Штам бактерій streptococcus thermophilus, що використовується у виробництві бактеріальних концентратів для кисломолочних продуктів функціональної дії

Штам бактерій Streptococcus thermophilus IMB В-7179, що використовується у виробництві бактеріальних концентратів для кисломолочних продуктів функціональної дії. (19) (21) a200815252 (22) 30.12.2008 (24) 26.07.2010 (46) 26.07.2010, Бюл.№ 14, 2010 р. (72) КІГЕЛЬ НАТАЛЯ ФЕДОРІВНА, НАУМЕНКО ОКСАНА ВАСИЛІВНА (73) ТЕХНОЛОГІЧНИЙ ІНСТИТУТ МОЛОКА ТА М`ЯСА УААН 3 дукту становить не менше 4,6од.рН, яка під час зберігання продукту за температури 8°С упродовж 28 діб не знижується більше ніж на 0,2од. рН. Штам застосовують як у монокультурі, так і з молочнокислими паличками Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei та біфідобактеріями для виробництва різноманітних продуктів: сирів, йогуртів, ферментованих молочних продуктів, пробіотиків для людей та тварин. Однак в описі винаходу відсутні результати досліджень (in vitro, або in vivo), що встановлюють можливість та ефективність застосування штаму як пробіотика. Найближчим до штаму, що заявляється, є штам Streptococcus thermophilus ВКПМ В-7331, який використовується для одержання бактеріального концентрату прямого внесення для продуктів спеціального призначення (Пат. України № 56385 А, 7 C12N1/20, А23С9/12, 2003 - прототип). Цей штам виділено з природних джерел та відібрано на основі лабораторних досліджень з урахуванням вимог, що висуваються до пробіотиків. Штам стійкий до продуктів метаболізму травної системи (30% жовчі, 6,5% NaCl, 0,5 фенолу) та характеризується високою адгезивністю - індекс адгезивності ІА - 7,2±0,1. Штам проявляє антагоністичну активність щодо патогенних та умовно-патогенних тест-культур родів Proteus, Escherichia та Staphylococcus з колекції мікроорганізмів Інституту епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського МОЗ України (зони затримки росту 11-15мм). Штам є технологічним: межа кислотоутворення не перевищує 115°С, характеризується високим ступенем виживання під час ліофілізації та зберігання. Недоліком цього штаму є відсутність холестеразної активності, низькі показники адгезивності, антагоністичної активності та реологічних властивостей. Завданням винаходу є отримання біологічно активного штаму термофільного стрептококу з комплексом технологічних і пробіотичних властивостей, що забезпечує формування в'язкої текстури ферментованого молока та підвищує функціональну дію цільових продуктів. Штам Streptococcus thermophilus - скорочена назва S. thermophilus,- був одержаний у результаті спрямованої селекції культури, вилученої із самоквасного молочного продукту. Ідентифікований як вид S. thermophilus за основними морфологічними, культуральними і фізіолого-біохімічними властивостями (Краткий определитель Берги, 1982; Л.А.Банникова. Селекция молочнокислых бактерий и их применение в молочной промышленности, 1975). Штам первісне депоновано у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України і зареєстровано за номером ІМВВ-7179. Штам Streptococcus thermophilus 1MB В-7179 використовується у виробництві біологічно активних бактеріальних препаратів для молочних продуктів функціональної дії. Штам S. thermophilus 1MB В-7179 характеризується такими ознаками та властивостями. Культурально-морфологічні ознаки штаму. Грампозитивні коки, діаметром 0,5-0,6мкм, неру 91441 4 хомі, не утворюють спори, розташовані переважно у вигляді звивистих ланцюжків різної довжини. В агарі з гідролізованим молоком утворює колонії білого кольору діаметром 1,2-1,5мм у вигляді "човників", на поверхні середовища - краплеподібні білуваті блискучі колонії діаметром 1,0-1,5мм. В гідролізованому бульйоні та рідкому середовищі МРС росте з утворенням рівномірної каламуті та дрібнодисперсного осаду на дні пробірки: за лужних умов рН 9,6од. розвиток не помічено. Фізіолого-біохімічні властивості штаму. Штам є факультативним анаеробом. Оптимальна температура росту 37°С. Штам ферментує глюкозу, лактозу, галактозу, сахарозу, не ферментує маніт, сорбіт, рамнозу, ксилозу, гліцерин. Штам відновлює лакмусове молоко, не утворює аміаку з аргініну. При внесенні 3% культури в молоко за температури 37°С молокозгортаюча активність штаму становить 4,5год. Основний продукт бродіння молочна кислота. Біотехнологічні