Суміш для приготування напою, що містить гідролізовану хлорогенову кислоту

Реферат: Винахід стосується сумішей для приготування напою, які містять мікроорганізм та/або фермент, придатний для гідролізу хлорогенових кислот кавового екстракту з утворенням фенолокислот, причому мікроорганізм і/або фермент не ферментує кавовий екстракт і/або інші інгредієнти під час зберігання і/або не реагує із ними, для покращення антиоксидантних та/або протизапальних властивостей. UA 103764 C2 (12) UA 103764 C2 UA 103764 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Галузь винаходу Даний винахід стосується сумішей для приготування напою. Суміші містять мікроорганізм та/або фермент, придатний для гідролізу хлорогенових кислот кавового екстракту з утворенням фенолокислот. Напої, що готують із сумішей згідно винаходу, мають підвищені антиоксидантні та протизапальні властивості. Рівень техніки У гризунів кава та активні компоненти кави, такі як кофеїн та дітерпени (кафестол, кафеол), є стимуляторами детоксифікуючих ферментів (наприклад, глютатіон-S-трансферази ГСТ) (Cavin C. et al, 1998. The coffee-specific diterpenes cafestol and kahweol protect against aflatoxin B1induced genotoxicity trough a dual mechanism. Carcinogenesis 19, 1369-1375; Cavin, C. et al, 2003. Coffee diterpenes prevent benzo[a]pyrene genotoxicity in rat and human culture systems. Biochemical Biophysical Research Communication 306, 488-495; Huber, W. et al. 2002a. Enhancement of the chemoprotective enzymes glucuronyl transferase and glutathione transferase in specific organs of the rat by the coffee components kahweol and cafestol. Archive of Toxicology 76, 209-217). Пізніше було продемонстровано, що підвищена за допомогою кави ГСТ активність у людей спостерігається після споживання 800 мл кави протягом 5 днів. (Steinkellner, H. et al. 2005. Coffee consumption induces GSTP in plasma and protects lymphocytes against (+/-)-anti-benzo[a]pyrene-7,8-dihydrodiol9,10-epoxide induced DNA-damage: results of controlled human intervention trials. Mut. Res. 591 264-275) Відомо, що такого роду антиоксидантна активність захищає від "окислювального стресу" шляхом зменшення кількості шкідливих вільних радикалів, які можуть стати причиною раку, серцево-судинних захворювань, дегенеративних порушень розумової діяльності та старіння. Для підвищення корисних ефектів харчових продуктів та напоїв необхідно одержати продукти з підвищеною антиоксидантною активністю та іншими видами корисної біологічної активності. Суть винаходу Винахідники несподівано з'ясували, що обробка кавового екстракту за допомогою мікроорганізмів або ферментів, придатних для гідролізу хлорогенових кислот з утворенням фенолокислот, є результатом підвищення антиоксидантних та/або протизапальних властивостей кавового екстракту. Більш того, виявили, що такого роду обробку можна проводити in vivo, коли людина або тварина приймає кавовий екстракт у поєднанні з ферментом або мікроорганізмом, придатним для гідролізу хлорогенових кислот з утворенням фенолокислот. Відповідно, даний винахід стосується порошку напою, який містить: а) сухий кавовий екстракт; та b) мікроорганізм та/або фермент, придатний для гідролізу кафеолової хінної кислоти та діестерів з утворенням кофеїнової кислоти. В іншому варіанті втілення винахід стосується комплекту для приготування напою, який складається принаймні з двох складових: a)перша містить кавовий екстракт b) друга – мікроорганізм та/або фермент, придатний для гідролізу хлорогенових кислот з утворенням фенолокислот. У ще одному варіанті втілення винахід стосується застосування продуктів згідно винаходу. Короткий опис креслень Фігура 1: В основному, гелями вестерн-блоттінгу, які демонструють експресію білка похідних ГСТ (ГСТА4, ГСТР1) та Гем-оксигенезу-1 (ГО-1) у пацюка, є гепатоцити, оброблені за допомогою 200 та 400 мкг/мл NESCAFE RED CUP® (екстрактом обсмажених кавових зерен), який не застосовувався для гідролізу хлорогенових кислот, і 200 та 400 мкг/мл NESCAFE PROTECT®, обробленого Lactobacillus johnsonii, а також