Горизонтальний спосіб виявлення коагулазопозитивних стафілококів у молоці та молокопродуктах

Реферат: Горизонтальний спосіб виявлення коагулазопозитивних стафілококів у молоці та молокопродуктах в якому використовують дослідну суспензію, яка готується у співвідношенні 1:5 з послідуючим інкубуванням отриманої суспензії упродовж 18±2 годин за температури 3 35±1 °C та наступним її посівом у кількості 1,0-1,1 см у велику чашку Петрі, що містить агарове середовище Беард-Паркера. У подальшому витримують за кімнатної температури (20±2 °C) упродовж 10-15 хвилин та інкубують у термостаті за температури 35±1 °C упродовж 24±1 та 48±1 годин для отримання типових колоній коагулазопозитивних стафілококів упродовж 24±1 годин у вигляді чорних або сірих, блискучих і випуклих, діаметром 1,0-1,5 мм (через 48±1 годин - діаметром 1,5-2,5 мм) і оточених чистою зоною, яка через 24±1 годин інкубації має опалесценцію кільця. UA 115760 U (12) UA 115760 U UA 115760 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до сільського господарства, зокрема до ветеринарної медицини, і може бути використана для удосконалення горизонтального методу виявлення коагулазопозитивних стафілококів у молоці та молокопродуктах при встановленні їх безпечності у виробничих лабораторіях на потужностях з переробки, виробництва, реалізації і зберігання молока та молокопродуктів, у бактеріологічних відділах державних лабораторіях ветеринарної медицини. За результатами цього методу можна отримати якісні показники при удосконаленні горизонтального методу виявлення коагулазопозитивних стафілококів у молоці та молокопродуктах. Аналогом корисної моделі є спосіб визначення загальної кількості мікроорганізмів у молоці та молокопродуктах згідно з ДСТУ 7357:2013 [1], який базується на особливості аеробів та факультативних анаеробів рости на живильному агарі за температури 37±0,5 °C з утворенням колоній та послідуючим їх підрахунком. Недоліком даного методу є те, що він довготривалий, громіздкий і значні грошові затрати на живильний агар. Крім цього даний метод дає похибку від 25 до 40 %. Прототипом корисної моделі є горизонтальний метод виявлення коагулазопозитивних стафілококів у молоці та молочних продуктах [2], у якому застосовують великий об'єм середовища для приготування вихідної суспензії, що готується у співвідношенні 1:10 (маса проби молока, молокопродуктів до об'єму середовища попереднього концентрування). Недоліком даного методу є те, що він громіздкий, з підвищеною вартістю середовищ, довготривалістю інкубування в агарі. Крім цього даний метод дає похибку у 25-30 %. В основу даної корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб удосконалення горизонтального методу виявлення коагулазопозитивних стафілококів у молоці та молокопродуктах шляхом зміни кількості використовуваної дослідної суспензії, яка готується у 3 3 співвідношенні 1:5 (проби молока та молокопродуктів у кількості 10-11 см (г) та 50-55 см селективного середовища попереднього концентрування (бульйон Джоліті та Кантоні із Твіном80), послідуючим інкубуванням отриманої суспензії упродовж 18±2 годин за температури 35±1 °C та наступним посівом у кількості 1,0-1,1 см у велику чашку Петрі, що містить агарове середовище Беард-Паркера, у подальшому витримуючи за кімнатної температури (20±2 °C) упродовж 10-15 хвилин та інкубуванням у термостаті за температури 35±1 °C упродовж 24±1 та 48±1 годин, щоб отримати