Спосіб очищення фолікулостимулювального гормону

1. Спосіб очищення рекомбінантного FSH або варіанта FSH, який включає здійснення таких стадій обробки рідини, яка містить FSH: (1) афінна хроматографія із забарвлюванням; (2) хроматографія з гідрофобною взаємодією; та (3) хроматографія з оберненою фазою; які можуть здійснюватись у будь-якому порядку. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що афінну хроматографію із забарвлюванням (стадія 1) здійснюють зі смолою з іммобілізованим Cibacron Вlue F3G-А. 3. Спосіб за п. 1 або п. 2, який відрізняється тим, що смолою, яку використовують для афінної хроматографії із забарвлюванням (стадія 1), є Blue Sepharose FF. 4. Спосіб за будь-яким із пп. 1-3, який відрізняється тим, що афінну хроматографію із забарвлюванням (стадія 1) здійснюють із використанням як елюенту натрійфосфатного буфера з рН, що дорівнює або приблизно дорівнює 6,5-11,5. 5. Спосіб за будь-яким із пп. 1-4, який відрізняється тим, що хроматографію з гідрофобною вза 2 (19) 1 3 87709 4 16. Спосіб за будь-яким із пп. 10-15, який додатко24. Спосіб очищення людського рекомбінантного во включає другу стадію аніонообмінної хроматогFSH, який включає здійснення таких стадій обробрафії (стадія 4). ки FSH: 17. Спосіб за п. 16, який відрізняється тим, що (-1) ультрафільтрування; другу стадію аніонообмінної хроматографії (стадію (0) аніонообмінна хроматографія на смолі Q 4) здійснюють після стадій (1), (2) і (3). Sepharose FF із застосуванням як елюенту бора18. Спосіб за п. 17, який відрізняється тим, що ту/NaCl, L-метіоніну з рН, що дорівнює або пристадії здійснюють у наведеному нижче порядку: близно дорівнює 8,5; (0) аніонообмінна хроматографія; (1) обробка елюату зі стадії (0) на стадії афінної (1) афінна хроматографія із забарвлюванням; хроматографії із забарвлюванням на смолі Q (2) хроматографія з гідрофобною взаємодією; Sepharose FF із застосуванням як елюенту фос(3) хроматографія з оберненою фазою; і фату, NaCl, L-метіоніну з рН, що дорівнює або (4) аніонообмінна хроматографія. приблизно дорівнює 7,0; 19. Спосіб за будь-яким із пп. 16-18, який відріз(2) обробка елюату зі стадії (1) на стадії хроматогняється тим, що другу стадію аніонообмінної хрорафії з гідрофобною взаємодією на смолі матографії (стадію 4) здійснюють із застосуванням Тоуoреаrl Butyl 650М із застосуванням як елюенту смоли Fractogel ЕМР ТМАЕ НіСар або смоли Q фосфату, сульфату амонію, L-метіоніну з рН, що Sepharose FF. дорівнює або приблизно дорівнює 7,0; 20. Спосіб за пп. 16-19, який відрізняється тим, (3) обробка елюату зі стадії (2) на стадії хроматогщо другу стадію аніонообмінної хроматографії рафії з оберненою фазою на смолі Source 30 RFC (стадію 4) здійснюють із застосуванням боратного із застосуванням як елюенту ацетату амонію, Lбуфера і градієнта зростаючої концентрації NaCl. метіоніну з 2-пропанолом з рН, що дорівнює або 21. Спосіб за будь-яким із пп. 16-20, який включає приблизно дорівнює 7,6; стадію (4') нанофільтрування, яку здійснюють піс(4) обробка елюату зі стадії (3) на стадії аніонообля другої стадії аніонообмінної хроматографії мінної хроматографії на смолі Fractogel EMD (стадії (4)). ТМАЕ НіСар з боратом, L-метіоніном з рН, що до22. Спосіб за п. 21, який включає стадію (5) ультрівнює або приблизно дорівнює 8,5, і NaCl; рафільтрування після стадії (4') нанофільтрування. (4') обробка елюату зі стадії (4) на стадії нанофіль23. Спосіб за будь-яким із пп. 1-22, який відрізнятрування; і ється тим, що будь-який з елюентів та/або буфе(5) обробка розчиненої речовини зі стадії (4') на рів може містити антиоксидант, зокрема, Lстадії ультрафільтрування. метіонін. Цей винахід має відношення до галузі очищення фолікулостимулювального гормону (FSH). Фолікулостимулювальний гормон (FSH) являє собою впорскуваний білок, що належить до класу гонадотропінів. FSH застосовують при лікуванні безплідності і репродуктивних розладів як у хворих-чоловіків, так і у хворих-жінок. FSH за природних умов продукується гіпофізом. Для фармацевтичного застосування FSH може продукуватись рекомбінантним шляхом (rFSH), або він може бути виділеним із сечі постклімактеричних жінок (uFSH). FSH застосовують у хворих-жінок для індукування овуляції (OI) та для регульованого гіперстимулювання яєчників (СОН) у разі методик допоміжної репродукції (ART). Відповідно до типової схеми лікування, для індукування овуляції хвора щоденно одержує ін'єкції FSH або варіанта (від приблизно 75МОд FSH/добу до 300МОд FSH/добу) впродовж періоду