Спосіб регульованої ферментації для виготовлення мевіноліну та спосіб одержання мевіноліну

Цей винахід взагалі стосується біосинтезу агентів, що знижують рівень холестерину. Точніше, він стосується біосинтезу певними мікроорганізмами агента, що знижує рівень холестерину, - мевіноліну. Мевінолін (ловастатин; монаколін К; d-лактон b,d-дигідрокси-7-[1,2,6,7,8,8а-гексагідро-2,6-диметил-8-(2метилбутирилокси)-нафталін-1-іл]-гептанової кислоти) є одним з найважливіших відомих агентів, що знижують рівень холестерину. Назва "мевінолін" у значенні, вжитому в цьому описі, охоплює як лактонну форму, так і вільну гідроксикислотну форми згаданої сполуки. Відкрита гідроксикислотна форма мевіноліну є потужним інгібітором ферменту 3-гідрокси-3метилглутарилкоензим А-редуктази, який є каталізатором утворення мевалонової кислоти, що є проміжним продуктом ранньої стадії біосинтезу холестерину. Мевінолін має особливі переваги, оскільки в результаті його вживання виключається накопичення проміжних продуктів біосинтезу з токсичним стероїдним скелетом, які утворюються на пізнішій стадії біосинтезу. Мевінолін збільшує кількість LDL-рецепторів на поверхні клітинної мембрани, які видаляють LDL-холестерин, що циркулює в крові, тим самим викликаючи зниження рівня холестерину в плазмі крові. Цю активну сполуку звичайно одержують шляхом ферментації. Як описано в патенті Великобританії №2046737, цю активну сполуку можуть продукувати деякі штами, що належать до роду Monascus, наприклад, М. ruber 1005, який культивують в діапазоні температур від 7°С до 40°С. Як живильне середовище для культури були використані водний розчин глюкози, пептону, кукурудзяного екстракту та хлористого амонію. Ферментацію провадили протягом 10 діб в аеробних умовах, і з фільтрату 5 л ферментаційної маси було одержано 87мг мевіноліну. В патенті США №4,294,926 розкрито спосіб біосинтезу мевіноліну, згідно з яким перевага віддається використанню мікроорганізмів, депонованих під номерами АТСС 20541 або 20542, які належать до роду Aspergillus terreus. на живильному середовищі, що містить вуглеводи, наприклад, глюкозу, фруктозу, мальтозу, як джерела вуглецю, джерела азоту, наприклад, дріжджі, гідролізовані дріжджі, гідролізований казеїн, кукурудзяний екстракт; і мінеральні солі, наприклад, карбонат кальцію, сульфат магнію, солі кобальту, тривалентного заліза, тривалентного марганцю, при температурі 20-37°С. Аналогічні способи описано в патентах США №№4,420,491, 4,342,767, 4,319,039 і 4,294,846, згідно з якими ферментацію провадять протягом 3-5 діб на середовищах, що містять 1-6% вуглеводів і 0,2-6% джерел азоту. У патенті Німечини №4402591 описано біосинтез мевіноліну мікроорганізмами, які належать до роду Pleurotus наприклад, Pleurotus ostreatus. P. sapidus, P. saca. при 25-35°С при тривалості культивації 7-14 діб у поверхневих або глибинних культурах. У патенті Канади №2129416 розкрито спосіб виготовлення мевіноліну, у конкретному випадку, мевастатину, з використанням мікроогранізму, що належить до роду Coniothvrium, наприклад, депонованого під номером Coniothvrium fuckelii ATCC 74227, на живильному середовищі, що містить 3-15% глюкози, 0,54% пептону, 0,5-5% амілази, 0,2-1% сульфату амонію, 0,01-0,1% сульфату магнію, 0,05-0,2% протиспінювального агента, 0,2-1,5% L-ізолейцину, 0,2-1,5% L-аспарагінової кислоти в діапазоні pH 5-6. Згідно з прикладами, концентрація активного компоненту в ферментаційній масі становила від 19мг/л до 430мг/л. В патенті Угорщини №208997 описано використання голотипного штаму Aspergillus obscurus. що має номер MV-1 і депонований під номером