Спосіб мікроструктурного виявлення бактерій у м’ясі забійних тварин, птиці та м’ясопродуктах

Реферат: Спосіб мікроструктурного виявлення бактерій у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах. З проби м'яса та м'ясопродуктів у кількості 50-60 г нарізають зрізи у кількості 2-4 на заморожувальному мікротомі, товщиною 10-15 мкм, наклеюючи їх на предметні скельця за допомогою суміші яєчного білка і гліцерину у співвідношенні 1:1 упродовж 30-35 хв, у подальшому застосовуючи для фарбування водний розчин тіокарміну Ρ з масовою концентрацією 0,2 % упродовж 10-11 хв, далі промиваючи у дистильованій воді упродовж 1-1,5 хв, наступному диференціюванні зрізів у суміші етанолу з масовою концентрацією 96 % та 3 розчину хлористоводневої кислоти з масовою концентрацією 0,1 моль/дм (1:1), у подальшому зневодненні зрізів розчином етанолу з масовою часткою 70 % упродовж 2-2,5 хв та розчином етанолу з масовою часткою 96 % упродовж 1-1,5 хв, переносячи зрізи у ксилол на 1-1,5 хв та заведенням у канадський бальзам і подальшим розгляданням препаратів під світловим x х мікроскопом з об'єктивом зі збільшенням 40 і окуляром зі збільшенням 10 і виявленням бактерій, що фарбуються у синій колір. UA 109384 U (12) UA 109384 U UA 109384 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до сільського господарства, зокрема до ветеринарної медицини, й може бути використана для мікроструктурного виявлення бактерій у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах при встановленні їх безпечності у виробничих лабораторіях на потужностях з переробки, реалізації і зберіганні м'яса та м'ясопродуктів, у державних лабораторіях ветеринарної медицини. За результатами цього методу можна отримати якісні показники при мікроструктурному виявленні бактерій у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах. Аналогом корисної моделі є спосіб підрахування загальної кількості мікроорганізмів, згідно з ГОСТ 9958-81 [1], який базується на особливості аеробів та факультативних анаеробів рости на живильному агарі за температури 37±0,5 °C з утворенням колоній та послідуючим їх підрахунком. Недоліком даного методу є те, що він довготривалий, громіздкий і вимагає значних грошових затрат на живильний агар. Крім цього даний метод дає похибку від 25 до 45 %. Прототипом корисної моделі є спосіб фарбування бактерій у гістозрізах м'яса [2], у якому застосовують карболовий тіонін Ніколя. Недоліком даного методу є те, що використовують парафінові зрізи, які попередньо витримують у ксилолі упродовж 5 хв, потім у розчині етанолу з масовою концентрацією 96 % упродовж 2 хв, а потім у розчині етанолу з масовою концентрацією 70 % упродовж 2 хв. Це значно збільшує час, який витрачається на виготовлення одного препарату. Крім цього даний метод дає похибку у 15-20 %. В основу корисної моделі поставлено задачу - розробити спосіб мікроструктурного виявлення бактерій у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах шляхом використання заморожених зрізів у кількості 2-4, які фарбують водним розчином тіокарміну Ρ з масовою концентрацією 0,2 % упродовж 10-11 хв, промивають дистильованою водою, диференціюють зрізи у суміші розчину етанолу з масовою концентрацією 96 % та розчині хлористоводневої 3 кислоти з масовою концентрацією 0,1 моль/дм (1:1), витримують зрізи у розчині етанолу з масовою концентрацією 70 % упродовж 2-2,5 хв, а потім у розчині етанолу з масовою концентрацією 96 % упродовж 1-1,5 хв та