часу, тривалість якого становить від приблизно 6 днів до приблизно 12 днів. Відповідно до типової схеми лікування у разі регульованого гіперстимулювання яєчників, хвора щоденно одержує ін'єкції FSH або варіанта (приблизно 150-600МОд FSH/добу) впродовж періоду часу, тривалість якого становить від приблизно 6 днів до приблизно 12 днів. FSH застосовують також для індукування сперматогенезу у чоловіків, що страждають на олігоспермію. Схема лікування із застосуванням 150МОд FSH тричі на тиждень у поєднанні з 2500МОд hCG (хоріонічний гонадотропін людини) двічі на тиждень була успішною щодо забезпечення збільшення кількості сперматозоїдів у чоловіків, що страждають на гіпогонадотропний гіпогонадизм [Берджес (Burgues) та інші; Subcutaneous selfadministration of highly purified follicle stimulating hormone and human chorionic gonadotrophin for the treatment of male hypogonadotrophic hypogonadism. Spanish Collaborative Group on Male Hypogonadotrophic Hypogonadism', Hum. Reprod.; 1997, 12, 980-986]. Важливістю ролі FSH при лікуванні розладів плідності обумовлена бажаність одержання FSH високого ступеня чистоти і високого рівня питомої активності. Лікування із застосуванням FSH потребує повторних ін'єкцій. Препарати FSH високого ступеня очищення можуть вводитись підшкірно, що надає можливість самостійного введення препаратів хворими, завдяки чому збільшується зручність для хворих і їх піддатливість лікуванню. Лінч (Lynch) та інші [The extraction and purification of human pituitary foMcle-stimulating hormone and luteinising hormone; Ada Endocrinologica, 1988, 288, 12-19] описує спосіб очищення людського гіпофізарного FSH. Згаданий спосіб включає аніонообмінну та катіонообмінну хроматографію, імуноафінну екстракцію та гель-хроматографію за розміром молекул. Повідомляється, що згаданий спосіб забезпечує одержання гіпофізарного FSH, що має питому активність 4990МОд (імунологічний аналіз)/мг, з 16МОд/мг LH (лютеїнізувальний гор 5 87709 6 мон, LH). Вміст білка визначали за сухою масою матографії з іммобілізованим іоном металу із заабо у розчині за абсорбцією при 280нм (приймаюстосуванням Сu++. Повідомляється, що одержаний чи А2801см для 1г/л за 1). FSH має питому активність 2,17МОд/г за резульWO 98/20039 (IBSA Institut Biochimique SA) татами визначення за допомогою радіорецепторописує спосіб очищення людського сечового FSH, ного аналізу FSH для визначення біологічної актирозпочинаючи із сечових екстрактів, які називають вності і набору для аналізу білків фірми BioRad клімактеричними гонадотропінами людини (hMG). (фірма BioRad Laboratories, штат Каліфорнія, У цьому способі застосовується іонообмінна хроСША) для визначення вмісту білків. матографія на аніонообмінних смолах типу DEAE WO 88/10270 (Institute di Ricerca Cesare Serono (діетиламіноетил), що мають властивості слабкої SPA) описує спосіб очищення людського FSH із основи, з подальшою афінною хроматографією на сечі. Згаданий спосіб включає імунохроматограсмолі, лігандом якої є похідна антрахінону. Повідфію з FSH-специфічними іммобілізованими моноомляється, що за допомогою цього способу одерклональними антитілами, зв'язаними зі смолою жують сечовий FSH без LH, що має питому активSepharose 4B дивінілсульфоном, із подальшою ність 6870МОд (імунологічний аналіз)/мг. Вміст високоефективною рідинною хроматографією з білка визначали, приймаючи, що водний розчин оберненою фазою. Одержаний FSH є вільним від білка (1мг/мл) має оптичну густину 0,62 при 277нм LH та інших сечових білків і має питому активність у кварцовій кюветі з довжиною шляху, що дорів6200МОд/мг у формі ліофілізованого порошку (менює 1см. тод Стілмена-Полі). Згаданий препарат був перWO 00/63248 (Instituto Massone SA) описує шим препаратом FSH, придатним для підшкірного спосіб очищення гонадотропінів, у тому числі FSH, введення завдяки його чистоті. із людської сечі. Згаданий спосіб включає такі стаЗалишається потреба у нових способах очидії: іонообмінна хроматографія з катіонообмінною щення FSH і варіантів FSH Зокрема, існує потреба смолою типу сульфопропілу, що має властивості у способах очищення, які виключають застосувансильної основи, іонообмінна хроматографія з аніоня стадій високовитратної імуноафінної хроматогнообмінною смолою, що має властивості сильної рафії. основи, та гідрофобна хроматографія (НІС). За Мета цього винаходу полягає у наданні нового повідомленням, одержують препарат FSH, що має способу очищення рекомбінантного FSH або варіпитому активність 8400МОд/мг (метод Стілменаанта