NCAJM(P)F 001189. Перевага віддається проведенню ферментації на середовищі, яке містить дріжджовий екстракт та/або пептон та/або казеїн як джерело (джерела) азоту і глюкозу та/або мальтозу або сахарозу як джерело (джерела) вуглецю. Активність розчину в кінці культивації в лабораторних умовах лежить у межах 400-850мг/л. Вищенаведені дані свідчать, що роботи в області розвитку біосинтезу мевіноліну зосереджені на пошуку нових мікроорганізмів, що продукують мевінолін, а не на розвитку методики самої ферментації. Деякі роботи вказують, що ферментацію можна виконувати на звичайних і добре відомих живильних середовищах з застосуванням як поверхневого вирощування, так і культивації на твердій фазі. Застосовувалися періодичні процедури, в яких хід вирощування залежав від початкових умов. Однак, технічні обмеження, наприклад, підтримання найзручніших концентрацій інгредієнтів, оптимального рівня вмісту розчиненого кисню та pH тощо, утруднюють застосування безперервних коригувальних заходів для забезпечення найсприятливіших умов. Для забезпечення оптимального режиму росту та продукування активної сполуки на основній стадії ферментації потрібні різні умови та склад живильного середовища залежно від особливостей метаболічних процесів кожного конкретного виду мікроорганізму. На основі своїх експериментів автори цього винаходу прийшли до висновку, що у посівній культурі та на початку основного процесу ферментації кількість активної біомаси дуже невелика та непостійна. Відповідно, вихід продуктів ферментації також відносно низький і непостійний. Виходи, що досягаються наприкінці ферментації і залежать, звичайно, від вживаного штаму, не перевищують концентрації мевіноліну 850мг/л. Автори цього винаходу детально проаналізували всю процедуру ферментації, починаючи від стадії посівної культури аж до кінця процесу ферментації. З'ясовано, що на стадії приготування посівної культури у випадку застосування відомих живильних середовищ та методик виконання процедури кількість біомаси занадто мала. Тому на основній стадії ферментації метаболізм мікроорганізму і культура не відповідають одне одному. Таким чином, однією ціллю цього винаходу є підвищення ефективності методу ферментаційного продукування мевіноліну шляхом підвищення продуктивної здатності мікроорганізму за допомогою зміни умов ферментації та процедури її проведення. Іншою ціллю цього винаходу є забезпечення найбільш сприятливих хімічних та фізіологічних умов метаболізму мікроорганізму як на стадії посівної культури, так і на основній стадії ферментації. Ще однією ціллю цього винаходу є забезпечення найбільш сприятливих хімічних та фізіологічних умов метаболізму мікроорганізму як на стадії посівної культури, так і на основній стадії ферментації шляхом підтримання в умовах стаціонарного стану сталої швидкості росту і, таким чином, максимальної швидкості утворення продукту протягом тривалого часу. Вищевказані та інші цілі винаходу досягаються в одному з варіантів здійснення цього винаходу шляхом забезпечення способу продукування мевіноліну мікроорганізмом у процесі ферментації, який включає стадію посівної культури і основну стадію ферментації, причому згаданий спосіб включає: a) вирощування біомаси мікроорганізму на вищезгаданій стадії посівної культури для продукування інокуляційного матеріалу; b) перенесення вищезгаданого інокуляційного матеріалу в ферментаційне середовище на вищезгаданій основній стадії ферментації; і c) підтримання умов стаціонарного стану на вищезгаданій основній стадії ферментації з одержанням таким чином ферментаційної маси, яка містить мевінолін. У