контрольні зразки, які не були оброблені кавовим екстрактом. Більш детально наведено у прикладі 1. Фігура 2: Вестерн-блоттінг демонструє підвищення експресії детоксифікуючих ферментів (ГСТР1, 4-нітрохінолін-1-оксид (НХО-1)) у печінці щурів чоловічої статі, яких протягом 2х тижнів годували 5 % NESCAFE RED CUP® (екстрактом обсмажених кавових зерен), який не застосовувався для гідролізу хлорогенових кислот (RN), NESCAFE PROTECT® (суміш екстрактів необсмажених та обсмажених кавових зерен), яка не застосовувалася для гідролізу хлорогенових кислот (Р) та NESCAFE PROTECT®, обробленим Lactobacillus johnsonii (La1-P). Більш детально наведено у прикладі 1. Детальний опис винаходу Суміші, які додаються до кавового екстракту для приготування кавового напою, наприклад, молоко, кавові забілювачі та кавові вершки, добре відомі з рівня техніки. Дані суміші застосовуються споживачами для зміни, наприклад, аромату, зовнішнього вигляду та смакових властивостей кави. Суміші можуть мати форму рідини або сухої речовини, наприклад, порошку, 1 UA 103764 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 який розчиняється та/або суспендується у чашці кави, наприклад, у чашці свіжозвареної кави або у чашці кави, приготовленої шляхом розведення розчинної кави без домішок у воді. В одному з варіантів втілення винаходу суміш, яка додається до кавового екстракту, є кавовими вершками або кавовим забілювачем. Основою вершків може бути, наприклад, молочний білок та/або молочний жир, або це можуть бути немолочні вершки, основою яких є рослинний білок та/або рослинний жир. Суміш може мати форму сухої речовини, наприклад, порошку, вміст води в якому менше ніж 5 %. Також, суміш може мати форму рідини. Суміш, яку додають до кавового екстракту згідно винаходу, містить мікроорганізм та/або фермент, придатний для гідролізу хлорогенових кислот з утворенням фенолокислот. Хлорогенові кислоти є сім'єю складних ефірів, які є проміжним продуктом між транскоричними кислотами та хінною кислотою. Хлорогенові кислоти є природними компонентами кави, переважно у формі моно- та диефірів хінної кислоти та фенольних груп (кофеїнової, ферулової, кумарової, метоксикоричної) у різних позиціях. В одному з варіантів втілення винаходу мікроорганізм та/або фермент, придатний для гідролізу кафеолової хінної кислоти та її диефірів (наприклад, 3-,4-, або 5кафеолової хінної кислоти та її диефірів) та/або ферулової хінної кислоти (наприклад, 3-, 4-, або 5-ферулової хінної кислоти та її диефірів) з утворенням кофеїнової та ферулової кислоти. Рецептура суміші згідно винаходу має бути такою, щоб протягом строку зберігання вона не ферментувала або не реагувала з мікроорганізмом та/або ферментом. Цього можна досягти шляхом надання суміші форми сухого порошку та/або інкапсуляції мікроорганізму та/або ферменту, щоб його вивільнення відбувалося лише у випадку поєднання суміші з кавовим екстрактом або під час споживання. У подальшому суміш згідно винаходу може містити будь-який інгредієнт, прийнятний для включення до суміші для поєднання з кавовим екстрактом для приготування напою. Традиційними інгредієнтами можуть бути, наприклад, різного виду цукор, штучні підсолоджувачі, емульгатори, стабілізатори, згущувачі, агенти текучості, барвники, ароматизатори смаку, запаху та ін. До прийнятних штучних підсолоджувачів відносять: сахарин, цикламін, ацесульфам, підсолоджувачі, основою яких є L-аспартил, такі як аспартам, та їх суміші. До прийнятних емульгаторів відносять: моногліцерид, дигліцерид, лецитин, складні ефіри монодигліцеридів із диацетилвинною кислотою, емульгуючі крохмалі та їх суміші. До прийнятних стабілізаторів відносять: двокалієвий фосфат та натрій цитрат. Прийнятним агентом текучості є натрій алюмосилікат. В одному з варіантів втілення суміш містить молочний білок та/або рослинний білок. У ще одному варіанті втілення суміш містить молочний жир та/або рослинний жир. Кавовий екстракт Кавовим екстрактом згідно винаходу є екстракт необсмажених кавових зерен та/або обсмажених кавових зерен, одержаний при застосуванні