типові колонії коагулазопозитивних стафілококів упродовж 24±1 годин у вигляді чорних або сірих, блискучих і випуклих, діаметром 1,0-1,5 мм (через 48±1 годин діаметром 1,5-2,5 мм) і оточених чистою зоною, яка через 24±1 годин інкубації має опалесценцію кільця. Поставлена задача вирішується тим, що використовують дослідну суспензію, яка готується у 3 співвідношенні 1:5 (проби молока та молокопродуктів у кількості 10-11 см (г) та 50-55 см селективного середовища попереднього концентрування (бульйон Джоліті та Кантоні із Твіном80), у подальшому проводять інкубування отриманої суспензії упродовж 18±2 годин за температури 35±1 °C. Потім проводять посіви отриманої суспензії у кількості 1,0-1,1 см у велику чашку Петрі, що містить агарове середовище Беард-Паркера, шляхом розтирання шпателем інокуляту по поверхні агару. Дають висохнути агару в чашці із закритою кришкою упродовж 1015 хвилин за кімнатної температури (20±2 °C). Потім проводять інкубування: ставлять чашку Петрі догори дном у термостат і витримують упродовж 24±1 та 48±1 годин за температури 35±1 °C, щоб отримати типові колонії коагулазопозитивних стафілококів упродовж 24±1 годин у вигляді чорних або сірих, блискучих і випуклих, діаметром 1,0-1,5 мм (через 48±1 годин діаметром 1,5-2,5 мм) і оточених чистою зоною, яка через 24±1 годин інкубації має опалесценцію кільця. Етапи вирішення даного завдання наведено у нижчезазначених прикладах. Приклад 1. Для розробки методу використовують дослідну суспензію, яка готується у 3 3 співвідношенні 1:6 (проби молока та молокопродуктів у кількості 14-15 см (г) та 84-90 см селективного середовища попереднього концентрування (бульйон Джоліті та Кантоні із Твіном80), у подальшому проводять інкубування отриманої суспензії упродовж 20±2 годин за температури 28±1 °C. Потім проводять посіви отриманої суспензії у кількості 0,5-0,6 см у велику чашку Петрі, що містить агарове середовище Беард-Паркера, шляхом розтирання шпателем інокуляту по поверхні агару. Дають висохнути агару в чашці із закритою кришкою упродовж 15 16 хвилин за кімнатної температури (18±2 °C). Потім проводять інкубування: ставлять чашку Петрі догори дном у термостат і витримують упродовж 25±1 та 49±1 годин за температури 35±1 °C, щоб отримати типові колонії коагулазопозитивних стафілококів упродовж 25±1 годин у вигляді чорних або сірих, блискучих і випуклих, діаметром 1,0-1,5 мм (через 49±1 годин діаметром 1,5-2,5 мм) і оточених чистою зоною, яка через 25±1 юдин інкубації має опалесценцію кільця. 1 UA 115760 U 5 10 15 20 25 Приклад 2. Для розробки методу використовують дослідну суспензію, яка готується у 3 3 співвідношенні 1:8 (проби молока та молокопродуктів у кількості 21-22 см (г) та 168-176 см селективного середовища попереднього концентрування (бульйон Джоліті та Кантоні із Твіном80), у подальшому проводять інкубування отриманої суспензії упродовж 24±2 годин за 3 температури 29±1 °C. Потім проводять посіви отриманої суспензії у кількості 0,8-1,0 см у велику чашку Петрі, що містить агарове середовище Беард-Паркера, шляхом розтирання шпателем інокуляту по поверхні агару. Дають висохнути агару в чашці із закритою кришкою упродовж 12-13 хвилин за кімнатної температури (25±2 °C). Потім проводять інкубування: ставлять чашку Петрі догори дном у термостат і витримують упродовж 22±1 та 46±1 годин за температури 38±1 °C, щоб отримати типові колони коагулазопозитивних стафілококів