Спосіб удосконалення горизонтального методу виявлення salmonella у м’ясі забійних тварин, птиці та м’ясопродуктах

Реферат: Спосіб удосконалення горизонтального методу виявлення Salmonella у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах. Використовують дослідну суспензію, яка готується у співвідношенні 1:5 3 (проби м'яса та м'ясопродуктів у кількості 10-11 г та 50-55 см середовища попереднього концентрування (буферизованої лептонної води), з послідуючим інкубуванням отриманої суспензії упродовж 16±2 годин за температури 35±1 °C та наступним селективним 3 концентруванням: отриману культуру у кількості 0,05-0,06 см переносять у пробірку, в якій 3 міститься 5-6 см середовища RV (середовище хлориду малахітового зеленого РаппапортаВасіліадіса), та витримують у термостаті за температури 41±1 °C упродовж 23±2 годин, також 3 3 переносять отриману цю культуру у кількості 5,0–5,1 см у колбу, що містить 50-51 см середовища селеніту цистину, та витримують у термостаті за температури 35±1 °C упродовж 23±2 годин. UA 109385 U (12) UA 109385 U UA 109385 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до сільського господарства, зокрема до ветеринарної медицини, і може бути використана для удосконалення горизонтального методу виявлення Salmonella у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах при встановленні їх безпечності у виробничих лабораторіях на потужностях з переробки, реалізації і зберіганні м'яса та м'ясопродуктів, у бактеріологічних відділах державних лабораторій ветеринарної медицини. За результатами цього методу можна отримати якісні показники при удосконаленні горизонтального методу виявлення Salmonella у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах. Аналогом корисної моделі є спосіб визначення загальної кількості мікроорганізмів, згідно з ГОСТ 9958-81 [1J, який базується на особливості аеробів та факультативних анаеробів рости на живильному агарі за температури 37±0,5 °C з утворенням колоній та послідуючим їх підрахунком. Недоліком даного методу є те, що він довготривалий, громіздкий і значні грошові затрати на живильний агар. Крім цього даний метод дає похибку від 25 до 45 %. Прототипом корисної моделі є горизонтальний метод виявлення Salmonella [2], у якому застосовують великий об'єм середовища попереднього концентрування (буферизованої лептонної води) і для дослідження береться вихідна суспензія, що готується у співвідношенні 1:10 (маса проби м'яса, м'ясопродуктів до об'єму середовища попереднього концентрування). Недоліком даного методу є те, що він громіздкий, з підвищеною вартістю середовищ, довгою тривалістю інкубування в селективних середовищах. Крім цього даний метод дає похибку у 1520 %. В основу корисної моделі поставлено задачу - розробити спосіб удосконалення горизонтального методу виявлення Salmonella у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах шляхом зміни кількості використовуваної дослідної суспензії, яка готується у співвідношенні 1:5 3 (проби м'яса та м'ясопродуктів у кількості 10-11 г та 50-55 см середовища попереднього концентрування (буферизованої пептонної води), з послідуючим інкубуванням отриманої суспензії упродовж 16±2 годин за температури 35±1 °C та наступним селективним 3 концентруванням: отриману культуру у кількості 0,05-0,06 см переносять у пробірку, в якій 3 міститься 5,0-5,1 см середовища RV (середовище хлориду малахітового зеленого Раппапорта3 3 Васіліадіса) та 5-6 см цієї отриманої культури також переносять у колбу, що містить 50-51 см середовища селеніту цистину. Витримують ці два засіяних середовища відповідно у термостаті за температури 41±1 °C упродовж 23±1 годин та за температури 35±1 °C упродовж 23±1 годин, потім