води або пари. Численні способи одержання кавового екстракту відомі з рівня техніки, наприклад, з ЕР 0916267. Кавовим екстрактом може бути, наприклад, розчинна кава без домішок. Доступними вже є продукти розчинної кави без домішок, а також, з рівня техніки відомі численні методи виготовлення продуктів розчинної кави без домішок, наприклад, з ЕР 106930. Мікроорганізми Мікроорганізми, придатні для гідролізу хлорогенової кислоти можуть бути, наприклад, визначені згідно прикладів у даній заявці. Прийнятні мікроорганізми можуть бути обрані серед дріжджів, грибів або бактерій. Прийнятними мікроорганізмами можуть бути, наприклад, Aspergillus, наприклад, Aspergillus oryzae, Lactobacillus, наприклад, L. Johnsonii (CNCM I-1225), Bifidobacterium, наприклад, B. lactis (CNCM I-3446) або дріжджі, наприклад, Sacchromyces cerevisiae. Ферменти Прийнятним ферментом є, наприклад, естераза, наприклад, хлорогенат естерази, одержаної з Aspergillus japonicus (що реалізується у Kikkoma, Японія), таназа – з Aspergillus oryzae (УС 3.1.1.20) (що реалізується у Kikkoma, Японія) та палатаза 20000L (ЕС 3.2.2.3) (що реалізується у Novozymes A/S, Данія). Ферменти можуть бути наявні в якості очищених ферментів, наприклад, у формі клітинного лізату мікроорганізму. Прийнятними клітинами можуть бути, наприклад, клітини вищезгаданих мікроорганізмів. Прийнятні способи одержання клітинного лізату відомі з рівня техніки. Кількість мікроорганізму та ферменту повинна бути достатньою для гідролізу необхідної кількості хлорогенових кислот, наявних у кавовому екстракті, з утворенням фенолокислот під час травлення. Кількість необхідного мікроорганізму та ферменту можна визначити за допомогою моделі травлення ТІМ, описаної у прикладі 3, шляхом встановлення кількості хлорогенових кислот, одержаних в результаті гідролізу, під час експерименту з травленням. 2 UA 103764 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Бажано, щоб принаймні 20 %, 30 %, 50 %, або 75 % кафеолових хінних кислот (CQA) та/або ферулових хінних кислот (FQA), наявних у кавовому екстракті, були піддані гідролізу. Комплект складових В одному з варіантів втілення винахід стосується комплекту, який складається принаймні з 2 складових: а) перша містить кавовий екстракт, та b) друга – мікроорганізм та/або фермент, придатний для гідролізу хлорогенових кислот з утворенням фенолокислот. Дві складові розповсюджують разом для приготування напою, але вони фізично відокремлені одна від одної в упаковці продукту. Кінцевий напій, готовий до споживання, готують шляхом змішування двох складових безпосередньо перед споживанням. Якщо одна або дві складові мають форму рідини, їх можна змішати безпосередньо та за бажанням, додатково, можна додати рідину, наприклад, воду або молоко. Також обидві складові можна змішувати шляхом розчинення або суспендування їх у рідині, наприклад, у воді або молоці. Застосовувана рідина може бути гарячою або холодною, залежно від бажання отримати гарячий або холодний напій. Якщо застосовується гаряча рідина, вона не повинна мати температуру, вищу за рівень, при якому може відбутися інактивація мікроорганізму та/або ферменту до споживання напою. Перша складова набору містить кавовий екстракт. У переважному варіанті втілення перша складова має форму сухої речовини, наприклад, форму порошку. Кавовим екстрактом може бути традиційний розчинний кавовий порошок без домішок, наприклад, кавовий екстракт, висушений шляхом розпилювання або сублімації. Порошки розчинної кави без домішок доступні і широко описані в відомостях з рівня техніки. Перша складова також може мати форму рідини. Рідкі кавові екстракти вже доступні, наприклад, у вигляді готових до вживання кавових напоїв. Додатково, перша частина може містити будь-який інший інгредієнт, наприклад, екстракт цикорію, ароматичні добавки, стабілізатори, солі та/або підсолоджувачі. Першу складову можна запаковувати будь-яким прийнятним чином, наприклад, у маленькі пакетики, пляшки або банки. Друга складова містить мікроорганізм та/або фермент, придатний для гідролізу