властивості штаму подані у таблиці 1. Штам на відміну від штаму-прототипу, характеризується більшою стійкістю до високих концентрацій жовчі до 40%. Позитивною властивістю порівняно з прототипом є його здатність знижувати рівень холестерину під час ферментації молока кількість зв'язаного холестерину становить більше 30% від початкового вмісту. Крім того, штам є високоадгезивним, індекс адгезивності ІА=11,2±1,4, що у 1,5 рази вище порівняно з прототипом. Штам, що заявляється, характеризується помірним рівнем енергії кислотоутворення, гранична кислотність становить 100°Т. Штам за розвитку у знежиреному молоці утворює щільний в'язкий згусток з ефективною в'язкістю в 1,9 рази більшою ніж штам-прототип. Реологічні властивості визначали за допомогою приладу Реотест 2. Останнім часом збільшилася кількість випадків вад ферментацій, спричинених фагами, активними до штамів S. Thermophilus, які є головними компонентами заквасок для йогуртів, сметани, кисломолочних напоїв та багатьох сичужних сирів. Тому встановлення фагочутливості є обов'язковим етапом при доборі культур. Штам, що заявляється, характеризується стійкістю до фагів, активних щодо S. thermophilus. Антагоністична активність штаму - таблиця 2. Штам, що заявляється, характеризується більшою інтенсивністю антагоністичної дії щодо патогенних та умовно-патогенних тест-культур родів Proteus, Escherichia, Staphylococcus, Enterobacteria та Pseudomonas порівняно з прототипом. Зони затримки росту становлять від 12 до 18мм. Крім того штам відрізняється від прототипу здатністю до стримування росту спороутворювальних бактерій виду Bacillus subtilis, що є частим представником сторонньої мікрофлори молочних продуктів. Означені властивості штаму, що заявляється, а саме: високі показники холестеразної і антагоністичної активності, здатність до адгезії, стійкість до агресивих сполук шлунково-кишкового тракту забезпечать успішний транзит штаму через травну систему, закріплення в кишечнику та протидію його небажаній мікрофлорі, корегування ліпідного 5 обміну макроорганізму, санітарний рівень продукту в процесі його виробництва та зберігання тощо. Структурно-механічні характеристики молока, ферментованого штамом S. thermophilus 1MB В7179 показано на кресленні (Рис.). Руйнування молочного згустку, що утворює штам, відбувається за високих значень показників швидкості деформації та напруження зсуву. Отримані значення індекса текучості (n=0,3), дозволили класифікувати молочні згустки S. thermophilus 1MB В-7179, як псевдопластичні системи. Аналіз реологічних властивостей за темпом руйнування структури (m=0,8) свідчать, що штам S. thermophilus 1MB В7179 є перспективним з точки зору покращення консистенції молочних згустків. Сукупність зазначених пробіотичних та технологічних властивостей штаму забезпечить високу якість та функціональну активність молочного продукту з його використанням. Приклад 1. Одержання лабораторної закваски 5'. thermophilus 1MB В-7179. В 100см3 стерилізованого молока з температурою (37±1)°С вносять 1% свіжої чистої культури S. thermophilus 1MB В-7179 і термостатують за вказаної температури до утворення згустку, після чого охолоджують і використовують для приготування пересадкової лабораторної або виробничої закваски. Для цього в стерилізоване молоко з температурою (37±1)°С вносять 3% первинної лабораторної закваски і витримують за вказаної температури до утворення згустку упродовж 4-5 годин. Кількість життєздатних клітин S. thermophilus 1MB В-7179 у заквасці складає 1,0 108 КУО/см3. Приклад 2. Виробництво бактеріального концентрату з використанням S. thermophilus 1MB В-7179. Готують ростове середовище. Для цього у 100дм3 водопровідної води з температурою 45°С розчиняють 3,0кг сухого знежиреного молока та встановлюють рН 6,6. Одержане молоко підігрівають до температури 55°С та вносять 50г протосубтіліну ГЗХ активністю 70од./г. Гідроліз молока проводять за температури 55°С упродовж 3 годин. У гідролізоване молоко додають компоненти у таких кількостях: сухе знежирене молоко - 1000г, лактоза -1000г, глюкоза -500г, дріжджовий екстракт - 500г, натрій лимоннокислий тризаміщений - 500г, натрій оцтовокислий однозаміщений - 300г, магній сірчанокислий - 20г. Одержане ростове середовище стерилізують за температури 121°С упродовж 25 хвилин та охолоджують