуються локусами Hor2, Hor1, Hor3 і Hor5, відповідно, на хромосомі 1H (Shewry et al. 1999). Вказані локуси кодують білки, які варіюють від одного проламіну (наприклад, D гордеїн) до сімейств білків, що містять 20-30 членів (наприклад, В і С гордеїни). В і С гордеїни зустрічаються відносно частіше, включаючи приблизно 70 % і 24 % від загальної кількості гордеїнів, відповідно. D і γ-гордеїни представляють мінорні компоненти, приблизно по 2-4 % кожний. Молекулярна маса гордеїнів змінюється приблизно від 35 кДа до 100 кДа. Яких-небудь проламінів ячменю, які мають близьку гомологію з α-гліадинами пшениці, немає, однак загальновідомо, що гордеїни токсичні для хворих на целіакію (Williamson & Marsh 2000). Стосовно ступеню, в якому окремі гордеїни ячменю стимулюють CD, не повідомляли. Пиво є широко споживаним продуктом, що виробляється з солодженого ячменю, тому пиво, як широко припускається, не підходить для хворих на целіакію і, як правило, виключене з їх дієти. Kanerva et al. (2005) змогли ідентифікувати проламіни у низьких рівнях у всіх сортах з множини сортів пива, крім одного. Лікарі і дієтологи звичайно переконують своїх пацієнтів з CD намагатися уникати споживання будь-яких продуктів, що містять пшеницю, ячмінь або жито, включаючи пиво. У США визначення FDA "не містить глютену" вимагає, щоб продукт був зроблений тільки з сировини, що не містить глютену, тобто такої, яка взагалі не містить пшениці, ячменю або жита. Кодекс аліментаріус допускає помітку "не містить глютену" на харчових продуктах, що містять не більше 200 м.ч. глютену (0,2 г на кілограм або літр), це також відповідає європейському стандарту для продуктів, які "не містять глютену". Більшість хворих на целіакію може споживати приблизно до 10 мг глютену на день без розвитку основного ефекту (Thompson, 2001). Проламіни, токсичні для пацієнтів з целіакією, можна специфічно виявити за допомогою імуноаналізів, таких як ELISA (Ellis et al., 1990; Sorell et al., 1998). Дані аналізи базуються на специфічній взаємодії між білком і антитілом. Також використовували електрофорез у поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію (ДСН-ПААГ) і ВЕРХ (Kanerva et al., 2005; Marchylo et al., 1986; Sheehan and Skerritt, 1997). Таким чином, існує потреба в ячмені зі значно нижчим вмістом CD-індукуючих гордеїнів, який може застосовуватися у продуктах харчування і напоях, призначених для осіб, схильних до ризику розвитку CD. Суть винаходу В ячмені присутні чотири класи проламінів - В, С, D і γ-гордеїни, що кодуються локусами Hor2, Hor1, Hor3 і Hor5, відповідно. Автори даного винаходу виявили, що, щонайменше, В, С і D класи викликають небажані запальні відповіді у осіб з целіакією. Тоді як раніше були ідентифіковані різні мутанти ячменю з продукуванням визначених класів гордеїнів у зменшених рівнях, також спостерігали, що це, щонайменше, компенсувалося збільшеним продукуванням гордеїнів інших класів. Це дозволяє припустити, що насіння ячменю має компенсаційні механізми, які забезпечують визначені рівні гордеїнів, необхідні для того, щоб насіння було життєздатним. Несподівано автори даного винаходу визначили, що велику частину, якщо не всю кількість, гордеїнів, що виробляються в ячмені, можна видалити і одержати при цьому життєздатне насіння, яке здатне проростати і давати рослини ячменю у польових умовах, незважаючи на втрату основної запасної форми азоту у насінні. Вказане насіння зокрема корисне для виробництва продуктів харчування і напоїв, придатних для споживання особами, які страждають на целіакію. Таким чином, в одному аспекті даний винахід забезпечує спосіб одержання продукту харчування або напою на основі солоду, що включає змішування зерна ячменю або солоду, 2 UA 101480 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 борошна або непросіяного борошна, одержаного з вказаного зерна, з щонайменше іншим компонентом продукту харчування або напою, причому зерно, солод, борошно або непросіяне борошно містить близько 25 % або менше від вмісту гордеїнів у зерні, від відповідної рослини ячменю дикого типу, або солоді, борошні або непросіяному борошні, одержаному аналогічним шляхом із зерна, яке одержують з відповідної рослини ячменю дикого типу, з одержанням у результаті продукту харчування або напою на основі солоду. Переважно, зерно, солод, борошно або непросіяне борошно містить близько 15 % або менше, близько 10 % або менше, близько 7,5 % або менше, близько 5 % або менше або, більш переважно, близько 2,5 % або менше від вмісту гордеїнів у зерні відповідної рослини ячменю дикого типу, або солоді, борошні або непросіяному борошні, одержаних аналогічним шляхом із зерна дикого типу. Приклади рослини ячменю дикого типу включають, крім інших, Bomi, Sloop, Carlsberg II, K8 або L1. В іншому варіанті здійснення зерно містить близько 25 % або менше, близько 20 % або менше, близько 15 % або менше, близько 10 % або менше, близько 7,5 % або менше, близько 5 % або менше або, більш переважно, близько 2,5 % або менше від вмісту В, С і/або D гордеїнів або будь-яких комбінацій перерахованого у зерні відповідної рослини ячменю дикого типу. Солод, борошно або непросіяне борошно можуть включати аналогічний ступінь зниження рівня гордеїнів В, С і/або D, або будь-яких комбінацій перерахованого. В іншому варіанті здійснення борошно містить менш ніж близько 0,4 %, менш ніж близько 0,3 %, менш ніж близько 0,2 % і, більш переважно, менш ніж близько 0,1 % гордеїнів. Рівні гордеїну у борошні, одержаному з вказаного зерна, можуть бути визначені за допомогою будьякого методу, відомого у рівні техніки, такого як спиртове фракціонування. В одному з варіантів здійснення зерно має середню вагу (сер. вага 100 зерен), щонайменше, близько 2,4 г. Переважно, зерно має середню вагу від близько 2,4 до близько 6 г, більш переважно, середню вагу від близько 3,5 до близько 6 г. В іншому варіанті здійснення вміст крохмалю у зерні складає, щонайменше, приблизно 50 % (за вагою). Більш переважно, вміст крохмалю у зерні складає від приблизно 50 % до приблизно 70 % (за вагою). Вміст крохмалю може бути визначений з використанням будь-якої методики, відомої у рівні техніки. Наприклад, може застосовуватися спосіб, наведений у Прикладі 4. У наступному варіанті здійснення токсичність при целіакії борошна, одержаного із зерна, складає менш ніж приблизно 50 %, менш ніж приблизно 25 %, більш переважно, приблизно 10 % або менше, від відповідного показника борошна, одержаного із зерна відповідної рослини ячменю дикого типу. Токсичність при целіакії може бути визначена, використовуючи будь-яку техніку, відому у рівні техніки. Наприклад, може застосовуватися спосіб, наведений у Прикладі 1. У ще одному варіанті здійснення солод, одержаний із зерна, містить менш ніж приблизно 200 м.ч. гордеїнів, менш ніж приблизно 125 м.ч. гордеїнів, більш переважно, менш ніж приблизно 75 м.ч. гордеїнів. Вміст гордеїну також може бути визначений за допомогою будьякого методу, відомого у рівні техніки. Наприклад, може застосовуватися спосіб, наведений у Прикладі 7. В іншому варіанті здійснення, щонайменше, приблизно 50 % геному зерна ячменю ідентичні геному ячменю сорту Sloop. Переважно, зерно одержане з рослини, яка є гомозиготною, щонайменше, по одному, щонайменше, по двох, щонайменше, по трьох або більше локусах для генетичної варіації (варіацій), яка приводить до зниженого вмісту гордеїну, щонайменше, одного, щонайменше, двох або всіх трьох класів В, С і D, у порівнянні з відповідною рослиною ячменю дикого типу. Більш переважно, вказані генетичні варіації являють собою алелі, в яких видалена більша частина або всі гени, що кодують В-гордеїн, у локусі Hor2, і/або мутантний алель у локусі Lys3 ячменю. В одному варіанті здійснення зерно одержане з нетрансгенної рослини. Наприклад, зерно може бути одержане внаслідок схрещування між Riso 56 і Riso 1508 або їх потомства, що включають мутації Hor2 і Lys3, відповідно, присутні у вказаних батьківських лініях. Переважно, такі рослини, одержані внаслідок схрещування, включають генетичний фон, по суті відмінний від Riso 56 або Riso 1508, наприклад, що містить менш ніж приблизно 25 % генетичного фону вказаних батьківських ліній. В іншому варіанті здійснення зерно одержане з трансгенної рослини. Одним з варіантів здійснення трансгенної рослини є рослина, яка включає трансген, що кодує полінуклеотид, який придушує продукування, щонайменше, одного гордеїну у зерні. Переважно, полінуклеотид даного варіанту здійснення є антисмисловим полінуклеотидом, смисловим полінуклеотидом, 3 UA 101480 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 каталітичним полінуклеотидом, штучною мікроРНК або РНК дуплексом, які придушують експресію одного або, переважно, декількох генів, що кодують гордеїни. Іншим варіантом здійснення трансгенної рослини є рослина, яка включає трансген, що кодує проламін, який менш токсичний, або переважно нетоксичний, для особи, яка страждає на целіакію. Приклад проламіну, що є нетоксичним для особи, яка страждає на целіакію, включає, крім іншого, авеніни вівса і зеїни кукурудзи. В одному з варіантів здійснення спосіб включає одержання із зерна борошна або непросіяного борошна. В особливо переважному варіанті здійснення спосіб додатково включає солод, одержаний із зерна. У варіанті здійснення спосіб додатково включає фракціонування висушеного, пророщеного зерна на дві або більше з фракції ендосперму, фракції ендотеліального шару, фракції лузги, фракції зародків і фракцій солодових паростків; а також комбінування і змішування заданої кількості двох або більше фракцій. Що стосується виробництва солоду і пива, важливим компонентом насіння ячменю є крохмаль. При цьому рівні крохмалю у мутантах ячменю зі зменшеним вмістом гордеїнів, як було показано раніше, знижені, що може привести до того, що насіння буде непридатним для виробництва солоду і пива. Автори винаходу, зокрема, несподівано виявили, що насіння ячменю, в якому більша частина, якщо не вся кількість, гордеїну, що продукується, була видалена, можуть використовуватися для виробництва солоду і пива з придатними властивостями для комерційного виробництва. Таким чином, у найбільш переважному варіанті здійснення напоєм на основі солоду є пиво або віскі, причому спосіб включає пророщування зерна. В одному з варіантів здійснення напоєм на основі солоду є пиво, яке містить, щонайменше, близько 2 %, більш переважно, щонайменше, близько 4 % спирту. Переважно, спирт є етанолом. У ще одному варіанті здійснення напоєм на основі солоду є пиво, яке містить менш ніж близько 1 м.ч. гордеїнів. У наступному варіанті здійснення, щонайменше, приблизно 50 % зерна проростає протягом 3 днів після бубнявіння у стандартних умовах, що використовуються при солодженні. Приклади продуктів харчування, які можуть бути вироблені із застосуванням способів винаходу, включають, крім інших, борошно, крохмаль, дріжджовий або бездріжджовий хліб, пасту, локшину, корм для тварин, готові сніданки (пластівці), закусочні харчові продукти, пироги, солод, борошняні кондитерські вироби або продукти харчування, що містять соуси на основі борошна. Переважно, продукт харчування або напій на основі солоду призначений для споживання людиною. В іншому переважному варіанті здійснення після вживання продукту харчування або напою, щонайменше, один симптом целіакії не розвивається у особи з вказаним захворюванням. В іншому аспекті даний винахід забезпечує спосіб одержання продукту харчування або напою на основі солоду, який включає змішування солоду, що включає один або більше білків зерна ячменю і менш ніж приблизно 200 м.