упродовж 22±1 годин у вигляді чорних або сірих, блискучих і випуклих, діаметром 1,0-1,5 мм (через 46±1 годин - діаметром 1,5-2,5 мм) і оточених чистою зоною, яка через 22±1 годин інкубації має опалесценцію кільця. Приклад 3. Для розробки методу використовують дослідну суспензію, яка готується у 3 3 співвідношенні 1:5 (проби молока та молокопродуктів у кількості 10-11 см (г) та 50-55 см селективного середовища попереднього концентрування (бульйон Джоліті та Кантоні із Твіном80), у подальшому проводять інкубування отриманої суспензії упродовж 18±2 годин за 3 температури 35±1 °C. Потім проводять посіви отриманої суспензії у кількості 1,0-1,1 см у велику чашку Петрі, що містить агарове середовище Беард-Паркера, шляхом розтирання шпателем інокуляту по поверхні агару. Дають висохнути агару в чашці із закритою кришкою упродовж 10-12 хвилин за кімнатної температури (20±2 °C). Потім проводять інкубування: ставлять чашку Петрі догори дном у термостат і витримують упродовж 24±1 та 48±1 годин за температури 35±1 °C, щоб отримати типові колонії коагулазопозитивних стафілококів упродовж 24±1 годин у вигляді чорних або сірих, блискучих і випуклих, діаметром 1,0-1,5 мм (через 48±1 годин - діаметром 1,5-2,5 мм) і оточених чистою зоною, яка через 24±1 годин інкубації має опалесценцію кільця. Порівняльна оцінка результатів випробування вищезазначених способів удосконалення горизонтального методу виявлення коагулазопозитивних стафілококів у молоці та молокопродуктів до прототипу наведені у таблиці 1. 30 Таблиця 1 Порівняння способів удосконаленого горизонтального методу виявлення коагулазопозитивних стафілококів у молоці та молокопродуктів до прототипу № п/ 1. 2. 3. 4. Показники, що порівнюються Приготування дослідної суспензії: Кількість молока, 3 молокопродуктів, см або г Кількість бульйону Джоліті та Кантоні із Твіном-80, см Співвідношення Витримування суспензії в термостаті: За температури Експозиція, год. Посів у чашки Петрі: кількість чашок Кількість вихідної 3 суспензії, см Середовище Висихання агару в чашках За температури Експозиція, хв. 1 Приклади 2 3 25,0 14-15 21-22 10-11 250 84-90 168-176 50-55 1:10 1:6 1:8 1:5 35 або 37 °C 16-20 28±1 °C 20±2 29±1 °C 24±2 35±1 °C 18±2 Прототип 2 маленьких 1 велика 1 велика 1 велика 0,1 0,5-0,6 0,8-1,0 1,0-1,1 агарове агарове агарове агарове середовище середовище середовище середовище Беард-Паркера Беард-Паркера Беард-Паркера Беард-Паркера 20±2 °C 15 хв 18±2 °C 15-16 2 25±2 °C 12-13 20±2 °C 10-12 UA 115760 U Продовження таблиці 1 5. Інкубування середовища агарового середовища Беард-Паркера із посівом за температури Експозиція, год. 6. Ідентифікація типових колоній коагулазопозитивних стафілококів через 24 год. 7. Інкубування середовища агарового середовища Беард-Паркера із посівом за температури Експозиція, год. 8. Ідентифікація колоній коагулазопозитивних стафілококів через 48 год. Швидкість визначення досліду, год. Стабільність показників по удосконаленому горизонтальному методу 10. виявлення коагулазопозитивних стафілококів у молоці, молокопродуктах, % Співвідношення результатів досліджень щодо визначення 11. наявності лістерій у молоці, молокопродуктах, у % Співвідношення результатів досліджень щодо визначення 12. наявності сальмонел у молоці, молокопродуктах, у % 9. 