здійснюють посів отриманої культури на допомогою електронного контуру на поверхню 3 чашки Петрі у кількості 2,0-2,5 см , що містить тверде селективне середовище - феноловий червоний-брильянтовий зелений агар-агар, та витримують за температури 35±1 °C упродовж 23±2 год., щоб отримати ізольовані типові колонії Salmonella червоного кольору при зміні середовища з рожевого на червоний колір. Задача вирішується тим, що використовують дослідну суспензію, яка готується у 3 співвідношенні 1:5 (проби м'яса та м'ясопродуктів у кількості 10-11 г та 50-55 см середовища попереднього концентрування (буферизованої пептонної води), з послідуючим інкубуванням отриманої суспензії упродовж 16±2 годин за температури 35±1 °C та наступним селективним 3 концентруванням: отриману культуру у кількості 0,05-0,06 см переносять у пробірку, у якій 3 міститься 5-6 см середовища RV (середовище хлориду малахітового зеленого РаппапортаВасіліадіса), та витримують у термостаті за температури 41±1 °C упродовж 23±2 годин. Також 3 3 5,0-5,1 см отриманої цієї культури переносять у колбу, що містить 50-51 см середовища селеніту цистину, та витримують у термостаті за температури 35±1 °C упродовж 23±2 годин. Потім здійснюють посіви отриманої культури шляхом селективного концентрування двома середовищами за допомогою електронного контуру на поверхню чашки Петрі у кількості 2,0-2,5 3 см , що містить тверде селективне середовище - феноловий червоний-брильянтовий зелений агар-агар, та витримують за температури 35±1 °C упродовж 23±2 год., щоб отримати ізольовані типові колонії Salmonella червоного кольору при зміні середовища з рожевого на червоний колір. Етапи вирішення даної задачі наведено у нижчезазначених прикладах. Приклад 1. Для розробки методу використовують дослідну суспензію, яка готується у 3 співвідношенні 1:8 (проби м'яса та м'ясопродуктів у кількості 15Н 6 г та 120Н 28 см середовища попереднього концентрування (буферизованої пептонної води), з послідуючим інкубуванням отриманої суспензії упродовж 20±2 годин за температури 28±1 °C та наступним селективним концентруванням: отриману культуру у кількості 0,2-0,4 см переносять у пробірку, в якій 3 міститься 20-22 см середовища RV (середовище хлориду малахітового зеленого РаппапортаВасіліадіса), та інкубують у термостаті за температури 35±1 °C упродовж 48±2 годин. Також 8,03 3 8,1 см отриманої цієї культури переносять у колбу, що містить 80-81 см середовища селеніту цистину, та інкубують у термостаті за температури 28±1 °C упродовж 20±2 годин. Потім 1 UA 109385 U 5 10 15 20 25 30 35 здійснюють посіви отриманої культури шляхом селективного концентрування двома середовищами за допомогою електронного контуру на поверхню чашки Петрі у кількості 2,5-3,0 3 см , що містить тверде селективне середовище - феноловий червоний-брильянтовий зелений агар-агар, та вигримують за температури 34±1 °C упродовж 25±2 год., щоб отримати ізольовані типові колонії Salmonella червоного кольору при зміні середовища з рожевого на червоний колір. Приклад 2. Для розробки методу використовують дослідну суспензію, яка готується у 3 співвідношенні 1:7 (проби м'яса та м'ясопродуктів у кількості 20-21 г та 140Н 47 см середовища попереднього концентрування (буферизованої пептонної води), з послідуючим інкубуванням отриманої суспензії упродовж 24±2 годин за температури 29±1 °C та наступним селективним 3 концентруванням: отриману культуру у кількості 0,1 0,2 см переносять у пробірку, в якій 3 міститься 10-12 см середовища RV (середовище хлориду малахітового зеленого РаппапортаВасіліадіса), та інкубують у термостаті за температури 38±1 °C упродовж 46±2 годин. Також 6,03 3 6,1 см отриманої цієї культури переносять у