переносять у ксилол на 1-1,5 хв та подальшим заведенням зрізів у канадський бальзам та розгляданням препаратів під світловим мікроскопом і виявленням бактерій, що фарбуються у синій колір, решта тканин м'яса, м'ясопродуктів - у світло-блакитний. Задача вирішується тим, що використовують проби м'яса забійних тварин, птиці та м'ясопродуктів у кількості 50-60 г, від яких нарізають зрізи у кількості 2-4, виготовлені на заморожувальному мікротомі, товщиною 10-15 мкм (мікрометрів), які наклеюють на предметні скельця за допомогою суміші яєчного білка і гліцерину в співвідношенні 1:1 і витримують упродовж 30-35 хв за кімнатної температури (20±2 °C) і, використовуючи хімічний посуд з відповідними реактивами, послідовно фарбують отримані препарати: - фарбують зрізи у водному розчині тіокарміну Ρ з масовою концентрацією 0,2 % упродовж 10-11 хв; - переносять зрізи у дистильовану воду на 1-1,5 хв; - диференціюють зрізи у суміші розчину етанолу з масовою концентрацією 96 % та розчину 3 хлористоводневої кислоти з масовою концентрацією 0,1 моль/дм (1:1) упродовж 2-5 хв; - зрізи переносять у розчин етанолу з масовою концентрацією 70 % на 2-2,5 хв; - зрізи переносять у розчин етанолу з масовою концентрацією 96 % на 1-1,5 хв; - зрізи переносять у ксилол на 1-1,5 хв; - заводять зрізи у канадський бальзам: на поверхню зрізів наносять 1 краплю канадського бальзаму, зверху кладуть покривне скельце і притискають його вантажем. Пофарбовані x препарати розглядають під світловим мікроскопом з об'єктивом зі збільшенням 40 і окуляром x зі збільшенням 10 . У кожному зрізі виявляють бактерії, що фарбуються у синій колір, решта тканин м'яса, м'ясопродуктів - у світло-блакитний. Етапи вирішення даної задачі наведено у нижчезазначених прикладах. Приклад 1. Для розробки методу використовують проби м'яса забійних тварин, птиці та м'ясопродуктів у кількості 100-120 г, від яких нарізають зрізи у кількості 4-6, що виготовлені на заморожувальному мікротомі, товщиною 10-15 мкм (мікрометрів), які наклеюють на предметні скельця за допомогою суміші яєчного білка і гліцерину у співвідношенні 1:1 і витримують упродовж 40-45 хв за кімнатної температури (20±2 °C) і, використовуючи хімічний посуд з відповідними реактивами, послідовно фарбують отримані препарати: - фарбують зрізи у водному розчині тіокарміну Ρ з масовою концентрацією 0,1 % упродовж 20-21 хв; - переносять зрізи у дистильовану воду на 2-2,5 хв; - диференціюють зрізи у суміші розчину етанолу з масовою концентрацією 70 % та розчину 3 хлористоводневої кислоти з масовою концентрацією 0,2 моль/дм (1:1) упродовж 6-8 хв; 1 UA 109384 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 - зрізи переносять у розчин етанолу з масовою концентрацією 96 % на 1-2 хв; - зрізи переносять у розчин етанолу з масовою концентрацією 80 % на 2-3 хв; - зрізи переносять у ксилол на 2-3 хв; - заводять зрізи у канадський бальзам: на поверхню зрізів наносять 1 краплю канадського бальзаму, зверху кладуть покривне скельце і притискають його вантажем. Пофарбовані х препарати розглядають під світловим мікроскопом з об'єктивом зі збільшенням 40 і окуляром х зі збільшенням 10 . У кожному зрізі виявляють бактерії, що фарбуються у світло-синій колір, решта тканин м'яса, м'ясопродуктів - у світло-блакитний. Приклад 2. Для розробки методу використовують проби м'яса забійних тварин, птиці та м'ясопродуктів у кількості 80-100 г, від яких нарізають зрізи у кількості 6-8, що виготовлені на