Спосіб одержання з глютену фракцій, збагачених гліадином та глютеніном, у водному середовищі та у присутності кислоти

1. Спосіб одержання з глютену фракцій, збагачених гліадином та глютеніном, у водному середовищі та у присутності кислоти, який відрізняється тим, що глютен диспергують у воді до досягнення вмісту сухої речовини від 5 до 30 %, при цьому рН дисперсії підтримують на рівні від 4,4 до 4,8, отриману суміш глютен-вода піддають зсувній дії на змішувальному засобі з інтенсивним зсувом, завдяки чому дисперсію фракціонують та одержують одну фракцію, збагачену гліадином, зі співвідношенням гліадин / глютенін принаймні 2,5 та одну фракцію, збагачену глютеніном, зі співвідношенням гліадин / глютенін, меншим ніж 0,8. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що суміш глютен-вода піддають зсувній дії таким чином, що об'єм осаду, утвореного з дисперсії глютену після фракціонування, визначений шляхом "спінтесту", становить від 15 до 35 %. C2 2 (19) 1 3 76480 4 спиртові суміші та розчини оцтової кислоти випролин. Співвідношення водного розчинника з глютебували в лабораторних масштабах на їхню здатном становить від 7:1 до 16:1 (об'єм/маса). ність до відокремлення білкових фракцій. Збагачену розчинним гліадином фракцію відоУ заявці ЕР 685164 описано спосіб екстрагукремлювали за допомогою горизонтальної деканвання, при якому застосовують водний розчин туючої центрифуги Westfalia і залишок після цього етанолу, який має концентрацію від 30 до 70% за знову змішували з водою або розведеною кислооб'ємом, водний розчин ізопропілового спирту або тою й піддавали другому етапові центрифугуванn-пропанолу, який має концентрацію від 10 до 20% ня. В результаті одержували нерозчинну збагачеза об'ємом, або водний розчин ацетону, який має ну глютеніном фракцію та проміжну фракцію. концентрацію від 20 до 50% за об'ємом, для одерЗагальні характеристики проміжної фракції були жання фракції, яка має концентрацію гліадину 80% наближені до характеристик глютену пшениці. або вище. Екстрагування здійснюють за допомоЦей процес, хоча він і забезпечує збагачену гою кислого водного розчину етанолу, який має гліадином фракцію, є менш привабливим, оскільки концентрацію від 5 до 30% за об'ємом і рН від 3,5 проміжну фракцію одержують як побічний продукт. до 5,5, для одержання фракції гліадину, що має Цей побічний продукт вважають значним недоліконцентрацію 50% або вище. До кислот, які можуть ком з огляду на вихідну кількість. використовуватися, належать оцтова, лимонна, Крім того, система обробки є досить складною яблучна, молочна, адипінова, фумарова, винна, і вимагає спрощення, бажано без втрати функціоглюконова, фосфорна та фітинова кислоти. нальних властивостей фракціонованого матеріалу. Оскільки застосування займистих розчинників Крім ускладненого характеру процесу Bérot, вимагає певних додаткових заходів безпеки, перетакож спостерігали, що проміжна фракція не може вагу віддають процесові, що не вимагає таких розбути піддана повторній обробці через зворотне чинників. С. de Meester у роботі "Industries змішування зі свіжим глютеном. Дійсно, спостеріAlimentaires et Agricoles" (1974) описує такий прогали, що рециркуляція цього проміжного продукту цес, згідно з яким застосовують 0,01-0,1Μ розчини в результаті призводила до зниження чистоти та оцтової кислоти для екстрагування білків з вітальякості фракцій. ного глютену пшениці. Після періоду екстрагуванМета винаходу полягає в забезпеченні спосоня, що триває від 1 до 8 годин, кінцевий вихід стабу приготування гліадин- та глютенін-збагачених новить 20-55%. Розчинну фракцію, збагачену фракцій з глютену у водному середовищі й у пригліадином, видобували шляхом осадження при сутності кислоти, який не має