Похідні арилсульфоніламіногідроксамової кислоти, фармацевтична композиція, спосіб інгібування матричних металопротеїназ або продукування фактору некрозу пухлин і спосіб лікування захворювань, обумовлених матрич

Даний винахід стосується похідних арилсульфоніламіногідроксамових кислот, які є інгібіторами матричних металопротеїназ або продукування фактору некрозу пухлини (TNF), а також які використовуються в лікуванні станів, вибраних з групи, яка складається з артритів, раку, утворення виразок тканини, рестенозу, захворювань периодонту, бульозного епідермолізу, склеритів та інших захворювань, що характеризуються активністю матричних металопротеїназ, ВІЛ, сепсису, септичного шоку та інших захворювань, які включають продукування TNF. Крім того, сполуки, представлені винаходом, можуть бути застосовані в комбінованій терапії із стандартними нестероїдними протизапальними засобами (далі в тексті NSAID'S) та анальгетиками для лікування артритів та в комбінації з цитотоксичними засобами, такими як адріаміцин, дауноміцин, цис-платина, етопозид, таксол, таксотер та алкалоїдами, такими як вінкристин, у лікуванні раку. Цей винахід також стосується способів використання цих сполук в лікуванні інших захворювань в ссавців, особливо людей, та до фармацевтичних композицій, придатних для цього використання. Існує велика кількість ферментів, які призводять до розриву стр уктури білків, та які структурно подібні до металопротеаз. Металопротеїнази, що мають руйнівну матрицю, такого типу як желатиназа, стромелізин та колагеназа, беруть участь в розкладі матриці тканини (наприклад, коллапс колагену) та зумовлюють багато патологічних станів, які характеризуються аномальним метаболізмом з'єднувальної тканини та матриці базальної мембран, таких як артрит (наприклад, остеоартрит та ревматоїдний артрит), утворення виразки тканини (наприклад рогівкова, епідермальна та шлункові виразки), аномальне загоєння рани, захворювання періодонту, кісткові захворювання (наприклад хвороба Педжета та остеопороз), метастаз пухлини або інвазія, а також ВІЛ-інфекція (J. Leuk. Biol., 52 (2): 244-248, 1992). Фактор некрозу пухлини, як визнають, зумовлює ряд інфекційних та автоімунних захворювань (W. Fiers, FEBS Letters, 1991, 285, 199). Крім того, доведено, що TNF - головний медіатор запальної реакції, що спостерігається при сепсисі та септичному шоку (СЕ. Spooner тa інші, Клінічна Імунологія та Імунопатологія, 1992, 62 S11). Даний винахід стосується сполук формули І або їх фармацевтично прийнятних солей, де R1 та R2 - кожний незалежно вибраний з (С1-С6)алкілу, трифторметилу, три фторметил(С 1-С6)алкілу, (С1С6)алкіл(дифторметилену), (С1-С3)алкіл(дифторметилен)-(С1-С3)алкілу, (С6-С10)арилу, (С2-С9)ге тероарилу, (С6-С10)арил(С 1-С6)алкілу, (С2-С9)гетероарил(С1-С6)алкілу або R1 та R2 взяті разом, можуть утворювати (С3С6)циклоалкіл або бензо-конденсоване (С3-С6)циклоалкільне кільце або групу формули де n та m незалежно дорівнюють 1 або 2 та X - CF2, S, О або NR3, де R3 являє собою водень, (С1С6)алкіл, (С6-С10)арил, (С2-С9)гетероарил, (С6-С10)арил (С1-С6)алкіл, (С2-С9)гетероарил(С1-С6)алкіл, (С1С6)алкілсульфоніл, (С6-С10)арилсульфоніл або ацил; та Q являє собою (С1-С6)алкіл, (С6-С10)арил, (С6-С10)арилокси(С6-С10)арил, (С6-С10)арил(С 6-С10)арил, (С6С10)арил(С 6-С10)арил(С 6-С10)алкіл, (С6-С10)арил(С 2-С9)гетероарил, (С6-С10)арилокси(С 2-С9)гетероарил, (С2С9)гетероарил, (С2-С9)гетероарил(С2-С9)гетероарил, (С2-С9)гетероарил(С6-С10)арил, (С1-С6)алкіл(С 6С10)арил, (С1-С6)алкокси(С 6-С10)арил, (С6-С10)арил(С 1-С6)алкокси(С 6-С10)арил, (С6-С10)арил(С 