хлорогенових кислот з утворенням фенолокислот. Ця складова може мати форму суміші, яка додається до кавового екстракту, як це було описано вище, переважно у формі кавового забілювача або кавових вершків. Також, вона може містити будь-які інші прийнятні компоненти, наприклад, компоненти, які, зазвичай, наявні у кавових вершках або кавових забілювачах, зокрема, які були згадані в якості інгредієнтів суміші, яку додають до кавового екстракту. Складова може мати форму сухої речовини, наприклад, порошку, або форму рідини, та може бути запакована будь-яким прийнятним чином, наприклад, у маленький пакетик, пляшку або банку. Суміш необхідно складати таким чином, щоб мікроорганізм та/або фермент не ферментував або не вступав у реакцію з іншими інгредієнтами протягом терміну зберігання. Для цього суміш повинна мати форму сухого порошку та/або шляхом інкапсуляції мікроорганізму та/або ферменту, щоб вивільнення мікроорганізму та/або ферменту відбувалося лише у випадку поєднання суміші з кавовим екстрактом або під час споживання. Дві складові можна пакувати разом будь-яким прийнятним чином. Вони можуть бути запаковані у комбінований контейнер, де складові зберігаються фізично окремо і змішуються при відкритті контейнера, або їх можна запакувати в окремі контейнери, які розповсюджують разом для приготування напою. Порошок напою В одному з варіантів втілення винахід стосується порошку напою, який містить: а) сухий кавовий екстракт та b) мікроорганізм та/або фермент, придатний для гідролізу хлорогенових кислот з утворенням фенолокислот. Порошок напою згідно винаходу є порошком, який застосовується для приготування напою шляхом розчинення або суспендування порошку у рідині, наприклад у воді або молоці. Напоєм, який готується з порошку, може бути, наприклад, чорна кава, кава-латте, кава-маккіато, капучіно або будь-який інший напій на основі кави. Сухим кавовим екстрактом може бути, наприклад, традиційний розчинний кавовий порошок без домішок, наприклад, кавовий екстракт, висушений шляхом розпилювання або сублімації. Розчинні кавові порошки без домішок доступні та сповна висвітлені в рівні техніки. Мікроорганізм та/або фермент наявний у сухій порошкоподібній формі, наприклад, у формі сухого сублімованого порошку. Мікроорганізм та/або фермент може бути інкапсульований. Рецептура порошку напою має бути такою, щоб мікроорганізм та/або фермент не ферментував або не вступав у реакцію з кавовим екстрактом та/або іншими інгредієнтами протягом терміну зберігання. У переважному варіанті втілення винаходу порошок напою містить суміш, яка додається до кавового екстракту, як це було описано, у формі сухої речовини. У ще одному переважному варіанті втілення винаходу порошок напою містить вершки. 3 UA 103764 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Порошок напою може містити будь-який інгредієнт, прийнятний для приготування бажаного напою. Прийнятні інгредієнти добре відомі з рівня техніки, і до них можуть належати, наприклад, різного виду цукор, штучні підсолоджувачі, емульгатори, стабілізатори, згущувачі, агенти текучості, барвники, ароматизатори смаку, запаху та ін. До прийнятних штучних підсолоджувачів відносять: сахарин, цикламін, підсолоджувачі, основою яких є L-аспартил, такі як аспартам, та їх суміші. До прийнятних емульгаторів відносять: моногліцериди, дигліцериди, лецитин, складні ефіри монодигліцеридів з диацетилвинною кислотою (основні ефіри), емульгуючі крохмалі, та їх суміші. До прийнятних стабілізаторів відносять двокалієвий фосфат та натрій цитрат. Прийнятним агентом текучості є натрій алюмосилікат. В одному з варіантів втілення порошок напою містить молочний білок та/або рослинний білок. В іншому варіанті втілення порошок напою містить молочний жир або рослинний жир. У ще одному варіанті втілення порошок напою містить підсолоджувач. Застосування продуктів згідно винаходу Продукти згідно винаходу можна застосовувати для підвищення in vivo у людини або тварини антиоксидантної властивості, шляхом споживання напою, приготовленого з продуктів згідно