Стабілізована композиція природної канабіноїдної сполуки і спосіб її приготування

Цей винахід стосується фармаційної композиції, яка стабілізує природні канабіноїдні сполуки, особливо Д9-тетрагідроканабінол (ТГК). Винахід також стосується способів одержання таких композицій. Природні канабіноїдні сполуки, які можна одержати з кількох природних джерел, але здебільшого їх одержують з Cannabis Sativa, можна використовувати як лікарські засоби проти дуже широкого кола хвороб. Огляд природних канабіноїдних сполук [див. David Т. Brown ed., Cannabis, Harwood Academic Publishers 1998, ISBN 90-5702-291-5]. Прикладом природної канабіноїдної сполуки є ТГК, який продається під товарним знаком Marinol® (фармаційна назва дронабінол). Випускною формою ТГК зараз є м'які желатинові капсули, де діюча речовина розчинена в олії. Недоліком цієї композиції є нестабільність ТГК. Через те його доводиться зберігати при низькій температурі (4°С). Безсумнівно, для фармаційного виробу низька стабільність сполуки та необхідність витримувати його у холодильнику є дуже серйозною вадою. В основу цього винаходу поставлено завдання знайти таку композицію для нестійких природних канабіноїдних сполук типу ТГК, яка поліпшувала ь стабільність сполук до такого ступеню, щоб їх можна було тривалий час зберігати при кімнатній температурі. Також завданням винаходу є створення способу одержання діючої речовини у вигляді сухого порошку. Сухий стан дозволяє готувати інші випускні форми, наприклад, сухі порошкові композиції для пульмонарного введення та таблетки для прийому через рот або під язик. У [WO9932107] описано застосування цикл о декстрину для солюбілізації ТГК у двофазній або мікросферичній випускній формі. Солюбілізуюча дія циклодекстрину зумовлена утворенням так званих інклюзивних комплексів або комплексів гість-хазяїн. Винахід за WO9932107 має метою солюбілізацію ТГК, щоб сприяти його засвоєнню з носової порожнини. Про стабілізацію ТГК у складі композиції у цій заявці не йдеться. Рівень техніки не дає змоги зробити висновок щодо стабілізуючої дії утворення комплексу гість-хазяїн, бо фахівцям відомо, що ці комплекси іноді справляють стабілізуючу дію, але в інших випадках сприяють розкладу діючої речовини за рахунок каталізу. Недоліком циклодестринів також є те, що вони викликають подразнення слизової оболонки при введенні у вигляді назальної або пульмонарної композиції. Особливо подразнюють слизові тканини похідні циклодекстрину, що мають поверхнево активні властивості. У [WO9736577] описано застосування сухих твердих ліпідних композицій для орального введення ліпофільних сполук, таких, як природні канабіноїди, причому така тверда ліпідна композиція містить поряд з діючою речовиною також твердий жир та фосфоліпід. Ця композиція спрямована на поліпшення оральної біозасвоюваності, а не на підвищення стабільності діючої речовини. У [WO0078817] описано стабілізацію лужної фосфатази шляхом сушіння білку з чистого водного розчину в присутності олігосахариду інуліну. Під час сушіння мономолекулу білку капсулюють до матриці, яка складається з аморфного інуліну, що знаходиться у склоподібному стані. Поряд з іншими ефектами досягається і стабілізація, бо інулін є скловидний і захищений від навколишнього середовища. Втім, лужна фосфатаза як гідрофільна сполука добре розчиняється у воді, а тому може бути одержана прямо з водного розчину. Далі, стабілізація стосується перш за все збереження третинної та четвертинної структури білку, що важливо для активності ферментів. У [WO 9118091] описано застосування невідновлювальних молекул сахарів, особливо моноглікозидів, як мальтітол, лактитол та палатинит, для збереження стабільності ферментів тину обмежувальної ендонуклеази Pst І та гідрофільних антитіл. Згідно з цією заявкою, стабілізовані ферменти можна одержувати змішуванням ферменту з сахаром та відповідним буфером з наступним сушінням на повітрі. Цей спосіб непридатний для ліпофільних сполук, бо ті не є у достатньому ступені розчинними у полярній системі. Мальтітол та лактитол мають точку склоутворення при 44°С [Y. Roos, Carbohydrate Research 1993,238, 39-48] та 33°С відповідно у сухому стані. Нами несподівано встановлено, що високоліпофільні сполуки на зразок природних канабіноїдів також можна стабілізувати проти окислення та ізомеризації шляхом включення склистих сахарів або склистих цукрових спиртів за вищезазначеним механізмом. Більш того, встановлено, що технологія скляних сахарів також призводить до поліпшення біозасвоюваності. Оскільки природні канабіноїди включаються як мономолекули, швидкість