варіанті здійснення цього винаходу, якому віддається перевага, умови стаціонарного стану на основній стадії ферментації підтримують шляхом одноразового чи багаторазового додавання органічних джерел вуглецю; регулювання вмісту глюкози та/або загального вмісту відновлювальних цукрів; додавання органічних та/або неорганічних джерел азоту; регулювання pH; регулювання ступеню спінювання; регулювання кількості ферментаційної маси шляхом відбирання та додавання; і регулювання вмісту розчиненого кисню. Перевага віддається проведенню процесу ферментації в глибинній культурі мікроорганізму при температурі в межах від 24°С до 30°С. У варіанті здійснення винаходу, якому віддається особлива перевага, мікроорганізмом є вид Aspergillus. В іншому варіанті здійснення винаходу, якому віддається перевага, органічне джерело вуглецю вибране з групи, що складається з глюкози, гідролізованого крохмалю та рослинної олії; вміст глюкози підтримують на рівні нижче 0,2%, починаючи з 60-ї години основної стадії ферментації; джерела азоту вибрані з групи, яка складається з кукурудзяного екстракту та гідроксиду амонію; pH регулюють шляхом додавання джерел вуглецю та/або основи так, щоб значення цього показника були в межах від приблизно 5,2 до приблизно 7,0, причому перевага віддається діапазону від приблизно 5,2 до приблизно 6,2; ступінь спінювання регулюють шляхом додавання пінорегулювального матеріалу, причому перевага віддається синтетичному матеріалу або рослинній олії; і спосіб регулювання вмісту розчиненого кисню, якому віддається перевага, полягає в перемішуванні та/або аерації ферментаційної маси. Ще в одному варіанті здійснення цього винаходу, якому віддається перевага, інокуляційний матеріал переносять зі стадії посівної культури на основну стадію ферментації, коли pH на стадії посівної культури починає підвищуватися після досягнення мінімального значення. На відміну від простого періодичного процесу, де результат ферментації залежить здебільшого від початкових умов (наприклад, склад живильного середовища), результат ферментації при здійсненні регулювання за метаболізмом залежить від багатьох чинників, зокрема, від точного контролю фізичних, фізико-хімічних, хімічних, біохімічних тощо параметрів в процесі ферментації (наприклад, температура, розчинений кисень, pH, концентрація критично важливих складових, швидкість росту, в'язкість тощо). Така складна процедура контролювання має на меті забезпечити утримання в стаціонарному стані впродовж якомога довшого періоду часу максимальний вихід продукту. Стаціонарний стан слід розуміти як такий стан, при якому певні визначені параметри процесу, такі як розмір, швидкість, періодичність тощо, є постійними або істотно не змінюються впродовж довільного інтервалу часу. Винахідники ставили за мету розробити таку процедуру ферментації, за якої параметри, які є критичними для утворення ловастатину, в процесі ферментації контролюються таким чином, щоб підтримувати їх на постійному рівні якомога довше. Серед таких критичних параметрів, що зазнають регулювання, - фізичні (температура, внутрішній тиск тощо), фізико-хімічні (pH, концентрація розчиненого кисню, в'язкість, ступень спінювання тощо), хімічні (концентрація компонентів живильного середовища, наприклад, вміст NH3-N, вміст глюкози тощо), фізіологічні (швидкість росту, швидкість утворення продукту тощо) та інженерні параметри (інтенсивність перемішування тощо). Як результат, при застосуванні нової процедури вдалося утримувати високу швидкість утворення ловастатину впродовж всього процесу ферментації. Автори цього винаходу встановили, що