ч. гордеїнів, і/або борошна, що включає один або більше білків зерна ячменю і менш ніж приблизно 0,4 % гордеїнів, щонайменше, з одним іншим компонентом продукту харчування або напою, з одержанням у результаті продукту харчування або напою на основі солоду. В одному з варіантів здійснення спосіб включає одержання солоду і/або борошна. У ще одному аспекті даний винахід забезпечує спосіб одержання продукту харчування або напою на основі солоду, що включає змішування зерна ячменю або солоду, борошна або непросіяного борошна, одержаного з вказаного зерна, щонайменше, з одним іншим компонентом продукту харчування або напою, з одержанням у результаті продукту харчування або напою на основі солоду, де борошно, одержане із зерна, містить менш ніж приблизно 0,4 % гордеїнів, і/або солод, одержаний із зерна, містить менш ніж приблизно 200 м.ч. гордеїнів. В одному з варіантів здійснення спосіб включає одержання солоду і/або борошна. В іншому аспекті даний винахід забезпечує рослину ячменю, з якої одержують зерно, що включає приблизно 25 % або меншу кількість гордеїнів, від рівня у зерні, одержаному з відповідної рослини ячменю дикого типу. Переважно, зерно містить близько 15 % або менше, близько 10 % або менше, близько 7,5 % або менше, близько 5 % або менше, або, більш переважно, близько 2,5 % або менше гордеїнів, від вмісту у зерні від відповідної рослини ячменю дикого типу. Приклади рослини ячменю дикого типу включають, крім інших, Bomi, Sloop, Carlsberg II, K8 або L1. 4 UA 101480 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В іншому варіанті здійснення зерно містить близько 25 % або менше, близько 20 % або менше, близько 15 % або менше, близько 10 % або менше, близько 7,5 % або менше, близько 5 % або менше, або, більш переважно, близько 2,5 % або менше від вмісту В, С і/або D гордеїнів, або будь-яких комбінацій перерахованого, у зерні від відповідної рослини ячменю дикого типу. В іншому варіанті здійснення борошно, одержане із зерна, містить менш ніж близько 0,4 %, менш ніж близько 0,3 %, менш ніж близько 0,2 % і, більш переважно, менш ніж близько 0,1 % гордеїнів. У варіанті здійснення зерно має середню вагу (сер. вага 100 зерен), щонайменше, близько 2,4 г. Переважно, зерно має середню вагу від близько 2,4 г до близько 6 г, більш переважно, середню вагу від близько 3,5 г до близько 6 г. В іншому варіанті здійснення вміст крохмалю у зерні складає, щонайменше, близько 50 % (за вагою). Більш переважно, вміст крохмалю у зерні складає від близько 50 % до близько 70 % (за вагою). У наступному варіанті здійснення токсичність при целіакії борошна, одержаного із зерна, складає менш ніж приблизно 50 %, менш ніж приблизно 25 %, більш переважно, приблизно 10 % або менше, від рівня токсичності борошна, одержаного із зерна відповідної рослини ячменю дикого типу. У ще одному варіанті здійснення солод, одержаний із зерна, містить менш ніж близько 200 м.ч. гордеїнів, менш ніж близько 125 м.ч. гордеїнів, більш переважно, менш ніж близько 75 м.ч. гордеїнів. В іншому варіанті здійснення, щонайменше, близько 50 % геному зерна ячменю ідентичні геному сорту ячменю Sloop. Переважно, зерно одержане з рослини, яка є гомозиготною, щонайменше, по одному, щонайменше, по двох, щонайменше, по трьох або більше локусах для генетичної варіації (варіацій), яка приводить до зниження рівня гордеїну, щонайменше, одного, щонайменше, двох або всіх трьох класів В, С і D, у порівнянні з рівнем у відповідній рослині ячменю дикого типу. В одному варіанті здійснення зерно одержане з нетрансгенної рослини. Наприклад, зерно може бути одержане внаслідок схрещування Riso 56 і Riso 1508 або їх потомства, що включають мутації Hor2 і Lys3, відповідно, присутні у вказаних батьківських лініях. Переважно, таке зерно включає генетичний фон, по суті відмінний від Riso 56 або Riso 1508, наприклад, що містить менш ніж приблизно 25 % генетичного фону вказаних батьківських ліній. В іншому варіанті здійснення зерно одержане з трансгенної рослини. Один з варіантів здійснення трансгенної рослини є рослиною, яка включає трансген, що кодує полінуклеотид, який придушує продукування у зерні, щонайменше, одного гордеїну. Переважно, полінуклеотид даного варіанту здійснення є антисмисловим полінуклеотидом, смисловим полінуклеотидом, каталітичним полінуклеотидом, штучною мікроРНК або РНК дуплексом, які придушують експресію одного або, переважно, декількох генів, що кодують гордеїни. Іншим варіантом здійснення трансгенної рослини є рослина, яка включає трансген, що кодує проламін, який менш токсичний, переважно нетоксичний для особи з целіакією. Приклад проламіну, який є нетоксичним для особи з целіакією, включає, крім інших, авенін вівса. У наступному варіанті здійснення, щонайменше, приблизно 50 % зерна проростає протягом 3 днів після бубнявіння у стандартних умовах, які використовуються при солодженні. В іншому аспекті даний винахід забезпечує рослину ячменю, з якої одержують зерно, де борошно, одержане із зерна, включає менш ніж приблизно 0,4 % гордеїнів, і/або солод, одержаний із зерна, включає менш ніж приблизно 200 м.ч. гордеїнів. В іншому аспекті даний винахід забезпечує зерно рослини ячменю відповідно до винаходу. У наступному аспекті даний винахід забезпечує спосіб одержання зерна ячменю, що включає: a) вирощування рослини ячменю винаходу, b) збір врожаю зерна, і c) можливо, обробку зерна. Переважно, рослини вирощують у комерційному масштабі у польових умовах. Наприклад, в одному варіанті здійснення спосіб включає вирощування, щонайменше, 1000, більш переважно, щонайменше, 5000 рослин у полі на площі, щонайменше, один гектар. Також пропонується спосіб одержання борошна, непросіяного борошна, крохмалю або іншого продукту, одержаного із зерна, що включає: a) одержання зерна винаходу, і 5 UA 101480 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 b) обробку зерна для одержання борошна, непросіяного борошна, крохмалю або іншого продукту. В іншому аспекті даний винахід забезпечує продукт, одержаний з рослини ячменю винаходу або зерна винаходу. В одному з варіантів здійснення продукт є продуктом харчування або напоєм на основі солоду. Переважно напій на основі солоду є пивом або віскі. В іншому варіанті здійснення продукт є нехарчовим продуктом, що переважно включає крохмаль або складається, щонайменше, з приблизно 50 % крохмалю. Приклади включають, крім іншого, плівки, покриття, клеючі матеріали, папір, будівельні матеріали і пакувальні матеріали, або продукти, що не містять крохмалю, такі як етанол. У ще одному аспекті даний винахід забезпечує продукт харчування або напій на основі солоду, вироблений із застосуванням способу винаходу. В одному з варіантів здійснення напій на основі солоду є пивом, яке включає, щонайменше, приблизно 2 %, більш переважно, щонайменше, приблизно 4 % спирту. Переважно, спирт є етанолом. У ще одному варіанті здійснення напій на основі солоду є пивом, яке включає менш ніж приблизно 1 м.ч. гордеїнів. В іншому аспекті даний винахід забезпечує пиво, що включає один або більше білків зерна ячменю і менш ніж приблизно 1 м.ч. гордеїнів. В одному з варіантів здійснення пиво містить менш ніж приблизно 0,5 м.ч. гордеїнів. Переважно пиво включає, щонайменше, приблизно 2 %, більш переважно, щонайменше, приблизно 4 % спирту. Переважно спирт є етанолом. Приклади білків зерна ячменю включають, крім інших, 9 кДа білок перенесення ліпідів 1 ячменю (LTP1) і білок Z. В іншому аспекті даний винахід забезпечує борошно, що включає один або більше білків зерна ячменю і менш ніж приблизно 0,4 % гордеїнів. В одному з варіантів здійснення борошно включає менш ніж приблизно 0,3 %, менш ніж приблизно 0,2 % і, більш переважно, менш ніж приблизно 0,1 % гордеїнів. Переважно борошно включає менш ніж приблизно 7 мг, більш переважно, менш ніж приблизно 5 мг спирторозчинного білка/г сухої ваги борошна. У ще одному аспекті даний винахід забезпечує солод, що включає один або більше білків зерна ячменю і менш ніж приблизно 200 м.ч. гордеїнів. В одному з варіантів здійснення солод включає менш ніж приблизно 125 м.ч. гордеїнів, більш переважно, менш ніж приблизно 75 м.ч. гордеїнів. В іншому аспекті даний винахід забезпечує спосіб ідентифікації зерна ячменю, яке може використовуватися для одержання продукту харчування і/або напою на основі солоду, придатного для вживання особою з целіакією, що включає: a) одержання одного або декількох наведених нижче матеріалів: i) зразка з рослини, здатної давати вказане зерно, ii) зерна, iii) солоду, одержаного із зерна, і/або iv) екстракту вказаного зерна, b) аналіз матеріалу стадії a) на наявність, щонайменше, одного гордеїну і/або, щонайменше, одного гена, що кодує гордеїн, де, чим більша кількість гордеїнів, продукованих у зерні, тим зерно менше підходить для виробництва продукту харчування і/або напою на основі солоду, придатного для вживання особою з целіакією. У варіанті здійснення зразок є зерном, а стадія b) включає аналіз матеріалу на наявність гордеїнів В і/або C. Це може бути виконано з використанням будь-якого методу, відомого у рівні техніки, наприклад, з використанням імунологічного методу, такого як аналіз ELISA. Може застосовуватися спосіб, описаний у Прикладі 1. В одному з варіантів здійснення стадія b) включає пероральне введення матеріалу зі стадії a) особі з целіакією і визначення імунореактивності Т-клітин, одержаних у особи, стосовно одного або декількох гордеїнів ячменю. В іншому варіанті здійснення матеріал зразка стадії a) включає геномну ДНК, а стадія b) включає виявлення відсутності одного або декількох функціональних генів гордеїнів. Знову ж, це може бути виконано з використанням будь-якого методу, відомого у рівні техніки, наприклад, виконуючи стадію ампліфікації гена, як описано у Прикладі 9. В одному з варіантів здійснення спосіб включає стадію селекції рослини ячменю, зерна або солоду відповідно до винаходу з множини зразків рослин, зерна або солоду для культивування 6 UA 101480 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або застосування. Така селекція базується, безпосередньо або опосередковано, на зменшеній токсичності матеріалу при целіакії. В іншому аспекті даний винахід забезпечує спосіб профілактики або зниження частоти або тяжкості целіакії у особи, що включає пероральне введення особі продукту харчування або напою на основі солоду винаходу, або зерна винаходу. Частота або тяжкість захворювання у даному контексті, як розуміють, знижені відносно введення рівної кількості продукту харчування або напою, приготованого з ячменю дикого типу. Продукт харчування або напій можуть застосовуватися для забезпечення поживними речовинами, або підвищеною кількістю поживних речовин, особи, яка страждає на целіакію, зменшуючи при цьому ризик провокування симптомів захворювання. В іншому аспекті даний винахід передбачає застосування продукту харчування або напою на основі солоду винаходу, або зерна винаходу, з метою виробництва лікарського засобу, призначеного для перорального введення особі поживних речовин, запобігаючи або зменшуючи у той же час частоту або тяжкість целіакії. Як очевидно, переважні ознаки і особливості одного з аспектів винаходу застосовні до будьякого іншого аспекту винаходу. У всьому тексті даного опису слово "включає", або такі варіації як "що включає", потрібно розуміти як включення вказаного елемента, цілого числа або стадії, або групи елементів, цілих чисел або стадій, а не виключення якого-небудь іншого елемента, цілого числа або стадії, або групи елементів, цілих чисел або стадій. Далі винахід описаний за допомогою необмежувальних Прикладів з посиланням на супровідні ілюстрації. Короткий опис супровідних ілюстрацій Фіг. 1: Зворотно-фазова FPLC сумарного екстракту проламінів, на якій показані хроматограми A280 нм пшениці (a), ячменю (b), вівса (с); кукурудзи (d) або чистий градієнт (е). Наносили проламіни, еквівалентні 0,2 г борошна. Показаний окиснений ДТТ (DTTox); хроматограми були зведені для ясності. Фіг. 2: Зворотно-фазова FPLC гордеїнів. На репрезентативній хроматограмі показані A280 нм (суцільна лінія) і суміш розчинників (пунктирна лінія) у ході виділення гордеїнової фракції 1 (#1), 2 (#2), 3 (#3), 4 (#4), 5 (#5), або 6 (#6) з екстракту ячменю. Вказані фракції були об'єднані, як показано (жирна лінія), з послідовних введень проб. Фіг. 3: Аналіз 20 мкг гордеїнових фракцій #1-6 за допомогою електрофорезу у ДСН-ПААГ, гель забарвлений 0,06 % Coomassie Blue G250. На лівій доріжці вказане положення стандартів молекулярної маси (у кДа, BenchMark, Invitrogen). Фіг. 4: Стимуляція вироблення IFN-γ у Т-клітинах, виділених у хворих на целіакію через шість днів після дієтичної провокації, сумарними препаратами проламінів, приготованими з ячменю, пшениці, вівса або кукурудзи у присутності (-, n=21) або за відсутності (о, n=13) попередньої обробки tTG. IFN-γ позитивні колонії були підраховані і представлені як середнє SFU ± SE. Планки погрішностей не показували, коли SE було меншим, ніж символи. Фіг. 5: Стимуляція вироблення IFN-γ у Т-клітинах, виділених у хворих на целіакію через шість днів після дієтичної провокації гордеїновими фракціями #1, 2, 3, 4, 5 і 6, у присутності (-, n=21) або за відсутності (о, n=13) попередньої обробки tTG. IFN-γ позитивні колонії були підраховані і представлені як середнє SFU ± SE. Планки погрішностей не показували, коли SE було меншим, ніж символи. Фіг. 6: Хроматограми аналітичної зворотно-фазової ВЕРХ виділених гордеїнових фракцій. На репрезентативних хроматограмах показані A280 нм у ході ВЕРХ гордеїнових фракцій #1, 2, 3, 4, 5, 6, виділених з ячменю. Для порівняння показані хроматограми для ячменю дикого типу (Himalaya), на яких показана елюція (суцільна лінія) гордеїнів D, С, і В, а також мутант R56, в якому накопичуються головним чином С гордеїни. Фіг. 7: Характеристика проламінів у Riso 56 і Riso 1508 за допомогою електрофорезу у ДСНПААГ і Вестерн-блотингу. Двадцять мкг проламіну, очищеного як у Прикладі 1, з вказаної лінії ячменю, інкубували протягом 30 хвилин при кімнатній температурі у буфері, що містить 6,6 М сечовини, 2 % (ваг./об.) ДСН, 1 % (ваг./об.) ДТТ, 62,5 мМ Трис-HCl (pH 6,8) і 0,01 % (ваг./об.) бромфенолового синього, а потім наносили на дві доріжки у 12 % акриламідний гель і проводили електрофорез при 200 V протягом 40 хв. Гель промивали у буфері для перенесення, що містить 192 мМ гліцину, 25 мМ Трис-основи і 20 % (об./об.) метанолу, протягом 10 хвилин, після чого виконували перенесення на нітроцелюлозу (Amersham Hybond С+) при 100 V протягом 1 години. Мембрану зліва забарвлювали в 0,2 % Ponceau S (ваг./об.) у 3 % (ваг./об.) трихлороцтовій кислоті, 3 % 5-сульфосаліциловій кислоті і швидко видаляли надлишки барвника у воді; мембрану справа блокували у 5 % знежиреному молоці у PBST протягом 7 UA 101480 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1 години, потім інкубували з мишачим моноклональним антитілом 12224 (Skerrit, 1988) у PBST, 3x промивали у PBST протягом 10 хвилин, інкубували з антитілом вівці проти мишачого антитіла, кон'югованим з HRP (Selenius), у PBST, 3x промивали у PBST 5 хвилин, інкубували в ECL-реагенті Amersham відповідно до інструкції виробника, і витримували на Amersham Hyperfilm. MAb 12224 індукували проти сумарного глютенінового екстракту, тому детектували всі гордеїни і проламіни (Skerrit, 1988). Фіг. 8: Зворотно-фазова FPLC гордеїнових екстрактів у Riso 56 і Riso 1508 у порівнянні з диким типом Bomi і Carlsberg II. Гордеїни виділяли з вказаних ліній, як у Прикладі 1, при цьому на FPLC колонку наносили кількість, еквівалентну 0,2 г борошна, використовуючи перший метод FPLC у Прикладі 1. Вказано час елюювання С-гордеїну (C-Hor) і В-гордеїну (B-Hor). Фіг. 9: Репрезентативний електрофорез у ДСН-ПААГ спирторозчинних білків, нанесених з розрахунку на насінину. Проламінові екстракти (10 мкл) окремих насінин ячменю F2 з схрещування Riso 1508 і Riso 56 одержували, як описано вище. Положення білкових стандартів 30, 50, 70 і 100 кДа вказані на доріжці зліва. Також показані білкові профілі батьківських ліній Riso 1508 і Riso 56, і дикого типу (Bomi). Шість доріжок з передбачуваних подвійних нульових проб містять дуже мало білка (нуль), шість інших доріжок містять низькі рівні білка (знижений). Фіг. 10: Репрезентативний електрофорез у ДСН-ПААГ спирторозчинних білків, нанесених виходячи з рівної кількості білка. Проби, що містять 20 мкг спирторозчинного білка, екстрагованого з окремих насінин ячменю F2, розділяли за допомогою електрофорезу, а гель забарвлювали Coomassie blue. Наносили проби з батьківських ліній (Riso 1508 і Riso 56), а також дикого типу (Bomi). Зовнішні і центральні доріжки (10 кДа) містили білкові стандарти з відомою молекулярною вагою, вказані положення смуг 30, 50, 70 і 100 кДа. Фіг. 11: Хроматограми ЗФ FPLC спирторозчинних екстрактів з насіння ячменю F3. Спирторозчинні білки екстрагували з окремих насінин F3, як описано; супернатанти двох насінин з кожної лінії об'єднували, 50 мкл вводили у колонку ЗФ FPLC і елюювали, як описано у Прикладі 1. Фіг. 12: Вміст водорозчинного (А), солерозчинного (В), спирторозчинного (С) і розчинного у розчині сечовини (D) білка у продубльованих зразках борошна з ячменю дикого типу (Sloop, Carlsberg II, Bomi), одно-нульових батьків (Riso 56, Riso 1508) і насінні F4 рослин ліній J4, J1, BB5, G1, 5RB визначали, як у Прикладі 4. Визначали вміст сумарного білка (Е), який екстрагують, підсумовуючи вміст в окремих фракціях. Вміст сумарного білка також оцінювали за допомогою елементного аналізу відповідно до методу Дюма (F). Вміст білка наведений як середнє ± SE. Фіг. 13: Токсичність при целіакії гордеїнів, виділених з різних зразків борошна, визначали з використанням Т-клітин, виділених у хворих на целіакію, через 6 днів після провокації, як у Прикладі 5, і наводили середнє число плямоутворюючих одиниць (SFU) + SE в залежності від сирої ваги борошна. Для ясності, середнє SFU показане тільки для гордеїнів, виділених з ячменю дикого типу (Sloop) або подвійної нульової лінії (G1) у присутності (+tTG) або за відсутності (-tTG) ферменту, тканинної трансглутамінази (А). У всіх випадках обробка tTG підвищувала токсичність гордеїнів, як очікується при целіакії. SFU також наведене для оброблених tTG гордеїнів (В), виділених зі зразків борошна ячменю дикого типу (Sloop), однонульових батьків (Р56, R1508) і насіння F4 (4BH). Фіг. 14: Послідовності генів, специфічні або до контрольного гена (gamma3-Hor), або до гена В-гордеїну (B-Hor), ампліфікували з ДНК екстрактів окремих сходів F4 або ліній 9RE, 4BH, або батьківської лінії Р56, як у Прикладі 9. Загальні методики і визначення Якщо конкретно не визначено інше, всі технічні і наукові терміни, які використовуються у даній заявці, мають стандартне значення, під яким вони звичайно розуміються середнім фахівцем у даній галузі техніки (наприклад, у рослинництві, технології харчових продуктів, культивуванні клітин, молекулярній генетиці, імунології, хімії білків і біохімії). Якщо не вказано інше, методи генної інженерії, культивування клітин, а також імунологічні методи, які використовуються у даному винаході, являють собою стандартні методики, відомі фахівцям, кваліфікованим у даній галузі техніки. Такі методи широко описані і пояснені у літературі, наприклад, у J. Perbal, А Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: А Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T. A. Brown (редактор), Essential Molecular Biology: А Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (редактори), DNA Cloning: А Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), а також F.M. Ausubel et al., (редактори), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, включаючи всі редакції на даний момент), Ed Harlow and David Lane (редактори) Antibodies: А 8 UA 101480 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), and J.E. Coligan et al., (редактори) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (включаючи всі редакції на даний момент). Використовуваний у даній заявці термін "ячмінь" стосується будь-яких видів роду Hordeum, включаючи попередників даного роду, а також потомство, одержане внаслідок схрещування з іншими видами. Переважною формою ячменю є види Hordeum vulgare. Целіакія або глютенова ентеропатія є аутоімунним захворюванням тонкої кишки, яке розвивається у генетично схильних людей у всіх вікових групах після першого року життя. Вона уражує приблизно 1 % індоєвропейських популяцій, хоча діагностується значною мірою недостатньо. Целіакія викликана реакцією на гліадин, глютеновий білок, присутній у пшениці (а також подібними білками пшеницевих (Triticeae), які включають інші культури, такі як ячмінь і жито). При контакті з гліадином, фермент тканинна трансглутаміназа модифікує білок, а імунна система перехресно реагує з тканиною кишечнику, викликаючи запальну реакцію. Це приводить до вирівнювання оболонки тонкої кишки і, як наслідок, порушення всмоктування поживних речовин. Єдиним ефективним методом лікування є довічна аглютенова дієта. Дане захворювання має декілька інших назв, що включають: целіакію (coeliac disease, з лігатурою), целіакію-(c(о)eliac) спру, нетропічну спру, ендемічну спру, глютенову ентеропатію або глютензалежну ентеропатію, а також непереносимість глютену. Симптоми целіакії значно відрізняються від людини до людини. Симптоми целіакії можуть включати одне або більше з наведеного далі: газоутворення, періодичне абдомінальне здуття і болі, хронічна діарея, запор, блідість, смердючі або жирні випорожнення, втрата ваги/збільшення ваги, стомлюваність, нез'ясовна анемія (низька кількість еритроцитів, що викликає стомлюваність), болі у кістках або суглобах, остеопороз, остеопенія, поведінкові зміни, поколювання з онімінням (від пошкодження нервів), м'язові спазми, судоми, порушення менструального циклу (часто через надмірну втрату ваги), безпліддя, звичайне невиношування, затримка росту, затримка у розвитку у дітей, сіруваті виразки у роті, які називаються афтозними виразками, знебарвлення зубів або втрата емалі, а також сверблячий шкірний висип, який називається герпетиформним дерматитом. Деякі з симптомів, що найчастіше зустрічаються, включають: втому, переміжну діарею, абдомінальні болі або спазми, розлад травлення, метеоризм, здуття, а також втрату ваги. Целіакія може бути діагностована, наприклад, як описано у WO 01/025793. Використовуваний у даній заявці термін "нетоксичний для особи з целіакією" стосується вживання продукту харчування або напою, що не приводить до розвитку симптому целіакії у особи, яка страждає від вказаного захворювання. Як описано у даній заявці, продукт харчування або напій, приготований з відповідної рослини ячменю дикого типу, приводить до розвитку симптомів захворювання. Терміни "насіння" і "зерно" використовуються у даній заявці поперемінно. "Зерно" звичайно стосується зрілого, зібраного зерна, але може також стосуватися зерна після обробки, наприклад, після розмелювання або полірування, при якому склад більшої частини зерна залишається у незмінному вигляді, або після бубнявіння або проростання, відповідно до контексту. Зріле зерно звичайно має вміст вологи менш ніж приблизно 18-20 %. Зерно ячменю дикого типу (цілісне зерно) звичайно містить 9-12 % білка, з якого приблизно 30-50 % складає проламін, звичайно 35 %, таким чином, зерно ячменю дикого типу містить приблизно 3-4 % проламіну за вагою. Проламіни присутні практично тільки в ендоспермі, який складає приблизно 70 % ваги цілісного зерна. Використовуваний у даній заявці термін "відповідний дикий тип" рослини ячменю стосується рослини, яка включає, щонайменше, 50 %, більш переважно, щонайменше, 75 %, більш переважно, щонайменше, 