розчинення цих сполук визначатиметься швидкістю розчинення цукрових стекол. Оскільки швидкість розчинення у цукрових стекол набагато вище, ніж у природних канабіноїдних сполук, ліки швидше засвоюються поглинаючими оболонками. У першому аспекті винахід стосується фармаційної композиції, що містить природну канабіноїдну сполуку та склоподібний сахар або цукровий спирт, або суміш сахарів та цукрових спиртів, яка відрізняється тим, що природна канабіноїдна сполука включена до сахару як мономолекулярна оболонка без утворення комплексу гість-хазяїн. Сполука включається до скловидного сахару, коли має місце мономолекулярне включення по суті кожної молекули канабіноїду до матриці сахару. Отже, систему постачання діючої речовини до організму згідно з винаходом можна розглядати як однофазну. Молекули природного канабіноїду довільно орієнтовані усередині скловидного сахару. На відміну від комплексів гість-хазяїн, наприклад, комплексів з циклодекстринами, після розчинення будь-яка взаємодія між канабіноїдними сполуками та розчиненими молекулами сахару відсутня. Включення канабіноїдної сполуки до скловидного сахару призводить до зниження температури склоутворення (Tg) скловидного сахару, зникнення Tg канабіноїдної сполуки та прискореного розчинення канабіноїдної сполуки. Більш того, скануючою електронною мікроскопією можна визначити, чи досягнуто включення. Переважною природною канабіноїдною сполукою є ТГК. З метою досягнення найвищої стабільності скловидний сахар переважно має температуру склоутворення (Tg) вище за 50°С у нормальних умовах і слабко виражену схильність до кристалізації. Нормальними вважаються умови 20 - 25°С та відносна вологість до 40%. У межах цього винаходу вираз "природна канабіноїдна сполука" включає штучні похідні канабіноїдів, які можна одержати з природних канабіноїдів і які є так само нестійкі. У межах цього винаходу вираз "сахар" охоплює полісахариди, а вираз "цукровий спирт" - полісахаридні спирти. Переважними сахарами у цьому винаході є невідновлювальні сахари. Невіднолювальним є такий сахар, що не має і не може утворювати реакційноздатних альдегідних або кетонових груп. До невідновлювальних сахарів належать, наприклад, трегалоза та фруктани на зразок інулінів. Переважними невідновлювальними сахарами у цьому винаході є фруктани або суміші фруктанів. Фруктан - це оліго- або полісахарид, що містить кілька ангідрофруктанових одиниць. Фруктани можуть мати полідісперсний розподіл довжини ланцюга, а їхній ланцюг може бути прямим або розгалуженим. Переважно фруктани містять здебільшого β-1,2 зв'язки, як інулін, але можуть бути й β-2,6 зв'язки, як леван. Придатні фруктани можуть надходити безпосередньо з природних джерел, але можуть бути й модифіковані. Прикладами модифікацій можуть бути відомі самі по собі реакції, що призводять до подовження або скорочення ланцюга. На додаток до природних полісахаридів у цьому винаході придатні також полісахариди промислового походження, наприклад, продукти гідролізу зі скороченим ланцюгом та продукти фракціонування з модифікованою довжиною ланцюга. Реакція гідролізу для одержання фруктану зі скороченим ланцюгом може бути ферментативною (наприклад, з ендоінулазою), хімічною (наприклад, з водним розчином кислоти), фізичною (наприклад, термічною) або з використанням гетерогенного каталізу (наприклад, з кислотним іонообмінником). Фракціонування таких фруктанів, як інулін, можна провадити шляхом кристалізації при низьких температурах, розділення колонковою хроматографією, фільтрації крізь мембрану або селективного осадження спиртом. Інші фруктани, наприклад, з довгим ланцюгом, можна одержати, наприклад, кристалізацією з фруктанів, з яких було видалено моно- та дісахариди. Припустиме є використання у цьому винаході фруктанів з розтягнутим ферментативним шляхом ланцюгом. Далі, можна застосовувати відновлені фруктани, тобто такі, у яких кінцеві групи, звичайно фруктозні, було піддано відновленню, наприклад, борогідридом натрію у приступності каталізатору на перехідному металі. Припустимі також хімічно модифіковані фруктани, такі, як зшиті та гідроалкільовані. Середня довжина ланцюга в усіх фруктанах виражається як усереднений ступінь полімеризації (СП). Скорочення СП означає середню кількість сахарних одиниць в олігомері або полімері. Найбільш бажаними сахарами у цьому винаході є інуліни або суміші інулінів. Інуліни - це оліго- та полісахариди, що містять b-1,2-зв'язані фруктозні одиниці з a-D-глюкопіранозною одиницею на відновлювальному кінці молекули і можуть мати різні ступені полімеризації (СП). Переважними є інуліни з СП більшим за 6 або суміші інулінів, де кожний інулін має СП вище за 6. Ще бажанішими є інуліни з СП від 10 до 30. Найкращими є інуліни з СП у межах від 15 до 25. Інуліни зустрічаються, між іншим, у коренях та бульбах рослин родин Liliaceae та Compositae. Головними джерелами одержання інуліну є топінамбур, жоржина та коріння цикорію. Промисловою сировиною слугує коріння цикорію. Головна відміна між інулінами, одержаними з різних природних джерел, полягає у ступені полімеризації (СП), який коливається від 6 у топінамбурі до ΙΟΙ 4 у корінні цикорію, а у жоржині перевищує 20. Інулін - це оліго- або полісахарид, який у аморфному стані посідає сприятливих фізико-хімічних властивостей для використання у ролі допоміжної речовини у фармаційних композиціях. До таких властивостей належать висока (регульована) температура склоутворення, відсутність відновлювальних альдегідних груп і, як правило, низька швидкість кристалізації. Крім того, інулін нетоксичний і недорогий. Масове співвідношення між природною канабіноїдною сполукою та сахаром або цукровим спиртом звичайно знаходиться у межах від 1:5 до 1:100, переважно у межах від 1:10 до 1:50, а найкраще у межах від 1:12 до 1: 25. Фармаційна композиція за винаходом може бути надалі перероблена на таблетки, як звичайні оральні таблетки, таблетки під язик, таблетки за щоку або такі, що розпадаються або розчиняються у роті, капсули, лозенжі, супозиторії, продукти для втирання до шкіри, порошки для пульмонарного введення або суспензії для підшкірних та внутрішньом'язових ін'єкцій. Ці випускні форми є добре відомі, і фахівцеві не буде важко надати композиції за винаходом бажаної форми для введення. Переважні випускні форми призначені для орального або пульмонарного введення. Для приготування скловидних сахарів за винаходом придатним прийомом є сушка виморожуванням. Припустимі є також розпилювальна сушка, вакуумна сушка та суперкритична сушка. Першим кроком при одержанні скловидних сахарів з включеними природними канабіноїдами буде приготування розчину, в якому обидві речовини розчиняються. Однак завдяки гідрофільній природі сахарів та ліпофільній природі канабіноїдних сполук важко знайти спільний розчинник для обох. Нами встановлено, що цю проблему можна вирішити за рахунок застосування суміші розчинників. Вода добре розчиняє сахари та цукрові спирти, тоді як всілякі органічні розчинники, наприклад, спирти, добре розчиняють природні канабіноїдні сполуки. Оскільки вода та спирти добре змішуються між собою, цілком імовірно, що при певному співвідношенні вода-спирт обидві речовини розчиняться до прийнятного ступеню. Отже, цей винахід стосується також способу приготування фармаційної композиції, що містить природну канабіноїдну сполуку та скловидний сахар або суміш сахарів, де природна канабіноїдна сполука включена до скловидного сахару як мономолекулярна оболонка без утворення комплексу гість-хазяїн, який відрізняється тим, що: ) зазначену природну канабіноїдну сполуку розчиняють в органічному розчиннику, який розчиняється у воді, й розчиняють у оді зазначений сахар або суміш сахарів; ) розчинену канабіноїдну сполуку та розчинений сахар або суміш сахарів перемішують до утворення достатньо стабільної суміші; ) зазначену суміш піддають сушці виморожуванням, розпилювальній, вакуумній або суперкритичній сушці. Для одержання стабільної суміші з сахаром, водою та природною канабіноїдною сполукою придатні органічні розчинники, що змішуються з водою, такі, як діметилсульфоксид (ДМСО), Ν,Ν-діметилформамід (ДМФ), ацетонітрил, етилацетат та нижчі спирти. Оскільки розчинник треба видаляти розпилювальною сушкою або сушкою виморожуванням, ін також переважно повинен мати прийнятний парціальний тиск при температурі сушки. Через те найприйнятнішими є нижчі спирти, або C1-С6 спирти, з розгалуженим або нерозгалуженим алкільним ланцюгом. Оптимальними є С2-С4 спирти, як етанол, п-пропиловий спирт та t-бутиловий спирт. Найкращим є t-бутиловий спирт. Співвідношення між канабіноїдною сполукою, розчинником, одою та сахаром або сумішшю сахарів обирається таким чином, щоб одержати достатньо стабільний розчин. За бажанням можна додати поверхнево активну речовину для поліпшення стабільності. Розчин вважається стабільним, якщо у ньому не з'являється туман за час обробки, наприклад, 120 хвилин, 60 хвилин, 30 хвилин або 10 хвилин. Для розпилювальної сушки час обробки звичайно становить 30 хвилин. При сушці виморожуванням розчин повинен залишатися чистим, доки не замерзне. Час обробки здебільшого становить 10 хвилин. Після