вищезгаданих недонейтральному рівні рН. Оскільки несолюбілізовані ліків. гліадини є дуже клейкими, така технологія є не Цієї мети досягають шляхом забезпечення дуже прийнятною для промислового застосування, способу приготування гліадин- та глютенінй етапу осадження білка у процесі видобування збагачених фракцій з глютену у водному середослід уникати. Цей спосіб було розроблено в лабовищі й у присутності кислоти, але при цьому глюраторних масштабах, але він є непридатним для тен диспергують безперервно або не в воді до промислових масштабів. вмісту сухої речовини від 5 до 30%, причому Інший процес без застосування розчинника - рН дисперсії підтримують на рівні від 4,4 до описано у WO 9710260. У цій заявці описано спо4,8, і сіб фракціонування глютену пшениці. Згідно з цим - глютено-водну суміш піддають зсувній дії, способом, глютен пшениці спочатку диспергують у через яку дисперсія, безперервно або переривчасводному кислому середовищі при першому кислото, може бути фракціонована на гліадин- та глюму рівні рН у присутності відновника для відновтенін-збагачені фракції, завдяки чому одержують лення дисульфідних зв'язків у глютені. Потім рН єдину збагачену гліадином фракцію зі співвіднодисперсії підвищують до другого рівня, який перешенням гліадину/глютеніну принаймні 2,5 та єдину вищує вищезгаданий перший рівень рН, змушуючи збагачену глютеніном фракцію зі співвідношенням глютенін осідати, водночас залишаючи гліадин гліадину/глютеніну менше 0,8. завислим у дисперсії, і, нарешті, глютенін та гліаВ оптимальному способі згідно з винаходом дин розділяють на відповідні фракції. глютено-водну суміш піддають зсувній дії таким ЕР 992193 стосується способу водного екстрачином, що об'єм осаду глютенової дисперсії після гування, при якому використовують водний розфракціонування, визначений шляхом "спін-тесту", чин, рівень рН якого є меншим або дорівнює 4,5, і становить від 15 до 35%. який включає від 0,1 до 10% (маса/об'єм) принайВ оптимальному варіанті у способі згідно з вимні однієї органічної кислоти. До кислот, які для находом вищезгаданий об'єм осаду становить від цього вибирають, належать: лимонна, молочна, 20 до 30%. яблучна, оцтова кислоти, а також фосфорна кисВ іншому оптимальному способі згідно з виналота та їхні солі. У цій заявці не повідомляється ходом вищезгаданий осад включає від 48 до 58% інших деталей щодо способу здійснення такого сухої речовини, присутньої у глютеновій дисперсії. водного екстрагування. У ще кращому варіанті у способі згідно з вина[Bérot et al. у "Intern. Journal of Food Science & ходом вищезгаданий осад включає від 50 до 55% Technology" (1994), p.489-502] описали процес сухої речовини, присутньої у глютеновій дисперсії. фракціонування глютену з застосуванням водних У ще одному оптимальному способі згідно з розчинів кислот. Згідно з цією публікацією глютен винаходом рН дисперсії підтримують на рівні від пшениці та розчин розведеної кислоти змішують у 4,5 до 4,7. міксері з інтенсивним зсувом протягом двох хвиВ оптимальному варіанті у способі згідно з вилин і безперервно перемішують протягом 30 хвинаходом глютен диспергують шляхом змішування 5 76480 6 глютену з водою, застосовуючи змішувальні засоаналітичним методом. би протягом періоду, меншого за 60 хвилин, зі У цьому методі використовують різні характешвидкістю від 500 до 3000об./хв. ристики розчинності різних класів білків пшениці в У ще кращому варіанті у способі згідно з винарізних розчинниках для відокремлення гліадинів, ходом змішування здійснюють протягом періоду, глютенінів, альбумінів та глобулінів. Розподіл білка меншого за 30 хвилин. в різних розчинниках кількісно визначають за доВ оптимальному способі згідно з винаходом помогою аналітичного