Мікросфера гідролізованого крохмалю з ендогенним зарядженим лігандом

Реферат: Винахід стосується біологічно розкладальної мікросфери з діаметром 10-2000 мкм, яка містить перехресно-зв'язаний гідролізований крохмаль, на котрому принаймні один тип ліганду з молекулярною масою меншою 1000 Да, який є амінокислотою, органічною кислотою, що містить нітроген, дикарбоновою кислотою, сполучено через зв'язок естеру карбонової кислоти, у середньому 0,05-1,5 лігандів сполучено з кожним залишком глюкози в гідролізованому крохмалі. UA 110776 C2 (12) UA 110776 C2 UA 110776 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Заявлений винахід стосується здатних до біологічного розкладу мікросфер гідролізованого крохмалю з ендогенними зарядженими лігандами, приєднаними до нього. Винахід також стосується матеріалу, який містить такі мікросфери, та застосування мікросфер або матеріалу в гемостазі, лікуванні рани, культурі клітини або судинній емболії. Крохмаль, розгалужений полімер глюкози (ланцюги α4-глюкози з α6-розгалуженнями), є природним матеріалом, знайденим у рослинах та тваринах, де він функціонує як джерело енергії. Полімер складається з амілози (довголанцюгової та низькорозгалуженої) та амілопектину (високорозгалуженого та коротколанцюгового). Здатні до розкладу мікросфери крохмалю (DSM) сформовано з перехресно-зв'язаних ланцюгів крохмалю. Здатні до розкладу мікросфери крохмалю протягом багатьох років застосовували для тимчасової оклюзії судини з та без співзастосування цитотоксичних ліків (лікування пухлин та попередження крововиливів), але також застосовували для місцевого та інтраопераційного гемостазу. Мікросфери крохмалю деградовано in vivo амілазою плазми до олігосахариду, мальтози та, зрештою, до глюкози, що вводить нормальний метаболізм. Мікрочастинки крохмалю або модифікований крохмаль показано для біосумісного гемостазу у відомому рівні техніки, наприклад, у US 6,060,461 та WO 2009/091549,. Крім того, US 3,812,252 стосується гідролізованого крохмалю та його застосування для обробки ран, охоплюючи хронічні. Лікування рани − складний процес, при якому шкіра або інший орган відновлюється після враження. Класичний зразок лікування рани розподілено на чотири послідовні, ще й із перекриттям, фази: (1) гемостатична, (2) запальна, (3) проліферативна та (4) корекційна. Гемостаз є первинною фазою в лікуванні рани, яка призводить до зупинки крововиливу. Протягом хвилин після враження шкіри або іншого органу, бляшки (тромбоцити) активовано та агреговано на місці ураження для створення згустку фібрину. Коли відбувається ендотеліальне ураження, ендотеліальні клітини припиняють інгібувати коагуляцію та починають секретувати фактори згортання крові, які збуджують гемостаз після ураження. Гемостаз має три головні етапи: 1) звуження судин, 2) тимчасова блокада тромбоцитною пробкою, та 3) коагуляція крові перетворенням фібриногену до фібрину та утворення згустку, який закриває отвір до регенерації тканин. У запальній фазі бактерії та уламки фагоцитовано та видалено, та фактори звільнено, що спричиняє міграцію та поділ клітин, залучених у проліферативну фазу. Приблизно за 2-3 доби фібробласти починають надходити до місця рани, що означає початок проліферативної фази навіть до закінчення запальної фази. Цю фазу охарактеризовано ангіогенезом, осадженням колагену, утворенням грануляції тканин, епітелізацією та скороченням рани. В ангіогенезі створено нові кровоносні судини, потрібні для постачання кисню та поживних речовин до місця рани для підтримання подальших етапів лікування рани. Одночасно фібробласти починають накопичуватися на місці рани, пік їх накопичення створюється за 1 − 2 тижні після травми. З кінцем першого тижня фібробласти є головними клітинами в рані. У перші 2 або 3 доби після ураження фібробласти переважно проліферують та мігрують, а потім вони є головними клітинами, які вкладають колагеновий матрикс у місце рани. Спочатку фібробласти застосовують струп фібрину, створений у запальній фазі, щоб мігрувати, налипаючи до фібронектину. Потім фібробласти осаджують головну речовину на місці рани, та потім колаген здатен для міграції. Грануляція тканин, яка росте від основи рани, починає з'являтися в рані протягом запальної фази, та продовжує нарощування до покриття шару рани. Грануляційна тканина складається з нових кровоносних судин, фібробластів, запальних клітин, ендотеліальних клітин, міофібробластів та компонентів нового тимчасового позаклітинного матриксу. Повторна епітелізація епідермісу відбувається, коли епітеліальні клітини проліферують та "повзуть" по поверхні шару рани, забезпечуючи покриття для основної знов утвореної тканини. Культура клітин − процес зростання клітин у контрольованих умовах. Історичний розвиток та способи культури клітини тісно пов'язані з культурою тканини та органу. Культура клітини тварини стала предметом загальних лабораторних способів у середині 1900-их років, але концепція підтримання життя ліній клітини, відокремлених від оригінального джерела тканини, виявили в 19 столітті. Культура тканини − зростання тканин та/або клітин окремо від організму. Типово, це полегшено через застосування рідинного, напівтвердого або твердого середовища зростання, як-то бульйон або агар-агар. У цій специфікації культуру клітини та культуру тканини слід застосовувати синонімічно. 