1С6)алкокси(С 1-С6)алкіл, (С2-С9)гетероарилокси(С6-С10)арил, (С1-С6)алкіл(С 2-С9)гетероарил, (С1С6)алкокси(С 2-С9)гетероарил, (С6-С10)арил(С 1-С6)алкокси(С 2-С9)гетероарил, (С2-С9)гетероарилокси(С2С9)гетероарил, (С6-С10)арилокси(С 1-С6)алкіл, (С2-С9)гетероарилокси(С1-С6)алкіл, (С1-С6)алкіл(С 6С10)арилокси(С 6-С10)арил, (С1-С6)алкіл(С 2-С9)гетероарилокси(С6-С10)арил, (С1-С6)алкіл(С 6-С10)арилокси(С 2С9)гетероарил, (С1-С6)алкокси(С 6-С10)арилокси(С6-С10)арил, (С1-С6)алкокси(С 2-С9)гетероарилокси(С6С10)арил або (С1-С6)алкокси(С 6-С10)арилокси(С 2-С9)гетероарил, де кожна група арилу необов'язково заміщена фтором, хлором, бромом, (С1-С6)алкілом, (С1-С6)алкокси або перфтор(С1-С3)алкілом. Термін 'алкіл', що застосований тут, якщо не вказано інакше, означає, одновалентні вуглеводневі радикали, що мають прямі, розгалужені або циклічні залишки або їх комбінації. Термін 'алкокси', що застосований тут, означає О-алкільні групи, де 'алкіл' визначений вище. Термін 'арил', що застосований тут, якщо не вказано інакше, означає органічний радикал, що походить від ароматичного вуглеводню відщепленням одного водню, такого як феніл або нафтил, необов'язково заміщеного від 1 до 3 замісниками, вибраних з групи, яка складається з фтору, хлор у, три фторметилу, (С1С6)алкокси, (С6-С10)арилокси, трифторметокси, дифторметокси та (С1-С6)алкілу. Термін 'гетероарил', що застосований тут, якщо не вказано інакше, означає органічний радикал, що походить від ароматичної гетероциклічної сполуки відщепленням одного водню, такої як піридил, фурил, піроїл, тієнил, ізотіазоліл, імідазоліл, бензімідазоліл, тетразоліл, піразиніл, піримідил, хіноліл, ізохіноліл, бензофурил, ізобензофурил, бензотієнил, піразоліл, індоліл, ізоіндоліл, пурінил, карбазоліл, ізоксазоліл, тіазоліл, оксазоліл, бензтіазоліл або бензоксазоліл, необов'язково заміщених від 1 до 2 замісниками, вибраними з групи, яка складається з фтору, хлору, трифторметилу, (С1-С6)алкокси, (С6-С10)арилокси, трифторметокси, дифторметокси та (С1-С6)алкілу/ Термін 'ацил', що застосований тут, якщо не вказано інакше, означає вуглеводень загальної формули RCO, де R - алкіл, алкокси, арил, арилалкіл або арилалкілокси, та терміни 'алкіл' або 'арил' як визначені вище. Термін 'ацилокси', що застосований тут, означає О-ацильні групи, де 'ацил' визначений вище. Сполука формули І може мати хіральні центри і тому існує в різноманітних енантіомерних формах. Цей винахід стосується усі х оптичних ізомерів та стереоізомерних сполук формули І та їх сумішей. Переважні сполуки формули І являють собою сполуки, в яких R1 та R2, взяті разом, утворюють (С3С6)циклоалкіл або бензо-конденсоване (С3-С6)циклоалкільне кільце або групу формули де n та m незалежно 1 або 2, та X - CF2, S, О або NR3, де R3 водень, (С1-С6)алкіл, (С6-С10)арил, (С2С9)гетероарил, (С6-С10)арил(С 1-С6)алкіл, (С2-С9)гетероарил(С1-С6)алкіл, (С1-С6)алкілсульфоніл, (С6С10)арилсульфоніл або ацил. Іншими переважними сполуками формули І є ті, де R 1 та R 2 взяті разом, утворюють (С3-С6)циклоалкіл або бензо-конденсоване (С3-С6)циклоалкільне кільце. Іншими переважними сполуками формули І є ті, де Q - (С6-С10)арил, (С6-С10)арил(С 6-С10)арил, (С6С10)арилокси(С 6-С10)арил, (С6-С10)арилокси(С2-С9)гетероарил, (С2-С9)гетероарил, (С2-С9)гетероарил(С2С9)гетероарил, (С6-С10)арил(С 2-С9)гетероарил, (С2-С9)гетероарил(С6-С10)арил або (С2С9)гетероарилокси(С6-С10)арил. Іншими переважними сполуками формули І є ті, де Q - (С6-С10)арилокси(С 6-С10)арил. Іншими переважними сполуками формули І є ті, де R1 та R2 - кожний незалежно (С6-С10)алкіл. Більш