95 %, більш переважно, щонайменше, 97 %, більш переважно, щонайменше, 99 %, і найбільш переважно, 99,5 % генотипу рослини винаходу, але дає зерно з незміненим вмістом гордеїнів. В одному варіанті здійснення "відповідний дикий тип" рослини ячменю являє собою сорт рослини, що використовується в експериментах з селекції рослин з метою введення генетичних варіантів, які приводять до зменшення продукування гордеїнів у зерні. В іншому варіанті здійснення, "відповідний дикий тип" рослини ячменю є батьківським сортом, в який був введений трансген, який зменшує продукування гордеїнів у зерні. У наступному варіанті здійснення, "відповідний дикий тип" рослини ячменю є сортом, який застосовується на дату реєстрації комерційного виробництва зерна ячменю, такого як, крім інших, Bomi, Sloop, Carlsberg II, K8, L1, Vlamingh, Stirling, Hamelin, Schooner, Baudin, Gairdner, Buloke, WI3586-1747, WI3416, Flagship, Cowabbie, Franklin, SloopSA, Sloop Vic, Quasar, VB9104, Grimmett, Cameo*Arupo 31-04, Prior, Schooner, Unicom, Harrington, Torrens, Galleon, Morex, Dhow, Capstan, Fleet, Keel, Maritime, Yarra, Dash, Doolup, Fitzgerald, Molloy, Mundah, Onslow, Skiff, Unicorn, Yagan, Chebec, Hindmarsh, Chariot, Diamant, Koral, Rubin, Bonus, Zenit, Akcent, Forum, Amulet, Tolar, Heris, Maresi, Landora, Caruso, Miralix, Wikingett Brise, Caruso, Potter, Pasadena, 9 UA 101480 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Annabell, Maud, Extract, Saloon, Prestige, Astoria, EIo, Cork, Extract, Laura. У варіанті здійснення, "відповідний дикий тип" рослини ячменю дає зерно з незміненим вмістом гордеїнів, оскільки він включає повний набір функціональних гордеїнових генів, що кодують функціональні білки гордеїнів, включаючи В, С, D і γ-гордеїни, що кодуються локусами Hor2, Hor1, Hor3 і Hor5. Використовуваний у даній заявці термін "один або більше білків зерна ячменю" стосується природних білків, які продукуються зерном ячменю. Приклади таких білків відомі фахівцям, кваліфікованим у даній галузі техніки. Конкретні приклади включають, крім інших, альбуміни ячменю, наприклад, 9 кДа білок перенесення ліпідів 1 (LTP1) (див. огляд Douliez et al. (2000) і Swiss-prot P07597, як приклад), а також білок Z (див. Brandt et al. (1990) і Genbank P06293), включаючи відповідні процесовані (зрілі) форми, а також їх денатуровані форми і/або фрагменти, одержані у результаті виробництва солоду, борошна, непросіяного борошна, продукту харчування або напою на основі солоду відповідно до винаходу. Використовуваний у даній заявці термін "солод" стосується ячмінного солоду, "борошно" стосується ячмінного борошна, "борошно з цілісного зерна" стосується ячмінного борошна з цілісного зерна, і "пиво" стосується ячмінного пива. Більш конкретно, джерело солоду, борошна, пива, борошна з цілісного зерна, продукту харчування і т.д. відповідно до винаходу одержують у результаті обробки (наприклад, розмелювання і/або ферментації) зерна ячменю. Вказані терміни включають солод, борошно, пиво, борошно з цілісного зерна, продукт харчування і т.д., одержані з суміші зерен. У переважному варіанті здійснення, щонайменше, 50 % зерна, що використовується для виробництва солоду, борошна, пива, борошна з цілісного зерна, продукту харчування і т.д., є зерном ячменю. Термін "рослина", що також використовується у даній заявці, стосується цілої рослини, такої як, наприклад, рослина, що росте у полі з метою комерційного виробництва ячменю. "Частина рослини" стосується вегетативних структур рослини (наприклад, листя, стебел), коріння, квіткових органів/структур, насінини (включаючи зародок, ендосперм і оболонку насінини), тканини рослини (наприклад, судинної тканини, покривної тканини і т.п.), клітин, крохмальних зерен або потомства перерахованого вище. "Трансгенна рослина", "генетично модифікована рослина" або варіанти перерахованого, стосуються рослини, яка містить генну конструкцію ("трансген"), не присутню у рослині дикого типу того ж виду, роду або сорту. "Трансген", як вказано у даній заявці, має нормальне значення з галузі біотехнології і включає генетичну послідовність, яка була одержана або змінена за допомогою генно-інженерних методів ДНК або РНК, і яка була введена у клітину рослини. Трансген може включати генетичні послідовності, одержані з клітини рослини. Як правило, трансген введений у рослину штучно, наприклад, за допомогою трансформації, однак, при цьому може використовуватися будь-який метод, відомий фахівцю у даній галузі техніки. "Молекула нуклеїнової кислоти" стосується полінуклеотиду, такого як, наприклад, ДНК, РНК або олігонуклеотиди. Вона може являти собою ДНК або РНК геномного або синтетичного походження, двониткову або однониткову, а також пов'язану з вуглеводом, ліпідами, білком або іншими матеріалами для виконання специфічної функції, визначеної у даній заявці. "Функціонально пов'язаний", що використовується у даній заявці, стосується функціонального співвідношення між двома або більше сегментами нуклеїнових кислот (наприклад, ДНК). Як правило, це стосується функціонального співвідношення елемента регуляції транскрипції (промотору) з послідовністю, яку транскрибують. Наприклад, промотор функціонально пов'язаний з кодуючою послідовністю, такою як полінуклеотид, визначений у даній заявці, якщо він стимулює або модулює транскрипцію кодуючої послідовності у відповідній клітині. У більшості випадків промоторні елементи регуляції транскрипції, які функціонально пов'язані з послідовністю, яку транскрибують, фізично прилягають до послідовності, яку транскрибують, тобто, вони діють у cis-положенні. Однак, деякі елементи регуляції транскрпції, такі як енхансери, не обов'язково повинні фізично прилягати або розташовуватися безпосередньо близько до кодуючих послідовностей, транскрипцію яких вони посилюють. Використовуваний у даній заявці термін "ген" потрібно розуміти в його найбільш широкому значенні, при цьому він включає дезоксирибонуклеотидні послідовності, які включають область структурного гена, що кодує білок, і включає послідовності, що прилягають до кодуючої області на 5'- і на 3'-кінцях на протязі, щонайменше, приблизно 2 т.п.н. у будь-якому кінці, і які беруть участь в експресії гена. Послідовності, які розташовані на 5'-кінці кодуючої області і які присутні на мРНК, називаються 5'-нетрансльованими послідовностями. Послідовності, які розташовані на 3'-кінці або праворуч від кодуючої області і які присутні на мРНК, називаються 3'нетрансльованими послідовностями. Термін "ген" охоплює і кДНК, і геномні форми гена. Геномна форма або клон гена містять кодуючу область, яка може бути перервана некодуючими послідовностями, які називають "інтронами" або "проміжними областями", або "проміжними 10 UA 101480 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 послідовностями". Інтрони являють собою сегменти гена, які транскрибуються в ядерну РНК (гяРНК), інтрони можуть містити регуляторні елементи, такі як енхансери. Інтрони видаляються або "вирізаються" з ядерного або первинного транскрипту, тому інтрони відсутні у транскрипті інформаційної РНК (мРНК). Функціонує мРНК у ході трансляції, визначаючи послідовність або порядок амінокислот у поліпептиді, який синтезують. Термін "ген" включає синтетичну або злиту молекулу, що кодує всі або частину білків винаходу, описаних у даній заявці, а також нуклеотидну послідовність, комплементарну будь-якій зі згаданих вище. Використовуваний у даній заявці термін "інший компонент продукту харчування або напою" стосується будь-якої речовини, придатної для вживання твариною, переважно будь-якої речовини, придатної для вживання людиною. Приклади включають, крім іншого, воду, зерно рослин інших видів, цукор і т.д. Використовуваний у даній заявці термін "генетична варіація, яка приводить до зменшення рівня, щонайменше, одного гордеїну", стосується будь-якого поліморфізму рослини ячменю, який приводить до зменшення продукування гордеїну. Генетична варіація може бути, наприклад, делецією гордеїнового гена (генів) або його частини, або мутацією, яка приводить до зменшення транскрипції гена в ячмені. Приклади таких генетичних варіацій присутні у Riso 56, Riso 527 і Riso 1508. Отже, такі рослини можуть застосовуватися у способах винаходу. Крім того, рослина винаходу може бути гібридом будь-якого з вказаних мутантів ячменю. У переважному варіанті здійснення рослина винаходу є гібридом Riso 56 і Riso 1508 або їх потомства, що включає мутації Hor2 і Lys3, присутні у даних лініях. У варіанті здійснення рослина не є гібридом Riso 527 і Riso 1508. Використовуване у даній заявці слово "приблизно", якщо не вказано інше, стосується будьякого допустимого діапазону з врахуванням значення, що розглядається. У переважному варіанті здійснення термін "приблизно" відповідає +/- 10 %, більш переважно, +/- 5 % від вказаного значення. Проламіни і гордеїни Проламіни злакових культур (відомі як гліадини у пшениці, гордеїни в ячмені, секаліни у житі, авеніни у вівсі і зеїни у кукурудзі) є головними запасними білками ендосперму у всіх зернах злакових культур, за винятком вівса і рису (Shewry and Halford, 2002). Гордеїни складають 3550 % сумарного білка у насінні ячменю (Jaradat, 1991). Вони поділяються на чотири групи – А (також відомі як γ-гордеїн), В, С, і D, у порядку зменшення рухливості (Field et al., 1982). Вгордеїни є головною фракцією білка і відрізняються від С-гордеїнів за вмістом сірки (Kreis and Shewry, 1989). В-гордеїни складають 70-80 % від загальної кількості, а С-гордеїни - 10-20 % (Davies et al., 1993). А-гордеїни загалом не розглядають як фракцію запасу, тоді як D-гордеїни гомологічні глютенінам з високою молекулярною масою. Гордеїни, нарівні з іншою частиною споріднених проламінів злакових культур, не експресуються у зиготному ембріоні безпосередньо, на відміну від інших запасних білків, таких як напіни, при цьому вони, як вважають, експресуються винятково у крохмалистому ендоспермі протягом середніх/пізніх стадій розвитку насінини. Приклади амінокислотних послідовностей гордеїнів ячменю (наведені у формі номеру NCBI з описом, ідентифікатором gi), включають, крім інших: 11 UA 101480 C2 12 UA 101480 C2 13 UA 101480 C2 14 UA 101480 C2 Приклади генів і/або кДНК, що кодують гордеїни ячменю (наведені у формі номеру NCBI з описом, ідентифікатором gi), включають, крім інших: 5 15 UA 101480 C2 16 UA 101480 C2 17 UA 101480 C2 5 Один з варіантів здійснення даного винаходу стосується трансгенних рослин ячменю, що включають проламін, який не токсичний для особи з целіакією. Як показано у даній заявці, прикладами такого проламіну є авенін вівса і зеїн кукурудзи. Приклади амінокислотних послідовностей авенінів вівса (наведені у формі номеру NCBI з описом, ідентифікатором gi), включають, крім інших: 18 UA 101480 C2 5 10 15 20 25 30 35 Солодження Напій на основі солоду, що забезпечується даним винаходом, включає алкогольні напої (включаючи напої, одержані перегонкою) і безалкогольні напої, які виробляють з використанням солоду як частини або всього початкового матеріалу. Приклади включають пиво, хапошу (напій на зразок пива, з низьким вмістом солоду), віскі, слабоалкогольні напої на основі солоду (наприклад, напої на основі солоду, що містять менше 1 % спиртів), а також безалкогольні напої. Солодження являє собою процес контрольованого замочування і пророщування з подальшим сушінням зерна ячменю. Дана послідовність подій важлива для синтезу численних ферментів, які викликають модифікацію зерна, процес, в якому переважно деполімеризуються стінки мертвих клітин ендосперму і мобілізуються поживні речовини зерна. У подальшому процесі сушіння у результаті хімічних реакцій потемніння розвивається аромат і колір. Хоча основним застосуванням солоду є виробництво напоїв, він може також застосовуватися в інших виробничих процесах, наприклад, як джерело ферментів у хлібопекарній промисловості або як смакова домішка і барвник у харчовій промисловості, наприклад, у вигляді солоду або солодового борошна, або опосередковано, у вигляді солодового сиропу, і т.