винаходу, наприклад, шляхом стимулювання детоксифікуючих ферментів, таких як глютатіон-S-трансфераза (ГСТ), та шляхом підвищення під впливом генної експресії активності Nrf2. Було встановлено, що підвищена під впливом генної експресії активність Nrf2, підсилює детоксифікацію та стимулює ендогенний захист проти окислювального стресу. Продукти згідно винаходу можна застосовувати для ослаблення запального процесу, наприклад, шляхом зниження рівня простагландіну Е2. Багато проблем зі здоров'ям та порушень пов'язано з окислювальним стресом та запальним процесом. Продукти згідно винаходу можна застосовувати для лікування та профілактики у людини або тварини таких проблем та порушень, шляхом споживання напою, приготовленого з продуктів згідно винаходу. Відповідними проблемами та порушеннями є запалення шкіри, наприклад, фото пошкодження, спричинене ультрафіолетовим випромінюванням, атопічний дерматит, екзема, лущення, свербіж, алергічні симптоми; порушення роботи головного мозку; запальний процес; ожиріння та рак, наприклад, рак шкіри та легень. Продукти згідно винаходу можна застосовувати в якості протидіабетичних засобів, наприклад, шляхом зниження рівнів глюкози в крові та/або шляхом підвищення в крові рівнів лептину, інсуліну та/або с-пептиду; також, в якості засобів для відновлення кісток, наприклад, шляхом підвищення рівня концентрації мінералів в кістках, наприклад, підвищення рівнів естрогену та/або прогестерону в сировотці крові, та/або активності лужних фосфатів; та в якості антиметастатичного засобу, наприклад, з антиангіогенним впливом. Приклади Приклад 1 Обробка NESCAFE PROTECT ® свіжими клітинами Lactobacillus johnsonii Клітини L. johnsonii (CNCM I-1225) виростили (7,0 Е08 куо/мл) та відцентрифугували (5000 г, 10 хв.), після чого осад повторно розчинили у фосфатному буфері (50 ммоль, рН 7,0) при концентрації 0,61 г/мл. Потім додали 30 мг/мл NESCAFE PROTECT ® (cухого коекстракту необсмажених та обсмажених кавових зерен) та суміш проінкубували при 37 °C. Зразки виділили у різні періоди реакції, відцентрифугували (3000 г, 5 хв.), профільтрували через шприцевий фільтр з розміром пор 0,45 мкмоль (Millipore SLHA 025 BS) та протестували за допомогою рідинної хроматографії високого тиску). Паралельно за аналогічних умов провели реакцію контрольного зразку, але без застосування бактерій. Обробка NESCAFE PROTECT ® екстрактом Lactobacillus johnsonii (підданих лізису клітин) Клітини L. johnsonii (CNCM I-1225) виростили (7.0 Е08 куо/мл) та відцентрифугували (5000 г, 10 хв.), після чого, осад повторно розчинили у фосфатному буфері (50 ммоль, рН 7,0) при концентрації 0,61 г/мл. Потім клітини піддали лізису, застосовуючи метод скляних бус. 600 мкл клітинного препарату помістили у пробірку з пробкою, що закручується, до яких додали 600 мкл скляних бус при 0 °C. Потім пробірки на 1 хвилину помістили у мінібедшейкер для інтенсивного перемішування, потім охолодили за допомогою льоду та ще на одну хвилину помістили у мінібедшейкер. Потім необроблений клітинний екстракт додали до 900 мкл розчину NESCAFE PROTECT ® (30мг/мл, фосфатного буферу рН 7,0) і суміш проінкубували при 37 °C. Зразки виділили у різні періоди реакції, відцентрифугували (3000 г, 5 хв.) та профільтрували через шприцевий фільтр з розміром пор 0,45 мкмоль (Millipore SLHA 025 BS) та протестували за допомогою рідинної хроматографії високого тиску. Обробка NESCAFE PROTECT® препаратом Lactobacillus johnsonii, висушеним шляхом розпилювання 4 UA 103764 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 30 мг NESCAFE PROTECT ® розчинили у 1 мл фосфатного буферу (50 мкмоль, рН 7.0) або 9 у 1мл води. До цього розчину додали 10 мг препарату Lactobacillus johnsonii (СNCM І-1225) (3.3 КУО/г), висушеного шляхом розпилювання. Потім суміш проінкубували при 37 °C, а зразки виділили в різні періоди реакції. Після центрифугування (3000г, 5 хв.) та фільтрування (розмір пори шприцевого фільтру - 0,45 мкмоль, Millipore SLHA 025 BS) зразки протестували за допомогою рідинної хроматографії високого тиску. Обробка