Спосіб інактивації бактерій при виробництві вакцин

Спосіб інактивації бактерій при виробництві вакцин, що передбачає використання девіталізуючого фактора хімічної природи, який відрізняє ться тим, що до суспензії мікроорганізмів додають водний розчин пероксиду водню у кінцевій концентрації 0,5 %, здійснюють інкубацію одержаної суміші при 37,0-38,0 °С протягом 12 годин при ретельному перемішуванні з наступним контролем повноти інактивації. (19) (21) u200704139 (22) 16.04.2007 (24) 26.11.2007 (72) РУДЕНКО АНДРІЙ АН АТОЛІЙОВИЧ, U A, РУДЕНКО ПАВЛО АН АТОЛІЙОВИЧ, U A, КЛІМЕНКО СЕРГІЙ СЕРГІЙОВИЧ, UA (73) ЛУГАНСЬКИЙ НАЦІОН АЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ, UA (56) 3 27905 біотехнології та протиепізоотичній справі. До того ж зазначена вище речовина дуже токсична та її водяні розчини нестійкі. Нарешті, цей препарат не виробляється в Україні і є дорогим та малодоступним для вітчизняної біотехнологічної промисловості. В основу передбачуваної корисної моделі поставлено завдання здійснити підбір препарату для інактивації мікроорганізмів, з числа доступних для вітчизняної промисловості, за допомогою якого можливо створювати високоімуногенні, нетоксичні й малореактогенні антигени. Поставлена задача вирішується тим, що в запропонованому способі інактивації інфекційних агентів для виробництва бактерійних біопрепаратів застосовують фармакопейний пероксид водню у кінцевій концентрації 0,5%. Перекис водню розщеплюється з виділенням атомарного кисню і має виражену протимікробну активність in vitro. Цей препарат більш ніж 100 років використовується в клінічній практиці як гуманної, так і ветеринарної медицини; його фармакодинаміка, нешкідливість й біологічна небезпечність вивчена з вичерпаною повнотою і не викликає жодних сумнівів. Спосіб, що передбачається, складається з наступних те хнологічних етапів: 1) для виготовлення вакцин та антигенів проводять накопичення бактеріальної маси на МЛА з додаванням 10,0% дріжджового аутолізату крові (ДАК) у 1,5 л матрацних колбах. Матричні культури епізоотичних штамів попередньо вирощують у пробірках з 9,0мл МПБ при температурі 37,5±0,5°С на протязі 20,0±2,0 годин з розрахунку 1 пробірка на матрас з 250,0 см щільного поживного середовища; 2) вирослими культурами бактерій засівають матраси, які після висіву витримують агаром вниз при кімнатній температурі 20-30 хвилин, а потім агаром догори розміщують в термостаті і вирощують при температурі 37,5±0,5°С впродовж 18-22 годин в залежності від накопичення біомаси; 3) після візуальної перевірки чистоти росту культури, з матрасів зливають конденсат і в кожну матрасну колбу наливають по 15,0-20,0см 3 стерильного фосфатно-буферного фізіологічного розчину. Біомасу бактерій змивають коливанням матрасу й роблять мазки, які фіксують на полум'ї спиртівки і фарбують за Грамом. Суспензія повинна бути типовою до відповідного штаму мікроорганізмів і не мати домішок сторонніх бактерій; 4) суспензії бактерій стандартизують шляхом вимірювання об'єму і визначення кількості мікробних клітин, яку проводять за стандартом каламутності ДІСК їм. Тарасевича (1,0×10 мікробних клітин в 1см 3). Встановлюють 9 концентрацію 30 × 10 мікробних клітин шляхом додавання стерильного фосфатно-буферного фізіологічного розчину. Після стандартизації бактеріальної суспензії в останню додають інактивант (32,3-32,6% розчин пероксиду водню) в кількості необхіднії! для одержання кінцевої концентрації 0,5% і витримують впродовж 12годин при температурі 37,5 ± 0,5°С для девіталізації; 4 5) стерильність і повноту інактивації перевіряють висівом по 0,5см із кожної інактивованої суспензії бактерій на МПА, 10% кров'яний МЛА, Ендо і на агар Сабуро по 3 пробірки; на середовище Кітт-Тароцці по 2 пробірки і 2 флакона. Пробірки і флакони з посівами на середовищах, крім Сабуро, витримують в термостаті при температурі 37,5 ± 0,5°С, а на агарі Сабуро - при температурі 21,0 ± 1,0°С протягом 7 діб; 6) імуногенність та токсичність антигенів оцінюють відповідно за тестами