рекомбінантного FSH. Полі (Steelman-Pohley method): Assay of the follicle Відповідно до першого аспекту, цей винахід stimulating hormone based on the augmentation with пропонує спосіб очищення рекомбінантного людhuman chorionic gonadotrophin; Endocrinology', ського FSH або варіанта FSH, розпочинаючи з 1953, 53, 604-616) із біологічною активністю LH, рідини, що містить неочищений FSH, що включає меншою за 1МОд (метод визначення приросту наведені нижче стадії: маси сім'яних пухирців пацюків: Ван Гелл Г. (Van (1) афінна хроматографія із забарвлюванням; Hell Η.), Матгійсен P. (Matthijsen R.), ПА. Овербік (2) хроматографія з гідрофобною взаємодією; (G.A Overbeek); Ada Endocrinol, 1964, 47, 409) на та 75МОд FSH. Вміст білка визначали за методом (3) високоефективна рідинна хроматографія з Лоурі [О.Г. Лоурі (О.Н. Lowry) та інші, J. Вiol. оберненою фазою; які можуть здійснюватись у Chem., 1951, 193, 265]. будь-якому порядку. Патент США №5,990,288 (на ім'я Мазік Фіг.1 ілюструє цей винахід, тобто спосіб очи(Musick) та інші) описує спосіб очищення FSH із щення, що включає стадії: біологічних зразків, наприклад, людського гіпофізу - афінної хроматографії із забарвлюванням, або людської постклімактеричної сечі. У згаданому - хроматографії з гідрофобною взаємодією, способі застосовують катіонообмінну хроматогра- високоефективної рідинної хроматографії з фію на смолі Fractogel EMD SO3-650M, із подальоберненою фазою. шою афінною хроматографією із забарвлюванням Фіг.2 показує схему послідовності операцій на смолі Mimetic Orange 1, із подальшою стадією конкретного варіанта здійснення цього винаходу, гідрофобної хроматографії на смолі Bakerbond тобто способу очищення, що включає стадії: Wide Pore НІ-Рrоруl. Як повідомляється, наслідком - ультрафільтрування/діафільтрування, застосування згаданого способу є одержання - аніонообмінної хроматографії, людського гіпофізарного FSH із питомою активніс- афінної хроматографії із забарвлюванням, тю 7066МОд (імунологічний аналіз)/мг і меншою за - хроматографії з гідрофобною взаємодією, 1МОд (імунологічний аналіз)/мг активністю LH, та - високоефективної рідинної хроматографії з сечового FSH із питомою активністю 6298МОд оберненою фазою (імунологічний аналіз)/мг і меншою за 3МОд (іму- аніонообмінної хроматографії, нологічний аналіз)/мг активністю LH. Вміст білка - нанофільтрування, визначали за абсорбцією при 280нм (приймаючи - ультрафільтрування/діафільтрування. А2801см для 1г/л за 1). Скорочення Чіба (Chiba) та інші [Isolation and partial characУ описі цього винаходу застосовуються навеterisation of LH, FSH and TSH from canine pituitary дені нижче скорочення: gland ; Endocrinol. J., 1997, 44, 205-218] описує DF: діафільтрування; спосіб очищення собачих гіпофізарних гонадотроFSH: фолікулостимулювальний гормон (FSH); пінів, у тому числі FSH, за допомогою афінної r-FSH: рекомбінантний FSH; хроматографії із застосуванням конканаваліну hFSH: людський FSH; (Соn) А, гідрофобної хроматографії (НІС) та хроr-hFSH: рекомбінантний людський FSH; 7 87709 8 BV: об'єм шару; стосовується антиоксидант або вільна DEAE: діетиламіноетил; амінокислота чи дипептид з антиоксидантним ELISA: твердофазний імуноферментний анаефектом та ефектом видалення домішок. Точніше, ліз; антиоксидант входить до складу будь-якого з буDAC: афінна хроматографія із забарвлюванферів, що застосовуються для очищення та/або ням; концентрування та/або фільтрування r-hFSH. АнІМАС: афінна хроматографія з іммобілізоватиоксидант запобігає окисненню FSH у процесі ним іоном металу; обробки. Антиоксидантом, якому віддається переOD: оптична густина; вага, є L-метіонін. Відповідно до варіанта, якому НІС: хроматографія з гідрофобною взаємодівіддається перевага, L-метіонін застосовується з єю; концентрацією, що дорівнює або приблизно дорівHPLC: високоефективна рідинна хроматогранює 10-100мМ. Додатковими прикладами антиокфія; сиданта є трет-бутил-4-метоксифенол, 2,6-біс(1,1IRMA: імунорадіометричний аналіз; диметилетил)-4-метилфенол; біметагідросульфіт кД: кілодальтон; калію або натрію, гідросульфіт натрію. ПрикладаНСР: білок клітини-хазяїна, білки, що походять ми вільної амінокислоти та дипептиду з антиоксиіз клітини-хазяїна, що застосовується для експресії дантним ефектом та ефектом видалення домішок FSH; є гістидин, таурин, гліцин, аланін, карнозин, ансеІРС: контроль якості у процесі виготовлення; рин, 1-метилгістидин або їх комбінації. IEF: ізоелектрофокусування; Відповідно до типового варіанта, вихідний маPES: поліефірсульфон; теріал спочатку просвітлюють, після чого, відповіRP-HPLC: високоефективна рідинна хроматогдно до факультативного варіанта, концентрують рафія з оберненою фазою; (наприклад, шляхом ультрафільтрування) та/або Q FF: аніонообмінна хроматографія на смолі Q піддають буферному обміну (наприклад, шляхом Sepharose FF; діафільтрування) перед захопленням на першій к.