колбу, що містить 60-61 см середовища селеніту цистину, та інкубують у термостаті за температури 29±1 °C упродовж 24±2 годин. Потім здійснюють посіви отриманої культури шляхом селективного концентрування двома середовищами за допомогою електронного контуру на поверхню чашки Петрі у кількості 3,5-4,0 3 см , що містить тверде селективне середовище - феноловий червоний-брильянтовий зелений агар-агар, та витримують за температури 39±1 °C упродовж 23±2 год. щоб отримати не типові колонії для Salmonella блідо-рожевого кольору при не зміні середовища з рожевого на червоний колір. Приклад 3. Для розробки методу використовують дослідну суспензію, яка готується у 3 співвідношенні 1:5 (проби м'яса та м'ясопродуктів у кількості 10-11 г та 50-55 см середовища попереднього концентрування (буферизованої пептонної води), з послідуючим інкубуванням отриманої суспензії упродовж 16±2 годин за температури 35±1 °C та наступним селективним 3 концентруванням: отриману культуру у кількості 0,05-0,06 см переносять у пробірку, в якій 3 міститься 5-6 см середовища RV (середовище хлориду малахітового зеленого РаппапортаВасіліадіса), та інкубують у термостаті за температури 41±1 °C упродовж 23±2 годин. Також 5,03 3 5,1 см отриманої цієї культури переносять у колбу, що містить 50-51 см середовища селеніту цистину, та інкубують у термостаті за температури 35±1 °C упродовж 23±2 годин. Потім здійснюють посіви отриманої культури шляхом селективного концентрування двома середовищами за допомогою електронного контуру на поверхню чашки Петрі у кількості 2,0-2,5 3 см , що містить тверде селективне середовище - феноловий червоний-брильянтовий зелений агар-агар, та витримують за температури 35±1 °C упродовж 23±2 год. щоб отримати ізольовані типові колонії Salmonella червоного кольору при зміні середовища з рожевого на червоний колір. Порівняльна оцінка результатів випробування вищезазначених способів удосконалення горизонтального методу виявлення Salmonella у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктів до прототипу наведена у таблиці 1. 40 Таблиця 1 Порівняння способів удосконаленого горизонтального методу виявлення Salmonella у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктів до прототипу № Показники, що п/п порівнюються 1. Приготування дослідної суспензії: Кількість м'яса, м'ясопродуктів, г Кількість буферизованої 3 лептонної води, см Співвідношення 2. Витримування вихідної суспензії в термостаті: За температури Експозиція, год. 1 Приклади 2 3 25,0 15-16 20-21 10-11 250 1:10 120-128 1:8 140-147 1:7 50-55 1:5 35 або 37 °C 16-20 28±1 °C 20±2 29±1 °C 24±2 35±1 °C 16±2 Прототип 2 UA 109385 U Продовження таблиці 1 № Показники, що Прототип п/п порівнюються 3. Селективне концентрування 1: 3 Кількість культури, см 0,1 Кількість RV середовища, 3 см 10 4. Інкубування середовища RV 42 °C 24, і із посівом за температури якщо Експозиція, год. необхідно 48 5. Селективне концентрування 2: 3 Кількість культури, см Кількість середовища 10 3 селеніту цистину, см 100 6. Інкубування середовища селеніту цистину із посівом за температури 35 або 37 °C Експозиція, год. 24 і більше до 42 7. Посів на чашки Нетрі отриманої культури після селективного концентрування 1: 3 Кількість культури, см 3 Середовище тверде Феноловий селективне червонийбрильянтовий зелений агарагар Інкубування за температури 35 або 37 °C Експозиція, год. 24 і більше до 48 8. Ідентифікація колоній ізольовані Salmonella: типові Забарвлення колоній через колонії 24 год. червоного кольору 9. Посів на чашки Петрі отримано культури після селективного концентрування 2: 3 Кількість культури, см 3 Середовище Феноловий Інкубування за температури червонийбрильянтовий зелений