д. В одному з варіантів здійснення даний винахід стосується способу одержання солодової композиції. Спосіб переважно включає наведені нижче стадії: (i) одержання зерен рослини ячменю винаходу, (ii) замочування вказаного зерна, (iii) пророщування замоченого зерна у заданих умовах, і (iv) сушіння вказаного, пророщеного зерна. Наприклад, солод може бути одержаний будь-яким зі способів, описаних у Hoseney (Principles of Cereal Science and Technology, Second Edition, 1994: American Association of Cereal Chemists, St. Paul, Minn.). Проте, у даному винаході може також використовуватися будь-який інший придатний спосіб одержання солоду, такий як способи одержання спеціальних сортів солоду, які включають, крім інших, способи обжарювання солоду. Один з необмежувальних прикладів описаний у Прикладі 6. Солод може бути приготований з використанням зерна, одержаного тільки з рослин ячменю винаходу, або сумішей, що включають інші зерна. Солод головним чином використовують у пивоварінні, однак він також застосовується і у виробництві міцних спиртних напоїв. Варіння пива включає виробництво затору, головну і допоміжну ферментації, а також постобробку. Спочатку солод промелюють, розмішують у воді і нагрівають. У ході даного "затирання" ферменти, активовані при солодженні, розщеплюють крохмаль зерна з утворенням зброджуваних цукрів. Приготований затор освітлюють, додають дріжджі, суміш зброджують і проводять постобробку. 19 UA 101480 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В іншому варіанті здійснення з солоду можуть бути приготовані заторні композиції. Вказаний затор може бути першим і/або другим, і/або наступним затором. Звичайно заторна композиція має високий вміст амідного азоту і зброджуваних вуглеводів, головним чином мальтози. Як правило, затор готують, витримуючи солод з водою, тобто, при затиранні. У процесі затирання у композицію з солоду/води можуть бути додані додаткові багаті на вуглеводи композиції, наприклад ячмінні, кукурудзяні або рисові домішки. Неосолоджені зернові домішки звичайно не містять яких-небудь активних ферментів і тому, щоб забезпечити ферменти, необхідні для гідролізу полісахаридів, необхідний солод або ферменти, що вводяться ззовні. Звичайно першою стадією у процесі виробництва затору є розмелювання солоду, необхідне для того, щоб вода могла одержати доступ до частинок зерна у фазі затирання, яке по суті є продовженням процесу солодження з ферментативною деполімеризацією субстратів. У ході затирання розмелений солод витримують з рідкою фракцією, такою як вода. Температуру або підтримують на постійному рівні (ізотермічне затирання), або поступово підвищують. У будьякому випадку, розчинні речовини, що утворюються при солодженні і затиранні, переходять у вказану рідку фракцію перед її розділенням за допомогою фільтрації на затор і залишкові тверді частинки, які називають дробиною. Вказаний затор може також називатися першим затором. Після фільтрації одержують другий затор. Наступні затори можуть бути одержані при повторенні даної процедури. Необмежувальні приклади придатних методик приготування затору описані у Hoseney (вище). Заторна композиція може бути також приготована шляхом витримування рослин ячменю винаходу або їх частин з одним або декількома придатними ферментами, такими як ферментні композиції або змішані ферментні композиції, наприклад Ultraflo або Cereflo (Novozymes). Заторна композиція може бути також приготована з використанням суміші солоду і неосолоджених рослин ячменю або їх частин, необов'язково з додаванням одного або декількох придатних ферментів у ході вказаного приготування. Крім того, ферменти пролілендопептидази, які специфічно руйнують токсичні амінозв'язки, залучені до целіакії, можуть бути додані у процесі зброджування затору з метою зменшення токсичності залишкових гордеїнів (De Angelis et al., 2007; Marti et al., 2005; Stepniak et al, 2006). Обробка зерна Зерно ячменю винаходу може бути оброблене з метою одержання продукту харчування або нехарчового продукту, з використанням будь-якої методики, відомої у даній галузі техніки. В одному з варіантів здійснення продуктом є борошно з цілісного зерна (борошно з цілісного зерна ультратонкого помелу, наприклад, борошно з цілісного зерна ультратонкого помелу; борошно з цілісного зерна, або борошно, одержане з приблизно 100 % зерна). Борошно з цілісного зерна включає очищену складову борошна (очищене борошно), а також грубу фракцію (грубу фракцію ультратонкого помелу). Очищене борошно може бути борошном, яке одержують, наприклад, при розмелюванні і просіюванні очищеного ячменю. Управління з контролю якості продуктів харчування і лікарських засобів (FDA) вимагає, щоб борошно відповідало визначеним стандартам величини частинок, щоб воно могло бути включене у категорію очищеного ячмінного борошна. Величина частинок очищеного борошна описується як борошно, в якому не менше 98 % частинок проходить через сито з отворами, розмір яких не перевищує розмір отворів тканої дротяної сітки, що визначаються як "212 мікрометрів (U.S. Wire 70)". Груба фракція включає, щонайменше, одне з: висівок і проростків. Наприклад, проросток являє собою зародок рослини, що знаходиться у зерні ячменю. Проростки включають ліпіди, волокно, вітаміни, білок, мінеральні речовини і поживні речовини рослинного походження, такі як флавоноїди. Висівки включають декілька клітинних шарів і містять істотну кількість ліпідів, волокна, вітамінів, білка, мінеральних речовин і поживних речовин рослинного походження, таких як флавоноїди. Крім того, груба фракція може включати алейроновий шар, який також включає ліпіди, волокно, вітаміни, білок, мінеральні речовини і поживні речовини рослинного походження, такі як флавоноїди. Алейроновий шар, який фактично вважається частиною ендосперму, проявляє багато з тих самих особливостей, що і висівки, і тому звичайно видаляється разом з висівками і проростками у ході процесу розмелювання. Алейроновий шар містить білки, вітаміни і поживні речовини рослинного походження, такі як ферулову кислоту. Далі груба фракція може бути змішана з очищеною складовою борошна. Переважно, грубу фракцію гомогенно змішують з очищеним елементом борошна. Гомогенне змішування грубої фракції і очищеної складової борошна може допомогти зменшити розшарування частинок за розміром у процесі відвантаження. Груба фракція може бути змішана з очищеною складовою борошна, з формуванням борошна з цілісного зерна, забезпечуючи, таким чином, борошно з цілісного зерна з підвищеною харчовою цінністю, вмістом волокон і антиоксидантною здатністю 20 UA 101480 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 у порівнянні з очищеним борошном. Наприклад, груба фракція або борошно з цілісного зерна можуть застосовуватися у різних кількостях для заміни очищеного борошна або борошна з цілісного зерна у хлібобулочних виробах, закусочних продуктах і продуктах харчування. Борошно з цілісного зерна даного винаходу (наприклад, борошно з цілісного зерна ультратонкого помелу) може також постачатися безпосередньо споживачам для застосування при виготовленні їх домашньої випічки. У прикладі здійснення величина частинок борошна з цілісного зерна є такою, що 98 % за вагою частинок борошна з цілісного зерна менші, ніж 212 мікрометрів. В інших варіантах здійснення ферменти, присутні у висівках і проростках борошна з цілісного зерна і/або грубої фракції, інактивовані для стабілізації борошна з цілісного зерна і/або грубої фракції. У даному винаході також розглядається, що інактивований може означати інгібований, денатурований або т.п. Стабілізація є процесом, в якому використовується пара, нагрівання, опромінення або інші способи обробки, призначені для інактивації ферментів, присутніх у шарі висівок і проростків. Природні ферменти у висівках і проростках каталізують зміни сполук у борошні, негативно впливаючи на кулінарні властивості борошна і термін придатності. Інактивовані ферменти не каталізують зміни сполук, присутніх у борошні, тому борошно, яке було стабілізоване, зберігає свої кулінарні властивості і має більш тривалий термін придатності. Наприклад, даний винахід може забезпечувати технологію розмелювання з двома потоками для розмелювання грубої фракції. Після відділення і стабілізації грубої фракції, груба фракція проходить через млин, переважно вальцьовий млин, з формуванням грубої фракції, що має розподіл розміру частинок, який менше або дорівнює приблизно 500 мікрометрам. У прикладі здійснення вальцьовий млин звичайно працює зі швидкістю вальця 115-144 м/сек., висока швидкість вальця приводить до нагрівання. Тепло, що виділяється у ході процесу, і потік повітря, приводять до зменшення вмісту мікроорганізмів у грубій фракції. В інших варіантах здійснення, перед розмелюванням на вальцьовому млині, груба фракція може мати середній вміст аеробних мікроорганізмів 95000 колонієутворюючих одиниць/грам (КУО/г) і середній вміст бактерій групи кишкової палички 1200 КУО/г. Після проходження через вальцьовий млин, груба фракція може мати середній вміст аеробних мікроорганізмів 10000 КУО/г і середній вміст бактерій групи кишкової палички 900 КУО/г. Таким чином, вміст мікроорганізмів у грубій фракції даного винаходу може бути істотно знижений. Після просіювання, подрібнена груба фракція з розміром частинок більше 500 мікрометрів може бути повернена у процес для додаткового розмелювання. У додаткових варіантах здійснення борошно з цілісного зерна або груба фракція можуть бути компонентом продукту харчування. Наприклад, продукт харчування може являти собою рогалик, бісквіт, хліб, булочку, круасан, галушки, англійську здобну булочку, здобну булочку, піту, бездріжджовий хліб, охолоджені/заморожені вироби з тіста, тісто, готові боби, буріто, чілі, тако, тамал, тортілью, пиріг, готовий сніданок, готовий обід, начинку, обід для приготування у мікрохвильовій печі, брауні, пиріг, чізкейк, булочку до кави, печиво, десерт, кондитерські вироби, солодкий рулет, солодкий батончик, хрустку основу для пирога, начинку для пирога, продукт для дитячого харчування, суміш для випічки, кляр, паніровку, суміш для соусу, наповнювач для м'яса, замінник м'яса, суміш приправ, супову суміш, соус, заправку для соусу, заправку до салату, суп, сметану, локшину, пасту, макарони, локшину чоу-мейн, локшину ло-мейн, наповнювач для морозива, брикет морозива, морозиво-ріжок, морозиво у вафлях, крекер, грінки, пампушку, яєчний рулетик, екструдовані снеки, пресовані мюслі з фруктами, закусочні продукти для приготування у мікрохвильовій печі, поживний батончик, млинець, хлібобулочний виріб-напівфабрикат, претцель, пудинг, продукт на основі граноли, чіпси, снеки, суміш снеків, вафлю, основу для піци, корм для тварин або корм для домашніх тварин. В альтернативних варіантах здійснення борошно з цілісного зерна або груба фракція можуть бути компонентом харчової домішки. Наприклад, харчова домішка може бути продуктом, який додають до їжі, і який містить один або більше компонентів, що звичайно включають: вітаміни, мінеральні речовини, трави, амінокислоти, ферменти, антиоксиданти, трави, спеції, пробіотики, екстракти, пребіотики і волокна. Борошно з цілісного зерна або груба фракція даного винаходу включають вітаміни, мінеральні речовини, амінокислоти, ферменти і волокна. Наприклад, груба фракція містить концентровану кількість харчового волокна, а також інші необхідні поживні речовини, наприклад, вітаміни групи В, селен, хром, марганець, магній і антиоксиданти, які