сушки вміст води переважно має бути меншим за 3%. Вміст розчинника також не має перевищувати 3%. Фахівцеві зрозуміло, що час, потрібний для сушки, залежить від таких факторів, як товщина зразку, температура зразку, тиск та температура у холодильнику. Хоча застосування розпилювальної сушки для приготування склоподібних сахарів з включеною канабіноїдною сполукою призводить до суттєвого поліпшення стабільності сполук, найкращі результати дає сушка виморожуванням. Отже, переважним способом сушки за винаходом є сушка виморожуванням. На першому етапі процесу сушки виморожуванням розчин заморожують. Бажано здійснювати цей перший етап досить швидко при температурі зразка, нижчій за Т’ тобто за температуру концентрованої заморожуванням фракції [D.L. Teagarden, Eur. J. Pharm. Sci., 15, 115-133, 2002]. При заморожуванні за температурою нижче Tg одержують пористий коржик, тоді як вище Tg коржик надто щільний. Пористий коржик краще, бо його легше переробити на, наприклад, порошок для таблетування або пульмонарного введення. Більш того, сушка виморожуванням при температурі вище Tg може викликати кристалізацію сахару. Це унеможливлює включення діючої речовини до скла, а відтак призведе до зниження стабільності. Наступний приклад лише детальніше ілюструє винахід і ніяким чином не обмежує його обсяг. Приклад 1 Приготування та властивості інулінових стекол А9-тетрагідроканабінолу Матеріали Інулін типу ТЕХ!803 надійшов від фірми Sensus, Роозендаль, Нідерланди. Очищений ∆9теірагідроканабінол (ТГК) надала фірма Unimed. Усі інші хімікати ґатунку для аналізів закуплено на ринку. Методика Фізико-хімічна характеристика інуліну Визначення ступеню полімеризації інуліну Середній ступінь полімеризації (СП) інуліну визначають наступним чином: розчин інуліну підкислюють до рН 1,45 З N НСl. Далі підвищують температуру до 80°С, коли інулін розкладається на фруктозу та глюкозу. Після охолодження до кімнатної температури рН підвищують до 6-8 доданням 1.5 Μ NaOH. Співвідношення фруктози та глюкози визначають високоефективною рідинною хроматографією з використанням колонки Aminex HPX-87C. Проби елююють MilliQ-водою при 80°С зі швидкістю 0,6 мл/хв. 14 детектором вимірюють кількість фруктози та глюкози. СП дорівнює співвідношенню вмісту фруктози до вмісту глюкози плюс одиниця. Визначення кількості відновлювальних груп Кількість відновлювальних груп визначають за Самнером наступним чином. Готують розчин 20 г 20 g NaKтартрат тетрагідрату, 1г дінітросаліцилової кислоти, 1г NaOH та 200мг фенолу в 100мл води. До 1,5мл цього розчину додають 1,0мл водного розчину сахару для аналізу. Після того до цієї суміші додають 100мкл свіжовиробленого водного розчину 0.24 Μ Na2SO3. Одержану суміш завихорять та вмішують на водяну баню при 95°С. За 15 хвилин проби знімають з бані та дають охолонути до кімнатної температури. Гасіння проб вимірюють на довжині хвилі 620нм. Готують калібрувальну криву з використанням водних розчинів, що мають концентрацію глюкози 0,10-1,00мг/мл. Виміри повторюють тричі. Диференціальна скануюча калориметрія (ДСК). Температуру склоутворення (Tg) висушеного виморожуванням інуліну, урівноваженого при відносній вологості 0%, 45% та 60%, визначають модульованою ДСК (диференціальний скануючий калориметр DSC 2920 фірми ТА instruments, Гент, Бельгія). Використовують амплітуду модуляції ± 0.318°С кожні 60 с та швидкість нагрівання 2°С/хв. Під час вимірювання комірку з пробою продувають азотом зі швидкістю 35мл/хв. Середню точку відхилення зворотного теплового потоку на температурній кривій приймають як Tg. Tg визначають двічі. Температуру склоутворення концентрованої виморожуванням фракції (Tg') розчину 9.6 мас.% інуліну в суміші 60/40 обc. вода/t-бутиловий спирт вимірюють звичайною ДСК. Розчини охолоджують до -70°С зі швидкістю 10°С/хв. Після того проби нагрівають до 40°С зі швидкістю 2°С/хв. Під час вимірювання комірку з пробою продувають гелієм зі швидкістю 35мл/хв. Середню точку відхилення зворотного теплового потоку на температурній кривій приймають як Tg. Tg визначають двічі. Фізична стабільність аморфного інуліну. Для оцінки фізичної стабільності аморфного інуліну пористі коржики аморфного інуліну, одержані виморожуванням, зволожують при 20°С, вміщуючи їх до кліматичних камер при відносній вологості 45% або 60% відповідно. Після вирівнювання візуально визначають, чи лишилися зразки незмінними або ущільнилися. Динамічне поглинання парів Ізотерму поглинання води висушеним виморожуванням інуліном вимірюють при атмосферному тиску та 25°С сорбциометричним аналізатором (DVS-1000 