агарагар 35або37 °C Експозиція, год. 24 і більше до 48 10. Ідентифікація колоній ізольовані Salmonella: типові Забарвлення колоній колонії через 24 год червоного кольору 3 1 Приклади 2 3 0,2-0,4 0,1-0,2 0,05-0,06 20-22 10-12 5-6 35 °C 48±2 38 °C 46±2 41±1 °C 23±2 8,0-8,2 80-82 6,0-6,2 60-62 5,0-5,1 50-51 28±1 °C 20±2 29±1 °C 24±2 35±1 °C 23±2 2,5-3,0 3,5-4,0 Феноловий Феноловий червонийчервонийбрильянтовий брильянтовий зелений агар- зелений агарагар агар 34±1 °C 39±1 °C 2,0-2,5 Феноловий червонийбрильянтовий зелений агарагар 35:1:1 °C 25±2 23±2 23±2 ізольовані типові колонії червоного кольору ізольовані типові колонії червоного кольору ізольовані типові колонії червоного кольору 2,5-3,0 Феноловий 3,5-4,0 Феноловий 2,0-2,5 Феноловий червонийчервонийбрильянтовий брильянтовий зелений агар- зелений агарагар агар 34±1 °C 25±2 ізольовані типові колонії червоного кольору 39±1 °C 23±2 не типові колонії блідо-рожевого кольору червонийбрильянтовий зелений агарагар 35±1 °C 23±2 ізольовані типові колонії червоного кольору UA 109385 U Продовження таблиці 1 № Показники, що п/п порівнюються 11. Швидкість визначення досліду, год. 12. Стабільність показників по удосконаленому горизонтальному методу виявлення Salmonella у м'ясі, м'ясопродуктах, % 13. % співвідношення результаті в досліджень щодо визначення наявності лістерій у м'ясі, м'ясопродуктах 14. % співвідношення результатів досліджень щодо визначення наявності стафілококів у м'ясі, м'ясопродуктах 5 10 Прототип 1 Приклади 2 3 110-120 год. 104±2 95±2 85±2 89,1 85,2 70,2 99,8 88,9-90,8 87,3-88,9 72,1-76,2 98,5 99,1 90,7-89,9 84,1-86,5 65,9-69,6 98,1-99,0 Дані таблиці 1 свідчать, що більш достовірні дані у порівнянні з результатами досліджень щодо визначення наявності лістерій у м'ясі, м'ясопродуктах - у 98,5-99,1 % [3] та до результатів досліджень щодо визначення наявності стафілококів у м'ясі, м'ясопродуктах - у 98,1 99,0 % [4] були отримані при застосуванні методу за прикладом № 3. Також найвища стабільність показників по удосконаленому горизонтальному методу виявлення Salmonella у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах була за прикладом № 3-99,8 %. Використовуючи метод за прикладом № 3, ми провели виявлення Salmonella у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах удосконаленим горизонтальним методом на 40 пробах: м'ясо яловичини - 7 проб; м'ясо свинини - 6 проб; м'ясо курей - 9 проб; ковбаса варена - 4 проб; ковбаса варенокопчена - 4 проб; ковбаса копчена - 6 проб; м'ясний балик - 4 проби. Результати наведені у таблиці 2. Таблиця 2 Показники виявлення удосконаленого горизонтального методу виявлення Salmonella у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах за прикладом № 3 п/п 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Виявлення Salmonella за забарвленням та розміром колоній за прикладом № 3 Відсутність Кількість Наявність колоній Кількість колоній Lister і а проб Salmonella проб monocytogenes М'ясо яловичини, n=7 n=3 n=4 М'ясо свинини, n=6 n=0 n=6 Характерних М'ясо курей, n=9 n=3 n=6 Ізольовані типові ізольованих Ковбаса варена, n=4 n=1 n=3 колонії червоного типових колоній Ковбаса варено-копчена, кольору Salmonella не n=1 n=3 n=4 виявлено Ковбаса копчена, п~6 n=1 n=4 М'ясний балик, n=4 n=1 n=3 Види м'яса забійних тварин, птиці та м'ясопродуктів 15 20 Проведеними дослідженнями встановлено, що були виявлені ізольовані типові колонії Salmonella через 23±2 години за температури 35±1 °C у наступних пробах м'яса забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах: по І пробі у ковбасі вареній, варено-копченій, ковбасі копченій, м'ясному балику; у 3-х пробах яловичини та м'ясі курей. У м'ясі свинини характерних колоній Salmonella не було виявлено. 