необхідні для здорового харчування. Наприклад, 22 грами грубої фракції даного винаходу забезпечують 33 % рекомендованого щоденного споживання волокна для людини. Далі, для забезпечення людини 20 % рекомендованого щоденного споживання волокна необхідно 14 грамів. Таким чином, груба фракція є чудовим додатковим джерелом для задоволення потреби людини у волокні. Таким чином, у даному варіанті здійснення борошно з 21 UA 101480 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 цілісного зерна або груба фракція можуть бути компонентом харчової домішки. Харчова домішка може включати будь-які відомі харчові компоненти, які сприяють поліпшенню загального самопочуття людини, приклади включають, крім іншого, вітаміни, мінеральні речовини, інші волокнисті компоненти, жирні кислоти, антиоксиданти, амінокислоти, пептиди, білки, лютеїн, рибозу, омега-3 жирні кислоти і/або інші харчові компоненти. У додаткових варіантах здійснення борошно з цілісного зерна або груба фракція можуть бути волокнистою домішкою або її компонентом. Багато існуючих волокнистих домішок, таких як лузга насіння подорожника, похідні целюлози і гідролізована гуарова камедь крім вмісту волокна не мають істотної харчової цінності. Крім того, багато волокнистих домішок мають небажану структуру і поганий смак. Волокнисті домішки, приготовані з борошна з цілісного зерна або грубої фракції, можуть сприяти забезпеченню волокном, а також білком і антиоксидантами. Волокнисті домішки можуть бути виготовлені, крім іншого, у наведених далі формах: швидкорозчинні суміші для приготування напоїв, готові до вживання напої, харчові брикети, вафлі, печиво, крекери, гель, капсули, жуйки, жувальні таблетки і пілюлі. Один з варіантів здійснення забезпечує волокнисті домішки у формі ароматизованого коктейлю або солодового напою, даний варіант здійснення може бути особливо привабливим як волокниста домішка для дітей. У додатковому варіанті здійснення борошномельний процес може використовуватися для одержання борошна з декількох видів зерна, борошна з декількох видів ячменю або грубої фракції з декількох видів зерна. Наприклад, висівки і проростки з одного типу ячменю можуть бути подрібнені і змішані з подрібненим ендоспермом або борошном з цілісного зерна ячменю іншого типу. В альтернативному варіанті висівки і проростки одного типу зерна можуть бути подрібнені і змішані з подрібненим ендоспермом або борошном з цілісного зерна іншого типу. У додатковому варіанті здійснення висівки і проростки з першого типу ячменю або зерна можуть бути змішані з висівками і проростками з другого типу ячменю або зерна, з одержанням грубої фракції з декількох видів зерна. Розглядається, що даний винахід охоплює змішування будьякої комбінації одного або більше з висівок, проростків, ендосперму і борошна з цілісного зерна, одержаних із зерна одного або декількох видів. Даний багатозерновий, багатоячмінний підхід може використовуватися для одержання борошна спеціальних сортів і вигідного використання властивостей і харчової цінності зерна або ячменю декількох видів, при виготовленні борошна одного сорту. Борошно з цілісного зерна даного винаходу може бути одержане за допомогою різних борошномельних процесів. Приклад здійснення включає розмелювання зерна в одному потоці, без відділення ендосперму, висівок і проростків зерна в окремі потоки. Чисте і кондиціоноване зерно надходить у перший млин, такий як молоткова дробарка, вальцьова дробарка, стрижневий млин, ударна дробарка, дисковий млин, роторно-струминний млин, вальцьовий млин і т.п. В одному варіанті здійснення млин може бути вальцьовим млином. Після розмелювання зерно вивантажують і подають на сито. Може використовуватися будь-яке сито, що відоме з рівня техніки і застосовується для просіювання подрібнених частинок. Матеріал, що проходить через сітку сита, є борошном з цілісного зерна даного винаходу і не потребує ніякої додаткової обробки. Матеріал, який залишається на сітці, називається другою фракцією. Друга фракція потребує додаткового подрібнення частинок. Таким чином, вказана друга фракція може подаватися у другу дробарку. Після розмелювання друга фракція може подаватися у друге сито. Матеріал, що проходить через сітку другого сита, є борошном з цілісного зерна даного винаходу. Матеріал, який залишається на сітці, називається четвертою фракцією і потребує додаткової обробки для зменшення розміру частинок. Четверта фракція на сітці другого сита надходить зворотно, або у першу дробарку, або у другу дробарку для додаткової обробки через контур зворотного зв'язку. В альтернативному варіанті здійснення винаходу процес може включати ряд перших дробарок для забезпечення більш високої ємності системи. Передбачено, що борошно з цілісного зерна, груба фракція і/або зернові продукти даного винаходу можуть бути виготовлені за допомогою будь-якого борошномельного процесу, відомого у рівні техніки. Крім того, передбачено, що борошно з цілісного зерна, груба фракція і/або зернові продукти даного винаходу можуть бути модифіковані або поліпшені за допомогою ряду інших процесів, таких як: бродіння, інстантизація, екструзія, інкапсулювання, обжарювання, запікання і т.п. Полінуклеотиди, які придушують продукування гордеїну В одному варіанті здійснення зерно винаходу і/або застосовуване у способах винаходу, одержане з трансгенної рослини ячменю, яка включає трансген, що кодує полінуклеотид, який придушує продукування, щонайменше, одного гордеїну у зерні. Приклади таких полінуклеотидів включають, крім інших, антисмисловий полінуклеотид, смисловий полінуклеотид, каталітичний 22 UA 101480 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 полінуклеотид, штучну мікроРНК або РНК дуплекс. У випадку присутності у зерні кожного з перерахованих полінуклеотидів, це приводить до зниження кількості мРНК гордеїну, доступної для трансляції. Антисмислові полінуклеотиди Термін "антисмисловий полінуклеотид" потрібно розуміти як такий, що означає молекулу ДНК або РНК, або їх комбінацію, яка є комплементарною, щонайменше, частині специфічної молекули мРНК, що кодує гордеїн і здатна перешкоджати ходу посттранскрипційної події, такої як трансляція мРНК. Застосування методів з використанням антисмислових полінуклеотидів відоме у рівні техніки (див. наприклад, Hartmann and S. Endres, Manual of Antisense Methodology, Kluwer (1999)). Застосування методів з використанням антисмислових полінуклеотидів у рослинах було розглянуте в оглядах Bourque (1995) і Senior (1998). Senior (1998) констатував, що у наш час методи з використанням антисмислових полінуклеотидів є добре відпрацьованою методикою для керування експресією генів. Антисмисловий полінуклеотид у рослині ячменю винаходу гібридизується з цільовим полінуклеотидом за фізіологічних умов. Використовуваний у даній заявці термін "антисмисловий полінуклеотид, який гібридизується за фізіологічних умов" означає, що полінуклеотид (який є повністю або частково однонитковим) здатний, щонайменше, до формування двониткового полінуклеотиду з мРНК, що кодує білок, такий як гордеїн ячменю, за нормальних умов у клітині ячменю. Антисмислові молекули можуть включати послідовності, які відповідають структурним генам або послідовностям, що регулюють експресію гена або сплайсинг. Наприклад, антисмислова послідовність може відповідати цільовій кодуючій області генів винаходу або 5'-нетрансльованій області (UTR), або 3'-UTR, або їх комбінації. Вона може бути частково комплементарною послідовностям інтронів, які можуть вирізатися під час або після транскрипції, переважно тільки послідовностям екзонів цільового гена. Беручи до уваги загалом більш високу дивергенцію UTR, націлювання на дані області забезпечує більш високу специфічність інгібування гена. Довжина антисмислової послідовності повинна складати, щонайменше, 19 безперервних нуклеотидів, переважно, щонайменше, 50 нуклеотидів і, більш переважно, щонайменше, 100, 200, 500 або 1000 нуклеотидів. Може використовуватися повнорозмірна послідовність, комплементарна повному генному транскрипту. Довжина, найбільш переважно, складає 1002000 нуклеотидів. Ступінь ідентичності антисмислової послідовності цільовому транскрипту повинен складати, щонайменше, 90 %, а більш переважно, 95-100 %. Антисмислова молекула РНК, безумовно, може включати чужорідні послідовності, які можуть стабілізувати молекулу. Каталітичні полінуклеотиди Термін каталітичний полінуклеотид/нуклеїнова кислота стосується молекули ДНК або молекули, що містить ДНК (також відомої у рівні техніки як "дезоксирибозим"), або молекули РНК або молекули, що містить РНК (також відомої як "рибозим"), яка специфічно упізнає визначений субстрат і каталізує хімічну модифікацію даного субстрату. Основами нуклеїнової кислоти у каталітичній нуклеїновій кислоті можуть бути основи А, С, G, Т (а також U для РНК). Як правило, каталітична нуклеїнова кислота містить антисмислову послідовність для специфічного упізнавання цільової нуклеїнової кислоти, а також нуклеїнову кислоту, що проявляє гідролізуючу ферментативну активність (яка також згадується у даній заявці як "каталітичний домен"). Типи рибозимів, які є найбільш переважними у даному винаході, включають рибозим типу hammerhead (Haseloff and Gerlach, 1988, Perriman et al., 1992) і шпильковий рибозим (Shippy et al., 1999). Рибозими у рослинах ячменю винаходу і ДНК, що кодує рибозими, можуть бути хімічно синтезовані з використанням способів, відомих у рівні техніки. Рибозими можуть бути також одержані з молекули ДНК (яка після транскрипції дає молекулу РНК), функціонально пов'язаної з промотором РНК-полімерази, наприклад, промотором РНК-полімерази T7 або РНК-полімерази SP6. У випадку, коли вектор також містить промотор РНК-полімерази, функціонально пов'язаний з молекулою ДНК, рибозим може бути одержаний in vitro при інкубувані з РНКполімеразою і нуклеотидами. В окремому варіанті здійснення ДНК може бути вбудована у касету експресії або касету транскрипції. Після синтезу молекула РНК може бути модифікована за допомогою лігування з молекулою ДНК, що має здатність стабілізувати рибозим і робить його стійким до гідролізу РНКазою. Як і у випадку з антисмисловими полінуклеотидами, описаними у даній заявці, каталітичні полінуклеотиди також повинні бути здатні до гібридизації з цільовою молекулою нуклеїнової кислоти (наприклад, мРНК, що кодує гордеїн ячменю) за "фізіологічних умов", а саме, за умов всередині клітини ячменю. 