заморожувальному мікротомі, товщиною 10-15 мкм (мікрометрів), які наклеюють на предметні скельця за допомогою суміші яєчного білка і гліцерину у співвідношенні 1:1 і витримують упродовж 35-40 хв за кімнатної температури (20±2 °C) і. використовуючи хімічний посуд з відповідними реактивами, послідовно фарбують отримані препарати: - фарбують зрізи у водному розчині тіокарміну Ρ з масовою концентрацією 0,4 % упродовж 18-20 хв; - переносять зрізи у дистильовану воду на 1-1,5 хв; - диференціюють зрізи у суміші розчину етанолу з масовою концентрацією 80 % та розчину 3 хлористоводневої кислоти з масовою концентрацією 0,1 моль/дм (1:1) упродовж 1-2 хв; - зрізи переносять у розчин етанолу з масовою концентрацією 80 % на 2-3 хв; - зрізи переносять у розчин етанолу з масовою концентрацією 100 % на 1-2 хв; - зрізи переносять у ксилол на 1-2 хв; - заводять зрізи у канадський бальзам: на поверхню зрізів наносять 1 краплю канадського бальзаму, зверху кладуть покривне скельце і притискають його вантажем. Пофарбовані х препарати розглядають під світловим мікроскопом з об'єктивом зі збільшенням 40 і окуляром х зі збільшенням 10 . У кожному зрізі виявляють бактерії, що фарбуються у синій колір, решта тканин м'яса, м'ясопродуктів - у світло-блакитний. Приклад 3. Для розробки методу використовують проби м'яса забійних тварин, птиці та м'ясопродуктів у кількості 50-60 г, від яких нарізають зрізи у кількості 2-4, що виготовлені на заморожувальному мікротомі, товщиною 10-15 мкм (мікрометрів), які наклеюють на предметні скельця за допомогою суміші яєчного білка і гліцерину у співвідношенні 1:1 і витримують упродовж 30-35 хв за кімнатної температури (20±2 °C) і. використовуючи хімічний посуд з відповідними реактивами, послідовно фарбують отримані препарати: - фарбують зрізи у водному розчині тіокарміну Ρ з масовою концентрацією 0,2 % упродовж 10-11 хв; - переносять зрізи у дистильовану воду на 1-1,5 хв; - диференціюють зрізи у суміші розчину етанолу з масовою концентрацією 96 % та розчину 3 хлористоводневої кислотою з масовою концентрацією 0,1 моль/дм (1:1) упродовж 2-5 хв; - зрізи переносять у розчин етанолу з масовою концентрацією 70 % на 2-2,5 хв; - зрізи переносять у розчин етанолу з масовою концентрацією 96 % на 1-1,5 хв; - зрізи переносять у ксилол на 1-1,5 хв; - заводять зрізи у канадський бальзам: на поверхню зрізів наносять 1 краплю канадського бальзаму, зверху кладуть покривне скельце і притискають його вантажем. Пофарбовані х препарати розглядають під світловим мікроскопом з об'єктивом зі збільшенням 40 іокуляром зі х збільшенням 10 . У кожному зрізі виявляють бактерії, що фарбуються у синій колір, решта тканин м'яса, м'ясопродуктів - у світло-блакитний. Порівняльна оцінка результатів випробування вищезазначених способів мікроструктурного виявлення бактерій у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктів до прототипу наведені у таблиці 1. 50 2 UA 109384 U Таблиця 1 Порівняння способів мікроструктурного виявлення бактерій у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктів до прототипу № п/ Показники, що порівнюються Складові методу: Застосування приладу 1 Кількість м'яса, м'ясопродуктів, г Кількість зрізів Фіксування на предметних скельцях сумішшю зі співвідношенням Час фіксування зрізів,хв. Фарбування бактерій 2 3 Концентрація, % Експозиція фарбування, хв. Промивання зрізів у дистильованій воді, хв Диференціювання зрізів Прототип 1 Приклади 2 3 