т.: кімнатна температура; хроматографічній стадії. УФ: ультрафільтрування; На стадіях хроматографії можуть застосовуваWFI: вода для ін'єкцій. тись смоли на основі полімерів та агарози. МожЦей винахід пропонує спосіб очищення рекомливо також застосування мембранної хроматогбінантного людського FSH або варіанта рекомбірафії, де смолу замінено на функціоналізовану нантного FSH, розпочинаючи з рідини, що містить мембрану. неочищений FSH, що включає наведені нижче Нижче наведено докладніший опис 3 стадій стадії: очищення відповідно до цього винаходу (тобто (1) афінна хроматографія із забарвлюванням; афінна хроматографія із забарвлюванням, хрома(2) хроматографія з гідрофобною взаємодією; тографія з гідрофобною взаємодією, високоефекта тивна рідинна хроматографія з оберненою фа(3) високоефективна рідинна хроматографія з зою). оберненою фазою; які можуть здійснюватись у Стадія (1) афінної хроматографії із забарвлюбудь-якому порядку. ванням Спосіб очищення відповідно до цього винахоСпосіб відповідно до цього винаходу включає ду забезпечує одержання маси рекомбінантного стадію афінної хроматографії із забарвлюванням FSH високого рівня чистоти, який у подальшому (1). Відповідно до варіанта здійснення, якому відможе застосовуватись для виготовлення кінцевої дається перевага, стадію афінної хроматографії із лікарської форми, наприклад, Gonal-F (фірма забарвлюванням здійснюють із застосуванням Serono). Перевага цього способу полягає у тому, смоли, іммобілізованим лігандом у якій є забарвщо він забезпечує можливість досягнення високолювальна сполука, добре відома фахівцю у цій го рівня чистоти без застосування імуноафінної галузі, а саме Cibacron Blue F3G-A. Термін "іммохроматографії. Неочищений FSH, який являє собілізований" є добре зрозумілим фахівцю у цій бою вихідний матеріал для очищення відповідно галузі і означає, що згаданий ліганд є дериватизодо цього винаходу, складається зі зборів клітин, ваним у тому значенні, що він хімічно зв'язаний зі що виросли у культурі, які містять рекомбінантний смолою. Смолою, якій віддається особлива переFSH. вага, є Blue Sepharose FF (яку одержують від фірВідповідно до варіанта здійснення, якому відми Amersham Biosciences Inc.). Смола Blue Sephaдається перевага, на деяких або усіх стадіях споrose FF має наведені нижче технічні собу очищення відповідно до цього винаходу захарактеристики: 9 Ліганд Спосіб сполучення ліганду Зв'язувальна здатність Матриця Межа виключення (Мг) Діапазон розміру частинок Лінійна швидкість потоку* Густина ліганду Стабільність рН Хімічна стійкість 87709 10 Технічні характеристики Cibacron Blue F3G-A Сполучення за допомогою триазину =18мг людського сироваткового альбуміну/мл сухого гелю Високоструктуризована агароза, 6% 4´106 45-165мкм =750см/г =7мкмоль Cibacron Blue/мл середовища 4-12 (довгострокова), 3-13 (короткострокова) 40°С впродовж 7 днів у суміші: 70% розчин етанолу, 6Μ розчин гуанідину гідрохлориду, 8Μ розчин сечовини Зрозуміло, що згаданий спосіб може здійснюватись з іншими смолами, що мають подібні характеристики. Прикладами інших смол є: Тоуореагі AF-blue-HC-650M (фірма Tosoh Bioscience), Тоуореагі SuperButyl 550, Тоуореагі Phenyl 650, Blue Cellthru BigBead (фірма Sterogene), SwellGel Blue (фірма Pierce), Cibachrome blue 3GA-agarose 100 (фірма Sigma), Affi-Gel Blue (фірма BioRad), капсули Econo-Pac blue (фірма Bio-Rad), Blue sepharose HP (фірма Amersham), Cibacron Blue 3GA (фірма Sigma). Елюювання на стадії іммобілізованої афінної хроматографії із забарвлюванням, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, повинно здійснюватись із застосуванням фосфатного буфера, відповідно до варіанта, якому віддається особлива перевага, натрійфосфатного буфера. рН елюенту, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, повинен становити від або приблизно від 6,0 до або приблизно до 11,5, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, від або приблизно від 6,5 до або приблизно до 8, відповідно до варіанта, якому віддається особлива перевага, повинен дорівнювати або приблизно дорівнювати 7,0. Іншими буферами, придатними для підтримання рН на