оптимальний біосинтез мевіноліну можна здійснити, регулюючи один або кілька певних параметрів процесу, етапи та/або змінні величини на кожній зі стадій процесу біосинтезу (стадії посівної культури та основній стадії ферментації) або на обох стадіях. Щодо стадії посівної культури, автори винаходу визначили ці параметри, етапи та/або змінні величини процесу в розрахунку на постачання мікроорганізму необхідних компонентів живильного середовища у легко засвоюваній формі та в найбільш сприятливих концентраціях і збільшення тривалості культивування на величину від приблизно 10% до приблизно 25%. З метою забезпечення умов стаціонарного стану на протязі основної стадії ферментації автори винаходу визначили ці параметри, етапи та/або змінні величини процесу в розрахунку на регулювання вмісту глюкози та/або загального вмісту відновлювальних цукрів, підтримання вмісту джерел вуглецю на прийнятному мінімальному рівні, додавання органічних та/або неорганічних джерел азоту, регулювання pH, регулювання ступеню спінювання, регулювання маси розчину шляхом відбирання та додавання і регулювання вмісту розчиненого кисню шляхом змін швидкості перемішування та/або інтенсивності аерації. Для оптимізації процесу біосинтезу мевіноліну немає потреби одночасно регулювати кожний з вищезгаданих параметрів, етапів та/або змінних величин процесу для стадії посівної культури або для основної стадії ферментації. Проте, згідно з варіантом здійснення винаходу, якому віддається перевага, біосинтез мевіноліну охоплює всі вищезгадані параметри, етапи та/або змінні величини процесу. Згідно з таким варіантом, якому віддається перевага, може бути здійснений удосконалений спосіб ферментації мевіноліну з регулюванням за метаболізмом, в якому умови стаціонарного стану, тобто, сталі значення pH, концентрації глюкози, вмісту розчиненого кисню, в'язкості, об'єму тощо, можуть бути досягнуті швидко і підтримувані протягом тривалого часу, забезпечуючи вихід, який набагато перевищує результати відомих способів. Деякі переваги можуть бути реалізовані на стадії посівної культури шляхом регулювання одного або кількох вищезгаданих параметрів, етапів та/або змінних величин процесу на цій стадії. Ці переваги включають, наприклад, скорочення часу, необхідного для досягнення умов "стаціонарного стану" приблизно на 20-30% шляхом збільшення кількості центрів росту та забезпечення росту біомаси у більш сприятливій морфологічній модифікації, що забезпечує більш сприятливі умови для культивації мікроорганізму. В результаті цих переваг та подовження тривалості культивації концентрація активної біомаси зростає майже вдвічі. Деякі переваги можуть бути реалізовані на основній стадії ферментації шляхом регулювання одного або кількох вищезгаданих параметрів, етапів та/або змінних величин процесу на цій стадії. Ці переваги включають, наприклад, більш швидку фазу росту з меншими відхиленнями та швидке встановлення фази стаціонарного стану, яку можна підтримувати протягом тривалого часу. Ці переваги забезпечують значне підвищення активності ферментації. Таким чином, в одному з варіантів здійснення цей винахід спрямований на спосіб ферментації для виготовлення мевіноліну з використанням штаму, що належить до роду Aspergillus, у глибинній культурі при pH у межах від 5,2 до 7,0, при температурі в межах від 24 до 30°С, на живильному середовищі, що містить засвоювані джерела вуглецю та азоту і мінеральні солі, в якому на основній стадії ферментації застосовують процедуру регулювання за метаболізмом з метою підтримання культури у "стаціонарному стані". У цьому варіанті здійснення