Штам lactobacillus plantarum як антагоніст маслянокислого бродіння в твердих сичужних сирах

Реферат: Штам бактерій Lactobacillus plantarum IMB В-7371 як антагоніст маслянокислого бродіння в твердих сичужних сирах. Винахід належить до біотехнології та є штамом лактобацил, що використовуються у виробництві захисних культур для твердих сичужних сирів. Штам Lactobacillus plantarum IMB В-7371 має виражену антагоністичну дію відношенню до Clostridium tyrobutyricum та інших патогенних та умовно патогенних мікроорганізмів, помірну енергію кислоутворення в молоці і добрий синерезис молочного згустка, технологічно стійкий. UA 102803 C2 (12) UA 102803 C2 UA 102803 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до біотехнології та є штамом лактобацил, що використовують у виробництві бактеріальних препаратів для твердих сичужних сирів. Сучасний стан молока-сировини характеризується високим ступенем забруднення сторонньою мікрофлорою, яка негативно впливає на перебіг технологічних етапів виробництва сирів, якість готової продукції, її безпеку та призводить до відчутних матеріальних втрат. У виробництві сирів, особливо взимку та навесні, чинниками сторонньої мікрофлори є спороутворювальні бактерії роду Clostridium ssp. Ці мікроорганізми є збудниками маслянокислого бродіння у сирній масі - анаеробного окислення органічних речовин з утворенням кінцевого продукту масляної кислоти, яка надає сиру прогірклого присмаку. Водночас утворюється значна кількість газів - діоксид вуглецю, молекулярний водень, аміак, які спричиняють так звану ваду "пізнє спучування", і як наслідок розрив головки сиру. Також серед представників цього виду є патогенні та токсинпродукуючі штами, що є істотним ризиком для здоров'я споживача. Для запобігання розвитку маслянокислих бактерій застосовують певні хімічні речовини та антибіотики, які негативно впливають на визрівання сиру і є шкідливими для організму споживача. На противагу цим засобам можна застосовувати біологічний спосіб боротьби з цими контамінантами. Деякі молочнокислі бактерії здатні до продукування ефективних високоспецифічних антибактеріальних сполук так званих біоцинів. Мезофільні молочнокислі палички часто залучають до складу заквасок багатьох сирів. Вони беруть участь у перетворенні основних складових компонентів сирної маси - лактози, білків та жиру, на сполуки, що впливають на формування органолептичних показників продукту. Лактобацили мають виражену антагоністичну активність відносно широкого кола аеробних та факультативно-анаеробних грампозитивних і грамнегативних бактерій, що поліпшує показники безпеки продукту. Найбільш вираженою є ця активність у лактобацил видів L. plantarum, L. acidophilus, L. casei, L. fermentii. Штами, які залучають до складу заквашувальних культур для виробництва сирів, поряд з вираженою антагоністичною та протеолітичною активністю, повинні мати певний технологічний потенціал: помірний рівень кислотоутворення, добрий синерезис молочного згустка, стійкість до режимів теплової обробки сирного зерна, високої концентрації кухонної солі, загрози враження бактеріофагами та сторонньої мікрофлори. Водночас, штами повинні добре розвиватись у виробничому середовищі, бути стійкими до певних технологічних операцій, наприклад, центрифугування, сушіння, заморожування тощо. Існує штам Lactobacillus plantarum. Цей штам вирізняється високим рівнем антагонізму до маслянокислих бактерій, проте він не забезпечує потрібний рівень кислото- та ароматоутворювання, як в процесі виробництва, так і в процесі визрівання сирної маси [http://www.aibi-ssnab.ru/catalog/milk/index/view/id/28/]. Найближчим до штаму, що заявляється, є штам L. acidophilus В-7174, що використовують у виробництві заквашувальних культур для твердих сичужних сирів [Патент № 91417 Україна, C12N 1/20, А23С 19/032, 2006.] Цей штам характеризується високою антагоністичною активністю щодо патогенних та умовно патогенних мікроорганізмів, таких як Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Proteus rettgeri, Enterobacter, але має слабко виражену антагоністичну дію щодо Сl. tyrobutyricum. Штам L. acidophilus характеризується високою протеолітичною активністю, утворенням щільного згустка, термостійкістю та полірезистентністю до бактеріофагів. Однак даний штам є стійким лише до 4,0 % NaCl, що робить його непридатним у виробництві розсільних сирів та сирів з частковим солінням у зерні. Задачею винаходу є одержання власного штаму Lactobacillus plantarum, як антагоніста маслянокислого бродіння в твердих сичужних сирах. Штам бактерій L. plantarum був одержаний в результаті спрямованої селекції культури, виділеної з розсолу квашеної капусти. Ідентифіковано як вид Lactobacillus plantarum за основними морфологічними, культуральними і фізіолого-біохімічними властивостями [Краткий определитель Берги, 1982; Банникова Л.