Спосіб отримання поживної основи мікробіологічних середовищ

1. Спосіб отримання поживної основи мікробіологічних середовищ, що включає подрібнювання рибної сировини, готування гомогенату рибної сировини для гідролізу шляхом розведення подрібненої рибної сировини водою, гідроліз гомогенату рибної сировини при нагріванні, прогрівання гідролізату з рибної сировини і відділення нерозгідролізованих білків, який відрізняється тим, що додатково одержують лужний гідролізат з молюсків, а гідроліз гомогенату рибної сировини виконують у C2 2 UA 1 3 84818 тому що спрямована на використання альтернативних джерел сировини, що не використають важливі для людини продукти харчування. Гідролізати з морепродуктів, наприклад гідролізати з рибної сировини, відносяться до таких джерел, а поживні середовища, що приготовлені на їхній основі, використаються для біотехнологічного виробництва вакцин, сироваток й ін. медичних і ветеринарних препаратів. У зв'язку з тим, що рибні гідролізати недостатньо збалансовані по ряду поживних елементів, наприклад, амінокислотам, доцільно створити основу із сировини морського ґенеза, що відповідає, по амінному азоту (не менш 600мг %), Рн й іншим показникам, умовам використання для готування живильних, спеціальних і диференційнодіагностичних середовищ. Найбільш близьким за сукупністю ознак до винаходу «Спосіб отримання поживної основи мікробіологічних середовищ», що заявляється, є «Способ получения основы микробиологических сред» [див. патент RU №2001101, МПК C12N1/20], який включає здрібнювання рибної сировини, готування гомогенату рибної сировини для гідролізу шляхом розведення здрібненої рибної сировини водою, гідроліз гомогенату рибної сировини при нагріванні, прогрівання гідролізату з рибної сировини і відділення нерозгідролізованих білків. Сутністю відомого способу одержання основи мікробіологічних середовищ є те, що здрібнені внутрішні органи промислових риб змішують з водою в співвідношенні 1:1,5, витримують при 40-42°С у лужній зоні рН 7,6-8,0 у присутності хлороформу при перемішуванні протягом 2-2,5 діб. З наступним прогріванням при 90°С протягом 5-10 хвилин, осадженням високомолекулярних з'єднань у ізоелектричній точці білка, відділенням нерозгідролізованих білків і висушуванням кінцевого продукту. Недоліком відомого способу є те, що як сировину використовують тільки нехарчові відходи переробки риби, що обмежує сировинну базу, а з іншого боку, знижує якісний склад одержуваних поживних, середовищ у зв'язку з недостатньою збалансованістю по ряду амінокислот й інших поживних елементів. Крім того, наявність у технологічному процесі вибухонебезпечного і токсичного для персоналу хлороформу не дозволяє організувати екологічно чисте виробництво. В основу винаходу «Спосіб отримання поживної основи мікробіологічних середовищ" поставлено задачу шля хом розширення сировинної бази поліпшити якість основи поживного середовища, її збалансованість по ряду амінокислот й інших поживних елементів, а також забезпечити поліпшення екологічних умов виробництва шля хом виключення з технологічного циклу пожаро- і вибухонебезпечних органічних розчинників (хлороформ). Поставлена задача досягається тим, що Спосіб отримання поживної основи для мікробіологічних середовищ, включає здрібнювання рибної сировини, готування гомогенату рибної сировини для гідролізу шляхом розведення здрібненої рибної сировини водою, гідроліз (автоліз) гомогенату рибної сировини при нагріванні, прогрівання гідролізату з рибної сировини і відділення неразгідролі 4 зованих білків. При цьому додатково одержують лужний гідролізат з молюсків, а гідроліз гомогенату рибної сировини виконують у кислотному середовищі й отриманий кислотний гідролізат з рибної сировини з'єднують з лужним гідролізатом з молюсків у співвідношенні 1:3-3:1, щоб кількість амінного азоту була в межах 600-900мг %. При готуванні кислотного гідролізату з рибної сировини до гомогенату рибної сировини додають 18-20% розчин соляної кислоти до рН 4,5-5,0 і нагрівають до 4550°С протягом 22-26 годин, потім додають концентровану ортофосфорну кислоту до залишкової концентрації кислоти на рівні 2% і здійснюють прогрівання гомогенату рибної сировини при 100° С протягом 22-26 годин, потім гідролізат з рибної сировини нейтралізують додаванням 40% розчину їдкого натру до рН 6,8-7,4 При готуванні лужного гідролізату з молюсків до здрібненої сировини з молюсків додають 1,0% розчин їдкого натру у співвідношенні 1:1 та здійснюють гідроліз при 80°С протягом 20 - 24 годин, потім гідролізат з молюсків нейтралізують додаванням концентрованої соляної кислоти до рН 6,8-7,4. Гідроліз сировини з молюсків здійснюють до одержання кількості амінного азоту в межах 240-450мг %. З'єднання кислотного гідролізату з рибної сировини