винаходу перевага віддається регулюванню вмісту відновлювального цукру. На основній стадії ферментації перевага віддається введенню органічних джерел вуглецю, наприклад, глюкози, гідролізованого крохмалю та рослинної олії. У варіанті, якому віддається перевага, концентрацію глюкози підтримують на рівні менше 0,2% від 60-ї години ферментації. На протязі процедури додають джерела азоту, наприклад, кукурудзяний екстракт та гідроксид амонію. Щодо pH, перевага віддається підтриманню його значення в межах 5,2-6,2 шляхом додавання джерела вуглецю та/або основи, наприклад, гідроксиду амонію та/або гідроксиду натрію. Рівень піни у ферментаційному чані можна також регулювати шляхом додавання до маси рослинної олії, наприклад, соняшникової олії та/або соєвої олії та/або синтетичного протиспінювального агента. Перевага віддається регулюванню вмісту розчиненого кисню шляхом змінювання швидкості перемішування та/або інтенсивності аерації. На протязі ферментації масу відбирають один або кілька разів. У варіанті, якому віддається перевага, живильне середовище основної культури інокулюють посівною культурою, яка має такий склад: Компонент Глюкоза Фосфорна кислота Кислотний казеїн Кукурудзяний екстракт Соняшникова олія Поліпропіленгліколь Панкреатин* Кількість (маса/об'єм, %) 2-6 0,002-0,006 0,2-0,8 1,5-5 0,05-0,18 0,05-0,18 0,002-0,008 *4-кратна активність за Угорською Фармакопеєю VII Живильне середовище для культури вищевказаного складу доповнюють регулярно вживаними солями мікро- і макроелементів, наприклад, неорганічними солями натрію, калію, магнію та заліза. Середовище для основної культури інокулюють посівною культурою, тривалість культивації якої збільшена на 10-25%. На стадії переносу посівної культури значення pH перебуває в стадії зростання після досягнення його мінімального значення. Для ферментації використовують переважно штам Aspergillus obscurus. його варіацію або його мутант, більша перевага віддається використанню голотипу штаму Aspergillus obscurus n. sp. MV-1, депонований під номером NCAIM(P)F 001189. Посівну культуру інокулюють у стерильне живильне середовище основної ферментації при подовженій тривалості культивації у фазі зростання pH після досягнення його мінімального значення. На стадії основної ферментації умови "стаціонарного стану" з максимальною швидкістю продукування активної речовини можна підтримувати протягом тривалого часу шляхом додавання джерел вуглецю та азоту для постачання живильних речовин; регулювання концентрації глюкози з метою запобігання небажаному загустінню культури та надлишковому зростанню біомаси; реіулювання швидкості перемішування та інтенсивності аерації відповідно до споживання кисню; сполучення регулювання рівня піни з реулюванням споживання джерела вуглецю шляхом застосування матеріалу, що забезпечує обидві умови, наприклад, суміші рослинної олії та синтетичного агента; підтримання pH в діапазоні значень від приблизно 5,2 до 6,2 введенням джерела вуглецю, наприклад, розчину глюкози, або основи; і одно- або кількаразового відбирання маси, коли досягається максимальний робочий об'єм ферментаційного чана або коли досягається концентрація мевіноліну, достатня для економічної наступної переробки. Застосовуючи ці елементи технології, можна провадити універсальну керовану процедуру ферментації, яка забезпечує, залежно від життєвого циклу, сталі оптимальні умови в оточуючому середовищі для мікроорганізму. Згідно з вищеописаним варіантом здійснення винаходу, якому віддається перевага, цей винахід забезпечує виходи, які перевищують виходи, що досягаються при використанні відомих