А… Селекция молочнокислых бактерий и их применение в молочной промышленности, 1975]. Штам задепоновано в депозитарії Національної колекції промислових мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАНУ (IMB НАНУ) і зареєстровано під номером IMB В-7371. Штам бактерій L. plantarum IMB В-7371 використовується, як антагоніст маслянокислого бродіння в твердих сичужних сирах. Штам L. plantarum IMB В-7371 характеризується такими ознаками та властивостями. Культурально-морфологічні ознаки штаму. Клітини штаму грампозитивні, нерухомі палички шириною (0,3-0,4) мкм, різної довжини від 0,6 мкм до 1,0 мкм, прямі або вигнуті, не утворюють спор і капсул, розміщуються у вигляді окремих клітин, або утворюють короткі чи довгі ланцюжки. 1 UA 102803 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 На поверхні агаризованих середовищ утворюють круглі, гладенькі колонії білого кольору (1,02,0) мм у діаметрі. Глибинні колонії у вигляді "човників" або дисків. У рідкому середовищі MannRogosa-Sharpe-(МРС) утворюють однорідну каламуть та дрібнодисперсний осад. Фізіолого-біохімічні властивості штаму. Штам є аеротолерантним анаеробом. Оптимальна температура росту (33±1)°С, мінімальна (15±1)°С, максимальна (45±1)°С. Штам росте в гідролізованому молоці у присутності 20 % жовчі, 6,5 % NaCl, а також у м'ясопептонному бульйоні з активною кислотністю від 4,0 од. рН та 9,6 од. рН. Не росте в гідролізованому молоці з рН 3,0. Ферментує глюкозу, лактозу, галактозу, фруктозу, рамнозу, маніт, маннозу, сорбіт, рибозу, цукрозу, трезалозу. Не ферментує ксилозу, арабінозу, мелібіозу, інозит, гліцерин, рафінозу, декстрин. Не утворює каталазу, аміаку з аргініну, нітрит з нітрату, газу з глюкози та цитрату. При внесенні 5 % культури L. plantarum в стерильне знежирене молоко за температури (30±1)°С молокозсідальна активність становить (22±1) год., межа кислотоутворення 185°Т. 8 3 Нагромадження клітин у молоці складає (3,0-5,0)·10 КУО/см . За росту у молоці продукує 3 (18,0±0,1) мг/100 см молочної кислоти. Штам здатний активно розвиватися у рідких поживних середовищах різних за складом, які використовуються для промислового культивування лактобактерій. Технологічні властивості штаму. L. plantarum утворює в молоці однорідний щільний, помірно в'язкий згусток з добрим синерезисом 37 % та помірним рівнем граничної кислотності 185°Т, табл. 1. Через 3 години ферментування титрована кислотність молочної суміші не перевищує 30 °C. Такий темп кислотоутворення, властивий штаму L. plantarum, сприяє поступовому підкисленню сирної маси до нормованих значень, уникаючи надмірного нагромадження кислоти та необхідності внесення додаткової кількості води для промивання сирного зерна. Штам, що заявляється, на відміну від штаму L. acidophilus В-7174, забезпечує утворення молочного згустка з невисокою кінематичною в'язкістю та повнішою коагуляцією білку, за рахунок чого вміст білкових сполук у сироватці нижчий. Такі показники гарантують формування сирного зерна з інтенсивним виділенням сироватки та мінімізують втрати сухих речовин за рахунок утворення сирного пилу. Позитивною властивістю штаму є його стійкість до високих концентрацій NaCl6,5 %, завдяки чому штам L. plantarum можна залучати до складу заквашувальної мікрофлори сирів з частковим солінням у зерні та розсільних сирів. Високий ступінь виживання бактеріальних клітин L. plantarum під час заморожування та сублімаційного сушіння - 89-92 % - дає змогу одержувати високоактивний сухий бактеріальний концентрат та препарат прямого внесення. Антагоністична активність штаму - табл. 2. Антагоністичну активність визначали методом "лунок". Штам характеризується високою антагоністичною активністю щодо Сl. tyrobutyricum, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Enterobacter sp., Proteus vulgaris, Proteus rettgeri. Найефективнішим штам L. plantarum був до Сl. tyrobutyricum, розмір зони затримки росту складає 22-24 мм у діаметрі. Біохімічні властивості штаму. Штам L. plantarum характеризувався помірною протеолітичною активністю. Протеолітичну активність оцінювали за вмістом низькомолекулярних продуктів розщеплення білків молока після 24-годинної інкубації за температури (30±1)°С. Приклад 1. Одержання лабораторної закваски L. plantarum. 