з лужним гідролізатом з молюсків здійснюють до операції нейтралізації гідролізату з рибної сировини з наступним коректуванням кислотності біомаси до рН 6,8-7,4. Кислотність отриманої основи для мікробіологічних живильних середовищ коректують до рН 7,0. Винахід пояснюється ілюстрацією. На Фіг.1 Вміст амінного азоту у гідролізатах. Спосіб, що заявляється як винахід, характеризується тім, що: - гідроліз сировини з молюсків здійснюють до одержання кількості амінного азоту в межах 240450мг %, а кислотний гідролізат з рибної сировини змішують з виготовленим лужним гідролізатом з молюсків, щоб кількість амінного азоту поживної основи була в межах 600-900мг %; - з'єднання кислотного гідролізату з рибної сировини з лужним гідролізатом з молюсків здійснюють до операції нейтралізації гідролізату з рибної сировини з наступним коректуванням кислотності біомаси до рН 6,8 - 7,4; - кислотність отриманої основи для мікробіологічних поживних середовищ коректують до рН 7,0. Нашими дослідженнями встановлено, що для досягнення оптимальної якості основи для готування мікробіологічних живильних середовищ з сировини морського ґенезу доцільно з'єднання лужного гідролізату з молюсків з кислотним гідролізатом з рибної сировини. При цьому, експериментально (див. Фіг.) встановлено, що: 1. співвідношення об'єму лужного гідролізату з молюсків до об'єму кислотного гідролізату з рибної сировини повинне знаходитися в межах 1:3-3:1 до встановлення кількості амінного азоту в межах 600-900мг %; 2. при готуванні кислотного гідролізату з рибної сировини до гомогенату рибної сировини треба 5 84818 додати розчин соляної кислоти в межах 18-20% до рН у межах 4,5-5,0; 3. гомогенат рибної сировини треба нагрівати в межах 45-50°С протягом 22-26 годин; 4. додавання в гомогенат рибної сировини концентрованої ортофосфорної кислоти до залишкової концентрації кислоти на рівні 2% є оптимальним; 5. прогрівання гомогенату рибної сировини треба здійснювати при 100°С протягом 22-26 годин; 6. нейтралізацію гідролізату з рибної сировини треба здійснювати додаванням 40% розчину їдкого натру до рН у межах 6,8-7,4; 7. при готуванні лужного гідролізату з молюсків до здрібненої сировини з молюсків треба додавати 1,0% розчин їдкого натру в співвідношенні 1:1; 8. гідроліз сировини з молюсків оптимально здійснювати при 80°С протягом 20-24 годин; 9. нейтралізувати гідролізат з молюсків доцільно додаванням концентрованої соляної кислоти до рН в оптимальних межах 6,8-7,4; 10. гідроліз сировини з молюсків треба здійснювати до одержання кількості амінного азоту в межах 240-450мг %; 11. з метою зниження вмісту солей у кінцевому продукті, можливе з'єднання продуктів гідролізу риби з продуктами гідролізу мідій до стадії нейтралізації, з наступним коректуванням кислотності кінцевого продукту до рН 6,8-7,4; 12. коректування кислотності отриманої основи для мікробіологічних живильних середовищ до рН 7,0 обумовлено необхідністю одержання основи з біологічними значеннями рН; Спосіб одержання поживної основи мікробіологічних середовищ здійснюється таким чином. Як сировину використовують будь-які дрібні види промислових риб -тюльку, хамсу й і т.п., переважно чорноморський шпрот, а також молюски, переважно мідії. Розмірний склад риби, а також мінімальна довжина молюсків, що добувають на природних банках, або культивують в морегосподарствах, сезони і райони їхнього улову встановлюються правилами рибальства. Термін зберігання сировини з дня від улову до переробки визначається відповідними технологічними інструкціями і санітарно-гігієнічними вимогами. У замороженому вигляді сировина зберігається до шести місяців. Свіжу неопрацьовану рибу пропускають через подрібнювач для одержання фаршу. Фарш засипають у реактор з нержавіючої сталі або скла. Туди додають дистильовану воду в співвідношенні 1:1,5 обсягу фаршу до води і 18-20% розчин соляної кислоти до рН 4,5-5,0 і нагрівають до 45-50°С Гідроліз фаршу для готування середовищ проводять протягом 24 годин. Для припинення дії літичних ферментів в автолізат додають концентровану ортофосфорну кислоту до кінцевої концентрації кислоти в 2% і підвищують нагрів суміші до 100°С протягом 24 годин для видалення неприємного запаху. Отриманий гідролізат нейтралізують додаванням 40% розчину їдкого натру (NaOH) до рН 6,8-7,4. Закінчення гідролізу контролюють за вмістом амінного азоту відповідно. Його кількість повинна бути в межах 600 - 900мг %. Отримані гід 6 ролізати змішують у співвідношенні 1:1 або 1:4 обсягу лужного гідролізату з мідії до автолізату з риби, щоб кількість амінного азоту була не менш 600мг %. При цьому можливо випадання в осад агрегатуючи х високомолекулярних поліпептидів і зміна рН. Отриману основу поживного титрувального середовища коректують до рН 7,0 додаванням 