обладнання К'єльдаля. Обфракціонування дисперсії здійснюють за допомоладнання: гою засобу центрифугування, наприклад, за допо- поліпропіленові пробірки для центрифугумогою центрифуги з автоматичними самознешлавання по 40мл млювальними центрифугами або за допомогою - центрифуга (здатна обертатися при 15000г) декантуючих центрифуг. - аналітичні терези В іншому оптимальному способі згідно з вина- 0,5Μ NaCI ходом суха речовина дисперсії становить від 10 до - 1,5% розчин SDS 15%. - 95% етанол У ще одному оптимальному способі згідно з - інкубаційна камера при 10°С винаходом як кислоту використовують фосфорну - пристрій К'єльдаля кислоту. - таблетки К'єльдаля Далі винахід описується детальніше. Мета Спосіб (як показано на Фігурі 2): цього детального опису полягає в забезпеченні Екстрагування в усіх випадках здійснювали кращого розуміння винаходу та зазначенні інших протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. переваг та деталей цього винаходу. Крім того, да- Зразок зважують у поліпропіленовій пробірці ються пояснювальні приклади. Цей детальний для центрифугування ±40мл. Для борошна 2г, для опис та пояснювальні приклади не повинні тлумаглютену 200мг, для технологічних зразків кількість, читись як такі, що обмежують сферу застосування що відповідає ±150-160мг білка. винаходу або патентні права, зазначені у формулі. - Додають 20мл 0,5Μ NaCI. Перемішують проУ цьому детальному описі робиться посилання тягом 30 хвилин при кімнатній температурі (RT). на фігури, з яких: Після екстрагування центрифугують при 500г про- Фігура 1 є схематичним зображенням типовотягом 15 хвилин при RT. Обережно зливають суго процесу фракціонування згідно з винаходом; пернатант у чисту поліпропіленову пробірку. До - Фігура 2 є блок-схемою процедури екстрагузалишку (осад А) додають ще 20мл 0,5Μ NaCI і вання для відокремлення гліадинів, глютенінів, повторюють екстрагування та центрифугування. альбумінів та глобулінів. Цей другий супернатант комбінують з першим, а Підкислення здійснюють за допомогою органіпотім центрифугують при 15000г протягом 15 хвичної або неорганічної кислоти. Типовими кислоталин при RT. Супернатант містить альбуміни та ми, які можуть бути застосовані, крім інших, наприглобуліни. клад, є оцтова кислота, лимонна кислота, молочна - До залишку (осад В) додають 6мл розчину кислота, бурштинова кислота, яблучна кислота, 1,5% SDS. Суміш гомогенізують і комбінують з винна кислота, фумарова кислота, соляна кислоосадом А. Екстрагування здійснюють протягом 30 та, сірчана кислота та фосфорна кислота. В оптихвилин при RT. Потім по краплях додають 14мл мальному варіанті використовують фосфорну кисабсолютного етанолу і суміш перемішують ще 30 лоту. В оптимальному варіанті підтримують рівень хвилин при RT. Після центрифугування при RT рН дисперсії від 4,5 до 4,7, у ще кращому варіанті протягом 15 хвилин при 500г одержують осад та приблизно 4,6. супернатант 3. Цю процедуру повністю повторюКонцентрація глютену в дисперсії становить ють з одержаним осадом, одержуючи осад С та від 5-30% (маса/об'єм), причому перевагу віддасупернатант 4. ють концентрації від 10 до 15% (маса/об'єм). Глю- Супернатанти 3 та 4 комбінують у невеликій тен пшениці диспергують шляхом змішування глюхімічній склянці і тримають в інкубаційній камері тену з водою, застосовуючи, наприклад, лопаті при 10°С протягом 60 хвилин. Утворюється дрібмішалки з ножами або іншої конфігурації, які обернозернистий осад, і цю суміш після цього виливатаються зі швидкістю 500-3000об./хв. протягом ють у пробірку для центрифугування, що містить часу, достатнього для одержання дисперсії, яка осад С. Суміш відразу переносять у центрифугу і може бути розділена на фракції згідно з винахообертають при 