рівні 7,0, є такі: MES (2-(Nморфоліно)етансульфокислота), біс-трис (тригідроксиметиламінометан), ADA (адипінова кислота), PIPES (піперазин-N,N-біс-2-етансульфокислота), ACES (N-(2-ацетамідо)-2аміноетансульфокислота), BES (N,N-бic-(2гідроксіетил)-2-аміноетансульфокислота), MOPS (2-(N-морфоліно)пропансульфокислота), TES (2([2-гідрокси-1,1біс(гідроксиметил)етил]аміно)етансульфокислота), ГЕПЕС (N-2-гідроксіетилпіперазин-N-2етансульфокислота). Елюювальний буфер для стадії афінної хроматографії із забарвлюванням, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, повинен містити сіль для підвищення електропровідності, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, NaCl. Відповідно до варіанта здійснення, якому віддається особлива перевага, буфер, що контактує із продуктом, для стадії афінної хроматографії із забарвлюванням (зрівноважування, промивання та елюювання) містить антиоксидант, наприклад, L-метіонін. Додатковими прикладами антиоксиданта є трет-бутил-4-метоксифенол, 2,6-біс(1,1диметилетил)-4-метилфенол; біметагідросульфіт калію або натрію, гідросульфіт натрію. Стадія (2) гідрофобної хроматографії Згаданий спосіб включає також стадію (2) гідрофобної хроматографії. Відповідно до варіанта здійснення, якому віддається перевага, гідрофобну хроматографію здійснюють із застосуванням такої смоли, як Toyopearl Butyl 650М (яку одержують від фірми Tosoh Biosep Inc.) Зрозуміло, що стадія (2) може здійснюватись із застосуванням інших смол, що мають подібні характеристики. Іншими смолами, що можуть застосовуватись, є такі: Phenyl Sepharose 6 Fast Row (low sub); Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub); Butyl Sepharose 4 Fast Flow; Octyl Sepharose 4 Fast Flow; Phenyl Sepharose High Performance; SOURCE 15ETH; SOURCE 15ISO; SOURCE 15PHE, усі від фірми Amersham Biosciences (800) 526-3593; (дивись www.amershambiosciences.com). Додатковими смолами є такі: Hydrocell C3 або Hydrocell C4; Hydrocell Phenyl від фірми BioChrom Labs Inc. (812) 234-2558; (дивись www.biochrom.com). Зв'язування на смолі для гідрофобної хроматографії (НІС) здійснюють у буфері з високою електропровідністю, яка забезпечується доданням солі (наприклад, NaCl, (NH4)2SO4 або Na2SO4). Елюювання на стадії гідрофобної хроматографії, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, здійснюють шляхом зниження електропровідності рухомої фази (шляхом зниження концентрації солі) із застосуванням буфера, що має рН від або приблизно від 6 до або приблизно до 8, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, від або приблизно від 6,5 до або приблизно до 7,5, відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, який дорівнює або приблизно дорівнює 7. Система, якій віддається особлива перевага, містить натрію фосфат для забуферення, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, з рН, який дорівнює або приблизно дорівнює 7, та амонію сульфат. Альтернативні буфери згадувались вище. Відповідно до варіанта здійснення, якому віддається особлива перевага, буфери, що контактують із продуктом, для стадії (2) НІС (зрівноважування, промивання, елюювання) містять антиоксидант, наприклад, L-метіонін. Альтернативні антиоксиданти згадувались вище. Стадія (3) високоефективної рідинної хроматографії з оберненою фазою Згаданий спосіб відповідно до цього винаходу включає також стадію високоефективної рідинної 11 87709 12 хроматографії з оберненою фазою (RPC) (3). Відваріанта, якому віддається перевага, спирт (наповідно до варіанта здійснення, якому віддається приклад, метанол, етанол тощо), відповідно до перевага, RPC здійснюють із застосуванням такої варіанта, якому віддається найбільша перевага, 2смоли, як SOURCE 30 RPC (яку одержують від пропанол (ізо-пропанол). фірми Amersham Biosciences). Зрозуміло, що стаВідповідно до варіанта здійснення, якому віддія (3) може здійснюватись із застосуванням інших дається особлива перевага, буфери, які контактусмол, які є добре відомими фахівцю у цій галузі і ють із продуктами, для стадії RPC (зрівноважуванякі мають подібні характеристики. ня, промивання, елюювання), містять Відповідно до варіанта, якому віддається пеантиоксидант, наприклад, L-метіонін. Альтернатиревага, хроматографію здійснюють із застосуванвні антиоксиданти згадувались вище. ням рухомої фази, забуференої до слабколужного Факультативна додаткова стадія (0) очищення рН, наприклад, до рівня або приблизно до рівня - іонообмінна хроматографія рН 7-8,5, відповідно до варіанта, якому віддається На додаток до 3 