40% розчину їдкого натру (NaOH. Осад агрегатуючи х високомолекулярних поліпептидів відокремлюють центрифугуванням. Рідкий надосад фасують у добре вимиті скляні флакони, закупорюють гумовими пробками, герметизують ковпачками алюмінієвими і витримують в автоклаві при 0,6 Ат протягом 30 хвилин. Приклади реалізації способу Приклад №1 700г мороженого шпроту пропускали через електром'ясорубку для одержання фаршу. Фарш засипали в склянку і додавали 1100мл дистильованої води. При безперервному перемішуванні до суміші додавали 6мл 20%-го розчину соляної кислоти до рН 4,85. Суміш помістили в 2-х лі трову колбу в термостат і нагрівали до 45-50°С. Гідроліз фаршу проводили протягом 24 годин. Для припинення дії літичних ферментів в автолізат домішували 39,5мол 95%-ой ортофосфорної кислоти і підвищили нагрівання суміші до 100°С. Гідроліз вели протягом 24 годин до видалення неприємного запаху. Отриманий гідролізат нейтралізували додаванням 35мл 40% розчину їдкого натру (NaOH) до рН 6,86. Нейтралізований гідролізат фільтрували для відділення кісткових залишків і негідролізованого залишку. Фільтрат освітлювали центрифугуванням. Супернатант переносили в ділильну лійку, де декантацією відокремлювали жир. Вихід склав 1250мл готового продукту, утримуючого 12,7% сухої речовини і 0,9% амінного азоту. 1,1 кг мороженої мідії пропустили через електром'ясорубку для одержання фаршу. Фарш засипали в реактор з нержавіючої сталі і додавали 1100мл 2%-ного розчину їдкого натру у співвідношенні 1:1 обсягу фаршу до розчину лугу. Гідроліз вели протягом 24 годин при температурі 80°С. Кінець гідролізу контролювали за вмістом амінного азоту. Його кількість повинна бути в межах 240450мг %. Гідролізат відокремлювали от стулки фільтруванням. Фільтрат нейтралізували 80мл 37%-ної соляної кислоти до рН 6,9. Механічні домішки й осад відокремлювали центрифугуванням. Вихід склав 1800мл готового продукту, утримуючого 10,6% сухої речовини і 0,27% амінного азоту. 100мл лужного гідролізату мідії змішували з 300мл автолізату широту. Осад агрегуючих білків відокремлювали центрифугуванням. Вихід склав 395мл готового продукту, що утримував 11,8% сухої речовини і 0,74% амінного азоту Приклад №2 700г свіжомороженого шпроту подрібнювали на електром'ясорубці і змішували з 1200мл дистильованої води. До суміші додавали 3,5-4мл концентрованої соляної кислоти для доведення рН до 4,5-5,0. Суміш переносили в скляну колбу об'ємом 2л, горловина затикали стерильною ватяною про 7 84818 бкою і колбу поміщали в термостат на 24 години при температурі 45-50°С. Через 24 години у колбу додавали 40мл 95% ортофосфорної кислоти і температура підвищувалась до 100°С. Гідроліз продовжували протягом 24 годин. Отриманий гідролізат відокремлювали фільтруванням від неперетравлених кісткових залишків. 1кг мороженої мідії заливали 1л 2%-ного розчину їдкого натру і гідролізували протягом 24 годин. Отриманий гідролізат відокремлювали від стулок мідій фільтруванням. Кислий автолізат шпроту нейтралізували лужним гідролізатом мідії і рН доводили до нейтрального додаванням 3-5мл соляної кислоти. Розчин освітлювали центрифугуванням при 3000об/хв.. протягом 30 хвилин. Супернатант знежирювали декантацією в ділильній лійці. Вихід готового продукту 3,6л. Отримана композиція гідролізатів являє собою прозору рідину жовто-коричневого кольору, та містить комплекс амінокислот, пептидів, вітамінів, макро- і мікроелементів та призначена для використання як основа для приготування поживних середовищ для культивування мікроорганізмів при виготовленні ветеринарних імунобіологічних пре Комп’ютерна в ерстка В. Клюкін 8 паратів, а також як основа для приготування спеціальних та диференційно-діагностичних середовищ для культивування мікроорганізмів з метою визначення збудників захворювань у діагностичних лабораторіях. При використанні винаходу досягн уто те хнічний результат, що полягає в у розширенні сировинної бази при отриманні поживної основи для мікробіологічних середовищ і поліпшенні екологічних умов виробництва. В заявленому технологічному процесі не використовується така вибухонебезпечна і токсична для персоналу речовина, як хлороформ. Заявлено основу поживного середовища, що виготовлена із сировини морського генезу. Вона збагачена трофічними цінними речовинами з гідролізатів організмів різних таксономічних гр уп, переважно риб і молюсків і містить амінний азот не менш 600мг %. Основа може бути розведена водою, наприклад, до вмісту амінного азоту в поживному середовищі до 60-120мг %. Це забезпечить вміст хлориду натрію в готовому середовищ на рівні, що не перевищує 0,5%, і буде відповідати складові мясопептонів, рекомендованих для культивування великої кількості видів бактерій. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601