1 UA 110776 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Деякі клітини природно живуть у суспензії без приєднання до поверхні, як-то клітини, які існують у кровообігу. Ці клітини можуть зростати в суспензії. Однак, найбільша кількість клітин, які походять від твердої тканини, є залежними від закріплення, так звані суміжні клітини. В'язкі клітини для росту потребують поверхні, як-то пластична культура тканини або мікроносій. Мікроносії, наприклад, мікросфери декстрину, є придатними для зростання в'язких клітин. Коли в'язкі клітини зібрано або перенесено (транспорт субкультури), клітини потребують відокремлення від поверхні, де вони росли. Звичайно це зроблено додаванням до культури суміші трипсину-ЕДТА. Судинну емболію (оклюзію) застосовували як мінімально інвазивну альтернативу щодо хірургічного втручання. Метою емболізації є попередження виливу крові в організмі, який обумовлює ішемію, це може ефективно зменшувати пухлину або блокувати аневризму. Процедуру виконано як ендоваскулярну процедуру в інтервенціоністському наборі консультантом-радіологом. Звичайно для найбільшої кількості пацієнтів лікування виконують із малою кількістю або при відсутності седації, хоча це залежить значною мірою від органу, який емболізують, дротовий катетера. Доступ до органу отримують способами дротового провідника катетера та катетерів. Штучний ембол звичайно застосовували одним із наступних способів: спіраль або гідроспіраль, часточки, піна або тампон. Засобами, які застосовували при терапії емболізації, є рідинними емболічними засобами, які здатні протікати крізь структури судинного комплексу. Прикладами цього є ефіодол, зроблений з іоду та макової олії, який є дуже в'язким засобом, та його звичайно застосовували для хемоемболізацій, зокрема, для гепатом; склерозувальні засоби, котрі роблять твердою ендотеліальну вистілку судин, та етанол. Також застосовували часточкові емболічні засоби для емболізації прекапілярних артеріол ® або малих артерій. Gelfoam тимчасово обтуровує судини протягом 5 тижнів. Мікросфери є звичайно застосовуваними засобами для м'якої емболізації та хемоемболізації. Полівініловий спирт (PVA) та мікросфери акрилового желатину не розпадаються in-vivo, тому вони надовго залишаються в пацієнті. Залежно від ситуації застосовували мікросфери різних розмірів, приблизно, з діаметром 50 мкм − 1.2 мм. У деяких випадках було б цікавим змінювати властивості здатних до біологічного розкладу мікросфер крохмалю. Згідно із заявленим винаходом запропоновано шляхи зміни наступного: здатність до біологічного розкладу мікросфер крохмалю; спорідненість здатних до біологічного розкладу мікросфер крохмалю до біологічних систем та/або їх складових; ступінь набухання здатних до біологічного розкладу мікросфер крохмалю; швидкість набухання здатних до біологічного розкладу мікросфер крохмалю; стискальність/еластичність здатної до біологічного розкладу мікросфери крохмалю та/або селективність хімічної взаємодії з іонами та молекулами в та на здатній до біологічного розкладу мікросфери крохмалю. Біологічна система та/або її складові, описані вище, наприклад, можуть складати орган або клітину, або будь-яку з її складових; бактерії; віруси; білки та ферменти; полісахариди; ліпіди; малі молекули та/або іони. Отже, заявлений винахід стосується здатної до біологічного розкладу мікросфери, яка має діаметр 10-2000 мкм, яка містить перехресно-зв'язаний гідролізований крохмаль, на котрому, принаймні, один тип ліганду сполучений через зв'язок естеру карбонової кислоти, де названий ліганд є ендогенною зарядженою молекулою з молекулярною масою меншою 1000 Да, яка містить, принаймні, одну додаткову функцію карбонової кислоти та/або, принаймні, одну функцію аміну, та де в середньому 0.05-1.5 лігандів сполучено з кожною частинкою глюкози у гідролізованому крохмалі. Заявлений винахід також стосується різного використання та застосування цієї мікросфери. Мікросфери згідно з винаходом містять перехресно-зв'язаний гідролізований кислотою крохмаль. Мікросфери можна отримувати з гідролізованого кислотою крохмалю емульсифікацією розчину крохмалю в органічному розчиннику, як-то толуол або етилендихлорид. Ланцюги поліглюкози є перехресно-зв'язаними з реагентом для перехресного зв'язування, як-то епіхлоргідрин, утворюючи зв'язки етеру гліцерину (1,3-окси-пропан-2-олу), як показано нижче, утворюючи здатні до розкладу мікросфери крохмалю (DSM). 2 UA 110776 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 DSM деградовано in vivo амілазою до олігодекстринів, та, зрештою, − до глюкози. Перехресні зв'язки залишаються в олігосахариді змінного розміру. Їх доля in vivo тепер невідома, але можливо вони є екскретованими в сечу або відфільтрованими до ретикулоендотеліальної системи та розкладеними. Мікросфери є здатними до біологічного розкладу та визначеними як матеріал, який деградовано та/або метаболізовано й екскретовано у фізіологічних умовах (in vivo). У цьому випадку фізіологічні умови (in vivo) стосуються тварин, конкретніше − хребетних та найбільше − ссавців. Головним чином, здатні до біологічного розкладу мікросфери крохмалю, повністю деградували и вилучались з фізіологічного середовища, як-то організм людини. Залежно від застосування мікросфери пристосовано для деградації у відповідний час, придатний для призначеного застосування. Цей час може простягатися від хвилин до 3 місяців, краще − до 1 місяця. Розмір здатної до біологічного розкладу мікросфери згідно з винаходом розташовано в мікрошкалі, та конкретніше − 10 мкм − 2000 мкм. Властивості DSM можна змінювати приєднанням лігандів до DSM, та конкретніше − до гідроксильних груп глюкози. Властивості DSM змінено вибором лігандів і також вибором числа лігандів, приєднаних до крохмалю. Ліганди приєднано до DSM сполученням через естер карбонової кислоти до мономерів глюкози DSM. Для створення можливості приєднання лігандів до гідролізованого крохмалю через цей зв'язок естеру лігандам потрібно містити, принаймні, одну функцію карбонової кислоти, тобто, принаймні, одну групу -COOH, здатну до утворення зв'язку з естером. Зв'язок з естером є здатним до гідролізу хімічним та або ферментним гідролізом in vivo, та застосування такого зв'язку з естером