головних стадій очищення, перевага, до рівня або приблизно до рівня 7,5 або опис яких було наведено вище, цей винахід може 7,6. Відповідно до варіанта здійснення, якому відвключати додаткові стадії очищення. дається перевага, забуферення здійснюють за Відповідно до одного з варіантів здійснення, допомогою амонію ацетату. Іншими буферами, спосіб очищення відповідно до цього винаходу придатними для забезпечення рН на рівні або включає попередню стадію (0) іонообмінної хроприблизно на рівні 7,6, є: BES, MOPS, фосфат, матографії, яка здійснюється, відповідно до варіаTES, ГЕПЕС. Буферні розчини, які застосовують нта, якому віддається перевага, з аніонообмінною на цій стадії, можуть також містити органічний мосмолою, що має властивості сильної основи, віддифікатор, концентрація якого змінюється для різповідно до варіанта, якому віддається особлива них фаз стадії хроматографії (внесення, промиперевага, з четвертинною амонієвою смолою, навання, елюювання та регенерування). Відповідно приклад, Q Sepharose FF (яку одержують від фірдо варіанта здійснення, якому віддається перевами Amersham Biosciences), яка має наведені нижга, згаданим органічним модифікатором є змішуче характеристики: ваний з водою органічний розчинник, відповідно до Тип іонообмінника Повна ємність (ммоль/мл) Межа виключення (глобулярні білки) Форма кульок Структура кульок Робоча стабільність рН Очищувальна стабільність рН Лінійна швидкість потоку при температурі 25°С, 1бар (0,1МПа), товщині шару 15см, колонка ХК 50/30 Сильний аніон 0,18-0,25 4´106 Сферичні, діаметр 45-165мкм Структурована агароза, 6% 2-12 1-14 400-700см/год Відповідно до альтернативного варіанта, стадія (0) іонообмінної хроматографії може здійснюватись із застосуванням такої смоли, як Fractogel EMD ТМАЕ НІСАР (яку одержують від фірми Merck KGaA, Darmstadt, Германія), або смоли, що має подібні характеристики, дивись нижче: Основа Номер за каталогом Розмір частинок S-типу Тип хроматографії Функціональна група Структура мономера Здатність до зв'язування білка Діапазон стабільності рН Значення рК Умови елюювання Межа тиску (шар: 150´10мм) Робоча температура Консервант Готова до застосування капсула Речовина основи S-типів Лінійна швидкість потоку Fractogel® EMD ТМАЕ 1.16887 20-40мкм Іонообмінна хроматографія Триметиламіноетильна група (Q-тип) CH2=CH-CONH-(CH2)2N+(CH3)3 120мг сироваткового альбуміну великої рогатої худоби/мл гелю Від рН2 до рН12 >13 Високі концентрації солі 20 бар (2МПа) (перепад тиску на колонці) Від 4°С до кімнатної температури 20% розчин етанолу 50-10мм 100мл; 500мл 1,27-6,35см/хв Стадію іонообмінної хроматографії, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, здійснюють із застосуванням буфера, що має слабколужний рН (наприклад, від або приблизно від 7,2 до або приблизно до 9,0, від або приблизно від 8,0 до або приблизно до 9,0, відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, рН дорівнює або приблизно дорівнює 8,5). До придатних буферів належать, наприклад, боратний буфер, триетаноламін/імінодіоцтова кислота-трис, ацетат 13 87709 14 амонію, трицин, біцин, TES, ГЕПЕС, TAPS. Найбіхроматографії із забарвлюванням, хроматографії з льша перевага віддається боратному буферу з рН, гідрофобною взаємодією (НІС), високоефективної що дорівнює або приблизно дорівнює 8,5. Елююрідинної хроматографії з оберненою фазою та вання з іонообмінної смоли здійснюють шляхом факультативна друга стадія аніонообмінної хромапідвищення електропровідності рухомої фази тографії можуть здійснюватись у будь-якому пошляхом додання солі, відповідно до варіанта, якорядку, хоча перевага віддається наведеному нижму віддається перевага, NaCl. Відповідно до варіче порядку: анта здійснення, якому віддається особлива пере(0) аніонообмінна хроматографія, (1) афінна вага, буфери, які контактують із продуктами, для хроматографія із забарвлюванням, (2) хроматогстадії іонообмінної хроматографії (зрівноважуванрафія з гідрофобною взаємодією (НІС), (3) високоня, промивання, елюювання) містять антиоксиефективна рідинна хроматографія з оберненою дант, відповідно до варіанта, якому віддається фазою (RPC); та (4) друга стадія аніонообмінної перевага, L-метіонін. Альтернативні антиоксиданхроматографії. ти згадувались вище. Факультативна додаткова стадія (5) очищення Таким чином, відповідно до варіанта здійснен- ультрафільтрування/діафільтрування ня, якому віддається перевага, спосіб відповідно Відповідно до додаткового варіанта здійснендо цього винаходу включає наведені нижче