фірми Surface Measurement Systems Limited, Лондон, Велика Британія). Засвоєння оди інуліном вимірюють при відносній вологості від 0% до 90% приростами по 10%. Початкова маса зразка становить біля 10мг. Рівновага вважається досягнутою, якщо протягом 10 хвилин збільшення маси не перевищує 0,9 мкг. Фізико-хімічна характеристика ТГК. Розчинність у воді. До ТГК додають у надлишку чисту воду. Одержану дисперсію перемішують магнітною мішалкою при 20°С. Після 3 діб суспензію центрифугують і вміст ТГК у спливаючій фазі визначають спектрофотометром на довжині хвилі 210нм. Пробу розбавляють етанолом. Будують калібрувальну криву з використанням розчинів ТГК в етанолі з відомими концентраціями (1.244-12.44мкг/мл). Динамічна сорбція парів. Сорбцію води для ТГК визначають за методикою, наведеною вище для інуліну. ТГК розчиняють у метанолі й подають до приладу DVS-1000 instrument. Під дією потоку сухого азоту метанол випарюється. Як тільки випариться біля 90% розчиннику, до чаші подають додатковий ТГК. Цю процедуру повторюють, аж доки у чаші не набереться 15 мг чистого ТГК. Після випарювання останньої порції метанолу відносну вологість збільшують з 0 до 90% приростами по 10%. Диференціальна скануюча калориметрія (ДСК). Температурну поведінку ТГК визначають мДСК. Використовують амплітуду модуляції ± 0.318°С кожні 60 с та швидкість нагрівання 2°С/хв. Під час вимірювання через камеру прокачують азот зі швидкістю 35 мл/хв. У чаші залишається шлір чистого ТГК. Після початкового охолодження провадять перше сканування зразку до 50°С. Завдяки цьому шлір розповсюджується по дну чаші, збільшуючи таким чином поверхню теплопередачі при другій розгортці. Далі зразок охолоджують до -40°С й нагрівають до 350°С. Одержання зразків, що містять ТГК. Приготування розчинів для розпилювальної сушки або сушки виморожуванням Готують три різних композиції для розпилювальної сушки та одну для сушки виморожуванням (табл.2). Композиції 5, 6, 9 та 12 готують нарізним розчиненням інуліну у воді, а ТГК у відповідному спирті. Потрібне обсягове співвідношення вода/спирт підбирають шляхом випробування стабільності 10% мас. розчину інуліну з різними співвідношеннями вода/спирт. Інулін розчиняють у різних обсягах води (від 3 до 7 мл). Після того додають спирт у різних кількостях до загального обсягу 10мл. Для ТГК процедура така сама, тільки оду додають до спиртового розчину ТГК. Розчин вважається достатньо стабільним, якщо під час обробки не утворюється туман. Для розпилювальної сушки готують порції, що потребують до півгодини розпилення. Отже, розчин має лишатися прозорим протягом принаймні цього часу. Для сушки виморожуванням розчин має лишатися прозорим, доки не замерзне. У даному випадку для цього досить 10 хвилин. Крім того, досліджувалося, чи можна додавати інуліновий розчин повільно або весь одразу. Таблиця 2 Композиції для розпилювальної сушки та сушки виморожуванням Композиція Спосіб сушки Розчинник 9 5 6 12 Розпилення Розпилення Розпилення виморожування Н2О/ЕtН = 50/50(обс.) Н2О/1-РrН = 60/40(обс.) Н20/1-Рr0Н = 60/40(обс.) H2O/t-BuOH = 60/40(обс.) [Інулін] (мг/мл) 47.73 49.00 46.17 96.00 ТГК/інулін (мас.%) 4.00% 3.34% 7.77% 4.00% Розпилювальна сушка. Розпилювальну сушку здійснюють у міні-сушарці моделі Buchi 190 (Btichi, Флавіль, Швейцарія). Типові умови роботи завдаються такі: температура газу азоту на вході 148°С, відповідно температура на виході 87°С, витрата сушильного повітря 525л/год, уставка аспіраційного потоку 20, уставка регулятора насоса 6. Після розпилювальної сушки одержаний порошок збирають у 50мл пляшечку та прочищають азотом біля 15хв. Продукт зберігають при -18 °С. Сушка виморожуванням. Сушку виморожуванням провадять у ліофілізаторі моделі Christ Alpha 2-4 (Salm en Kipp, Брейкелен, Нідерланди). У типовому досліді до 20 мл скляних флаконів наливають 2-5 мл розчину. Розчини заморожують у рідкому азоті, після чого ліофілізують при температурі зберігання -30°С, температурі конденсатора -53°С та тиску 0.220 мбар протягом 1-3 діб. Потім поступово підвищують температуру зберігання до 20°С, а тиск поступово знижують до 0,05 мбар протягом 8 годин. Зразки зберігають у вакуумному десікаторі протягом принаймні 1 доби. Дослідження стабільності зразків, що містять ТГК. Зразки зберігають за п'ятьма різними режимами (див. табл.3). Через нерівні проміжки часу беруть проби та визначають кількість ТГК, що ще не розклався, високоефективною рідинною хроматографією. Для контролю застосовують зразки чистого ТГК та фізичної суміші ТГК з інуліном. Зразки чистого ТГК готують наступним чином. 