призводить до біовідокремлюваного ліганду. Крім того, лігандам слід бути ендогенними субстанціями, які є зарядженими при фізіологічному pH, тобто при pH 6-8. Крім того, для функції карбонової кислоти, застосованої щоб зробити можливим приєднання ліганду до гідролізованого крохмалю через зв'язок з естером, лігандам слід містити, принаймні, одну додаткову функцію карбонової кислоти та/або, принаймні, одну первинну, вторинну, третинну або четвертину функцію аміну. Якщо ліганд є ендогенними сполуками, то DSM деградує до ендогенних сполук, які метаболізовано та/або екскретовано. Отже, ліганд може бути позитивно зарядженим, негативно зарядженим або цвітер-іоном, тобто позитивно та негативно зарядженим одночасно. Ліганди також можуть мати неполярні (гідрофобні) частки для подальшої зміни властивостей DSM. Далі є можливим застосування суміші різних лігандів. Заряджені ліганди потребують протилежного іону. Коли ліганд є позитивно зарядженим, протилежному іону слід бути негативно зарядженим, та коли ліганд є негативно зарядженим, протилежному іону слід бути позитивно зарядженим. Цей протилежний іон може бути фізіологічно активним протилежним іоном. Коли ліганд є цвітер-іоном, він має свій протилежний іон. Ендогенним лігандам далі слід бути малими молекулами з молекулярною масою меншою 1000 Да. Згідно із винаходом до кожної частинки глюкози у DSM може приєднуватися в середньому 0.05-1.5 лігандів. Молярне співвідношення ліганду до глюкози в DSM, отже, дорівнює 1.5:1 − 1:20. Ліганд можна вибирати із групи, яка охоплює наступне: амінокислоти, інші органічні кислоти, які містять нітроген, та діоєві кислоти. Переважні для деяких втілень винаходу ліганди наведено в таблиці 1. 3 UA 110776 C2 У таблиці 1 показано переважні ліганди. Показаний нижче у структурах R представляє 2 мономер глюкопіранозилу в гідролізованому крохмалі. R − ліганд, у будь-якій з можливих позицій 2, 3 та /або 6 на частинці глюкози DSM, як показано нижче. Таблиця 1 R R O 2 H O 2 H OH H O O H O R Амінокислоти як 2 R Заряд 2 Властивості Структура NH2 Аргінін 2+ полярна + H2N O NH O R + NH3 O Гістидин + (10 %) N полярна O R + NH3 N H O + Лізин 2+ H3N полярна O + NH3 O Гліцин + полярна + H3N R O O Пролін Аланін + H2+ N+ O R O гідрофобна O R + NH3 O Ізолейцин + гідрофобна O R + NH3 O Лейцин + гідрофобна O R + NH3 O Фенілаланін + гідрофобна O + NH3 O Триптофан + гідрофобна O R + NH3 NH O Тирозин + гідрофобна O R + NH3 HO O Валін + гідрофобна O + NH3 4 R R UA 110776 C2 O Серин + полярна HO R O + NH3 O + Аспарагін H2N O R + O NH2 Глутамін + полярна NH3 O O R O + NH3 O Треонін + полярна HO R O + NH3 O Глутамінова кислота ± полярна O O O R + NH3 O Аспарагінова кислота ± O полярна O R + NH3 O Кислоти як R Бурштинова кислота 2 Заряд Властивості Структура O O O R O Адипінова кислота O O O R O O Щавлева кислота O R O O O O Лимонна кислота 2 O O R HO O O Винна кислота O OH O O OH Малеїнова кислота O R O O O R O Малонова кислота Нітроген, який містять органічні 2 кислоти як R Бетаїн O O O Заряд Властивості Структура O + + R O R N O OH O Карнітин + N O + R NH2 Креатин + + H2N O NH O Метилгліцин Диметилгліцин O + + NH2 + NH R O O + O 5 R R UA 110776 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Описану вище мікросферу можна застосовувати у гемостазі, лікуванні рани, культурі клітин in vitro та судинній емболії. Описану вище мікросферу також можна застосовувати для отримання здатного до біологічного розкладу матеріалу, придатного для застосування у лікування рани. Ці різні застосування розглянуто далі нижче. Гемостаз У деяких утіленнях для застосування у гемостазі ліганди, приєднані до мікросфер, переважно є позитивно зарядженими або цвітер-іонами. У деяких утіленнях, ліганди, приєднані до мікросфер, переважно є позитивно зарядженими. Застосований протилежний іон може бути елагіновою кислотою. Згідно із винаходом при гемостазі мікросферам переважно слід мати середній діаметр 10 мкм − 200 мкм. Згідно із винаходом застосовані при гемостазі мікросфери можна додавати на/в рану як порошок, у розчині, або приліплений до структури підкладки, як-то марля. Лікування рани Для лікування рани для отримання матеріалу можна застосовувати мікросфери. Цьому матеріалу слід мати тривимірну структуру, яка складається з мікросфер та пустоти між мікросферами. Внаслідок пустот матеріалу треба бути проникним для газів та рідин, отже, не утворювати гель при контакті з рідинами. Той факт, що матеріал не утворює гель, означає, що можливо запобігати створенню шару плівки при застосуванні матеріалу на/у рану, і, таким чином, можна попередити набряк, який збирається під шаром; ефективно сприяти транспорту кисню та поживних речовин, і потім це дозволяє вільну міграцію клітин та дієву трансдукцію тиску до або від тканини, яка розташована нижче. Мікросфери у матеріалі можуть бути фракцією гомогенного складу. При утворенні пустот між мікросферами у багатьох випадках переважним є те, що мікросфери у матеріалі мають досить одноманітний розмір. Якщо мікросферам не треба мати нерівномірний розмір, пустоти слід заповнювати меншими мікросферами, у такий спосіб створюючи більш тверду структуру, котра буде шкідливою для призначеної дії матеріалу. Коли мікросфери утворюють частину фракції гомогенного складу, розміру мікросфер, принаймні, для деяких втілень, не слід відрізнятися більше + 15 % від середнього. Наприклад, у фракції мікросфер по 300 мкм окремі мікросфери можуть бути 255 − 345 мкм. Розмір пустот, тобто простір між круглими впакованими разом сферами однакового розміру, можна розраховувати як ((2/квадратний корінь з 3) - 1) ≈ 0.155 діаметру розмірів мікросфер. Матеріал може складатися із цільної, твердої, пористої та три тривимірної сітки. Мікросфери можуть приєднуватися до підкладки для втримання, таким чином, іммобілізуючи