необсмаженого кавового екстракту препаратом Lactobacillus johnsonii (СNCM І1225), висушеним шляхом розпилювання 30 мг висушеного необсмаженого кавового екстракту розчинили у 1 мл фосфатного буферу (50 мкмоль, рН 7.0) або у 1мл води. До цього розчину додали 10 мг препарату Lactobacillus johnsonii (3.3 Е9 куо/г), висушеного шляхом розпилювання. Потім суміш проінкубували при 37 °C, а зразки виділили в різні періоди реакції. Після центрифугування (3000г, 5 хв.) та фільтрування (розмір пори шприцевого фільтру - 0,45 мкмоль, Millipore SLHA 025 BS) зразки протестували за допомогою рідинної хроматографії високого тиску. Обробка NESCAFE ® концентрованим препаратом Lactobacillus johnsonii (СNCM І-1225) 400 мг NESCAFE SPECIAL FILTRE ® (висушеного екстракту обсмажених кавових зерен) розчинили у 1 мл кип'ятку, а потім розчин охолодили до 37 °C кімнатної температури. До 250 мкл даного кавового розчину додали концентрований препарат Lactobacillus johnsonii у різній кількості (50мкл, 100 мкл, 350 мкл, 750 мкл), потім даний об'єм, за допомогою води, довели до 1 мл. Надалі суміші проінкубували при 37 °C протягом 2 та 4 годин. Після центрифугування (3000г, 5 хв.) та фільтрування зразки протестували за допомогою рідинної хроматографії високого тиску. Тестування за допомогою рідинної хроматографії високого тиску Кавові зразки розвели до 1 мас/об % та протестували за допомогою обернено-фазної хроматографії на колонці СС250/4 Нуклеозил 100-5-С18 (Macherey-Nagel). В якості елюентної системи слугувала вода Мілліпор, 0,1 % трифтороцтова кислота та CH3CN при швидкості потоку 1 мл/хв. Спосіб дозволяє одночасно визначати кафеолові хінні кислоти (CQA), ферулові хінні кислоти (FQA), дикафеолові хінні кислоти (diCQA), лактони ферулові хінні кислоти, кофеїнову кислоту (CA) та ферулову кислоту (FA) (спектральна поглинальна властивість 325 нм), застосовуючи зовнішні стандартні градуювальні криві. Результати виражені відносно часу 0 (t0) або відносно аналогічного часу, але без застосування бактерій. Дослідження чутливого до антиоксиданту елементу ARE гену люциферази рGL-8xARE, який містить 8 зразків ARE, наявний у глютатіоні-S-трансферазі А2 (ГСТА2) щурів, разом з плазмідою pcDNA3.1, яка містить селекційний маркер меоміцину, трансфіціювали у людські MCF7 клітини (Wang et al., Cancer Res. 66, 10983-10994, 2006). ARE (елемент чутливий до антиоксиданту) є зв'язуючою ділянкою фактору транскрипції Nrf2, який регулює діяльність генів у процесі детоксифікації та ендогенного захисту у боротьбі з окислювальним стресом. Плазміда pGL-8xARE містить ген люциферази нижче від восьми зв'язуючих ділянок, який дозволяє відслідковувати активність Nrf2. Для обробки кавою, AREс 32 клітини висадили у 96-лункову мікротитрову пластинку, у модифіковане за способом Дульбеко середовище Ігла. Після 24-годинної обробки різними видами кави, зафіксували активність люциферази світлячка. Експресія білку Основні гепатоцити одержали шляхом перфузії печінки щурів Sprague-Dawley розчином коллагенази (Sidhu et al., Arch. Biochem. Biophys. 301. 103-113. 1993). Виявилося, що життєздатність клітини, оцінена за допомогою діагностики методом виключення трипанового 5 2 синього, варіюється у межах 90-95 %. Клітини висадили щільністю 1,5 × 10 клітин/см на 60 мм пластикову чашку Петрі у 3 мл середовище Уільяма, з додаванням 2 мМ L-глютаміну, 10 мМ Нереs рН 7,4, ITS+, 15000U пеніцилін/стрептоміцин, 100 нМ дексаметозону та 5 % фетальної бичачої сироватки (Hi-clone). Гепатоцити залишили на 2 години для приєднання, після чого їх промили за допомогою EBSS для очищення від залишків та клітин, які не приєдналися. Клітини помістили у нове вільне від сироватки середовище, яке містить 25 нм дексаметазону, яке, пізніше, вкрили шаром матригелю (233 г/мл). По мірі зміни середовища кожних 2 дні до культивованих мікроорганізмів додавали новий шар матригелю. Для дослідження впливу кави на детоксифікуючі ферменти та антиоксидантну експресію білку, після 24 годин після висадки та в період протягом 48 годин перед екстракцією білку та тестування за допомогою вестернблоттингу, до культивованого середовища додали тестовий матеріал. (Cavin et. Al., Food Chem Tox. 46. 