стадії: ня, якому віддається перевага, після будь-якої (0) аніонообмінна хроматографія, відповідно стадії хроматографії (зокрема, після стадії високодо варіанта, якому віддається перевага, на аніоефективної рідинної хроматографії з оберненою нообмінній смолі, що має властивості сильної осфазою) зразок FSH піддають стадії концентруваннови, [відповідно до варіанта, якому віддається ня. Відповідно до варіанта, якому віддається переперевага, четвертинна амонієва смола, напривага, згадану стадію здійснюють із застосуванням клад, Q Sepharose FF або Fractogel EMD ТМАЕ]; ультрафільтрування у поєднанні з діафільтруван(1) афінна хроматографія із забарвлюванням ням з метою одержання маси, що має бажану [відповідно до варіанта, якому віддається перевакомпозицію. Відповідно до варіанта, якому віддага, на Blue Sepharose FF]; ється перевага, ультрафільтрування (або діафіль(2) хроматографія з гідрофобною взаємодією трування) здійснюється за допомогою мембрани, [відповідно до варіанта, якому віддається переваяка має межу пропускання, що дорівнює або прига, на Toyopearl Butyl 650M]; близно дорівнює 3-10кДа, відповідно до варіанта, (3) високоефективна рідинна хроматографія з якому віддається найбільша перевага, що дорівоберненою фазою [відповідно до варіанта, якому нює або приблизно дорівнює 5кДа. віддається перевага, на Source 30 RPC]; Відповідно до варіанта здійснення, якому відФакультативна додаткова стадія (-1) очищення дається особлива перевага, наведені нижче стадії - ультрафільтрування/діафільтрування здійснюють у порядку, показаному нижче: Перед стадією (0) іонообмінної хроматографії (-1) Ультрафільтрація (відповідно до варіанта, бажаним може бути здійснення стадії ультрафільякому віддається перевага, з мембраною, що має трування для концентрації неочищеного FSH. Відмежу пропускання, яка дорівнює або приблизно повідно до варіанта, якому віддається перевага, дорівнює 8кДа); ультрафільтрування (або діафільтрування) здійс(0) аніонообмінна хроматографія (відповідно нюють із застосуванням мембрани, що має межу до варіанта, якому віддається перевага, на колонці пропускання, яка дорівнює або приблизно дорівзі смолою Q Sepharose FF); нює 3-10КДа, відповідно до варіанта, якому відда(1) афінна хроматографія із забарвлюванням ється найбільша перевага, яка дорівнює або при(відповідно до варіанта, якому віддається переваблизно дорівнює 8КДа. Факультативна додаткова га, на колонці зі смолою Blue Sepharose FF); стадія (4) очищення - аніонообмінна хроматогра(2) хроматографія з гідрофобною взаємодією фія (НІС) (відповідно до варіанта, якому віддається Відповідно до додаткового варіанта здійсненперевага, на колонці зі смолою Butyl 650M); ня, якому віддається перевага, спосіб відповідно (3) високоефективна рідинна хроматографія з до цього винаходу включає також другу стадію (4) оберненою фазою (RPC) (відповідно до варіанта, аніонообмінної хроматографії. Смолою, якій віддаякому віддається перевага, на колонці зі смолою ється перевага, є Fractogel EMD ТМАЕ НІСАР (яку Source 30 RPC); одержують від фірми Merck KGaA, Darmstadt, Гер(4) аніонообмінна хроматографія на аніонообманія) або смола, що має подібні характеристики, мінній смолі, що має властивості сильної основи як згадувалось вище. Відповідно до альтернатив(відповідно до варіанта, якому віддається переваного варіанта, друга стадія аніонообмінної хромага, на колонці зі смолою ТМАЕ hiсар); та тографії може здійснюватись на смолі Q Sepha(5) ультрафільтрування (відповідно до варіанrose FF або іншій смолі, що має подібні та, якому віддається перевага, з мембраною, що характеристики, як згадувалось вище. має межу пропускання 5кДа). Стадії аніонообмінної хроматографії, афінної Бажаним може бути піддання зразка FSH стахроматографії із забарвлюванням, хроматографії з дії нанофільтруванню, зокрема, як стадії очищення гідрофобною взаємодією (НІС), високоефективної від вірусу; тобто для зниження ризику забруднення рідинної хроматографії з оберненою фазою та препарату FSH вірусами або вірусоподібними часдруга стадія аніонообмінної хроматографії можуть тинками, які походять із культури клітин. Нанофіздійснюватись у будь-якому порядку, хоча перевальтрування може здійснюватись на будь-якій стагу віддають здійсненню стадії аніонообмінної хродії процесу очищення, однак, відповідно до матографії першою. Інші згадані стадії афінної варіанта, якому віддається особлива перевага, 15 87709 16 нанофільтруваня здійснюється після другої стадії або після очищення елюат може бути