60 23 UA 101480 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 РНК-інтерференція РНК-інтерференція (РНКі) особливо корисна з метою специфічного інгібування продукування специфічного білка. Не бажаючи обмежуватися якою-небудь теорією, Waterhouse і співавт. (1998) запропонували модель механізму, за яким днРНК (двониткова РНК) може використовуватися для зменшення продукування білка. Дана технологія базується на присутності молекул днРНК, які містять послідовність, що по суті ідентична послідовності мРНК цільового гена або його частинам, у даному випадку мРНК, що кодує поліпептид відповідно до винаходу. Зручно те, що днРНК може синтезуватися з одного промотору у рекомбінантному векторі або хазяйській клітині, в яких смислова і антисмислова послідовності фланковані чужорідною послідовністю, яка забезпечує гібридизацію смислової і антисмислової послідовностей з формуванням молекули днРНК, в якій чужорідна послідовність формує петльову структуру. Створення і одержання придатних молекул днРНК для даного винаходу лежить у межах компетенції фахівця, кваліфікованого у даній галузі техніки, зокрема див. Waterhouse et al. (1998), Smith et al. (2000), WO 99/32619, WO 99/53050, WO 99/49029, а також WO 01/34815. В одному прикладі вводять ДНК, яка направляє синтез, щонайменше, частково двониткового (дуплексного) РНК-продукту (продуктів), що має гомологію до цільового гена, який необхідно інактивувати. Таким чином, ДНК включає і смислову, і антисмислову послідовності, які при транскрипції в РНК можуть гібридизуватися з формуванням області двониткової РНК. У переважному варіанті здійснення смислова і антисмислова послідовності розділені спейсерною областю, яка включає інтрон, що піддається сплайсингу при транскрипції в РНК. Дана схема, як було показано, приводить до більш високої ефективності сайленсингу гена. Двониткова область може включати одну або дві молекули РНК, які транскрибують або з однієї області ДНК, або з двох. Присутність двониткової молекули, як вважають, індукує відповідь ендогенної системи рослини, яка руйнує як двониткову РНК, так і гомологічний РНК-транскрипт цільового гена рослини, ефективно зменшуючи або усуваючи активність цільового гена. Довжина смислової і антисмислової послідовностей, які гібридизуються, повинна, для кожної, складати, щонайменше, 19 безперервних нуклеотидів, переважно, щонайменше, 30 або 50 нуклеотидів і, більш переважно, щонайменше, 100, 200, 500 або 1000 нуклеотидів. Може використовуватися повнорозмірна послідовність, що відповідає повному транскрипту гена. Довжини, найбільш переважно, складають 100-2000 нуклеотидів. Ступінь ідентичності смислової і антисмислової послідовностей цільовому транскрипту повинен складати, щонайменше, 85 %, переважно, щонайменше, 90 %, а більш переважно, 95-100 %. Молекула РНК, безумовно, може включати чужорідні послідовності, які можуть стабілізувати молекулу. Молекула РНК може експресуватися під контролем промоторів РНК-полімерази II або РНКполімерази III. Приклади останнього включають промотори тРНК або мяРНК. Переважна молекула малої інтерферуючої РНК ("міРНК") включає нуклеотидну послідовність, яка ідентична послідовності з приблизно 19-21 нуклеотиду цільової мРНК. Переважно, цільова послідовність мРНК починається з динуклеотиду AA, має вміст GC приблизно 30-70 % (переважно, 30-60 %, більш переважно 40-60 % і, найбільш переважно, приблизно 45-55 %), і не має високої ідентичності з будь-якою нуклеотидною послідовністю, за винятком цільової послідовності у геномі рослини ячменю, в який вона повинна бути введена, наприклад, при визначенні за допомогою стандартного пошуку BLAST. МікроРНК МікроРНК регуляція являє собою спеціалізоване відгалуження шляху РНК сайленсингу, що розвинулося у спосіб регуляції генів, відмінний від звичайного РНКі/ПТСГ. МікроРНК є особливим класом малих РНК, які кодуються геноподібними елементами, організованими у характерні інвертовані повтори. При транскрипції з генів мікроРНК синтезуються РНКпопередники зі структурою стебло-петля, з яких згодом процесуються мікроРНК. МікроРНК звичайно мають довжину приблизно 21 нуклеотид. МікроРНК, що утворилися, включаються в RISC-подібні комплекси, що містять специфічне сімейство білків Argonaute, які викликають сіквенс-специфічну репресію гена (Millar and Waterhouse, 2005; Pasquinelli et al, 2005; Almeida and Allshire, 2005). Косупресія Іншим молекулярним біологічним підходом, який може використовуватися, є косупресія. Механізм косупресії повністю не вивчений, однак, як припускають, вона включає посттранскрипційний сайленсинг генів (ПТСГ), і у даному відношенні може бути досить подібною до багатьох прикладів антисмислової супресії. Вона включає введення додаткової копії гена або його фрагмента у рослину, у смисловій орієнтації відносно промотору для його експресії. Розмір смислового фрагмента, його відповідність областям цільового гена, а також 24 UA 101480 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ступінь ідентичності його послідовності цільовому гену - такі ж, як і у випадку антисмислових послідовностей, описаних вище. У деяких випадках додаткова копія генної послідовності порушує експресію цільового гена рослини. Для одержання інформації стосовно методів здійснення косупресії див. WO 97/20936 і EP 0465572. Конструкції нуклеїнових кислот Конструкції нуклеїнових кислот, придатні для одержання трансгенних рослин, можуть бути легко створені з використанням стандартних методів. При введенні області, що кодує мРНК, конструкція може включати послідовності інтронів. Вказані послідовності інтронів можуть сприяти експресії трансгену у рослині. Термін "інтрон" використовується у стандартному значенні і означає генетичний сегмент, що транскрибується, але при цьому не кодує білок і вирізається з РНК перед трансляцією. Інтрони можуть бути введені у 5'-UTR або кодуючу область, якщо трансген кодує продукт, що транслюється, або у будь-яку іншу ділянку області, що транскрибується, якщо трансген не кодує продукт, що транслюється. Проте, у переважному варіанті здійснення, будь-яка область, що кодує поліпептид, представлена у вигляді єдиної відкритої рамки зчитування. Як відомо кваліфікованому фахівцю, такі відкриті рамки зчитування можуть бути одержані шляхом зворотної транскрипції мРНК, що кодує поліпептид. Щоб забезпечити належну експресію гена, що кодує цільову мРНК, конструкція нуклеїнової кислоти звичайно включає один або більше регуляторних елементів, таких як промотори, енхансери, а також послідовності термінації транскрипції або поліаденілювання. Такі елементи відомі у рівні техніки. Область ініціації транскрипції, що включає регуляторний елемент(и), може бути присутньою для забезпечення регульованої або конститутивної експресії у рослині. Переважно, експресія, щонайменше, відбувається у клітинах насінини. Був описаний ряд конститутивних промоторів, які активні у клітинах рослини. Придатні промотори для конститутивної експресії у рослинах включають, крім інших, 35S промотор вірусу мозаїки цвітної капусти (CaMV), 35S промотор вірусу мозаїки ранника (FMV), промотор паличкоподібного вірусу цукрової тростини, промотор вірусу жовтої мозаїки комеліни, промотор, що легко індукується, маленької субодиниці рибулозо-1,5-бісфосфаткарбоксилази, промотор цитозольної триозофосфат-ізомерази рису, промотор аденінфосфорибозилтрансферази Arabidopsis, промотор гена актину 1 рису, промотори манопінсинтази і октопінсинтази, промотор Adh, промотор сахарозосинтази, промотор комплексу R генів, а також промотор гена хлорофіл α/β зв'язувального білка. Перераховані промотори використовувалися для створення ДНК векторів, які експресувалися у рослинах; див., наприклад, WO 84/02913. Всі вказані промотори використовувалися для створення різних типів рекомбінантних ДНК векторів, що експресуються у рослинах. Промотор може регулюватися такими факторами як температура, світло або стрес. Звичайно регуляторні елементи розташовані на 5'-кінці генетичної послідовності, що експресується. Конструкція може також містити інші елементи, які посилюють транскрипцію, такі як nos-3' або ocs-3' області поліаденілювання або термінатори транскрипції. 5'-нетрансльовані лідерні послідовності можуть бути одержані з промотору, вибраного для експресії послідовності гетерологічного гена, і можуть бути специфічно модифіковані, якщо необхідно збільшити трансляцію мРНК. Для одержання інформації стосовно оптимізації експресії трансгенів, див. огляд Koziel et al., (1996). 5'-нетрансльовані області можуть бути також одержані з РНК вірусів рослин (вірусу тютюнової мозаїки, вірусу гравіювання тютюну, вірусу карликової мозаїки кукурудзи, вірусу мозаїки люцерни і т.д.), з придатних еукаріотичних генів, генів рослин (пшениці і сигнальної послідовності гена хлорофіл α/β зв'язувального білка кукурудзи), або з послідовності синтетичного гена. Даний винахід не обмежується застосуванням конструкцій, в яких нетрансльована область одержана з 5'-нетрансльованої послідовності, яка супроводжує послідовність промотору. Лідерна послідовність може бути також одержана від чужорідного промотору або кодуючої послідовності. Лідерні послідовності, які можуть застосовуватися у межах даного винаходу, включають лідерну послідовність білка Hsp70 кукурудзи (US 5362865 і US 5859347), а також омега-елемент ВТМ. Термінація транскрипції забезпечується за допомогою 3'-нетрансльованої ДНК послідовності, функціонально пов'язаної у химерному векторі з цільовим полінуклеотидом. 3'нетрансльована область рекомбінантної молекули ДНК містить сигнал поліаденілювання, який функціонує у рослинах, викликаючи приєднання аденілат нуклеотидів до 3'-кінця РНК. 3'нетрансльована область може бути одержана з різних генів, які експресуються у клітинах рослин. Звичайно використовують 3'-нетрансльовану область нопалінсинтази, 3'нетрансльовану область гена малої субодиниці Rubisco, 3'-нетрансльовану область гена 25 UA 101480 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 запасного білка 7S сої. Також придатними є 3'-нетрансльовані області, що транскрибуються, які містять сигнал поліаденілювання генів Ti-плазміди (від англ. tumor-inducing - пухлиногенний) Agrobacterium tumefaciens. Як правило, конструкція нуклеїнових кислот включає селективний маркер. Селективні маркери допомагають в ідентифікації і скринінгу рослин або клітин, які були трансформовані екзогенною молекулою нуклеїнової кислоти. Селективний маркерний ген може надавати клітинам ячменю стійкість до антибіотика або гербіциду, або дозволяти утилізацію таких субстратів, як маноза. Селективний маркер переважно надає клітинам ячменю стійкість до гігроміцину. Переважно, конструкція нуклеїнових кислот стабільно інтегрована у геном рослини. Відповідно, нуклеїнова кислота включає необхідні елементи, які дозволяють молекулі інтегруватися у геном, або конструкцію вміщують у придатний вектор, який може інтегруватися у хромосому рослинної клітини. Один з варіантів здійснення даного винаходу включає застосування рекомбінантного вектора, який включає, щонайменше, трансген, описаний у даній заявці, вбудований у будьякий вектор, здатний доставляти молекулу нуклеїнової кислоти у хазяйську клітину. Такий вектор містить гетерологічні послідовності нуклеїнових кислот, які є послідовностями нуклеїнових кислот, що не присутні у природі, злиті з молекулами нуклеїнових кислот даного винаходу, і які переважно походять з виду, відмінного від видів, з яких походить молекула (молекули) нуклеїнової кислоти. Вектор може бути РНК або ДНК, прокаріотичним або еукаріотичним, і звичайно є вірусом або плазмідою. Множина векторів, придатних для стабільної трансфекції клітин рослин або створення стабільних трансгенних рослин, була описана, наприклад, у Pouwels et al., Cloning Vectors: А Laboratory Manual, 1985, supp. 1987; Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; а також Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. Як правило, рослинні вектори експресії включають, наприклад, один або декілька рослинних генів, клонованих під транскрипційним контролем 5'- і 3'-регуляторних послідовностей, а також домінантний селективний маркер. Такі рослинні вектори експресії можуть також містити промоторну регуляторну область (наприклад, регуляторну область, що контролює індуковану або конститутивну, регульовану зовнішніми умовами або розвитком, або клітинно-, або тканиноспецифічну експресію), сайт ініціації транскрипції, сайт зв'язування рибосоми, сигнал процесингу РНК, сайт термінації транскрипції і/або сигнал поліаденілювання. Трансгенні рослини Трансгенні рослини ячменю, як визначено у межах даного винаходу, включають рослини (а також частини і клітини вказаних рослин) і їх потомство, які були генетично змінені з використанням методів генної інженерії, з метою викликати продукування, щонайменше, одного полінуклеотиду і/або поліпептиду у бажаній рослині або органі рослини. Трансгенні рослини можуть бути одержані з використанням методів, відомих з рівня техніки, таких як описані у загальних рисах в A. Slater et al., Plant Biotechnology-The Genetic Manipulation of Plants, Oxford University Press (2003), а також в P. Christou and H. Klee, Handbook of Plant Biotechnology, John Wiley and Sons (2004). У переважному варіанті здійснення трансгенні рослини є гомозиготними по кожному гену, який був введений (трансгену), внаслідок чого їх потомство не розщеплюється по бажаному фенотипу. Трансгенні рослини можуть також бути гетерозиготними по введеному трансгену (трансгенах), наприклад, у потомстві F1, яке було вирощене з гібридної насінини. Такі рослини можуть забезпечити переваги, такі як гібридна сила, відомі з рівня техніки. Було описано чотири загальних методи прямої доставки гена у клітини: (1) хімічні методи (Graham et al., 1973); (2) фізичні методи, такі як мікроін'єкції (Capecchi, 1980); електропорація (див., наприклад, WO 87/06614, US 5472869, 5384253, WO 92/09696 і WO 93/21335), а також генна гармата (див., наприклад, US 4,945,050 і US 5,141,131); (3) вірусні вектори (Clapp, 1993; Lu et al., 1993; Eglitis et al., 1988); і (4) рецепторно-опосередковані механізми (Curiel et al., 1992; Wagner et al., 1992). Методи прискорення, які можуть використовуватися, включають, наприклад, бомбардування мікрочастинками і т.