мікросфери. Такою підкладкою може бути звичайна марля або полімерний пінний матеріал. Принаймні для деяких втілень для застосування у лікування рани ліганди, приєднані до мікросфер, переважно є позитивно зарядженими. Принаймні для деяких втілень при застосування у лікування рани ліганди, приєднані до мікросфер, переважно є позитивно зарядженими та гідрофобними. Для лікування рани мікросфери згідно із винаходом мають переважно середній діаметр 200 мкм − 2000 мкм. Пустоти в матеріалі переважно мають діаметр 30 мкм − 300 мкм, та краще − 100 мкм − 300 мкм. Пустотам слід мати розмір, принаймні, 30 мкм, бо це дозволяє проходження клітин тканини та пучків нервових клітин, які типово є 20-30 мкм у діаметрі. Крім того, характеристики поверхні матеріалу стимулюють зчеплення клітини та проліферацію. Це залучає спорідненість клітини до поверхні матеріалу та еластичність матеріалу, який є придатним для зчеплення. Здатний до біологічного розкладу матеріал, придатний для лікування рани, згідно із винаходом підсилює, зокрема, зчеплення клітини, міграцію та проліферацію, у терапії стандартного лікування рани або у NPWT (лікування рани під негативним тиском), конкретно при процедурах для третьої та четвертої фази процесу лікування рани, тобто проліферативної та корегувальної фази. Тривимірна структура здатного до біологічного розкладу матеріалу, придатного для лікування рани, згідно із винаходом зменшує утворення тканини шраму. Усвідомлюючи, що тканину шраму охарактеризовано кращим однобічним осадженням колагену, матрикс, здатний підсилювати дезорганізоване осадження колагену, є вірогідним для зменшення рубцювання. У 6 UA 110776 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 підсумку, згідно із заявленим винаходом матеріал стимулює та полегшує постійне вростання нової та здорової грануляційної тканини. У лікування рани може бути корисним затримувати здатність до біологічного розкладу матеріалу до 2 діб − 2 тижнів вибором придатних лігандів. Це дозволяє отримувати адекватне загоєння без потреби зміни перев'язування рани, якщо відсутні інші причини. При застосуванні в лікуванні рани або терапії рани матеріал згідно із винаходом можна додавати на/в рану як порошок, у розчині, приліплений до структури підкладки, як-то марля, або як тверда цільна сітка. Матеріал згідно із винаходом також може формувати частину перев'язного матеріалу рани. Показано, що при застосуванні до рани шару 2 мм сфер здатного до біологічного розкладу крохмалю, який не утворює гель, із середнім діаметром 200 мкм, який має позитивно заряджену поверхню, отримано дуже хорошу грануляцію зі зростанням клітин до 500 мкм за чотири доби. Культура клітин іn vitro Для застосування в культурі клітин in vitro, мікросфери переважно мають середній діаметр 200 мкм − 1000 мкм, краще − 200 мкм − 500 мкм. Для деяких втілень для культур клітини in vitro ліганди переважно є позитивно зарядженими. Пустоти є важливими для культур клітини, вони дозволяють ефективне проходження для в'язких клітин та клітин зростання, і також дозволяють ефективне транспортування матриксу росту та більших молекул усередині культури. Судинна емболія Згідно із винаходом мікросфера для судинної емболії переважно має середній діаметр 10 мкм − 1200 мкм. Для застосування у судинній емболії ліганди, приєднані до мікросфери, переважно є негативно зарядженими, принаймні, у деяких утіленнях. Для лікування пухлин можна застосовувати негативний заряд у цитостатичних ліках з іонним зв'язком, котрі потім створюють протилежний іон. Такі цитостатичні ліки охоплюють доксорубіцин, іринотекан, топотекан, епірубіцин, мітоміцин, цисплатин та сорафеніб. Мікросфери згідно з будь-якими втіленнями винаходу, які описано вище, та які вказано у формулі винаходу, можна застосовувати у способах підсилення, сприяння або виконання гемостазу, лікування рани та/або при судинній емболії. Аналогічно, матеріал згідно з будь-якими втіленнями винаходу, які описано вище, та які вказано у формулі винаходу, можна застосовувати у способі полегшення або завершення лікування рани. Мікросфери або матеріал, відповідно, далі застосовано в ефективній кількості до ссавця, якто людина, яка цього потребує, для гемостазу, лікування рани та/або судинної емболії. До людини, яка потерпає від крововиливу в рані або деякого іншого типу рани, надають внутрішньо або зовнішньо, як-то на шкіру. "Застосування" − призначення мікросфер або матеріалу згідно із винаходом для контакту з місцем, де потрібні гемостаз, лікування рани та/або судинна емболія. Для гемостазу або лікування рани матеріал, наприклад, можна розміщувати у порожнину рани або на поверхню рани. При лікуванні рани DSM можна постачати як порошок, суспензію або мазь. При гемостазі DSM можна застосовувати як сухий порошок або вводити в марлю або в прокладку. При емболізації DSM переважно суспендовано у придатному середовищі, як-то фізіологічний розчин. У цьому контексті "ефективна кількість" означає кількість, яка має позитивну дію на гемостаз, лікування рани та/або судинну емболію. Мікросфери згідно із винаходом також можна застосовувати у способах для підсилення, сприяння або виконання in vitro культивації клітин. Мікросферу згідно із винаходом далі можна додавати до придатного культурального середовища. Культивовані клітини також додавали до цього культурального середовища. Мікросфери можна додавати до культурального середовища разом із клітинами перед додаванням клітин або після додавання клітин. Потім клітинам дозволяли розмножуватися. Як пояснено вище, культура клітин у цих технічних умовах також охоплює культуру тканин. Крім того, мікросфери згідно з будь-якими втіленнями винаходу, які описані вище, та які вказано у формулі винаходу, можна застосовувати у підсиленні, сприянні або виконанні гемостазу, лікуванні рани та/або судинній емболії. Мікросфери згідно з будь-якими втіленнями винаходу як, описані вище, та які вказано у формулі винаходу, крім того, можна застосовувати для отримання медичного засобу або фармацевтичної композиції. 