1239-48. 2008). Дослідження утворення простагландіну Е2 5 UA 103764 C2 5 Людські НТ-29 клітини товстого кишківника обробили різними видами кави протягом 15 годин, із подальшою коінкубацією протягом 6 годин разом з протизапальним агентом TNF-α (10нг/мл). Тестування утворення простагландіну Е2 у НТ-29 клітинах, провели за допомогою порівняльного ферментативного імуноаналізу (ФІА) (Cavin et al., BBRC 327, 742-49, 2005). Результати Гідроліз хлорогенових кислот з утворенням фенолокислот Експеримент 1: Обробка NESCAFE PROTECT® свіжими клітинами L. johnsonii при різній тривалості реакції та різній кількості клітинного препарату. Результати продемонстровано у табл. 1. 10 Таблиця 1. Результати експерименту 1. Час (год.) 6 24 6 24 6 24 Клітинний препарат (мкл) 750 750 350 350 100 100 Концентрація у % відносно Часу t=0 Кафеолова хінна кислота (CQA) 3 0 14 3 39 15 Ферулова хінна кислота (FQA) 8 0 17 4 42 17 Дикафеолова хінна кислота 0 0 0 0 23 2 (diCQA) Кофеїнова кислота (CA) 13215 13238 14282 15981 10111 13661 Ферулова кислота (FA) 7776 8845 7234 8861 4594 6691 Баланс мас (ммоль/г сухої речовини) Витрачені хлорогенові кислоти 0,20 0,21 0,18 0,20 0,13 0,17 Одержана Кофеїнова кислота (СА) та Ферулова кислота (FA) 0,20 0,20 0,21 0,24 0,14 0,20 15 Експеримент 2: Обробка NESCAFE PROTECT ® екстрактом L. jonsonii (підданих лізису клітин) при різній тривалості реакції та різній кількості клітинного препарату. Результати продемонстровано у табл. 2. Таблиця 2. Результати експерименту 2. Час (год.) 2 2 6 6 Клітинний препарат (мкл) 350,0 100,0 350,0 100,0 Концентрація у % відносно Часу t=0 Кафеолова хінна кислота (CQA) 10 32 6 14 Ферулова хінна кислота (FQA) 15 36 11 18 Дикафеолова хінна кислота 1 8 1 1 (diCQA) Кофеїнова кислота (CA) 13901 10729 16300 12581 Ферулова кислота (FA) 7771 5581 9720 6960 20 25 Експеримент 3: Обробка NESCAFE PROTECT ®, висушеним шляхом розпилювання препаратом Lactobacillus johnsonii. Результати продемонстровано у табл. 3. Таблиця 3. Результати експерименту 3. Кофеїнова хінна кислота (CQA), ферулова хінна кислота (FQA), кафеолова кислота (CA) та ферулова кислота (CA) подані у % відносно необробленого контрольного зразку при t=0. Час (год.) 2 6 24 73 82 3598 1109 Кафеолова хінна кислота (CQA) Ферулова хінна кислота (FQA) Кофеїнова кислота (CA) Ферулова кислота (FA) 6 67 60 6140 2183 32 34 7879 3686 UA 103764 C2 Експеримент 4: Обробка необсмаженого кавового екстракту, висушеним шляхом розпилювання препаратом Lactobacillus johnsonii. Результати продемонстровано у табл. 4. 5 Таблиця 4: Результати експерименту 4. Кофеїнова хінна кислота (CQA), ферулова хінна кислота (FQA), кафеолова кислота (CA) та ферулова кислота (FA) подані у % відносно необробленого контрольного зразку при t=0. Час (год.) Кафеолова хінна кислота (CQA) Ферулова хінна кислота (FQA) Дикафеолова хінна кислота (diCQA) Кофеїнова кислота (CA) Ферулова кислота (FA) 4 77 79 67 2673 961 6 69 71 53 3762 1429 16 58 48 32 5182 1963 24 50 52 20 6145 2432 10 Експеримент 5: Обробка NESCAFE ® концентрованим препаратом Lactobacillus johnsonii. Результати продемонстровано у табл. 5. 15 Таблиця 5. Результати експерименту 5. Кофеїнова хінна кислота (CQA), ферулова хінна кислота (FQA), кафеолова кислота (CA) та ферулова кислота (FA) подані у % відносно необробленого контрольного зразку при t=0. К-сть клітин 50мкл/1мл 100мкл/1мл 350мкл/1мл 750мкл/1мл 50мкл/1мл 100мкл/1мл 350мкл/1мл 750мкл/1мл Час (год.) 2 2 2 2 4 4 4 4 Кафеолова хінна кислота 92 80 46 25 76 60 33 17 (CQA) Ферулова хінна кислота 90 82 61 41 89 74 53 37 (FQA) Дикафеолова хінна кислота 86 68 23 6 75 56 15 6 (diCQA) Кофеїнова 1737 2885 5752 7292 1763 2803 4491 5514 кислота (CA) Ферулова кислота 1509 2468 5327 7586 786 1266 2408 3281 (FA) 20 У таблиці 6 продемонстровано абсолютну концентрацію ряду сполук у двох різних зразках екстрактів необсмажених кавових зерен, які не застосовували для гідролізу хлорогенових кислот (контрольні зразки). 