до температури 37°С. Активну кислотність ростового середовища встановлюють на рівні 6,6од. рН і вносять 5,0дм3 закваски S. thermophilus 1MB В-7179. Культивування проводять упродовж 10 годин за температури 37°С з періодичним перемішуванням та контролем активної кислотності ростового середовища на рівні 6,6од. рН, застосовуючи 25%-ний водний розчин аміаку. Після закінчення культивування ростове середовище охолоджують до температури 10°С та відокремлюють біомасу. Одержану біомасу змі 91441 6 шують у співвідношенні 1:2 із захисним середовищем такого складу (в г/дм3): тризаміщений лимоннокислий натрій -50, сахароза -100, вода - до 1дм3. Суспензію клітин у захисному середовищі розливають у стерильні кювети шаром 1см, заморожують у морозильній шафі за температури мінус 40°С упродовж 16-18 годин, після чого сушать у сублімаційній сушарці протягом 18-20 годин за таких режимів: початок сушіння за температури мінус 25°С, закінчення - за температури плюс 30°С. Чисельність життєздатних клітин молочнокислих бактерій у 1г сухого бактеріального концентрату становить 1,0 1010 КУО. Бактеріальний концентрат швидко реактивується без додаткової стадії активізації. Стабільність властивостей концентрату зберігається тривалий час та визначається температурою зберігання - 6 місяців за 6-8°С і 12 місяців за мінус 18°С. Бактеріальний концентрат використовують у виробництві молочних продуктів функціональної дії. Приклад 3. Приготування функціонального молочного продукту з використанням штаму S. thermophilus 1MB В-7179. Молоко із вмістом жиру 2,5%, пастеризують за температури 86°С із витримкою 20 хвилин, охолоджують до температури заквашування 37°С та вносять бактеріальний концентрат штаму S. thermophilus 1MB В-7179 в кількості 1г/т та бактеріальний концентрат молочнокислих бактерій L. casei в кількості 4г/т. Сквашують протягом 6-7 годин. Титрована кислотність готового продукту - 70°Т, активна - 4,6од. рН. Кількість життєздатних клітин S. thermophilus в продукті - 1,0 108 КУО/см3, загальна чисельність молочнокислих бактерій в грамі продукту складає 1,0-109 клітин. Рівень холестерину у кисломолочному продукті на 42% знижено у порівнянні з вихідним молоком. Продукт проявляє антагоністичну активність по відношенню до бактерій групи кишкових паличок зона затримки росту Escherichia coli 113 (20±1)мм, Proteus vulgaris 2029 - (14±2)мм, Staphilococcus aureus 209 - (15±2)мм, Enterococcus cloaceae - (18±3)мм, Bacillus subtilis - (16±1)мм. Продукт має чистий кисломолочний смак, щільну, в'язку консистенцію, яка не псується в процесі зберігання. Активна кислотність протягом 14 діб знижується усього на 0,2од. рН. Штам Streptococcus thermophilus 1MB В-7179 характеризується низкою пробіотичних властивостей: стійкістю до продуктів метаболізму травної системи людини, здатністю до адгезії, має виражену антагоністичну дію по відношенню до широкого кола патогенних та умовно патогенних мікроорганізмів, високу холестеразну активність. Штам є високотехнологічним: фагостійкий, має помірну енергію кислотоутворення в молоці, утворює згустки з високою в'язкістю. Штам проявляє високу біотехнологічну активність, що дає змогу одержувати молочні продукти функціональної дії. 7 91441 8 Таблиця 1 Характеристика біотехнологічних властивостей штамів S.thermophilus Показник Розвиток в присутності: 40% жовчі 30% жовчі 6,5% NaCl 0,5% фенолу Зниження рівня холестерину в молоці, мкг/мл % Індекс адгезивності, (ІА) Гранична кислотність у молоці,°Т Ефективна в'язкість молочного згустку за температури 20°С, мПа*с Фагостійкість S. thermophilus (що заявляється) + + + + 60,1 35,4 11,2±1,4 100±5 74,4±0,3 + S. thermophilus (прототип) + + + 7,2±0,1 110±5 40,2±0,4 нд Примітка: * нд - дані відсутні Таблиця 2 Антагоністична активність штамів S.thermophilus щодо тест-культур патогенних та умовно патогенних бактерій Тест-культури Escherichia coli 111 Escherichia coli 113 Proteus vulgaris 2029 Staphilococcus aureus 209 Ps. aeruginosa 9027 Proteus morganii Proteus rectgeri Enterobacteria cloacae 186 Bacillus subtilis Величина зон затримки росту тест-культури, мм S.thermophilus (що заявляється) S.thermophilus (прототип) 17 12 18 14 15 15 16 10 13 10 15 11 13 10 12 7 15 Примітка: метод лунок, розмір зони відсутності росту тест-культури в мм, похибка середнього арифметичного 5%, р