способів, потребує значно менших витрат матеріалів та енергії, зменшує кількість відходів, які забруднюють навколишнє середовище, на одиницю маси активної речовини і забезпечує краще використання ферментаційного чана. У наведених нижче прикладах процес біосинтезу мевіноліну згідно з патентом Угорщини №208997 (Порівняльний приклад 1) порівнюється зі способом згідно з варіантом здійснення цього винаходу, якому віддається перевага (Приклад 2). Порівняльний Приклад 1 Біосинтез мевіноліну згідно з HU 208997 Живильне середовище нижчезазначеного складу для посівної культури готували у ферментаційному чані місткістю 600л. Компонент Кількість (%) Глюкоза Казеїновий пептон Нітрат натрію NaNO3 Дигідрофосфат калію КН2РО4 Хлорид калію КСl Сульфат магнію MgSO4*7H2O Сульфат заліза FeSO4*7H2O 4,0 0,5 0,3 0,2 0,05 0,05 0,001 Засів інокуляційного матеріалу виконували суспензією спор штаму Aspergillus obscurus з кількістю спор 6,5х109. Параметри процесу культивації посівної культури були такими: Параметр Об'єм маси Температура Інтенсивність аерації Внутрішній тиск Швидкість перемішування Значення 400л 27°С 20нм3/годину 0,5бар 320обертів/хвилину Перенесення посівної культури в живильне середовище основної ферментації виконували згідно зі стандартною процедурою у віці 36 годин, коли значення pH у стадії зниження досягало 5,6. Об'єм біомаси після згущення центрифугуванням складав 14%. Вищезазначену посівну культуру інокулювали в середовище основної ферментації, позначене MEF-03, при відношенні інокуляції 10%. Живильне середовище основної ферментації мало такий склад: Компонент Кількість (%) Моногідрат декстрози 1,0 Кислотний казеїн 0,2 Кукурудзяний крохмаль 8 Соєве борошно 1,5 Кукурудзяний екстракт (50%) 1 Хлорид натрію 1 Дигідрофосфат калію 0,2 Глутамат натрію 1,2 Соняшникова олія 0,16 Поліпропіленгліколь 0,16 Панкреатин* 0,002 Фермент BAN 240 0,007 Хлорид кальцію 0,02 Гідроксид калію до встановлення pH *4-кратна активність за угорською фармакопеєю VII Початковий об'єм маси (0 годин): 500л. Ферментацію провадили протягом 7 діб. Швидкість перемішування та інтенсивність аерації мали такі значення: Аерація* 18-25нм3/годину Перемішування* 180-320об/хв *Вміст розчиненого кисню підтримували вище 40% від концентрації насичення. У процесі ферментації до маси додавали 4 порції по 50кг ферментованого кукурудзяного крохмалю, згідно з графіком, при віці маси 50 годин, 73 години, 90 годин і 108 годин. Дані щодо продукування активної речовини Тривалість ферментації 164 години. Активність (за даними високоефективної рідинної хроматографії): 927 мг/кг. Кількість ферментаційної маси: 580кг. Відповідно, кількість ферментованої активної речовини 0,58тонних927г/тонну/1000/1м3=0,54кг/м3 загального об'єму. Приклад 2 Біосинтез мевіноліну з додаванням розчину глюкози та джерела азоту і регулюванням pH гідроксидом натрію та гідроксидом амонію У чані місткістю 600л готували живильне середовище для посівної культури вказаного нижче складу: Компонент Глюкоза Казеїновий пептон Кукурудзяний екстракт (50%) Нітрат натрію NaNO3 Дигідрофосфат калію КН2РО4 Кількість (%) 4,0 0,5 3,0 0,3 0,2 Хлорид калію КС1 Сульфат магнію MgSO4*7H2O Сульфат заліза FeSO4*7Н2О Панкреатин* Поліпропіленгліколь Соняшникова олія 0,05 0,05 0,001 0,005 0,1 0,1 *4-кратна активність за угорською фармакопеєю VII Засів інокуляційного матеріалу виконували суспензією спор штаму Aspergillus obscurus з кількістю спор 6,5х109. Параметри процесу культивації посівної культури були такими ж, як у Порівняльному прикладі 1. Проте перенесення посівної культури виконували інакше, ніж у Порівняльному