заморожу- заморожу- заморожуваль- заморожувальвальний вальний ний ний мікротом мікротом мікротом мікротом 100,0 100-120 80-100 г 50-60 г 4-6 4-6 6-8 2-4 яєчного яєчного яєчного білка й яєчного білка й білка й білка й гліцерину 1:1 гліцерину 1:1 гліцерину гліцерину 1:1 1:1 30-40 40-45 35-40 30-35 КарболоВодний Водний розчин Водний розчин вий тіонін розчин тіокарміну Ρ тіокарміну Ρ Ніколя тіокарміну Ρ 0,1 0,4 0,2 5-10 20-21 18-20 10-11 1 Ксилол 4 2-2,5 1-1,5 1-1,5 Суміш Суміш етанолу Суміш етанолу етанолу та та хлористовод- та хлористоводхлористоневої кислоти невої кислоти водневої кислоти (1:1) (1:1) (1:1) 70 80 96 0,2 0,1 0,1 Співвідношення у суміші Концентрація етанолу, % Концентрація хлористоводневої 3 кислоти, моль/дм Експозиція, хв 5 3-6 1-2 2-5 Зневоднення препаратів розчином етанолу 5 Концентрація, % 96 96 80 70 Експозиція, хв. 1-2 1-2 2-3 2-3 Зневоднення препаратів розчином етанолу 6 Концентрація, % 100 80 100 96 Експозиція, хв. 1 2-3 1-2 1-1,5 Витримування зрізів у ксилолі, 2 2-3 1-2 1-1,5 7 хв Заведення під покривне скельце канадський канадський канадський канадський 8 бальзам бальзам бальзам бальзам х х Мікроскопія препаратів під збільшення збільшення збільшення 40 ; збільшення 40 ; х х світловим мікроскопом 40 ; окуляр 40 ; окуляр окуляр зі окуляр зі 9 зі зі збільшен- збільшенням збільшенням х х х збільшенням 10 10 10 х ням 10 Інтенсивність кольору блакитний світло-синій синій синій 10 фарбування бактерій Швидкість визначення досліду, 1 год. 30хв - 1 год. 20 хв - 1 год. -1 год. 10 48-55 хв 11 год./хв 1 год. 40 хв 1 год. 30 хв 3 UA 109384 U Продовження таблиці 1 № п/ Показники, що порівнюються Стабільність показників по мікроструктурному визначенню 12 бактерій у м'ясі, м’ясопродуктах, % % співвідношення результатів досліджень щодо виявлення 13 наявності сальмонел у м'ясі, м'ясопродуктах % співвідношення результатів досліджень щодо виявлення 14 наявності лістерій у м'ясі, м'ясопродуктах 5 10 Прототип 1 Приклади 2 3 91,5 90,5 89,7 99,9 80,9-82,6 82,1-83,3 85,4-88,0 95,9-98,2 83,5-89,9 83,2-85,4 84,9-87,7 96,3-98,1 Дані таблиці 1 свідчать, що більш достовірні дані порівняно із результатами досліджень щодо виявлення наявності сальмонел у м'ясі, м'ясопродуктах - у 95,9-98,2 % [3] та до результатів досліджень щодо виявлення наявності лістерій у м'ясі, м'ясопродуктах -у 96,398,1 % [4] були отримані при застосуванні методу за прикладом № 3. Також найвища стабільність показників по мікроструктурному виявленню бактерій у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах була за прикладом № 3 - 99,9 %. Використовуючи метод за прикладом № 3, ми провели мікроструктурне виявлення бактерій у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах на 38 пробах: м'ясо яловичини - 6 проб; м'ясо свинини - 5 проб; м'ясо курей - 7 проб; ковбаса варена - 4 проби; ковбаса варено-копчена - 4 проби; ковбаса копчена - 5 проб; ковбаса сирокопчена - 4 проби; балик м'ясний - 3 проби. Результати наведені у таблиці 2. Таблиця 2 Показники мікроструктурного виявлення бактерій у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктів за прикладом № 3 № п/п 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Мікроструктурне виявлення бактерій за інтенсивністю кольору за прикладом №3 Кількість Наявність Відсутність Кількість проб проб бактерій бактерій М'ясо яловичини, n=6 n=2 n=4 М'ясо свинини, n=5 n=2 n=3 Усі тканини М'ясо курей, n=7 n=6 n=1 Фарбування фарбуються у Ковбаса варена, n=4 n=2 