4 UA 109385 U 5 10 15 20 25 Ці дані були стабільними та достовірними, отже, ці показники можна використовувати при оцінюванні безпечності м'яса забійних тварин, птиці та м'ясопродуктів. Крім цього, слід зазначити, що метод є економним, простим у виконанні, а його результати дають конкретні якісні показники по червоному забарвленню ізольованих типовий колоній Salmonella. Метод за прикладом № 3 нами пропонується як якісний спосіб удосконалення горизонтального методу виявлення Salmonella у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах поряд з іншими методами визначення їх безпечності (визначення загальної кількості мікроорганізмів, визначення бактерій групи кишкової палички, лістерій, стафілококів) [5]. Метод має перевагу перед існуючими якісними методами визначення безпечності м'яса забійних тварин, птиці та м'ясопродуктів тому, що результати мають достовірні показники за червоним забарвленням ізольованих типових колоній Salmonella. Джерела інформації: 1. Изделия колбасные и продукты из мяса. Методы бактериологического анализа: ГОСТ 9958-81. - М.: Госкомитет СССР по стандартам. - 20 с. 2. Мікробіологія харчових продуктів і кормів для тварин. Горизонтальний метод виявлення Salmonella: ДСТУ EN 12824:2004. - К.: Держспоживстандарт України, 2005. - 20 с. (Національний стандарт України). 3. Мікробіологія харчових продуктів та кормів для тварин. Горизонтальний метод виявлення та підрахування Listeria monocytogenes. Частина 1. Метод виявлення (ISO 11290-1:1996, ITD): ДСТУ ISO 11290-1:2003. - К.: Держспоживстандарт України, 2005. - 18 с. (Національний стандарт України). 4. Мікробіологія харчових продуктів і кормів для тварин. Горизонтальний метод підрахування коагулазо-позитивних стафілококів. Частина 1. Метод з використовуванням агарового середовища Беард-Паркера (ISO 6888-1:1999, ITD): ДСТУ ISO 6888-1:2003. - К.: Держспоживстандарт України, 2005. - 10 с. (Національний стандарт України). 5. Довідник мікробіологічних методів дослідження харчових продуктів і кормів для тварин згідно з міжнародними стандартами /В.Μ. Івченко, В.В. Шарандак, О.І. Горбатюк та ін. - Біла Церква, 2006. - 264 с. 30 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 40 45 Спосіб удосконалення горизонтального методу виявлення Salmonella у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах, який відрізняється тим, що використовують дослідну суспензію, яка 3 готується у співвідношенні 1:5 (проби м'яса та м'ясопродуктів у кількості 10-11 г та 50-55 см середовища попереднього концентрування (буферизованої лептонної води), з послідуючим інкубуванням отриманої суспензії упродовж 16±2 годин за температури 35±1 °C та наступним 3 селективним концентруванням: отриману культуру у кількості 0,05-0,06 см переносять у 3 пробірку, в якій міститься 5-6 см середовища RV (середовище хлориду малахітового зеленого Раппапорта-Васіліадіса), та витримують у термостаті за температури 41±1 °C упродовж 23±2 3 годин, також переносять отриману цю культуру у кількості 5,0–5,1 см у колбу, що містить 50-51 3 см середовища селеніту цистину, та витримують у термостаті за температури 35±1 °C упродовж 23±2 годин, у послідуючому здійснюючи посіви отриманої культури шляхом селективного концентрування двома середовищами за допомогою електронного контуру на 3 поверхню чашки Петрі у кількості 2,0-2,5 см , що містить тверде селективне середовище феноловий червоний-брильянтовий зелений агар-агар, та витримуючи за температури 35±1 °C упродовж 23±2 год., щоб отримати ізольовані типові колонії Salmonella червоного кольору при зміні середовища з рожевого на червоний колір. Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5