5 10 35 або 37 °C 35 °C 38 °C 35±1 °C 24 чорні або сірі, блискучі і випуклі діаметром 1,01,5 мм і оточені чистою зоною з опалесценцією кільця 25±1 чорні або сірі, блискучі і випуклі діаметром 1,01,5 мм і оточені чистою зоною з опалесценцією кільця 22±1 чорні або сірі, блискучі і випуклі діаметром 1,01,5 мм і оточені чистою зоною з опалесценцією кільця 24±1 чорні або сірі, блискучі і випуклі діаметром 1,01,5 мм і оточені чистою зоною з опалесценцією кільця 35 або 37 °C 35 °C 38 °C 35±1 °C 48 чорні або сірі, блискучі і випуклі діаметром 1,52,5 мм і оточені чистою зоною 49±1 чорні або сірі, блискучі і випуклі діаметром 1,52,5 мм і оточені чистою зоною 46±1 чорні або сірі, блискучі і випуклі діаметром 1,52,5 мм і оточені чистою зоною 48±1 чорні або сірі, блискучі і випуклі діаметром 1,52,5 мм і оточені чистою зоною 80-82 год. 84±2 81±2 67±2 94,7 75,0 84,5 99,9 87,0-93,6 85,4-87,0 76,3-80,2 98,9-99,5 84,9-87,8 87,3-89,8 83,7-85,1 98,2-99,6 Дані таблиці 1 свідчать, що більш достовірні дані у порівнянні з результатами досліджень щодо визначення наявності лістерій у молоці, молокопродуктах - у 98,9-99,5 % [3] та до результатів досліджень щодо визначення наявності сальмонел у молоці, молокопродуктах - у 98,2-99,6 % [4] були отримані при застосуванні методу за прикладом № 3. Також найвища стабільність показників по удосконаленому горизонтальному методу виявлення коагулазопозитивних стафілококів у молоці та молокопродуктах була за прикладом № 3-99,9 %. Використовуючи метод за прикладом № 3, ми провели виявлення коагулазопозитивних стафілококів у молоці та молокопродуктах удосконаленим горизонтальним методом на 67 пробах: молоко сире (уміст жиру 3.7 %) -!0 проб; молоко пастеризоване (уміст жиру 2,8 %) - 10 проб; вершки - 6 проб; вершки пастеризовані - 5 проб; сир кисломолочний - 6 проб; сир твердий 3 UA 115760 U 7 проб; сир плавлений - 8 проб; масло вершкове - 9 проб; спред - 6 проб. Результати наведені у таблиці 2. Таблиця 2 Показники виявлення удосконаленого горизонтального методу виявлення коагулазопозитивних стафілококів у молоці та молокопродуктах за прикладом № 3 Виявлення коагулазопозитивних стафілококів за забарвленням та розміром колоній за прикладом № 3 № Наявність колоній Відсутність колоній п/п Кількість Кількість коагулазопозитивних коагулазопозитивних проб проб стафілококів стафілококів Молоко сире (уміст Нетипові колонії 1 n=2 n=8 жиру 3,7 %), n=10 блискучі чорні Молоко пастеризоване з/або без вузького Через 24±1 год. типові n=10 2 (уміст жиру 2,8 %), n=0 білого краю, чиста колонії чорні або сірі, n=10 зона блискучі і випуклі відсутня, 3 Вершки, n=6 n=3 n=3 діаметром 1,0-1,5 мм (через 48±1 годин – Вершки пастеризовані, опалесцентне 4 n=0 діаметром 1,5-2,5 мм) і n=5 n=5 кільце теж оточені чистою зоною, Сир кисломолочний, відсутнє чи ледве 5 n=1 яка через 24 год. n=5 n=6 помітне; сірі інкубації має 6 Сир твердий, n=7 n=1 n=6 колонії без опалесценцію кільця і Сир плавлений, n=8 n=1 n=7 чистих зон 8 Масло вершкове, n=9 n=2 n=8 9 Спред, n=6 n=2 n=4 Перелік видів досліджуваних проб молока та молокопродуктів 5 10 15 20 25 30 35 Проведеними дослідженнями встановлено, що були виявлені типові колонії коагулазопозитивних стафілококів через 24±1 та 48±1 годин за температури 35±1 °C у наступних пробах молока та молокопродуктах: у 3-х пробах вершків; у 2-х пробах молока сирого, масла вершкового та спредах; у І пробі сиру кисломолочного, сиру твердого, сиру плавленого. У молоці пастеризованому, вершках пастеризованих типових колоній коагулазопозитивних