15000г протягом 15 хвилин при дом. Як правило, час змішування не перевищує 1 10°С. Таким чином одержують супернатант, що години, в оптимальному варіанті - становить менмістить гліадини, та осад, що містить глютеніни. ше 30 хвилин. Визначення методом К'єльдаля: Умови механічної подачі та змішування повинРозчини, які містять альбуміни/глобуліни та ні вибиратися таким чином, щоб одержана диспегліадини (±40мл), за кількістю переносять у дерсія могла бути розділена на збагачену гліадином струкційні колби (750мл). Додають таблетку, 14мл, фракцію, в якій співвідношення гліадину/глютеніну концентрованої сірчаної кислоти та 3 краплі октастановить принаймні 2,5, та збагачену глютеніном нолу (протиспінювач) і зразки (приблизно 15мл) фракцію, в якій співвідношення гліадину/глютеніну переносять до пробірки К'єльдаля і вміст азоту є меншим за 0,8. У стандартній глютеновій комповизначають стандартним методом К'єльдаля. зиції співвідношення гліадину/глютеніну може бути Глютенінову фракцію піддають ліофілізації і різним і становить, як правило, від 1 до 1,3. Ці різні вміст азоту визначають як у сухих продуктах. класи білків пшениці визначають описаним нижче Результати вказують як кількість білка, вияв 7 76480 8 лену в різних класах, і виражають у відсотках вифракцію. Збагачену гліадином фракцію перед видобутого білка. сушуванням концентрують шляхом концентруванСпостерігалося, що вищезгадані гліадин- та ня ультрафільтрацією. Збагачену гліадином фракглютенін-збагачені фракції можуть бути одержані цію після цього висушують, застосовуючи будьпісля центрифугування, коли подача механічної який відомий спосіб, причому перевагу віддають енергії в результаті забезпечує дисперсії, які вияврозпилювальному висушуванню. Рідина, яка ляють значення питомого об'єму осаду, визначені пройшла крізь мембрану, може бути рециркульошляхом "спін-тесту". вана й використана на етапі змішування. ЗбагачеДля цього "спін-тесту" застосовують стандартну глютеніном фракцію також висушують. ну лабораторну центрифугу та пробірки для Приклади: центрифугування по 15мл з поділками на шкалі по - Приклад 1: 0,1мл. Пробірки після цього заповнюють 10мл Приготування партії: глютенової дисперсії. Пробірки центрифугують Як вихідний матеріал використовують сухий протягом 10 хвилин при 1800г. Об'єм осаду, вираглютен пшениці серійного виробництва. У посудижений у %, після цього визначають за співвіднону, що містить 225л водопровідної води та 450г шенням осаду у мл та об'єму пробірок для фосфорної кислоти (75%), додають 25кг глютену центрифугування у мл, помноженим на 100. пшениці серійного виробництва за допомогою Відповідні дисперсії після цього характеризушнека (Katrion) через трубку безпосередньо у виють за об'ємом осаду, який може становити від 15 хор перемішуваного диспергатора. Рівень рН посдо 35%, в оптимальному варіанті - від 20 до 30%. тійно контролюють, застосовуючи pH-stat, і підтОсад, таким чином, включає від 48 до 58 %, у ще римують на рівні рН=4,6. Глютен диспергують кращому варіанті - від 50 до 55% сухої речовини, протягом періоду 10 хвилин і змішування продовприсутньої у глютеновій дисперсії. Суха речовина жують, доки не утворюється дисперсія, яка містить дисперсій може складати від 5 до 30% сухої речовід 45 до 50% матеріалу в дисперсній фазі. Це вини, в оптимальному варіанті - від 10 до 15% сувідповідає значенню "спін-тесту" 27%. хої речовини. Якщо інтенсивність зсуву та/або час Змішування здійснюють за допомогою міксера змішування не врегульовано, то неможливо одерз інтенсивним зсувом. Одержану таким чином дисжати фракції, які відповідають вищевказаним знаперсію відокремлюють за допомогою декантуючої ченням. центрифуги (Westfalia CA150), за допомогою якої Відокремлення