720.5мг ТГК розчиняють у 20.00мл метанолу. 70мкл цього розчину виливають до скляного флакону діаметром 24 мм. Після того випарюють розчинник потоком сухого азоту, залишаючи у флаконі 2,52мг чистого ТГК. Фізичну суміш готують, відважуючи біля 192г інуліну до 24-мм флакону. Після того додають 200мкл розчину 36,025мг/мл ТГК у метанолі; одержана суміш містить 4,0% мас.% ТГК. Таблиця 3 Режими зберігання зразків, що містять ТГК Температура (°С) 20 20 20 47 47 Аналіз ТГК Відносна вологість (%) 0 45 60 0 5 Атмосфера розріджена [О2] повітря повітря розріджена [О2] повітря Зразки аналізують високоефективною рідинною хроматографією. їх готують наступним чином. До проб додають метанол. За 10 хвилин ультразвукової обробки продукт диспергується у метанолі. Одержану суспензію трясуть вручну. Після двох днів екстрагують пробу. її центрифугують, спливаючу фазу розбавляють метанолом. Контрольний дослід показав, що ультразвукова обробка не веде до руйнування ТГК. За дві доби екстракції суттєвого руйнування ТГК не спостерігалося. Використовують прилад ISCO модель 2350 з фотодіодним УФ/ВІЧ детектором (Shimadzu SPD-M6A) та колонку Chrompack Nucleosil 100 С18 (4.6x250мм). Проби по 20мкл подають до автоматичного пробовідбирача Kontron Instruments HPLC 360 Autosampler та елююють сумішшю метанол/вода = 86/14 (обc.) зі швидкістю 1,5мл/хв. Оптичну щільність вимірюють на довжині хвилі 214нм. Одержані дані аналізують за програмою SPD-MXA. На хроматограмі необробленого ТГК спостерігається великий пік на час перебування 7,5хв. На хроматограмі ТГК, який було навмисне піддано частковому руйнуванню, розмір пика на час 7,5хв. зменшується, зате з'являються нові пики при меншому часі перебування. Пік на часі перебування 7,5хв. приписується Δ9-ΤΓΚ. Інші піки мають належати продуктам розкладу. Вміст (незруйнованого) ТГК в оброблених зразках розраховують з площі під піком на часі елюювання 7,5хв. Будують калібрувальну криву на підставі розчинів ТГК у метанолі з відомими концентраціями (0-122мкн/мл). Після кожного прогону хроматографії включають кілька точок калібрування. Розчини, використані для цієї мети, не показують помітного розкладу протягом 2 тижнів при 4°С. Кожний вимір повторюють принаймні двічі. Результати Фізико-хімічна характеристика інуліну Фізико-хімічні показники інуліну зведені у табл.4. Таблиця 4 Фізико-хімічні показники склоподібного інуліну Середній ступінь полімеризації % цукрових одиниць, що містять відновлювальні групи Tg Tg' Фізична стабільність при 20°С Гігроскопічність 23 5.9 ±0.1 155.4 ±0.1 °С -24°С Стабільний при ВВ £ 45%; розкладається при ВВ ³ 60% Зміна маси = 0.22 * RH(%) + 0.61 СП інуліну становить 23. З кількох причин цю величину треба розглядати як приблизну. Інулін складається з лінійних β-В-(2®1) зшитих олігомерів фруктози з a-D-(1®2) глюкопіранозним кільцем. Отже, СП можна розрахувати зі співвідношення глюкоза/фруктоза, як показано тут. Втім, інуліни, що випускаються промисловістю, можуть містити такі різновиди інуліну, де глюкозна кінцева група розщеплена. Наявність таких видів може дати перебільшене значення СП. З іншого боку, інуліни, що випускаються промисловістю, можуть містити невеличку кількість глюкози, що призводить до заниженої оцінки СП. Завдяки специфічним зв'язкам між моносахаридними кільцями інулін може не містити жодної відновлювальної групи. Однак проба за Самнером показує, що 5.9 ± 0.1% цукрових одиниць, використаних у нашому дослідженні, мали відновлювальні групи. Наявність відновлювальних груп можна пояснити видами інуліну з розщепленими кінцевими групами, хоча присутність моносахаридів теж може відігравати роль. Моносахаридами можуть бути глюкоза та фруктоза. Фруктоза - це невідновлювальний сахар. Однак під час випробування за Самнером цей сахар піддають дії високої температури, завдяки чому фруктоза може перетворитися на глюкозу (перегрупування Лобрі де Брьойн ван Екенстейна). Справді, контрольні досліди показують наявність однієї відновлювальної групи на молекулу в пробі. Отже, виміряна кількість відновлювальних груп, мабуть, перебільшена. Встановлена температура склоутворення (Tg) інуліну дорівнює 155.4 ± 0.1°С . Це набагато вище за Tg трегалози (120°С) та цукрози (76°С) - сахарів, які часто-густо використовують для стабілізації нестійких ліків. Високе значення Tg є важливим, бо при температурах вище Tg матеріал перетворюється на гумоподібну масу. У гумоподібному стані еуттєво зростає рухомість молекул у порівнянні зі склоподібним станом, а відповідно прискорюється розклад діючої речовини, що замкнена у ньому. Крім того, у