прикладі 1. Вік культури, що переносили, складав 40 годин. Показник pH досягав мінімального значення (4,9), і перенесення виконували, коли цей показник починав підвищуватися і досягав приблизно 5,0. Таким чином, значення pH підвищувалося приблизно на 0,1 порівняно з мінімумом. Об'єм біомаси після згущення центрифугуванням складав 24%. Вищезазначену посівну культуру інокулювали в середовище основної ферментації при відношенні інокуляції 10%. Живильне середовище основної ферментації мало такий склад: Компонент Кукурудзяний крохмаль Розчин глюкози* Кислотний казеїн Соєве борошно Кукурудзяний екстракт (50%) Хлорид натрію Дигідрофосфат калію Глутамат натрію Соняшникова олія Поліпропіленгліколь Панкреатин** Гідроксид калію Кількість (%) 8 1,0 0,2 1,5 1 1 0,2 1,2 0,16 0,16 0,002 до встановлення pH *25кг у вигляді 25%-ного розчину **4-кратна активність за угорською фармакопеєю VII Ферментацію провадили протягом 13 діб. Швидкість перемішування та інтенсивність аерації мали такі значення: Аерація* мін. 12, макс. 32 нм3/годину Перемішування* мін. 220, макс. 400 обертів/хвилину *Вміст розчиненого кисню підтримували вище 40% від концентрації насичення, головним чином, способом аерації. У процесі ферментації підтримання рівня розчиненого кисню має велике значення. На етапі найбільшої інтенсивності цього ефекту можна досягти, застосовуючи швидкості аерації 25-32нм3/годину і швидкості перемішування 300-400обертів/хвилину. На протязі основної стадії ферментації температура була 27±2°С, внутрішній тиск становив 0,4бар, а тривалість культивації була 309 годин. В процесі ферментації додавали нижчезазначені живильні речовини: 1. Гідролізований кукурудзяний крохмаль (розчин глюкози) підготовляли шляхом ферментної обробки та обробки хлористоводневою кислотою і додавали в масу. Для підготовки розчину глюкози використовували такі вихідні матеріали: 25% кукурудзяного крохмалю, 0,3-0,4% хлориду кальцію, 0,1-0,2% ферменту амілази (BAN) та 1% концентрованої хлористоводневої кислоти. Розчин глюкози починали додавати на етапі підвищення pH після досягнення його мінімального значення (5,0) у віці культури 45 годин і при значенні pH 5,6. Додавання провадили безперервно, підтримуючи pH у межах від 5,4 до 5,8. Мінімальна швидкість додавання становила 0,5л/год, а максимальна - 5л/год. 2. Розчин гідроксиду натрію або гідроксиду амонію додавали для регулювання pH, коли значення pH спадало нижче 5,5, на додаток до мінімальної швидкості додавання розчину глюкози. 3. Кукурудзяний екстракт (1% від об'єму маси у початковий момент (0 годин) додавали через 100 годин ферментації. Дані щодо продукування активної речовини Тривалість ферментації: 309 годин. Активність (за даними високоефективної рідинної хроматографії): 2868мг/кг. Кількість ферментаційної маси: 680кг. Відповідно, кількість ферментованої активної речовини 0,68 тонних2868г/тонну/1000/1м3=1,95кг/м3 загального об'єму. Приклад 3 Біосинтез мевіноліну з додаванням (живильних речовин), регулюванням (параметрів) та відбиранням (ферментаційної маси) Голотипний штам Aspergillus obscurus n. sp. MV-1 культивували на стерильному живильному середовищі для інокуляційного матеріалу такого складу: Компонент Глюкоза Фосфорна кислота Кислотний казеїн Кукурудзяний екстракт (50%) Нітрат натрію NaNO3 Дигідрофосфат калію КН2РО4 Хлорид калію КСl Сульфат магнію MgSO4*7H2O Сульфат заліза FeSO4*7H2O Соняшникова олія Поліпропіленгліколь Панкреатин* Гідроксид калію Хлористоводнева кислота Кількість (%) 4,0 0,0035 0,5 3,0 0,3 0,2 0,05 0,05 0,001 од од 0,005 для встановлення pH для встановлення pH *4-кратна активність за