дисперсії здійснюють засобами регулювали параметри для одержання приблизно центрифугування, наприклад, за допомогою само45% сухої речовини в супернатанті декантатора. знешламлювальних центрифуг або за допомогою Збагачену гліадином фракцію потім піддавали декантуючих центрифуг. Центрифугувальне обларозпилювальному висушуванню. Ця фракція має днання застосовують за оптимальних умов відовміст білка 80%. Вміст гліадину становив 68% від кремлення. загального вмісту білка порівняно з 45-48% для Типовий процес фракціонування згідно з винаприродного глютену. Співвідношення гліадиходом зазвичай здійснюють при температурі від 10 ну/глютеніну становило 3,1. до 40°С. Згідно зі схемою, показаною на Фігурі 1, У Таблиці наведено порівняння складу між сухий глютен пшениці змішують з кислим розчизразками глютенових фракцій, одержаних за доном у змішувальному резервуарі, постійно контропомогою способу Bérot (які є зразками, отриманилюючи рН за допомогою pH-stat. Одержану таким ми від Popineau et Berot), та зразками, одержаничином глютенову дисперсію піддають відокремми способом згідно з винаходом. Усі зразки ленню центрифугуванням, завдяки якому одержупіддавали аналізові за допомогою вищезгаданого ють збагачену гліадином та збагачену глютеніном способу. Таблиця Склад зразків, одержаних способом згідно з Bérot та Amylum, визначений описаним вище способом (тест а). Значення виражені як % загальної білкової фракції у зразках альбумін/глобулін гліадин глютенін Співвідн. glia/glu глютен 11,0-13,3 45,3-48,7 37,0-47,4 1,08-1,28 глютен 11,0-13,3 45,3-48,7 37,0 - 45,4 1,08-1,28 АВе гліадин 10,4 67,7 21,9 3,1 Спосіб згідно з Bérot гліадин проміжна фр 10,5 7,2 59,1 39,1 30,4 53,7 1,94 0,73 Спосіб згідно з Amylum АВе глютенін 8,8 35,6 55,6 0,64 AFr гліадин 10,4 67,9 21,6 3,13 глютенін 6,1 31 62,9 0,49 AFr глютенін 6,9 35,3 57,7 0,61 9 76480 АВе: зразки, одержані з глютену пшениці, виробленому в Amylum Belgium AFr: зразки, одержані з глютену пшениці, виробленому в Amylum France - Приклад 2: Продовження приготування: У посудину, що містить 225л водопровідної води та 450г фосфорної кислоти (75 %), додають 25кг глютену пшениці серійного виробництва за допомогою шнека (Katrion) через трубку безпосередньо у вихор переміщуваного диспергатора. Рівень рН постійно контролюють, застосовуючи pH-stat, і підтримують на рівні рН=4,6. Глютен диспергують протягом періоду 10 хвилин і змішування продовжують, доки не утворюється дисперсія, яка має значення за "спін-тестом" 25%. Забезпечують необхідний зсув для досягнення такого значення протягом 20 хвилин після диспергування глютену. Потім безперервно додають воду та глютен у вихор перемішуваної дисперсії, при цьому постійно контролюючи й підтримуючи рН=4,6 шляхом додавання фосфорної кислоти. Швидкість дода 10 вання становить 20кг глютену і 200л води на годину. Водовипуск із посудини відводиться у 60літрову буферуючу посудину з перемішуванням, яку застосовують для безперервного завантаження декантатора (Westfalia CA150). Кількість, яку додають, відповідає кількості, яка обробляється через декантатор (швидкість подачі 20л/год.; 2500об./хв.; перепад 10-15). Одержана таким чином гліадинова фракція має вміст сухої речовини 6%, і її піддають подальшій обробці на етапі ультрафільтрації. Воду, що пройшла крізь мембрану, застосовують для диспергування глютену в першому перемішувальному резервуарі. Решту, що має вміст сухої речовини близько 10%, висушують шляхом розпилювального висушування. Збагачену глютеніном фракцію нейтралізують карбонатом натрію до рН=7, промивають водою, а потім висушують у сушарці. 11 Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 76480 Підписне 12 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601