переважними сполуками формули І є ті, де R1 та R2, взяті разом, утворюють (С3-С6)циклоалкіл або конденсоване з бензольним ядром (С3-С6)циклоалкільне кільце або групу формули де n та m незалежно 1 або 2, та X-CF2 , S, О або NR3, де R3 водень, (С1-С6)апкіл, (С6-С10)арил, (С2С9)гетероарил, (С6-С10)арил(С 1-С6)алкіл, (С2-С9)гетероарил(С1-С6)алкіл, (С1-С6)алкілсульфоніл, (С6С10)арилсульфоніл або ацил; та Q - (С6-С10)арил, (С6-С10)арил(С 6-С10)арил, (С6-С10)арилокси(С 6-С10)арил, (С6-С10)арилокси(С 2-С9)гетероарил, (С2-С9)гетероарил, (С2-С9)гетероарил(С2-С9)гетероарил, (С6С10)арил(С 2-С9)гетероарил, (С2-С9)гетероарил(С6-С10)арил або (С2-С9)гетероарилокси(С6-С10)арил. 1 2 Більш переважними сполуками формули І є ті, де R та R , взяті разом, утворюють (С3-С6)циклоалкіл або конденсоване з бензольним ядром (С3-С6)циклоалкільне кільце; та Q - (С6-С10)арил, (С6-С10)арил(С 6С10)арил, (С6-С10)арилокси(С 6-С10)арил, (С6-С10)арилокси(С 2-С9)гетероарил, (С2-С9)гетероарил, (С2С9)гетероарил(С2-С9)гетероарил, (С6-С10)арил(С 2-С9)гетероарил, (С2-С9)гетероарил(С6-С10)арил або (С2С9)гетероарилокси(С6-С10)арил. Більш переважними сполуками формули І є ті, де R1 та R2 - кожний незалежно являє собою (С1-С6) алкіл; та Q - (С6-С10)арил, (С6-С10)арил(С 6-С10)арил, (С6-С10)арилокси(С 6-С10)арил, (С6-С10)арилокси(С 2С9)гетероарил, (С2-С9)гетероарил, (С2-С9)гетероарил(С2-С9)гетероарил, (С6-С10)арил(С 2-С9)гетероарил, (С2С9)гетероарил(С6-С10)арил або (С2-С9)гетероарилокси(С6-С10)арил. Більш переважними сполуками формули І є ті, де R1 та R2 - кожний незалежно являє собою (С1-С6) алкіл; та Q - (С6-С10)арилокси(С 6-С10)арил. Особливо переважними сполуками формули І є наступні: гідроксиамід 3-[4-(4-фторфенокси)бензолсульфоніламіно]азетідин-3-карбонової кислоти; гідроксиамід 4-[4-(4-фторфенокси)бензолсульфоніламіно]піперидин-4-карбонової кислоти; гідроксиамід 1-[4-(4-фторфенокси)бензолсульфоніламіно]циклопропан-1-карбонової кислоти; гідроксиамід 1-[4-(4-хлорфенокси)бензолсульфоніламіно]циклопропан-1-карбонової кислоти; гідроксиамід 1-[4-(4-фторфенокси)бензолсульфоніламіно]циклобутан-1-карбонової кислоти; гідроксиамід 1-[4-(4-хлорфенокси)бензолсульфоніламіно]циклобутан-1-карбонової кислоти; гідроксиамід 1-[4-(4-фторфенокси)бензолсульфоніламіно]циклопентан-1-карбонової кислоти; гідроксиамід 1-[4-(4-фторфенокси)бензолсульфоніламіно]циклогексан-1-карбонової кислоти; 2-[4-(4-фторфенокси)бензолсульфоніламіно]-N-гідрокси-2-метилпропіонамід; 2-[4-(4-xлopфeнoкcи)бeнзoлcyльфoнiлaмiнo]-N-гiдpoкcи-2-мeтилпpoпioнaмiд; N-гідрокси-2-метил-2-(5-піридин-2-ілтіофен-2-сульфоніламіно)пропіонамід; гідроксиамід 1-(5-піридин-2-ілтіофен-2-сульфоніламіно)циклопентан-1-карбонової кислоти; гідроксиамід 1-(4'-фторбіфенил-4-сульфоніламіно)циклопропан-1-карбонової кислоти; гідроксиамід 1-(4'-фторбіфенил-4-сульфоніламіно)циклобутан-1-карбонової кислоти; гідроксиамід 1-(4'-фторбіфенил-4-сульфоніламіно)циклопентан-1-карбонової кислоти; гідроксиамід 2-(4-метоксибензолсульфоніламіно)індан-2-карбонової кислоти; та гідроксиамід 2-[4-(4-фторфенокси)бензолсульфоніламіно]-індан-2-карбонової кислоти. Даний винахід також стосується фармацевтичної композиції для (а) лікування станів, вибраних з групи, яка складається з артриту, раку, синергії з цитотоксичними антираковими агентами, утворення виразки тканин, деградаційних плям, рестенозу, захворювань періодонту, бульозного епідермолізу, склеритів, в комбінації з стандартними NSAID'S та анальгезуючими засобами та інших захворювань, що характеризуються активністю матричних металопротеїназ, ВІЛ, сепсису, септичного шоку та