Спосіб одержання дріжджового ферментного препарату бета – фруктофуранозидази

Спосіб одержання дріжджового ферментного препарату b-фр уктофуранозидази, що складається з приготування суспензії з біомаси хлібопекар 34403 при частоті обертання ротора w=2000 хв-1 в рециркуляційному режимі. Зниження цього параметра (порівняно з аналогом) дозволяє без наслідків підвищити насипний об'єм молольних тіл (VMT ) до 125150 мл та концентрацію суспензії дріжджів до 12,516,5% СВ і вести процес більш ефективно, тобто за менший термін оброблення суспензії дріжджів досягати необхідного рівня СД та виходу bфр уктофуранозидази у дезінтеграт. Обрана авторами частота також дає можливість запобігти вищезгаданим негативним явищам, які спостерігалися при w=3000 хв-1. 3. Збільшення VMT з 125 до 150 мл при 2-3 кратній обробці дріжджової суспензії з концентрацією 12,5% СВ (див. фіг. 1) обумовлює значний приріст, на 50-56% активності b-фруктофуранозидази в супернатанті дезінтеграту, водночас при дезінтеграції суспензії з концентрацією 16,5% СВ приріст складає всього 4-10% (див. фіг. 2). Тому можна вважати доцільним збільшення насипного об'єму мікрокульок до 150 мл при дезінтеграції менш концентрованої суспензії дріжджів, тоді як дезінтеграцію суспензії з концентрацією 16,5% СВ рекомендовано проводити при 125 мл мікрокульок, тобто при коефіцієнті заповнення камери k=0,6. Збільшення концентрації суспензії та об'єму молольних тіл є недоцільним, тому що протікання процесу дезінтеграції дріжджової суспензії з концентрацією СВ>16,5% при Vмт>150 мл супроводжується появою таких негативних явищ, як зниження швидкості протікання суспензії внаслідок закупорювання щілин сепаратора, що веде до нагрівання дезінтеграту і, відповідно, до додаткової інактивації цільового клітинного компоненту. 4. Пропонується осадження b-фруктофуранозидази з супернатанту дезінтеграту за допомогою 10-20% розчину таніну до концентрації його в супернатанті 0,5-0,7% (з розрахунку на 60 од/мл інвертазної активності) при температурі 20-25°С, протягом 10-20 хвилин (див. табл. 1). Завдяки тому, що при осадженні таніном практично не збільшується об'єм суміші, яка поступає на центрифугування, енергоємність процесу концентрування ферменту знижується в 2-4 рази порівняно з процесом осадження етиловим спиртом. На відміну від процесу висолювання, осадження таніном протікає за короткий термін та не потребує охолодження, що також дає можливість запобігти додаткових енерговитрат. На фіг. 1 показано залежність виходу інвертази від терміну дезінтеграції суспензії дріжджів з концентрацією 12,5% СВ. На фіг. 2 показано залежність виходу інвертази від терміну дезінтеграції суспензії дріжджів з концентрацією 16,5% СВ. Для фіг. 1 та фіг. 2 позначки кривих - 1, 2, 3, 4 - вказують на те, що дезінтеграцію проводили при насипному об'ємі мікрокульок 75, 100, 125, 150 мл відповідно. Спосіб здійснюється таким чином. З біомаси пресованих виробничих дріжджів Saccharomycers cerevisiae, вирощених у стерильних умовах, виготовляли суспензію при використанні водопровідної води у співвідношенні 1:1 (СВ 12,5%) та 2:1 (СВ 16,5%). Клітинну суспензію піддавали обробці на балістичному дезінтеграторі ФУГ-1М у режимі рециркуляції при частоті обертання ротора 2000 хв-1, швидкості протоку 1 л/хв Недоліками вищезгаданого способу є мала концентрація вихідної клітинної суспензії, відповідно невисока інвертазна активність супернатанту дезінтеграту (до 53 од/мл), невідповідність обраного способу концентрування фізико-хімічним властивостям ферменту (складна четвертинна будова) та непридатність готового рідкого препарату інвертази для тривалого зберігання. Крім того, велика робоча частота обертання ротора при насипному об'ємі мікрокульок, що перевищує 100 мл, призводить до закупорювання щілин сепаратора, зниження швидкості протоку та нагрівання дезінтеграту. Недоліком способу осадження інвертази таніном (Заявка Японії № 12992, Бюл. № 36, 1961) є неспроможність (при вказаних в заявці умовах) повного виділення ферменту з дріжджового супернатанту дезінтеграту. Це пов'язано з тим, що супернатант дезінтеграту висококонцентрованих суспензій дріжджів (з яких ми пропонуємо осаджувати (b-фрукто фуранозидазу) містить набагато більше ферменту (білків), ніж бактеріальна культуральна рідина. В основу винаходу поставлена задача створення способу отримання високоактивного сухого препарату b-фрукто фуранозидази з хлібопекарських дріжджів з тривалим терміном зберігання. Поставлена задача вирішується в запропонованому способі одержання дріжджового ферментного препарату b-фр уктофуранозидази, який включає приготування суспензії з біомаси хлібопекарських дріжджів Saccharomyces cerevisiae, дезінтеграцію суспензії, відділення дріжджової пасти, осадження ферменту з супернатанту та висушування. Згідно з винаходом, дезінтеграцію суспензії дріжджових клітин з концентрацією в межах 12,516,5% СВ (суха вага) проводять в балістичному дезінтеграторі в рециркуляційному режимі зі швидкістю протікання суспензії -1 л/хв, протягом 2-3 хвилин при частоті обертання ротора 2000 хв-1 та насипному об'ємі молольних тіл 125-150 мл до ступеня дезінтеграції 50±5%, а після видалення клітинних залишків здійснюється осадження bфр уктофуранозидази з супернатанту дезінтеграту за допомогою 0,5-0,7% таніну (з розрахунку на 60 од/мл інвертазної активності). Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і технічним результатом буде в наступному: 1. Фокусування процесу дезінтеграції дозволяє визначити режими, при яких є можливим максимальне вилучення ферменту за мінімальну кратність процесу руйнування клітин. Для визначення цих режимів, з метою зниження втрат ферментативної активності внаслідок таких явищ, як механічна інактивація і мікрокрекінг, нами було апріорі обрана мінімальна кількість циклів дезінтеграції (1-3 цикли), що і обумовило вибір низької швидкості протікання дріжджової суспензії - 1 л/хв та терміну процесу руйнування - 1-3 хвилини. Подовження терміну обробки суспензії є недоцільним, тому що інактивація вилученого у дезінтеграт ферменту призводить до суттєвого зниження приросту інвертазної активності та виходу значної кількості баластних білків. 2. Процес руйнування клітин пропонується проводити в балістичному дезінтеграторі ФУГ-1М 2 34403 протягом 1-10 хвилин та насипному об'ємі молольних тіл 75-150 мл. В якості адгезивного матеріалу використовували кульки з сополімеру стиролу з дивінілбензолом, діаметром 350-500 мкм. Процент дезінтеграції складав 50±5% клітин. Супернатант відділяли від дебрісу центрифугуванням при 2500 об/хв, протягом 30-45 хв. При даному режимі дезінтеграції (результати дезінтеграції наведено на фіг. 1 та 2) після 2-3 циклів руйнування дріжджової суспензії з концентрацією 12,5% СВ при Vмт= 150 мл, активність b-фруктофуранозидази в супернатанті дезінтеграту становила 80-120 од/мл, а ступінь дезінтеграції - 45-57% (після 2-го та 3-го циклу руйнування відповідно). Дезінтеграція дріжджової суспензії з концентрацією 16,5% СВ при Vмт=125-150 мл за ту ж кількість циклів руйнування дозволяла досягати ступеня дезінтеграції 48-52% та отримувати активність b-фруктофуранозидази в супернатанті дезінтеграту до 150-175 од/мл. За умов використання дріжджової суспензії з мінімальною