7 UA 110776 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Мікросфери згідно з будь-якими втіленнями винаходу, які описано вище, та які вказано у формулі винаходу, крім того, можна виготовляти конкретно для застосування у підсиленні, сприянні або виконанні гемостазу, лікуванні рани та/або судинній емболії. У всьому опису та формулі винаходу слова "містять" та "охоплюють", та варіанти слова, наприклад, "який містить" та "охоплює", означають "охоплюючи, але без обмеження", та вони не виключають інші частини, додатки, складові, цілісності або етапи. У всьому описі та формулі винаходу одиничне охоплює загальне, якщо контекст не потребує іншого. Зокрема, де застосовано невизначений артикль, опис є зрозумілим як розглядання множинності, а також як особливості, якщо контекст не потребує іншого. Слід розуміти, що особливості, цілісності, характеристики, сполуки, хімічні частинки або групи, описані щодо конкретного аспекту, втілення або прикладу винаходу, є придатними до будь-якого іншого аспекту, втілення або прикладу, описаного тут, окрім несумісних із цими. Винахід описано більш детально нижче у прикладах, котрі стосуються доданих малюнків, на яких: Фіг. 1 − схематичне зображення здатної до розкладу мікросфери крохмалю (DSM) та хімічні модифікації, зроблені в цьому дослідженні. Фіг. 2 ілюструє, що набухання мікросфер може допускати наступну дифузію Фіка з вихідною енергійною швидкістю набухання, яка зменшується експоненціально: де k = константа набухання першого порядку, та Y∞ = зростання об'єму при максимумі набухання. Фіг. 3 ілюструє адгезію тромбоциту. Фіг. 3 показує фазовий контраст та флуоресцентні мікрознімки, які демонструють тромбоцити DSM та DSM-зліплені тромбоцити згідно із різними модифікованими партіями. Фіг. 3. показує великим планом з'єднання між двома агрегованими DSM (партія 4) та агрегати тромбоциту, приєднані до DSM. Експоновано із застосуванням мікроскопії по способу інтерференційного контрасту (DIC). Фіг. 4 ілюструє дослідження трьох партій DSM in vivo. Партії 5, 6 та 9 визначали в експериментальній моделі крововиливу (ниркова травма) у антикоагульованих щурів. Усі тварини, оброблені партією 9, за 20 хвил. спостереження отримували первинний гемостаз при 29 % зменшення кровотечі. Інші партії демонстрували значно меншу гемостатичну ефективність у п'яти тварин, які досягали первинного гемостазу. Фіг. 5 ілюструє втрату крові згідно із лікуванням партії в експериментальному дослідженні in vivo. Втрату крові вимірювали зважуванням надлишкової крові, зібраної у марлю. Існувала значна різниця у втраті крові між різними партіями (p=0.001), де партія 5 не була модифікованою DSM, партія 6 показала активацію коагуляції, та DSM у партії 9 адсорбували тромбоцити. Приклади Здатні до розкладу мікросфери крохмалю (DSM) отримували емульсією, зшиванням гідролізованого крохмалю з епіхлоргідрином у толуолі. Потім DSM промивали кілька разів етанолом, а потім − дистильованою водою, та, зрештою, послідовно зневоднювали зі зменшенням концентрацій етанолу та остаточно сушили протягом ночі при 60 °C. Деталі отримання DSM 2 г натрій гідроксиду розчиняли в 280 мл очищеної води й додавали та розчиняли 2 г натрій боргідриду. 153 г гідролізованого крохмалю розчиняли повільним перемішуванням, принаймні, протягом 2 год. Розчиняли 20 г поверхнево-активної речовини (Rhodafac PA17) в 450 г толуолу. Потім додавали розчин крохмалю, та емульгували в розчині толуолу, температуру підвищували до 70 °C та емульсію перемішували до досягнення розподілу бажаного розміру краплі. Додавали 22 г епіхлоргідрину та зшивання робили протягом 5 год. Суміш охолоджували до кімнатної температури та дозволяли створюватися осаду, після чого надосад декантували. DSM три рази промивали 95 % етанолом, оди раз − 0.8 % оцтовою кислотою, а потім − 4 рази очищеною водою та остаточно зневоднювали абсолютним етанолом перед висушування при 60 °C у вентильованій сушильній шафі. Визначення ступеню заміщення (DS) Ступінь заміщення визначали як середнє число заміщень на мономері глюкози. Спосіб лужного омилення, а потім титрування надлишку лугу застосовували для визначення ступеню заміщення. До зразку 250 мг DSM додавали 10 мл 0.50 M NaOH та цьому дозволяли стояти при кімнатній температурі протягом 72 год. при нерегулярному струшуванні. Надлишок NaOH титрували 0.50 M HCl, застосовуючи фенолфталеїн як індикатор. Визначення здатності до розкладу амілазою 8 UA 110776 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Зразок DSM (3-6 мг) розбавляли фосфатним буфером, pH 7 (5 мл), та потім додавали 400 мкл слини людини, а потім − інкубування при 37 °C протягом 4 год. Зразку дозволяли стояти протягом 20 хвил. або центрифугували, а потім відбирали малий зразок із дна та аналізували під мікроскопом для визначення присутності або відсутності мікросфер. Загальна процедура заміщення DSM діоєвими кислотами (приклади наведено в таблиці 1) DSM (1 г) суспендували в ДМФ (10 мл), до цього додавали суміш бурштинового ангідриду (154 мг, 1.54 ммол) та піридину (124 мкл, 1.60 ммол). Суміш перемішували та нагрівали до 90 °C протягом ночі, та потім матеріал промивали три рази 40 мл етанолу, а потім − 5 мл насич. NaHCO3, та потім − три рази 30 мл води. Матеріал зневоднювали етанолом та сушили у печі -1 при 60 °C. Матеріал аналізували FTIR, що показало естер карбоніл при 1730 см . DS: 0.25 (визначали як описано вище). Здатність до розкладу α-амілазою (визначали як описано вище). Загальна процедура заміщення DSM естерами Модифікація бетаїном Бетаїн (1.66 г, 10,8 