інших захворювань, що характеризуються утворенням фактору некрозу пухлини (TNF) або (b) інгібування матричних металопротеїназ або утворення фактору некрозу пухлини (TNF) у ссавців, включаючи людину, яка містить кількість сполуки формули І або її фармацевтично прийнятної солі, ефективну при такому лікуванні, та фармацевтично прийнятний носій. Даний винахід також стосується способу інгібування (а) матричних металопротеїназ або (b) продукування фактору некрозу пухлини (TNF) у ссавців, включаючи людину, який полягає в призначенні вказаному ссавцю ефективної кількості сполуки формули І або її фармацевтично прийнятної солі. Даний винахід також стосується способу лікування станів, вибраних з групи, яка складається з артриту, раку, утворення виразки тканини, макулярної деградації, рестенозу, захворювань періодонту, бульозного епідермолізу, склеритів, сполуки формули I можуть бути застосовані в комбінації з стандартними NSAID'S та анальгезуючими засобами та в комбінації з цитотоксичними антираковими агентами, та інших хвороб, що характеризуються активністю матричних металопротеїназ, ВІЛ, сепсису, септичного шоку та інши х хвороб, що беруть участь в утворенні фактору некрозу пухлини (TNF) в ссавців, включаючи людину, який полягає в призначенні вказаному ссавцю кількості сполуки формули І або її фармацевтично прийнятної солі, ефективної при лікуванні таких станів. Наступні схеми реакцій пояснюють одержання сполук даного винаходу. Якщо не вказано інакше, R1, R2 та Q в схемах реакцій та в наступному обговоренні, є такими як визначено вище. Приготування А В реакції 1 Приготування А, амінокислота формули III реагує з бензиловим спиртом та кислотою формули НХ, де X переважно 4-толуолсульфонат, в інертному розчиннику, типу бензолу або толуолу (толуол переважніше) для одержання відповідної солі ефіру бензилової кислоти формули V, реакція зазвичай виконується в інтервалі часу між приблизно 1 годиною до приблизно 24 годин, при температурі кипіння застосованого розчинника. Вода, яка утворюється під час процесу реакції, зазвичай збирається в пастці Діна-Старка. В реакції 2 Приготування А, сполука формули V перетворюється до відповідної сполуки формули VI, взаємодією V з реакційноздатною функціональною похідною сульфонової кислоти (QSO2OH), типу сульфонілхлориду (QSO 2CI), в присутності основи, типу гідроксиду натрію або триетиламіну, та розчинника, типу метиленхлориду, тетрагідрофурану, диоксану, води або ацетонітрилу, переважно суміші диоксану та води. Реакційну суміш перемішували при температурі між приблизно 0°С до приблизно 50°С, переважно при кімнатній температурі, в інтервалі часу між приблизно 10 хвилин до приблизно 2 днів, переважно приблизно 60 хвилин. В реакції 3 Приготування А, проміжні сполуки формули VI - гідрогенолізують, для одержання проміжних сполук формули II. Реакцію проводять в розчиннику, типу етанолу, в атмосфері азоту (переважно при тиску 3 атмосфери) з використанням каталізатору такого як 10% паладій-на-активованому вуглі. Реакційну суміш зазвичай перемішують при кімнатній температурі в інтервалі часу між приблизно 30 хвилин до приблизно 24 годин, переважно приблизно 1,5 години. В реакції 1 з Схеми 1, амінокислотну сполуку формули III перетворюють у відповідну сполуку формули II взаємодією III з реакційноздатною функціональною похідною сульфонової кислоти формули QSO2OH, де Q є такою, як зазначено вище, такою як сульфонілхлорид (QSO2CI), в присутності основи, такого як гідроксиду натрію або триетиламіну, та полярного розчинника такого як тетрагідрофуран, діоксан, вода або ацетонітрил, переважно