гумоподібному стані може відбуватися кристалізація. Під час кристалізації включена лікарняна речовина витісняється з стабілізуючої матриці й • повністю втрачає захист. Tg може бути досить високою,однак склоподібні сахари вбирають воду з вологого повітря (див. далі). Вода слугує пластифікатором для склоподібних сахарів і суттєво знижує Tg. Отже, склоподібний інулін може вбирати набагато більше води, ніж склоподібна трегалоза чи цукроза, перш ніж Tg впаде до кімнатної температури. Встановлена Tg' для інуліну -24°С. Ця температура також вище, ніж Tg трегалози (-36°С) та цукрози (39°С). У разі сушки виморожуванням бажано мати відносно високу Tg', оскільки температура зразка має лишатися нижчою за Tg', концентрована виморожуванням фракція знаходиться у гумоподібному стані, а молекули, як зазначалося вище, досить рухомі. Оскільки концентрована виморожуванням фракція має дуже високий вміст діючої речовини, швидкість розкладу може підвищуватися у порівнянні з початковим розчином. Більш того, і цьому випадку цілком можлива кристалізація сахару, що чинить несприятливу дію на лікарняну речовину. Далі, сушка виморожуванням при температурі нижче Tg' дає пористий коржик, а ущільнений коржик виходить при температурі вище Tg'. Пористий коржик краще, бо його легше переробити, наприклад, на порошок для таблетування або пульмонарного введення. Фізична стабільність склоподібного інуліну при 20°С оцінюється за дією різних значень відносної вологості на скло. Встановлено, що на пористий коржик інуліну, одержаний сушкою виморожуванням, відносна вологість 45% не справляє жодної дії. Однак при вологості 60% пористий коржик розсипається. Це означає, що при вологості між 45% и 60% зразок вбирає стільки води, що перевищується Tg. Можна на короткий час піддати одержаний виморожуванням коржик відносній вологості 60%, щоб він частково розсипався. З цього напіврозкладеного матеріалу можна робити досить міцні швидкорозчинні таблетки. Tg висушеного виморожуванням інуліну після вирівнювання при відносній вологості 0,45 та 60% наведені на фіг.1. Вбирання вологи одержаного сушкою виморожуванням інуліну під дією повітря з відносною вологістю у межах від 0 до 90% при 25°С вимірюють гравіметричним аналізатором сорбції. У цілому інтервалі відносних вологостей знайдена лінійна залежність між вбиранням води та відносною вологістю, дії якої піддається зразок (табл.5; фіг.2). Як зазначено вище, Tg проходиться при відносній вологості між 45 та 60%. Лінійна залежність вказує на те, що у часових межах експерименту (години) кристалізація інуліну не відбувається. Коли кристалізація має місце й утворюються безводні кристали, вміст води у зразку падає майже до нуля. З іншого боку, при утворенні кристалів, які оточують молекули води, вміст води у зразках лишається більш-менш незмінним при зростанні відносної вологості. Ці явища спостерігалися в експериментах з поглинанням води такими аморфними сахарами, як трегалоза, цукроза та лактоза. Отже, результати вказують на те, що аморфний інулін кристалізується не так активно, як трегалоза, цукроза та лактоза. Фізико-хімічна характеристика ТГК Розчинність Розчинність ТГК визначена меншою за 1мкг/мл (біля 0,5мкг/мл). Динамічна сорбція парів Чистий ТГК абсорбує лише 0,3% води під дією відносної вологості 90%. Таке низьке засвоєння води можна віднести скоріше до адсорбції, ніж до абсорбції для ТГК. Диференціальна скануюча калориметрія На термограмі ТГК визначена Tg 10°C. Також знайдено ендотермічний пік з початком на 200°С. З термодинамічної точки зору очікується, що одразу вище Tg матиме місце кристалізація. Однак відомо, що ТГК кристалізується погано. Отже, при кімнатній температурі ТГК знаходиться у гумоподібному або рідкому стані. Ендотермічний пік спричинений випарюванням. Приготування зразків, що містять ТГК Водно-алканольні розчини для розпилювальної сушки або сушки виморожуванням До водного розчину інуліну додають три різні спирти. Визначають, як довго одержані розчини лишаються прозорими. Після розчинення 1 г інуліну в 4 мл води додають воду та/або спирт до загального обсягу 10мл, що дає 10мас.% розчин. Таким чином одержують найвищу концентрацію спирту. ТГК розчиняють у випробуваному спирті. Після того додають спирт та/абоводу , одержуючи 0,4мас.