ммол) та CDI (1.75 г, 10.8 ммол) перемішували з 50 мл ДМФ та нагрівали до 80 °C протягом 2 год. Потім додавали DSM (5 г), та температуру підвищували до 90 °C, і суміш перемішували протягом ночі. Суміш промивали два рази етанолом (250 мл), розбавляли гідроген хлоридом (250 мл) та два рази водою (250 мл). Матеріал зневоднювали етанолом та сушили протягом ночі при 60 °C. -1 Дані FTIR показали естер карбоніл при 1751 cm . DS: 0.23 (визначали як описано вище). Здатність до розкладу α-амілазою (визначали як описано вище). Модифікація диметилгліцином Як у вищевказаному прикладі з бетаїном, але застосовували DSM (2 г), N, N-диметилгліцин гідрогенхлорид (430 мг, 3.1 ммол) та CDI (500 мг, 3.1 ммол). -1 Дані FTIR показали естер карбоніл при 1753 cm . DS: 0.24 (визначали як описано вище). Здатність до розкладу α-амілазою (визначали як описано вище). Модифікація Nα-ацетил-L-аргініном Як у вищевказаному прикладі з бетаїном, але застосовували DSM (2 г), Nα-ацетил-L-аргінін (623 мг, 2.5 ммол), CDI (400 мг, 2.5 ммол). -1 Дані FTIR показали естер карбоніл при 1748 cm . DS: 0.24 (визначали як описано вище). Здатність до розкладу α-амілазою (визначали як описано вище). Модифікація проліном Як у вищевказаному прикладі з бетаїном, але застосовували DSM (1 г), Boc-Pro-OH (266 мг, 1.2 ммол), CDI (200 мг), а потім − зняття захисту з трет-бутоксикарбонілу з TFA. -1 Дані FTIR показали естер карбоніл при 1743 cm . Здатність до розкладу α-амілазою (визначали як описано вище). Модифікація гліцином Як у вищевказаному прикладі з бетаїном, але застосовували DSM (1 г), Boc-Gly-OH (216 мг, 1.2 ммол), CDI (200 мг), а потім − зняття захисту з трет-бутоксикарбонілу з TFA. -1 Дані FTIR показали естер карбоніл при 1748 cm . Здатність до розкладу α-амілазою (визначали як описано вище). Модифікація фенілаланіном Як у вищевказаному прикладі з бетаїном, але застосовували DSM (1 г), Boc-Phe-OH (327 мг, 1.2 ммол), CDI (200 мг), а потім − зняття захисту з трет-бутоксикарбонілу з TFA. -1 Дані FTIR показали естер карбоніл при 1743 cm . Здатність до розкладу α-амілазою (визначали як описано вище). Модифікації невідокремлюваної поверхні застосовували у дослідженні дій заряду модифікації поверхні ілюстровано на фіг. 1. Октенілсукцмнат (негативний та гідрофобний) Суспендували 80 г DSM в очищеній воді, N-октеніл бурштиновий ангідрид (Pentagon) додавали до 0.08 г / г сухого DSM, та реакцію продовжували протягом 3 год. Підтримували pH вище 7.4 додаваннями 0.75 M NaOH. Отриманий матеріал промивали 8 разів 2000 мл очищеної води, та після цього зневоднювали зростаючими концентраціями етанолу та остаточно сушили протягом ночі при 60 °C (Hui Rea. Preparation and properties of octenyl succinic anhydride modified potato starch. Food Chemistry2009;114:81-6). Карбоусиметилування (негативнне) 9 UA 110776 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Суспендували 50 г DSM в очищеній воді; додавали хлороцтову кислоту до 0.1 г/г сухого DSM, та реакцію продовжували протягом 5 год. при 70 °C. Перед додаванням хлороцтової кислоти це розчиняли у воді та нейтралізували 1 M NaOH. Отриманий матеріал промивали 6 разів 2000 мл очищеної води та потім зневоднювали зростаючими концентраціями етанолу та остаточно сушили протягом ночі при 60 °C (Tomaski P, Schilling, C.H. Chemical modification of starch. Adv Carbohydr Chem Biochem 2004;59:175-403). Ацетилування (гідрофобне) Суспендували 50 г DSM в очищеній воді, додавали оцтовий ангідрид до 0.05 г/г сухого DSM. Краплями додавали оцтовий ангідрид, та підтримували pH між 7.3 та 7.8 додаваннями 0.75 M NaOH. Отриманий матеріал промивали 7 раз 2000 мл очищеної води та потім зневоднювали зростаючими концентраціями етанолу, та остаточно сушили протягом ночі при 60 °C (Sathe SK, Salunkhe, D.K. Isolation, Partial Characterisation and Modification of Great Northern Bean (Phaseolus vulgaris L.) Крохмаль. J Food Sci1981;46:617-21). Діетиламіноетил хлорид, Aldrich (позитивний) В очищеній воді суспендували 50 г DSM, додавали 0.375 мол DEAE гідроген хлориду, та температуру підвищували до 60 °C. Додавали 250 мл розчинів 3 M натрій гідроксиду, та реакцію тримали при 60 °C протягом одної год. Промивали DSM 20 л очищеної води у лійці Бюхнера. Потім DSM зневоднювали та сушили, як указано вище (Manousos M, Ahmed M, Torchio C, Wolff J, Shibley G, Stephens R, et al. Feasibility studies of oncornavirus production in microcarrier cultures. In vitro1980 Jun;16(6):507-15). Елагова кислота (адсорбована/абсорбована, негативний) Елагову кислоту (Alfa Aesar) пасивно адсорбували, застосовуючи два різних способи. Спосіб 1: елагову кислоту 0.1 мМ розчиняли у воді та потім змішували з DSM. Спосіб 2: елагову кислоту 0.1 мМ розчиняли в етанолі, потім змішували з DSM (Ratnoff OD, Saito H. Interactions among Hageman factor, plasma prekallikrein, high molecular weight kininogen, and plasma thromboplastin antecedent. Proc Natl Acad Sci U S A1979 Feb;76(2):958-61). Промивали та висушували, як указано вище. Елагову кислоту пасивно абсорбували/адсорбували, та це не було придатним для виміру зарядів. Модифікації різних поверхонь робили згідно зі звичайними протоколами модифікації (без оптимізації). Модифікації вибирали для перевірки концепції гемостатичної дії in vitro та in vivo, та не оцінювали токсикологічну прийнятність для людей. Зарядженість поверхні Ступінь зарядженості поверхні вимірювали детектором PCD 02, Particle Charge Detector (Mütek). Намір Дев'ять різних модифікованих DSM рандомізували та блокували. Інформація щодо модифікації не передана виконавцями досліджень. Характеристика DSM Морфологію мікросфер крохмалю визначали спостереженням у мікроскопі (AxioObserver Z1, Zeiss), та діаметр сфери вимірювали мінімум для п'яти сфер у кожній із дев'яти партій. Абсорбцію визначали