в суміші діоксану та води. Реакційну суміш перезмішували при температурі між приблизно 0°С до приблизно 50°С, переважно при кімнатній температурі, в інтервалі часу між 10 хвилинами до приблизно 2 днів, переважно приблизно 60 хвилин. В реакції 2 з Схеми 1, карбонову кислоту формули II перетворюють до гідроксамової кислоти формули І, обробкою II за допомогою 1-(3-диметиламінопропіл)-3-етилкарбодиіміду та 1-гідроксибензтриазолу в полярному розчиннику, такому як Ν,N-диметилформамід, з наступним додаванням гідроксиламіну до реакційної суміші в інтервалі часу між приблизно 15 хвилин до приблизно 1 години, переважно приблизно 30 хвилин. Гідроксиламін переважно утворюється in situ з солі, такої як хлоргідрат гідроксиламіну, в присутності основи, типу триетиламіну. Альтернативно, замість гідроксиламіну або солі гідроксиламіну можуть бути застосовані захищена похідна гідроксиламіну або її сіль, в яких гідроксильна група захищена трет-бутилом, бензилом, алілом або 2-триметилсілілетиловим ефіром. Видалення гідроксил-захисної групи проводять шляхом гідрогенолізу для бензил-захисної групи (5% паладій-на-сульфаті барію є переважним каталізатором) або обробкою сильною кислотою, такою як трифтороцтова кислота, для трет-бутильної захисної групи. Алільна захисна група може бути видалена обробкою трибутилтінгідридом та оцтовою кислотою в присутності каталітичної кількості біс(трифенілфосфін)паладій (II) хлориду. 2Триметилсілілетиловий ефір може бути видалений обробкою сильною кислотою такою як трифтороцтова кислота або взаємодією з джерелом фтору, таким як ефірат трифтористого бору. Реакція сполуки II з гідроксиламіном, сіллю гідроксиламіну, захищеною похідною гідроксиламіну або сіллю захищеної похідної гідроксиламіну може також бути проведена в присутності (бензтриазол-1ілокси)трис(диметиламіно)фосфонійгексафторфосфату та основи, такої як триетиламін, в інертному розчиннику, такому як метиленхлорид. Реакційна суміш перемішується при температурі між приблизно 0°С до приблизно 50°С, переважно при кімнатній температурі, в інтервалі часу між приблизно 1 година до приблизно 3 днів, переважно приблизно 1 день. Переважним процесом для перетворення сполуки II в сполуку І є взаємодія II з О-бензилгідроксиламін-гідрохлоридом в присутності гексафторфосфату (бензтриазол-1-ілокси)трис(диметиламіно)фосфонію та триетиламіну з використанням метиленхлориду як розчинника. Наступне видалення захисної групи О-бензилу для утворення сполуки формули І проводять шляхом гідрогенолізу під тиском 3 атмосфери при кімнатній температурі, використовуючи як каталізатор 5% паладій-на-сульфаті барію. Переважним розчинником є метанол. Час реакції може мінятися від приблизно 1 години до приблизно 5 годин (3,5 годин переважно). В певних випадках переважно одержувати сполуки формули І реакцією гідроксиламіну, солі гідроксиламіну, захищеної похідної гідроксиламіну або солі захищеної похідної гідроксиламіну з активним ефіром формули IV, як показано в реакції 3 схеми 1. Реакцію проводять в інертному розчиннику, такому як N,N-диметилформамід при температурі в межах від приблизно кімнатної температури до приблизно 80°С, переважно приблизно 60°С в інтервалі часу приблизно 1 година до приблизно 2 днів. Якщо використовується захищена похідна гідроксиламіну або солі захищеної похідної гідроксиламіну, видалення захисної групи виконують як описано вище. Активну ефірну похідну формули IV одержують обробкою сполуки формули II з (бензтриазол-1-ілокси)трис(диметиламіно)фосфоній гексофторфосфатом та основою, такою як триетиламін, в інертному