стафілококів не було виявлено. Ці дані були стабільними та достовірними, отже, ці показники можна використовувати при оцінюванні безпечності молока та молокопродуктів. Крім того, слід зазначити, що метод є економним, простим у виконанні, а його результати дають конкретні якісні показники по забарвленню типових колоній коагулазопозитивних стафілококів чорного або сірого кольору, блискучих і випуклих, діаметром 1,0-1,5 мм (через 48±1 годин - діаметром 1,5-2,5 мм) і оточених чистою зоною, яка через 24±1 годин інкубації має опалесценцію кільця. Метод за прикладом № 3 нами пропонується як якісний спосіб удосконалення горизонтального методу виявлення коагулазопозитивних стафілококів у молоці та молокопродуктах поряд з іншими методами визначення їх безпечності (визначення загальної кількості мікроорганізмів (КМАФаМ), визначення бактерій групи кишкової палички, лістерій, сальмонел) [5]. Метод має перевагу перед існуючими якісними методами визначення безпечності молока та молокопродуктів тому, що результати мають достовірні показники за забарвленням типових колоній коагулазопозитивних стафілококів. Джерела інформації: 1. Молоко та молочні продукти. Методи мікробіологічного контролювання: ДСТУ 7357:2013. К.: Мінекономрозвитку України, 2014.-35 с. (Національний стандарт України). 2. Мікробіологія харчових продуктів і кормів для тварин. Горизонтальний метод підрахування коагулазопозитивних стафілококів (Staphylococcus aureus та інших видів) (ISO 11290-1:1996, ITD): ДСТУ ISO 6888-1:2003. - К.: Держспоживстандарт України, 2005. - 10с. (Національний стандарт України). 3. Мікробіологія харчових продуктів та кормів для тварин. Горизонтальний метод виявлення та підрахування Listeria monocytogenes. Частина 1. Метод виявлення (ISO 11290-1:1996, ITD): ДСТУ ISO 11290-1:2003. К.: Держспоживстандарт України, 2005. - 18 с. (Національний стандарт України). 4 UA 115760 U 5 4. Мікробіологія харчових продуктів і кормів для тварин. Горизонтальний метод виявлення Salmonella: ДСТУ EN 12824:2004. - К.: Держспоживстандарт України, 2005. - 20 с. (Національний стандарт України). 5. Довідник мікробіологічних методів дослідження харчових продуктів і кормів для тварин згідно з міжнародними стандартами / В.М. Івченко, В.В. Шарандак, О.І. Горбатюк та ін. - Біла Церква, 2006. - 264 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 20 Горизонтальний спосіб виявлення коагулазопозитивних стафілококів у молоці та молокопродуктах, який відрізняється тим, що використовують дослідну суспензію, яка 3 готується у співвідношенні 1:5 (проби молока та молокопродуктів у кількості 10-11 см (г) та 503 55 см селективого середовища попереднього концентрування (бульйон Джоліті та Кантоні із Твіном-80), з послідуючим інкубуванням отриманої суспензії упродовж 18±2 годин за 3 температури 35±1 °C та наступним її посівом у кількості 1,0-1,1 см у велику чашку Петрі, що містить агарове середовище Беард-Паркера, у подальшому витримують за кімнатної температури (20±2 °C) упродовж 10-15 хвилин та інкубують у термостаті за температури 35±1 °C упродовж 24±1 та 48±1 годин для отримання типових колоній коагулазопозитивних стафілококів упродовж 24±1 годин у вигляді чорних або сірих, блискучих і випуклих, діаметром 1,0-1,5 мм (через 48±1 годин - діаметром 1,5-2,5 мм) і оточених чистою зоною, яка через 24±1 годин інкубації має опалесценцію кільця. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5