угорською фармакопеєю VII На стадії вирощування інокуляційного матеріалу параметри процесу мали такі значення: Параметр Об'єм маси Швидкість перемішування Інтенсивність аерації Внутрішній тиск Температура Значення 8м3 120обертів/хвилину 400±50нм3/годину 0,4±0,1бар 27±2°С Інокуляційний матеріал переносили після досягнення мінімального значення його pH (4,8) і наступного підвищення цього значення на 0,1, тобто, коли значення pH досягало 4,9. Об'єм біомаси після ущільнення шляхом центрифугування становив 24%. Вищезазначений інокуляційний матеріал переносили у відношенні 8% у живильне середовище основної ферментації нижче вказаного складу: Компонент Соєве борошно Сума кукурудзяного або пшеничного крохмалю Кислотний казеїн Кукурудзяний екстракт (50%) Хлорид натрію Дигідрофосфат калію Глутамат натрію Хлорид кальцію Фермент BAN Соняшникова олія Поліпропіленгліколь Панкреатин* Гідроксид калію або хлористоводнева кислота Кількість (%) 1,28-1,57 9 0,20 0,857-1,14 1,0 0,2 1,14-1,20 3,8х10-3 2,2х10-3 0,10 0,10 2,0x10-3 для встановлення pH На основній стадії ферментації процес провадили при таких значеннях параметрів: Параметр Внутрішній тиск Температура Швидкість перемішування Інтенсивність аерації Значення 0,2±0,05бар 27±2°С 60-85обертів/хвилину 1000-4000нм3/годину Матеріали для підживлення 1. Джерело вуглецю: Приблизно 40 тонн крохмалю, гідролізованого до глюкози (розчин глюкози), готували у вигляді 25%-ного розчину і додавали безперервно. Для приготування розчину глюкози застосовували такі вихідні матеріали: 25% кукурудзяного або пшеничного крохмалю, 0,3% хлориду кальцію, 0,3% ферменту BAN 240 і приблизно 2% хлористоводневої кислоти. 2. Джерело азоту: Кукурудзяний екстракт (50%) використовували для приготування в кількості 1% відносно об'єму на початку ферментації (0 годин) у стерильному об'ємі 5 м3. 3. Основа для регулювання pH: Нестерильний 25-30%-ний розчин гідроксиду натрію або гідроксиду амонію викорстовували для регулювання pH. Підживлення 1. Розчин глюкози: Підживлення починали приблизно через 50 годин від початку ферментації на етапі підвищення pH після досягнення його першого мінімального значення. Розчин глюкози додавали з метою підтримання pH в межах від 5,4 до 5,8. Підживлення глюкозою виконували періодично або безперервно. Розчин глюкози додавали зі швидкістю від 0кг/год до 1000кг/год, перевага віддавалася діапазону від 150кг/год до 500кг/год. В разі неможливості підтримання мінімального рівня pH навіть при мінімальній швидкості додавання розчину глюкози, для регулювання pH необхідно додавати основу. 2. Кукурудзяний екстракт: Додавали одною дозою приблизно через 100 годин від початку ферментації. В разі необхідності можна додавати додаткові дози. 3. Гідроксид натрію або гідроксид амонію: Основу додавали і регулювали таким чином pH в разі, якщо значення pH падало нижче 5,5, незважаючи на мінімальну швидкість додавання розчину глюкози. Рівень спінювання регулювали шляхом додавання суміші соняшникової олії з поліпропіленгліколем у співвідношенні 95:5 з таким розрахунком, щоб об'єм піни не перевищував 25% робочого об'єму ферментаційного чана. Відбирання ферментаційної маси із чана виконували у віці культури 112 годин, 138 годин, 178 годин, 204 години шляхом 4-кратного відведення по 4 м3 розчину. Дані щодо продукування активної речовини Тривалість ферментації 226 годин. Активність за даними високоефективної рідинної хроматографії (материнський розчин): 1825мг/кг. Активність з урахуванням відбирання: 1788мг/кг. Відповідно, кількість ферментованої активної речовини 95т.х1788г/т./1000/105м3 загального об'єму.