розчиннику, такому як хлористий метилен (Реакція 4, схема 1). Реакційну суміш перемішують при температурі між приблизно 0°С до приблизно 50°С, переважно при кімнатній температурі, в інтервалі часу між приблизно 1 година до приблизно 3 днів, переважно приблизно 1 день. Фармацевтично прийнятні солі кислих сполук винаходу це солі, які утворені основами, а саме, катіонні солі, такі як солі лужних та лужноземельних металів, таких як натрій, літій, калій, кальцій, магній, а також амонійні солі, такі як солі амонію, триметиламонію, диметиламонію, та сіль трис(гідроксиметил)метиламонію. Аналогічно солі приєднання кислот, таких як мінеральні кислоти, органічні карбонові та органічні сульфонові кислоти, наприклад соляна кислота, метансульфонова кислота, малеїнова кислота, також можуть містити основні групи, такі як піридил, що складають частину структури. Здатність сполук формули І або їх фармацевтично прийнятних солей (в подальшому також згаданих як сполуки даного винаходу) інгібува тиматричні металопротеїнази або утворення фактору некрозу пухлини (TNF) та, відповідно, проявляти їх ефективність для лікування захворювань, що характеризуються матричними металопротеїназами або утворенням фактору некрозу пухлини, підтверджується наступними виконаними in vitro тестами. Біологічні тести Інгібування Людської Колагенази (ММР-1) Людську рекомбінантну колагеназу активували трипсином, використовуючи наступне співвідношення: 10мкг трипсину в 100мкг колагенази. Трипсин та колагеназу культивували при кімнатній температурі на протязі 10 хвилин, потім додавали п'ятикратний надлишок сполуки (50мкг/10мкг трипсині) інгібітора трипсину сої. Готували 10мМ ви хідних розчинів інгібіторів в диметилсульфоксиді та потім розбавляли, використовуючи наступну схему: 10мМ®120мкМ®12мкМ®1,2мкМ®0,12мкМ Двадцять п'ять мікролітрів кожної концентрації вносили у відповідні лунки 96-лункової мікрофторованої кювети в трьох серіях. Після додавання ензиму та субстрату кінцева концентрація інгібітора буде 1:4 розведення. Позитивні контрольні тести (ензим, без інгібітору) здійснювали в лунках D1-D6 та тести порівняння (без ензиму, без інгібітору) проводили в лунках D7-D12. Колагеназу розбавляли до 400нг/мл і потім додавали 25мкл до відповідних лунок мікрофторної кювети. Кінцева концентрація колагенази в випробуванні - 100нг/мл. Субстрат (DNP-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(NMA)-NH 2) одержували як 5мМ напівпродукт в диметилсульфоксиді та потім розбавляли до 20мкМ в буфері випробування. Тест починали додаванням 50мкл субстрату в лунку мікрофторної кювети, до кінцевої концентрації 10мкМ. Флуоресцентні дані (360нм збудження, 460нгм випромінювання) були отримані на початку відліку часу і потім з 20-хвилинними інтервалами. Випробування проводили при кімнатній температурі з типовим часом випробування 3 години. Графік флуоресценції від часу будували як для порівняльного зразка так і для зразків, що містили колагеназу (дані трикратних вимірювань усереднювали). Точку часу, яка забезпечує хороший сигнал (порівняльна) та точку, що знаходиться на лінійній частині кривої (зазвичай біля 120 хвилин), вибирали так, щоб визначити значення ІС50. Нульовий час використовували як порівняльний для кожної сполуки при кожній концентрації, та ці значення віднімали від 120 хвилинних даних. Результати будували як залежність концентрації інгібітору від % контролю (флуоресценція інгібітору поділена на флуоресценцію самої колагенази х 100). ІС50 визначали з концентрації інгібітору, яка дає сигнал, який є 50% від контролю. Якщо було встановлено, що IC50