3 В 100 см стерилізованого молока з температурою (30±1)°С вносять 1 % свіжої чистої культури L. plantarum і термостатують за вказаної температури до утворення згустка, після чого охолоджують і використовують для приготування пересадкової лабораторної або виробничої закваски. Для цього в стерилізоване молоко з температурою (30±1)°С вносять 3 % первинної лабораторної закваски і витримують за вказаної температури до утворення згустку протягом 148 3 16 год. Кількість життєздатних клітин L. plantarum у заквасці складає 5·10 КУО/см . Приклад 2. Виробництво бактеріального концентрату L. plantarum IMB В-7371. 3 Приготування ростового середовища. У 100 дм водопровідної води з температурою 45° С розчиняють 3,0 кг сухого знежиреного молока та встановлюють рН 6,7. Одержане молоко підігрівають до температури 55 °C та вносять 50 г протосубтиліну ГЗХ активністю 70 од./г. Гідроліз молока проводять за температури 55 °C протягом 3 годин. У гідролізоване молоко додають компоненти у таких кількостях: сухе знежирене молоко - 1000 г, лактоза - 1000 г, глюкоза - 500 г, дріжджовий екстракт - 500 г, натрій лимоннокислий тризаміщений - 500 г, натрій оцтовокислий однозаміщений - 300 г, аскорбінова кислота - 40 г, магній сірчанокислий - 20 г. Ростове середовище стерилізують за температури 121 °C упродовж 25 хв та охолоджують до температури 30 °C. Активну кислотність ростового середовища встановлюють на рівні 6,7 од. 3 рН і вносять 5,0 дм закваски L. plantarum. Утворену суміш культивують протягом 16 годин за температури 30 °C з періодичним перемішуванням та контролем активної кислотності ростового середовища на рівні 6,7 од. рН, застосовуючи 25 %-ний водний розчин аміаку. Після закінчення 2 UA 102803 C2 5 10 15 культивування суміш охолоджують до температури 10 °C та відокремлюють біомасу. Одержану 3 біомасу змішують у співвідношенні 1:2 із захисним середовищем такого складу (в г/дм ): 3 тризаміщений лимоннокислий натрій - 50, сахароза - 100, вода - до 1 дм . Суспензію, біомасу у захисному середовищі, розливають у стерильні кювети шаром 1 см, заморожують у морозильній шафі за температури мінус 40 °C упродовж 6 год., після чого сушать у сублімаційній сушарці протягом 30 год. за таких режимів: початок сушіння за температури мінус 25 °C, закінчення - за температури плюс 30 °C. Чисельність життєздатних 10 клітин молочнокислих бактерій у 1 г сухого бактеріального концентрату становить 5,0·10 КУО. Бактеріальний концентрат використовують як антагоніст маслянокислого бродіння у виробництві твердих сичужних сирів. Завдяки високим антагоністичним властивостям та солестійкості, штам рекомендується використовувати для виробництва заквашувальних культур та сухих бактеріальних препаратів для твердих сичужних та розсільних сирів, а також сирів з частковим солінням у зерні. Застосування штаму L. plantarum дозволить уникнути забруднення сиру Сl. tyrobutyricum та іншою сторонньою мікрофлорою та дасть змогу отримати високоякісний продукт. Таблиця 1 Технологічні властивості штамів Показник L. plantarum B-7371 Гранична кислотність у молоці,°Т Титрівна кислотність у молоці через 3 години ферментування,°Т Синерезис молочного згустка, % Кінетична в'язкість молочного згустка за температури 20 °C, Па·с 3 Вміст білкових сполук у сироватці, мг/см Солестійкість (розвиток у присутності NaCl): 4,5 % 5,0 % 6,5 % Термостійкість упродовж 60 хвилин: за температури 50 °C за температури 60 °C Фагостійкість Ступінь виживання під час ліофілізації, % 185 L. acidophilus B-7174 (прототип) 240 30 25 37 25 -3 -3 3,04·10 8,0·10 2,1 2,7 + + + + + + + 89-92 + + 73 Таблиця 2 Антагоністична активність штамів Тест-культури Clostridium tyrobutyricum Escherichia coli Staphilococcus aureus Bacillus subtilis Enterobacter sp. Proteus vulgaris Proteus rettgeri Величина зон затримки росту тест-культури, мм L. acidophilus В-7174 L. plantarum В-7371 (прототип) 22-24 11-12 18-20 23-26 16-18 16-18 19-20 20-22 12-13 12-14 16-18 16-18 12-14 13-15 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 20 Штам бактерій Lactobacillus plantarum IMB В-7371, що використовується як захисна культураантагоніст маслянокислого бродіння у виробництві твердих сичужних сирів. 3 UA 102803 C2 Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4