ефективною концентрацією СВ 12,5% - оптимальними показниками були: насипний об'єм 150 мл, 3 цикли дезінтеграції, що дозволяло досягти дезінтеграції 57% клітин та виходу інвертазної активності у супернатант до 115 од/мл. Таким чином, оптимальний вихід b-фруктофуранозидази у дезінтеграт досягається за умов використання частоти обертання ротора 2000 хв-1, Vмт=125 мл, 2 циклів обробки дріжджової суспензії з концентрацією СВ 16,5%, що дозволяє досягти рівня дезінтеграції дріжджових клітин 42% та інвертазної активності у супернатанті дезінтеграту 143 од/мл. Саме при цьому режимі дезінтеграції був отриманий супернатант, з якого проводили виділення ферменту для визначення оптимального способу одержання сухого препарату інвертази. Осадження ферменту з супернатанту (об'єм супернатанту був постійним і дорівнював 50 мл) здійснювали за допомогою сульфату амонію при ступіні насичення 0,7-0,9, етанолом у співвідношенні 1:1, 1:2 та 1:3, а також таніном у співвідношенні 0,40,8% на 60 од/мл інвертазної активності. Осад ферментного препарату відділяли центрифугуванням при 6000 об/хв протягом 20 хв. та висушували вакуумним способом при температурі 20-25°С або ліофілізували. Вплив методу виділення та умов висушування на інвертазну активність сухи х ферментних препаратів (СФП) наведено у табл. 1. Слід зауважити, що інвертазну активність в супернатанті дезінтеграту (ІА) визначали методом Самнера у 0,2М Na-ацетатному буфері (рН 4,7) при 30°С (стандартні умови), тоді як активність сухи х ферментних препаратів (ІАсфп) визначали при оптимальній температурі дії ферменту (55°С). Це дозволило порівнювати одержані дані не тільки з даними попередніх досліджень з дезінтеграції дріжджів, але й з активністю сухих комерційних препаратів інвертази. Ефективність процесу осадження оцінювали також за сумарною інвертазною активністю (S IA), яка дорівнює добутку маси отриманого сухого препарату ферменту на його активність, тобто кількості одиниць активності, осаджених з певного об'єму супернатанту (в даному експерименті - з 50мл). За отриманими даними, оптимальним режимом осадження препарату інвертази слід вважати виділення ферменту з супернатанту за допомогою 0,6% таніну (з розрахунку на 60 од/мл інвертазної активності) та вакуумного висушування при 2025°С. Одержані препарати мають ферментативну активність 20-35 од/мг та можуть зберігатися у сухому стані при температурі +4°С протягом 1-2 років 90%-80% вихідної активності відповідно. Приклади здійснення способу одержання ферментного препарату (b-фр уктофуранозидази наведено у табл. 2. Технічний результат полягає в наступному: запропонований спосіб дозволяє одержати високоактивний сухий препарат дріжджової (b-фруктофуранозидази з тривалим терміном зберігання. Таблиця 1 Реагент (NH4)2SО4 етанол танін Умови обробки 0,7 нас. 0,8 нас. 0,9 нас. 1:1 1:2 1:3 0,4 % 0,5 % 0,6% 0,7 % 0,8% Вакуумне висушування IAсфп , од\мг S IA, од/50 мл 1368 2569 7015 8841 2466 4442 4634 8640 13327 10144 7148 1,15 1,27 2,71 29,52 6,08 10,47 21,38 24,92 35,61 27,33 20,08 3 Ліофілізація ІАсфп , од\мг S IA, од/50 мл 1683 3675 9413 7082 2787 3232 4486 8752 12842 10058 6784 1,06 1,73 3,07 22,21 7,18 8,15 19,63 25,26 31,95 26,87 19,02 34403 Таблиця 2 Показники Концентрація суспензії, СВ % Термін дезінтеграції, хв Кількість мікрокульок, мл Концентрація таніну, % Активність СФП, од/мг Сумарна активність, од/50мл 1 12,5 2 125 0,5 25,32 7329 Фіг. 1 Фіг. 2 4 2 12,5 2 150 0,6 27,26 8505 Приклади 3 12,5 3 150 0,6 32,54 10556 4 16,5 2 125 0,6 35,61 13327 5 16,5 3 125 0,7 29,33 12215 34403 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 5