вимірюванням діаметру перед та при фіксованих інтервалах часу (1, 3, 9, 15 та 30 сек.) після додавання 100 мкл фосфатного буферу. Вимірювали мінімум п'ять сфер із кожної партії, та потім розраховували їх об'єм, за умови, що DSM була повністю сферичною. Набухання мікросфер відбувається дифузією води в полімер та гідратацією полімеру, процес цей продовжується до врівноважування при максимумі релаксації перехресно-зв'язаних ланцюгів крохмалю. Отже, можна допускати, що процес проходить згідно із дифузією Фика з енергійною вихідною швидкістю набухання, яка спадає експоненціально. Отже, дані можна пояснювати згідно із рівнянням: де k − константа набухання першого порядку, та Y∞ − зростання об'єму при максимумі набухання. Адгезія тромбоцит іn-vitro Для дослідження можливої спорідненості/взаємодії між різними партіями DSM та відомими важливими факторами вивчали адгезію тромбоциту до різни партій DSM. Гепаринізовану збагачену тромбоцитом плазму, 450 мкл, додавали до пробірок, які містять 1 мкг DSM, та потім струшували в орбітальному струшувачі протягом 20 хвилин при 500 оберт/хвил… Потім DSM ретельно промивали у PBS, повторно допускаючи осадження DSM на дно та замінюючи надосад свіжим PBS, а потім − трубка для вихрювання. Потім DSM-зчеплені тромбоцити фіксували 3.7 % PFA у PBS та робили проникними, застосовуючи 0.1 % Triton-X у PBS, та остаточно флуоресцентно мітили на Alexa 546-Phalloidin. Ретельне промивання робили між 10 UA 110776 C2 5 10 15 20 25 30 35 кожним етапом процедури. Зображення DSM та флуоресцентних тромбоцитів отримували на флуоресцентному мікроскопі AxioObserver Z1 (Zeiss) та програмному забезпеченні зображення AxioVision (Zeiss). Попереднє експериментальне дослідження іn vivo на нирковій експериментальній моделі крововиливу Дослідження робили згідно із рекомендаціями хорошої лабораторної практики та затвердженої Local University Ethics Committee for Animal Experiments. Три різні партії DSM вибирали на базі описаних вище досліджень in-vitro. Для тестування in-vivo вибирали одну нейтральну партію, коагуляцію якої активовано, та остаточно − одну партію з властивостями адгезії тромбоциту. Партії блокували та рандомізували для виконання дослідження. Акліматизували двадцять одного дорослого акліматизованого самця щурів Sprauge-Dawley (середньої маси 342 г, iqr: 314-360) з вільним доступом до корму та води (Hynorm, Janssen Pharma, Belgium and Midazolam Hameln, Pharma Hameln, GmbH). Після катетеризації яремної вени (для IV ін'єкцій) робили поперечну лапаротомію. Розрізали ліву нирку та ниркові судини затискали на дві хвилини після IV застосувань нефракціонованого гепарину (UH, LEO Pharma A/S, Denmark) 200 IU/кг. Потім бокову третину нирки резектували та наносили 1 мл рандомізованих DSM на поверхню розрізу нирки, здавлювали руками (марлевий компрес між порошком крохмалю та пальцями дослідника) та судинний затискувач видаляли. Стискання залишали на 2 хвилини, потім припиняли для контролю гемостазу. Якщо відбувався крововилив, стискання продовжували з гемостатичним контролем кожної хвилини. Первинний гемостаз визначали як відсутність видимого крововиливу протягом 20 хвилин із ниркової резекції. Отримання тваринами гемостазу спостерігали ще 20 хвилин щодо можливого повторного крововиливу. Усіх тварин піддавали евтаназії IV ін'єкціями фенобарбітурату кислоти та етанолу. Втрачену крові збирали та зважували. У кінці дослідження була можливість отримати первинний гемостаз, час до гемостазу, частоту повторного крововиливу та втрату крові. Статистика Описані дані надано як середні величини та індивідуальні або як інтерквартильний розмах 2 (iqr). Робили непараметричний тест, бо розподіл даних був асиметричним. Тести χ робили для таблиць спряженості та застосовували аналіз варіантності Крускала-Валіса, коли непарні дані були порівнянними. Величини p 80 мкм 150 мкм Модифікація DSM: 1 N-октеніл бурштиновий ангідрид 2 Хлороцтова кислота 3 Оцтовий ангідрид 4 Діетиламіноетил хлорид 5 Відсутня модифікація поверхні 1 6 Елагова кислота 7 Діетиламіноетил хлорид 2 8 Елагова кислота 3 9 Діетиламіноетил хлорид 1 Розчиняли у воді 2 Розчиняли в етанолі 3 Більш просторове зшивання 40 Характеристика сфер крохмалю 11 Заряд: 11.8 мкекв./г аніонна 0.7 мкекв./г аніонна 0.3 мкекв./г аніонна 459 мкекв./г р катіонна 0.5 мкекв./г катіонна NA Не вимірювали NA 100 мкекв./г катіонна UA 110776 C2 5 Існує значна відмінність діаметру сухого між партіями (p=0.006), партія 6, яка має найменший розмір сфер (середній діаметр 54 мкм, iqr: 38-58) та партія 2 − найбільший (середній діаметр 72 мкм, iqr: 67-76). Після додавання фосфатного буферу всі партії швидко збільшувались в об'ємі (Фіг. 2), та після 30 сек. вони збільшували сухий об'єм в 5 − 25 разів (таблиця 3). Величина набухання значно різнилась між партіями (p=0.001). Таблиця 3 Об'єм сухого DSM та через 30 сек. у розчині фосфатного буферу Партія DSM Сухий об'єм пл* Об'єм пл* 30 сек. 157 1123 1 (110-165) (943-1150) 195 1047 2 (158-231) (871-1629) 102 3 775 (79-128) 128 1838 4 (120-180) (1551-2187) 88 998 5 (60-126) (688-1110) 82 750 6 (28-105) (439-1114) 166 829 7 (130-219) (760-1083) 113 659 8 (95-163) (599-875) 125 3368 9 (92-249) (1697-3368) -9 * Середні величини (iqr), об'єму в піколітрах (1 пл = 1 мл ) 10 15 20 25 30 35 Зростання об'єму % 700 (647-1000) 600 (512-715) 760 (653-760) 1308 (1001-1559) 1071 (853-1264) 1058 (714-1311) 538 (371-751) 619 (521-666) 2593 (2040-2593) Стимулювання тромбоциту Зчеплення тромбоцитів з DSM було очевидним у трьох з модифікованих партій (No. 4, 7 та 9), тоді як на решту DSM-партій зовсім не впливали тромбоцити (Фіг. 3). Результат підтверджували, застосовуючи PRP від трьох різних донорів. Рандомізоване блоковане попереднє експериментальне дослідження in vivo Усі тварини, оброблені