% розчин. Композиції, необхідні для одержання стабільного розчину (див. розділ "Матеріали та методика"), наведені у табл. 5. Таблиця 5 Співвідношення вода-спирт у розчинах інуліну та ТГК ТГК інулін %обс. води 53% макс. 62% макс. 63% макс. 50% мін. 60% мін. 60% мін. спирт EtOH (етанол) n-РгОН (n-пропанол) ТВА (t-бутанол) EtOH n-PrOH ТВА Розчини для розпилювальної сушки готують доданням водного розчину інуліну до розчину ТГК. Виявляється, що це треба робити дуже швидко, аби не дати інуліну затуманити суміш. Розчини залишаються прозорими протягом часу, необхідного, щоб розпилити розчин. Розчин ТГК для сушки виморожуванням готують, розчиняючи 690мг ТГК у 20мл t-бутанолу. Кожний з 20мл скляних флаконів заповнюють 0,23мл розчину ТГК. Далі розчини розбавляють 0,57мл чистого t-бутанолу. Після того додають 1,2мл водного розчину інуліну (160мг/мл), флакони струшують вручну і негайно заморожують. Виділення ТГК після сушки Вміст ТГК у зразках, висушених розпиленням, одразу після одержання виявився нижчим, ніж очікуваний. Початковий вихід становив біля 50%. Після того, як розпилювальний газ та газ від нагрівача замінили на азот, вихід зріс до 75%. У разі сушки виморожуванням зразки після сушки містили 100% очікуваної кількості ТГК. Характеристика зразків, що містять ТГК Скануюча електронна мікроскопія На фотознімках скануючого електронного мікроскопу (СЕМ) продуктів, висушених розпилюванням, видна наявність агломератів дрібних часток. Ці частки діаметром від 1 до 5мкм порожнисті. Малий розмір та низька щільність часток після розпилювальної сушки роблять їх дуже придатними до перероблення на сухі порошки для вдихання. СЕМ фотознімки контрольного продукту (інуліну без ТГК, одержаного розпилювальною сушкою у такому само режимі з такими само розчинниками) не показують жодних відмінностей. На поверхні часток ТГК-вмістних зразків немає плям ТГК, що свідчить про включення ТГК до інулінової матриці. Стабільність зразків, що містять ТГК Зразки піддають дії О2 або низького вмісту О2 (на кресленнях показаний як азот) при 20°С та 47°С відповідно. Крім того, на них діють двома різними величинами вологості при 20°С, як зазначалося вище. Колір продуктів після виймання з розпилювальної сушарки трохи змінюється. На фіг.3-6 наведені результати для партій 12, 5, 6 та 9. Визначено вміст ТГК. На кресленнях фракція Δ9 ΤΓΚ, визначена у зразках після кількох разів витримки, представлена для п'яти різних кліматичних режимів. Висушений виморожуванням зразок (партія 12) представлено на фіг.3. Крім п'яти кліматичних режимів, зазначених вище, цю партію піддають дії температури 60°С при відносній вологості 0%. На фіг.4 наведені дані про стабільність партії, одержаної розпилювальною сушкою з розчину в 1-РrOН та воді з вмістом 3.34% ТГК, на фіг.5 -партії з підвищеним вмістом ТГК - 7.77%, також одержаної розпилювальною сушкою з розчину води та 1-пропанолу. Фіг.6 показує дані щодо стабільності партії, одержаної розпилювальною сушкою з розчину етанолу та води з вмістом 4,00% ТГК. Результати для партій, висушених розпилюванням, показують, що стабільність можна поліпшити за рахунок відповідного складу композиції. Найбільше швидкість розкладу залежить від температури. Вологість та кисень відіграють меншу роль. Втім, треба зазначити, що зразки, які зберігаються в атмосфері азоту, скоріш за все, занечищуються киснем. На різних кресленнях чітко видно, що стабільність продукту, одержаного сушкою виморожуванням, краща, ніж у фізичної суміші та чистого ТГК (див. фіг.7 та 8). Судячи з усього, спосіб одержання скловидних сахарів сильно впливає на стабільність продукту. Як видно на фіг.5, розклад продукту, висушеного виморожуванням, мінімальний в усіх випробуваних режимах, крім відносної вологості 60%. Однак дещо менша концентрація в останньому випадку може бути спричинена тим, що у цьому стані матеріал руйнується, що може затрудняти екстракцію. Контрольні партії Щоб випробувати стабілізуючу спроможність інуліну, треба порівняти наведені дані з партією, яка має таку саме хімічну та фізичну будову, але без інуліну. При цьому контрольна партія має складатися з окремих молекул інуліну, а ТГК присутні лише пари. Оскільки це практично неможливо, готують дві інші контрольні партії: фізичну суміш з вмістом біля 4% ТГК й 96% необробленого інуліну та чистий ТГК. Результати наведені на фіг.7 та 8 відповідно. Треба зазначити, що під час приготування фізичної суміші розчин ТГК у метанолі дещо розм'якшує порошок інуліну. Після випарювання метанолу на дні флакону утворюється більш-менш тверда плівка інуліну та ТГК. Низькопориста плівка забезпечує додатковий захист контрольного матеріалу. Крім того, цілком можливо, що змішування метанольного розчину ТГК з сахаром вже призводить до часткового включення ТГК. Треба підкреслити, що цей самозахист відіграє певну роль і у зразках чистого ТГК, де також утворюється захисна плівка.