n=2 бактерій у синій світлоКовбаса варено-копчена, n=4 n=1 n=3 колір блакитний Ковбаса копчена, n=5 n=1 n=4 колір Ковбаса сирокопчена, n=4 n=1 n=2 М'ясний балик, n=3 n=2 n=1 Види м'яса забійних тварин, птиці та м'ясопродуктів 15 20 25 Проведеними дослідженнями встановлено, що при фарбуванні зрізів із м'яса забійних тварин, птиці та м'ясопродуктів за розробленим способом, на пофарбованих препаратах, які х розглядали під світловим мікроскопом і об'єктивом зі збільшенням 40 , і окуляром зі х збільшенням 10 , виявляли бактерії зафарбовані у синій колір. За відсутності бактерій - усі тканини фарбуються у світло-блакитний колір. Ці дані були стабільними та достовірними, отже, ці показники можна використовувати при оцінюванні безпечності м'яса забійних тварин, птиці та м'ясопродуктів. Крім цього, слід зазначити, що метод є експресним, простим у виконанні, а його результати дають конкретні якісні показники по інтенсивності фарбування бактерій у синій колір. Метод за прикладом № 3 нами пропонується як якісний спосіб мікроструктурного виявлення бактерій у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах поряд з іншими методами визначення їх безпечності (виявлення бактерій групи кишкової палички, сальмонел, стафілококів, лістерій 4 UA 109384 U тощо) [4]. Метод має перевагу перед існуючими якісними методами визначення безпечності м'яса та м'ясопродуктів тому, що результати мають достовірні показники по інтенсивності забарвлення. 5 10 15 Джерела інформації: 1. Изделия колбасные и продукты из мяса. Методы бактериологического анализа: ГОСТ 9958-81. - М.: Госкомитет СССР по стандартам. - 20 с. 2. Омеляненко Μ.Μ. Основи патогістологічних досліджень: Методичні вказівки для студентів та лікарів ветеринарної медицини / Μ.Μ. Омеляненко, Л.М. Потоцька. - К., 2013. - 137 с. 3. Мікробіологія харчових продуктів і кормів для тварин. Горизонтальний метод виявлення Salmonella: ДСТУ EN 12824:2004. К.: Держспоживстандарт України, 2005. - 20 с. (національний стандарт України). 4. Довідник мікробіологічних методів дослідження харчових продуктів і кормів для тварин згідно з міжнародними стандартами / В.М. Івченко, В.B. Шарандак, О.І. Горбатюк та ін. - Біла Церква, 2006. - 264 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 30 Спосіб мікроструктурного виявлення бактерій у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах, який відрізняється тим, що від проби м'яса та м'ясопродуктів у кількості 50-60 г нарізають зрізи у кількості 2-4 на заморожувальному мікротомі, товщиною 10-15 мкм, наклеюючи їх на предметні скельця за допомогою суміші яєчного білка і гліцерину у співвідношенні 1:1 упродовж 30-35 хв, у подальшому застосовуючи для фарбування водний розчин тіокарміну Ρ з масовою концентрацією 0,2 % упродовж 10-11 хв, далі промиваючи у дистильованій воді упродовж 1-1,5 хв, наступному диференціюванні зрізів у суміші етанолу з масовою концентрацією 96 % та 3 розчину хлористоводневої кислоти з масовою концентрацією 0,1 моль/дм (1:1), у подальшому зневодненні зрізів розчином етанолу з масовою часткою 70 % упродовж 2-2,5 хв та розчином етанолу з масовою часткою 96 % упродовж 1-1,5 хв, переносячи зрізи у ксилол на 1-1,5 хв та заведенням у канадський бальзам і подальшим розгляданням препаратів під світловим x х мікроскопом з об'єктивом зі збільшенням 40 і окуляром зі збільшенням 10 і виявленням бактерій, що фарбуються у синій колір. Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5