партією 9, отримали первинний гемостаз, у порівнянні з 14-43 % первинного гемостазу від інших партій (Фіг. 4). Час до гемостазу також відрізнявся між групами (p=0.044), оброблені партією 9 тварини були найшвидшими (в середньому − 2 хвил.: iqr: 2-3:20), тоді як для припинення кровотечі партія 6 потребувала в середньому 6 хвил. (n=3), та партія 5 потребувала 10 хвил. (n=1). Тварини, оброблені двома партіями 9 єдині перестали кровоточити (p=NS, у співставленні з іншими партіями). Тварини, оброблені партією 9 мали меншу втрату крові (в середньому 1 г, iqr: 0.4-1.2) у співставленні з іншими партіями (партія 5: 5 г, 4.3-6.7, партія 6: 5.3 г, 2.2-8.6), p=0.001 (Фіг. 5). Постульована гемостатична дія DSM абсорбцією рідини (та малих молекул) з крові та концентрування факторів ендогенної коагуляції на сферах може залежати від швидкості та суттєвого набухання мікросфер. Усі партії в цьому дослідженні швидко підвищували їх об'єм після додавання фосфатного буферу, але швидкість та загальна величина набухання відрізнялася між партіями. Набухання залежить від релаксації ланцюгів поліглюкози після її гідратації. Це обмежено багатьма перехресними зв'язками та полегшено відштовхуванням заряду лігандів. Однак, ми не змогли знайти чітких кореляцій з виміряними характеристиками (наприклад, зарядом). Слабке перехресне зв'язування та високе і швидке набухання залучає швидку деградацію, й тому збільшення в об'ємі не є небезпечним навіть при внутрішньому оперативному застосуванні у місцях, де відстань може ставати обмеженою в кінці процедури. У цьому дослідженні швидка абсорбція рідини та набухання DSM не були достатніми для гемостазу in vivo, тільки 1 − 7 тварин отримували первинний гемостаз при обробленні немодифікованими мікросферами. DSM з кращою гемостатичною властивістю in vivo виявляє разом з тромбоцитами стимулювальні властивості. Отримували партії (4, 7 та 9) з тромбоцитом, зчепленим з 12 UA 110776 C2 5 10 15 позитивно зарядженими DSM, діетиламіноетилом (DEAE), котрі є у відповідності з наведеними даними зчеплення тромбоциту з поверхнями з позитивно зарядженими групами (Lee JH, Khang G, Lee JW, Lee HB. Platelet adhesion onto chargeable functional group gradient surfaces. J Biomed Mater Res 1998 May; 40(2):180-6). Відсутнє об'єктивне визначення кількості тромбоцитів, які зчеплені з відповідною DEAE-модифікованою партією, але за наглядною оцінкою немає очевидної відмінності у кількості зчеплення тромбоциту між партіями 4, 7 та 9, навіть якщо вимірювали різницю заряду між партіями 4 та 9. DEAE-хлорид реагує з гідроксильними групами поверхні DSM, утворюючи групи DEAE, які є позитивними при фізіологічному pH. Ліганди DEAE надають мікросфери, які нездатні до біологічного розкладу та, вірогідно, непридатні для застосування до людини. Однак, якщо модифікація DEAE була повноцінною як підтвердження концепції, якщо сфери можуть зчіплюватися з тромбоцитом, то це може мати будь-яку клінічну гемостатичну значимість. Швидке та дієве стимулювання тромбоцитів є вирішальним для миттєвого гемостазу, отриманого фізичним тампоном агрегованих тромбоцитів. Також тромбоцит є потрібними для дієвого підсилення та розповсюдження створення тромбу, процесу, який енергійно каталізований поверхнею стимульованого тромбоциту, отриманої у фібриновій сітці, яка стабілізує первинну пробку тромбоциту. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Біологічно розкладальна мікросфера з діаметром 10-2000 мкм, що має поперечно-зшитий гідролізований крохмаль, з яким принаймні один тип ліганду, який є амінокислотою, вибраною з групи, що складається з аргініну, гістидину, лізину, гліцину, проліну, аланіну, ізолейцину, лейцину, фенілаланіну, триптофану, тирозину, валіну, серії, аспарагіну, глютаміну, треоніну, глютамінової кислоти та аспарагінової кислоти, органічною кислотою, що містить нітроген, вибраною з групи, що складається з бетаїну, карнітину, креатину, метилгліцину та диметилгліцину, або дикарбоновою кислотою, вибраною з групи, що складається з бурштинової кислоти, адипінової кислоти, щавлевої кислоти, лимонної кислоти, винної кислоти, малеїнової кислоти та шалонової кислоти, з'єднано за допомогою зв'язку естеру карбонової кислоти, причому названий ліганд є ендогенною зарядженою молекулою з молекулярною масою менше 1000 Да, який має принаймні одну додаткову функцію карбонової кислоти та/або принаймні одну функцію аміну, та в середньому 0,05-1,5 лігандів з'єднано з кожним залишком глюкози у гідролізованому крохмалі. 2. Мікросфера за п. 1, в якій ліганд є позитивно зарядженим. 3. Мікросфера за п. 1, в якій ліганд є негативно зарядженим. 4. Мікросфера за п. 1, в якій ліганд є цвітер-іонним. 5. Мікросфера за п. 2 або 3, в якій ліганд має фізіологічно активний протиіон. 6. Мікросфера за будь-яким з пп. 1-5 для застосування у гемостазі. 7. Матеріал для застосування у лікуванні рани, який містить мікросфери за п. 2 або 5, залежним від п. 2, в якому мікросфери утворюють тривимірну структуру, яка містить пустоти між мікросферами. 8. Матеріал за п. 7, в якому ліганд є гідрофобним. 9. Мікросфера за будь-яким з пп. 1-5 для застосування у культурі клітини in vitro. 10. Мікросфера за будь-яким з пп. 1-5 для застосування для судинної емболії. 11. Мікросфера за п. 10, залежним від п. 5, коли п. 5 є залежним від п. 3, в якій протиіон є цитостатичним. 12. Перев'язний матеріал для рани, який містить матеріал за будь-яким з пп. 7-8. 13. Спосіб культивації клітин in vitro, який полягає в тому, що принаймні одну мікросферу за будь-яким з пп. 1-5 або п. 9 додають до культурального середовища, до якого також додано клітини для культивування, а потім клітинам давали можливість розмножуватися. 13 UA 110776 C2 14 UA 110776 C2 15 UA 110776 C2 Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 16