активного захисту й летальності для білих мишей. Проведені дослідження свідчать про високу інактивуючу активність пероксиду водню відносно інфекційності пастерел, стафілококів, ешеріхій і бордетел. Після обробки тест-культур 0,5 % пероксидом водню протягом 12 годин при 37 °С повністю й необоротно руйнувалась їх інфекційна активність. Приклад 1. Накопичення бактеріальної маси на поживному середовищі. При здійсненні процесу культивування бактерій на МПА з додаванням 10,0 % дріжджового аутолізату крові (ДАК) у 1,5л матрацних колбах (n = 4), встановлено, що найбільше число бактеріальних клітин було отримано при вирощуванні культур Е.соlі № 88 (4,1 10) та S.aureus № 115 (3,6 × 1012), декілька слабкіше накопичувалися ізоляти P.multocida № 99 (2,9 × 1012), P. multocida № 127 (2,3 × 1012) та B.bronchistptica №129 (2,110і2 мікробних клітин за оптичним стандартом мутності). Приклад 2. Інактивація бактеріальної сировини. Для відпрацьовування режиму інактивації пастерел, стафілококів, ешеріхій та бордетел нами була вивчена кінетика інактивації. На початок досліду кількість живих мікробних клітин (ж.м.к.) P. multocida № 127, P. multocida № 99, S.aureus № 115, Е.соіі № 88 і B. bronchistptica №129 відповідно сягала 10,4; 10,3; 10,3; 10,5; 10,5 НВЧ (найбільш вірогідне число), lg/см 3. Через 1 годину після додавання пероксиду водню у кінцевій концентрації 0,5% кількість ж.м.к. пастерел, стафілококів, ешеріхій та бордетел відповідно становила 8,3; 7,8; 5,9; 6,5; 5,9; через 2 години 5,8; 4,2; 3,5; 2,6; 3,6; через 4 години - 2,2; 1,4; 2,1; 0,6; 1,1; через 6 годин - 0; 0; 0,6; 0; 0; через 8 годин - 0; 0; 0; 0; 0 НВЧ, lg/см 3. Приклад 3. Математична модель процесу інактивації бактерій 0,5 % пероксидом водню. За допомогою регресійного аналізу виявлено залежність логарифму виживаності досліджуваних бактерій від тривалості інактивації. Встановлено, що регресійний зв'язок близький до прямолінійного і його можна виразити рівнянням прямої лінії ух = а-b×х, де ух = lg ж.м.к.; х - тривалість інактивації, годин; а и b - коефіцієнти регресії (b - константа інактивації, год-1). Рівняння регресії виражають функціональний зв'язок між девіталізуючою активністю інактиватору у вигляді динаміки НВЧ мікробів у часовій перспективі. Необхідно відзначити, що функціональна залежність НВЧ клітин бактерій (у) від часу 5 27905 інактивації (х) P.multocida № 127 (у1), P.multocida № 99 (у2), S.aureus № 115 (у3), Е.соlі № 88 (у4) і B.bronchiseptica № 129 (у5) за допомогою 0,5% ПВ можна відповідно представити наступними рівняннями регресій: у1 = -1,8 × х + 9,9; у2 =-1,7 × х + 9,2; у3 = -1,1 × х + 7,7; у4 = -1,7 × х + 8,4 та у5 = -1,6 × х + 8,4. На підставі проведеного регресійного аналізу можна прогнозувати, що безпечний поріг інактивації культур, пастерел, стафілокококів, ешерихій та бордетел при застосуванні 0,5% пероксиду водню наступить відповідно через 7,7; 7,8; 10,6; 7,3 та 7,8 години. Приклад 4. Вивчення нешкідливості, імуногенності перекисних антигенів. Нешкідливість отриманих кожного зразка антигену (інактивованої біомаси бактерій) інокулювали 10 білим мишам масою 16-18г підшкірно в об'ємі 0,5см 3 з концентрацією мікробних клітин 3млрд/см 3. Облік одержаних результатів проводили через 1, 2 та 10 діб. Протягом всього терміну спостереження миші залишалися живими. Показник імуногенності (ImD50) оцінювали за тестом активного захисту мишей. Встановлено, що середньоефективна імунізуюча доза антигенів P.multocida № 127, P.multocida № 99, S.aureus № 115, Е.соlі № 88 і B.bronchistptica № 129 складала відповідно 1,08 × 108; 1,85 × 108; 4,22 × 108; 4,22 × 108; 7,32 × 108 м.к. при зараженні мишей внутрішньочеревно вихідними культурами бактерій у дозі 4LD5005см 3. Показники токсичності (LD50 антигенів оцінювали за тестом летальності для мишей. Встановлено, що LD50 нти генів P.multocida № 127, P.multocida № 99, S.aureus № 115, Е.соl № 88 і B.bronchistptica № 29 складала 1,93 × 1010; 2,54 × 1010 1,18 × 1010, 1,93 × 1010; 4,39 × 1010м.к., відповідно. 6