п. Одним з прикладів методу доставки трансформуючої молекули нуклеїнової кислоти у клітини рослин є бомбардування мікрочастинками. Даний метод був описаний в огляді Yang et al., Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, England (1994). Небіологічні частинки (мікрочастинки) можуть бути покриті нуклеїновими кислотами і введені у клітини за допомогою рушійної сили. Приклади частинок включають частинки з вольфраму, золота, платини і т.п. Особлива перевага бомбардування мікрочастинками, на додаток до того, що даний метод є ефективним способом відтворюваної 26 UA 101480 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 трансформації однодольних, полягає у тому, що не потрібне ні виділення протопластів, ні сприйнятливість до інфекції Agrobacterium. Ілюстративним варіантом здійснення способу доставки ДНК у клітини кукурудзи (Zea mays) за допомогою прискорення є біолістична система доставки α-частинок, яка може використовуватися для пропускання частинок, покритих ДНК, через екран, наприклад, з нержавіючої сталі або екран Nytex, на поверхню фільтра, покриту суспензією клітин кукурудзи. Система доставки частинок, придатна для застосування у даному винаході, є гарматою PDS-1000/He з прискоренням гелієм, що постачається Bio-Rad Laboratories. Для бомбардування, клітини у суспензії можуть бути сконцентровані на фільтрах. Фільтри, що містять клітини, що бомбардуються, поміщають на відповідній відстані під пластиною, що зупиняє мікрочастинки. Якщо необхідно, між гарматою і клітинами, що бомбардуються, також поміщають один або більше екранів. В альтернативі, незрілі зародки або інші цільові клітини можуть бути нанесені на тверде культуральне середовище. Клітини, що бомбардуються, поміщають на відповідній відстані під пластиною, що зупиняє мікрочастинки. Якщо необхідно, між прискорювачем і клітинами, що бомбардуються, також поміщають один або більше екранів. За допомогою способів, викладених у даній заявці, можна одержати до 1000 або більше осередків клітин, які транзиєнтно експресують маркерний ген. Число клітин в осередку, які експресують продукт екзогенного гена через 48 годин після бомбардування, звичайно варіює від однієї до десяти і в середньому складає одну-три клітини. У трансформації за допомогою бомбардування можна оптимізувати умови культивування перед бомбардуванням і параметри бомбардування, щоб одержати максимальну кількість стабільних трансформантів. У даному методі важливі як фізичні, так і біологічні параметри бомбардування. Фізичні фактори включають маніпуляції з осадженням ДНК/мікрочастинок або фактори, які впливають на політ і швидкість макро- або мікрочастинок. Біологічні фактори включають всі стадії, що включаються у маніпуляції з клітинами до і безпосередньо після бомбардування, осмотичне регулювання цільових клітин, направлене на пом'якшення травми, пов'язаної з бомбардуванням, а також властивості трансформуючої ДНК, такі як лінеаризована ДНК або інтактні суперскручені плазміди. Припускають, що маніпуляції, які проводяться перед бомбардуванням, особливо важливі для успішної трансформації незрілих зародків. В іншому альтернативному варіанті здійснення можуть бути стабільно трансформовані пластиди. Описаний спосіб трансформації пластид вищих рослин, що включає доставку за допомогою гармати на частинках ДНК, що містить селективний маркер, і направлення ДНК у геном пластиди за допомогою гомологічної рекомбінації (US 5451513, US 5545818, US 5877402, US 5932479 і WO 99/05265). Таким чином, розглядається, що може бути потрібно регулювати різні аспекти параметрів бомбардування у дрібномасштабних дослідженнях, щоб повністю оптимізувати умови. Може зокрема бути потрібно регулювати фізичні параметри, такі як відстань проміжку, відстань польоту, відстань тканини, а також тиск гелію. Можна також мінімізувати травматичні фактори, змінюючи умови, які впливають на фізіологічний стан реципієнтних клітин, і тому це може впливати на ефективність трансформації та інтеграції. Наприклад, осмотичний стан, гідратація тканини і фаза субкультури або клітинний цикл реципієнтних клітин можуть регулюватися для оптимальної трансформації. Виконання інших звичайних регуляцій відоме фахівцям у даній галузі техніки з врахуванням даного опису. Перенесення за допомогою Agrobacterium є широко застосовуваною системою для введення генів у клітини рослини, оскільки ДНК може бути введена у цілі тканини рослини, обходячи, таким чином, потребу у регенерації інтактної рослини з протопласта. Застосування агробактеріальних рослинних, інтегративних векторів для введення ДНК у клітини рослини відоме у рівні техніки (див., наприклад, US 5177010, US 5104310, US 5004863, US 5159135). Крім того, інтеграція Т-ДНК є відносно точним процесом, який приводить до малого числа перебудов. Область ДНК, яка піддається перенесенню, позначена бордерними послідовностями, при цьому ДНК, що знаходиться між ними, звичайно вбудовується у геном рослини. Сучасні вектори для агробактеріальної трансформації здатні до реплікації в E. Coli, як і в Agrobacterium, забезпечуючи зручність при маніпуляціях, як описано у Klee et al., In: Plant DNA Infectious Agents, Hohn and Schell, eds., Springer-Verlag, New York, pp. 179-203 (1985). Крім того, технологічні досягнення у галузі векторів для перенесення генів за допомогою Agrobacterium привели до поліпшень у розташуванні генів і сайтів рестрикції у векторах, що полегшує конструювання векторів, здатних до експресії генів, що кодують різні поліпептиди. Описані вектори несуть зручні мультилінкерні області між промотором і сайтом поліаденілювання для 27 UA 101480 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 прямої експресії генів, що вбудовуються, які кодують поліпептид, і є придатними у межах даного винаходу. Крім того, для трансформації може використовуватися Agrobacterium, що містить активні і неактивні Ti-гени. У тих різновидах рослин, в яких агробактеріальна трансформація ефективна, даний метод є переважним завдяки простоті і вивченості перенесення генів. Трансгенна рослина, одержана із застосуванням методів агробактеріальної трансформації, звичайно містить один генетичний локус на одній хромосомі. Такі трансгенні рослини можуть бути згадані як гемізиготні по введеному гену. Більш переважною є трансгенна рослина, яка є гомозиготною по введеному структурному гену, тобто, трансгенна рослина, яка містить два доданих гени, один ген в одному і тому ж локусі на кожній хромосомі у парі хромосом. Гомозиготна трансгенна рослина може бути одержана при статевому розмноженні (самозапиленні) покоління незалежної трансгенної рослини після розщеплення, яка містить один доданий ген, пророщуванні частини одержаного насіння і аналізі одержаних рослин на присутність цільового гена. Потрібно також розуміти, що дві різних трансгенних рослини можуть бути схрещені з одержанням потомства, яке містить два незалежно розщеплених екзогенних гени. Самозапилення відповідного потомства може дати рослини, які є гомозиготними по обох екзогенних генах. Зворотне схрещування з батьківською рослиною і ауткрос з нетрансгенною рослиною також розглядається, оскільки є вегетативним розмноженням. Описи інших способів розмноження, які звичайно використовуються для різних ознак і культур, можна знайти у Fehr, In: Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis (1987). Трансформація протопластів рослини може бути проведена з використанням методів, що базуються на преципітації з фосфатом кальцію, обробці поліетиленгліколем, електропорації і комбінаціях перерахованих методів. Застосування вказаних систем до різних видів рослин залежить від здатності відновлювати специфічну лінію рослини з протопластів. Приклади способів регенерації злаків з протопластів описані у Fujimura et al., 1985; Toriyama et al., 1986; Abdullah et al., 1986. Також можуть використовуватися інші методи трансформації клітини, які включають, крім іншого, введення ДНК у рослини за допомогою прямого перенесення ДНК у пилок, пряму ін'єкцію ДНК у репродуктивні органи рослини або пряму ін'єкцію ДНК у клітини незрілих зародків, з подальшою регідратацією висушених зародків. Регенерація, розвиток і культивування рослин з одного трансформованого протопласта рослини або з різних трансформованих експлантів відомі у рівні техніки (Weissbach et al., In: Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, Calif., (1988)). Вказаний процес регенерації і зростання звичайно включає стадії селекції трансформованих клітин, культивування одержаних окремих клітин у звичайних стадіях розвитку ембріона до стадії паростка, що дав коріння. Трансгенні зародки і насіння регенерують аналогічним шляхом. Потім одержані трансгенні паростки з корінням висаджують у придатне середовище для зростання рослини, таке як ґрунт. Розвиток або регенерація рослин, які містять чужорідний, екзогенний ген, відомі з рівня техніки. Переважно, регенеровані рослини є самозапилюваними, щоб забезпечувати одержання гомозиготних трансгенних рослин. В інших випадках, пилок, який одержують від регенерованих рослин, запилює вирощені з насіння рослини агротехнічно важливих ліній. У свою чергу, пилок з рослин вказаних важливих ліній використовується для запилення регенерованих рослин. Трансгенну рослину даного винаходу, що містить цільову екзогенну нуклеїнову кислоту, вирощують з використанням методів, відомих фахівцеві, кваліфікованому у даній галузі техніки. Способи трансформації дводольних рослин, передусім за допомогою Agrobacterium tumefaciens, і одержання трансгенних рослин були описані для бавовни (US 5004863, US 5159135, US 5518908), сої (US 5569834, US 5416011), капусти (US 5463174), арахісу (Cheng et al., 1996) і гороху (Grant et al., 1995). Способи трансформації злакових рослин, таких як ячмінь, введення генетичної модифікації у рослину шляхом введення екзогенної нуклеїнової кислоти і регенерація рослин з протопластів або незрілих зародків рослини відомі у рівні техніки, див. наприклад, CA 2092588, AU 61781/94, AU 667939, US 6100447, PCT/US97/10621, US 5589617, US 6541257 і WO 99/14314. Переважно, трансгенні рослини ячменю одержують за допомогою методів трансформації, опосередкованої Agrobacterium tumefaciens. Вектори, що несуть цільову конструкцію нуклеїнової кислоти, можуть бути введені у клітини ячменю, що регенеруються, тканин рослин або експлантів, які культивують, або придатні рослинні системи, такі як протопласти. Клітини ячменю, що регенеруються, переважно взяті з щитка незрілих зародків, зрілих зародків, калусу, одержаного з них, або меристематичної тканини. З метою підтвердження 28