підданим іонообмінної хроматографії або після високоефекліофілізуванню ("сублімаційному сушінню") для тивної рідинної хроматографії з оберненою фазою видалення розчинника. Одержаний рідкий або чи після хроматографії з гідрофобною взаємодією. ліофілізований продукт називають "нерозфасоваНанофільтрування може здійснюватись більше ним FSH". одного разу, наприклад, воно може здійснюватись Лікарські форми FSH двічі. FSH або варіант FSH відповідно до цього виВідповідно до варіанта здійснення, якому віднаходу або очищений за способом відповідно до дається особлива перевага, спосіб відповідно до цього винаходу може застосовуватись для виготоцього винаходу включає наведені нижче стадії: влення лікарської форми для ін'єкцій, внутрішньо(-1) Ультрафільтрування (відповідно до варіам'язових або підшкірних, відповідно до варіанта, нта, якому віддається перевага, з мембраною, що якому віддається перевага, підшкірних. Лікарська має межу пропускання, яка дорівнює або приблизформа FSH може ліофілізованою, і у цьому разі її но дорівнює 8кДа); розчиняють у воді для ін'єкцій безпосередньо пе(0) аніонообмінна хроматографія (відповідно ред ін'єкцією. Лікарська форма FSH може бути до варіанта, якому віддається перевага, зі смолою також рідкою лікарською формою, і у цьому разі Q Sepharose FF); вона може впорскуватись безпосередньо, без по(1) афінна хроматографія із забарвлюванням переднього розчинення. (відповідно до варіанта, якому віддається переваЛікарська форма FSH може бути однодозовою га, зі смолою Blue Sepharose FF); або багатодозовою. У разі, якщо лікарська форма (2) хроматографія з гідрофобною взаємодією FSH є багатодозовою, вона, відповідно до варіан(НІС) (відповідно до варіанта, якому віддається та, якому віддається перевага, повинна містити перевага, зі смолою Butyl 650M); бактеріостатичний агент, наприклад, бензиловий (3) високоефективна рідинна хроматографія з спирт, мета-крезол, тимол або фенол, відповідно оберненою фазою (RPC) (відповідно до варіанта, до варіанта, якому віддається перевага, бензилоякому віддається перевага, зі смолою Source 30 вий спирт або мета-крезол. Однодозові лікарські RPC); форми також можуть містити бактеріостатичний (4) аніонообмінна хроматографія на аніонообагент. мінній смолі, що має властивості сильної основи FSH відповідно до цього винаходу може за(відповідно до варіанта, якому віддається перевастосовуватись для виготовлення лікарської форми га, зі смолою ТМАЕ hicap); з відомими допоміжними речовинами та стабіліза(4') нанофільтрування; торами, наприклад, цукрозою та манітом. Лікарсь(5) ультрафільтрування (відповідно до варіанка форма може також містити антиоксидант, ната, якому віддається перевага, з мембраною, що приклад, метіонін. Вона може додатково містити має межу пропускання 5кДа). поверхнево-активну речовину, наприклад, Твін Перевага цього винаходу полягає у тому, що (відповідно до варіанта, якому віддається перевазгаданий спосіб очищення позбавлений стадії вига, Твін 20) або плуронік (відповідно до варіанта, соковитратної імуноафінної хроматографії і, неякому віддається перевага, плуронік F68). зважаючи на це, забезпечує одержання FSH висоУ разі багатодозової лікарської форми, якій кого ступеня чистоти і питомої біоактивності. Окрім віддається особлива перевага, FSH, який одержатого, очищений FSH відповідно до цього винаходу ли за способом відповідно до цього винаходу, зане містить небажаних домішок, які додаються у стосовують для її виготовлення шляхом розчиненразі імуноафінної хроматографії (наприклад, імуня у воді для ін'єкцій з цукрозою, фосфатним ноглобуліни, які вилуговуються зі смоли). буфером (рН7), плуронік F68, метіоніном іметаЗберігання/Ліофілізування крезолом або бензиловим спиртом. Рідка композиція, яку одержують за допомоРідкою багатодозовою лікарською формою регою способу очищення, опис якого наведено вище, комбінантного FSH для підшкірного або внутріі яка містить очищений FSH, може заморожуватись шньом'язового впорскування, якій віддається осодля зберігання у тому вигляді, у якому її одержали, блива перевага, є наведена нижче: Складова № 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Складові багатодозових рідких лікарських форм FSH Опис 300МОд FSH 450МОд FSH 900МОд FSH rhFSH (мг/капсулу) 22,2 (300МОд) 33,3 (458МОд) 66,7 (916МОд) Цукроза (мг/капсулу) 30,0 45,0 90,0 NaH2PO4H2O (мг/капсулу) 0,225 0,337 0,675 Na2HPO42H2O (мг/капсулу) 0,555 0,832 1,665 Плуронік F68 (мг/флакон) 0,050 0,075 0,150 Метіонін (мг/флакон) 0,050 0,075 0,150 л