25 Таблиця 6. Суміш необроблених необсмажених кавових екстрактів (контрольні зразки). Концентрація подана у міліграмах на грам сухої речовини. 3-кафеолова хінна кислота 4- кафеолова хінна кислота 5- кафеолова хінна кислота Загальний вміст Кафеолових хінних кислот (CQA) 3-ферулова хінна кислота 4- ферулова хінна кислота 5- ферулова хінна кислота Загальний вміст Ферулових хінних кислот (FQA) 7 A 13.88 17.58 81.16 B 15.57 20.08 85.45 112.62 121.10 0.00 3.29 17.70 0.00 4.41 19.77 20.99 24.18 UA 103764 C2 Кофеїнова кислота Ферулова кислота FA 3-лактон кафеолової хінної кислоти 4-лактон кафеолової хінної кислоти Загальний вміст лактонів 3,4-дикафеолова хінна кислота 3,5- дикафеолова хінна кислота 4,5- дикафеолова хінна кислота Загальний вміст Дикафеолової хінної кислоти 5 10 15 20 25 35 40 0.47 0.25 0.23 0.00 0.00 0.00 6.80 5.53 0.12 12.45 0.00 0.00 0.00 4.34 8.35 8.85 21.55 Експресія білку Основні гепатоцити щурів, після обробки протягом 48 годин 200 мкг/мл NESCAFE RED CUP® (екстрактом обсмажених кавових зерен), не проявили підвищеної експресії білку похідних ГСТ (ГСТА4, ГСТР1) та Гем-оксигенази-1 (НО-1), однак, при обробці 400мкг/мл по вестернблоттінгу проявили слабку індукцію ГСТР1 та експресію НО-1. На противагу, сильніша індукція різних експресій білку похідних ГСТА4, ГСТР1 та НО-1 спостерігалася у NESCAFE PROTECT ®, обробленому 200 мкг/мл та 400 мкг/мл L. johnsonii. Результати продемонстровано у вигляді гелів Вестерн-блоттінгу на фігурі 1. Результати, отримані від дослідження печінки щурів чоловічої статі, яких протягом 2х тижнів годували 5 % NESCAFE RED CUP ® у порівнянні з NESCAFE PROTECT® та NESCAFE PROTECT®, обробленого L. johnsonii, підтвердили наявність ефектів в основних гепатоцитах щурів. Найсильніша індукція експресії детоксифікуючого ферменту спостерігалася у NESCAFE PROTECT®, обробленого L. johnsonii, у порівнянні з необробленим NESCAFE PROTECT® (ГСТР1, НХО-1) та необробленим NESCAFE RED CUP® (ГСТР1, НХО-1). Результати продемонстровано у вигляді гелів Вестерн-блоттінгу на фігурі 2. Дослідження чутливого до антиоксиданту елементу ARE гену люциферази Легеневі ракові клітини людини (AREc32) трансфиціювали кількома зразками ГСТА2-ARE щурів, і застосували прилад-датчик для демонстрації активації кавою Nrf2-ARE. Необсмажений кавовий екстракт, що не застосовувався для гідролізу хлорогенових кислот, та інший необсмажений кавовий екстракт, оброблений протягом 24 годин L. johnsonii, проявили дозозалежне підвищення активності показника Nrf2-люциферази (див. табл. 7). Таблиця 7. Індукція Nrf2 кавою (активність люциферази світлячка, атомних одиниць) Кавовий екстракт мкг/мл 0 200 300 400 600 800 30 0.39 Необроблений необсмажений кавовий екстракт 0 0.3+/-0.1 0.8+/-0.1 1.0+/-0.1 2.0+/-0.2 2.8+/-0.1 Оброблений Оброблений Оброблений кавовий екстракт 1 кавовий екстракт 2 кавовий екстракт 3 0 15.2+/-1.5 29.0+/-3.0 40.4+/-6.6 77.7+/-10.5 77.3+/-4.9 0 22.1+/-1.6 40.5+/-1.6 59.3+/-1.9 90.4+/-0.7 80.7+/-7.3 0 22.6+/-2.4 32.1+/-6.0 47.3+/-3.4 80.4+/-8.2 96.2+/-4.1 Дослідження утворення простагландіну Е2 Потенційний протизапальний вплив необсмаженого кавового екстракту, обробленого L. johnsonii, оцінили на людських НТ-29 клітинах кишківника. Одразу після обробки протизапальним агентом TNF-α підвищився рівень простагландіну Е2 у клітинах кишківника. Для цього дослідження клітини попередньо обробили протягом 24 годин різними кавовими екстрактами (необсмаженим кавовим екстрактом, який не застосовувався для гідролізу хлорогенових кислот, та іншим необсмаженим кавовим екстрактом, обробленим протягом 24 годин L. johnsonii). В останні 6 годин експерименту додали TNF-α (10 нг/мл). Результати (див. табл. 8) показали чітку дозозалежність зменшення утворення простагландіну E2 під впливом кави, порівняно з контрольними зразками клітин, оброблених TNF-α. Таблиця 8. Зменшення утворення простагландіну E2 в результаті обробки кавовим екстрактом порівняно з контрольними зразками клітин, оброблених TNF-α (атомних одиниць). 8 UA 103764 C2 Кавовий екстракт мкг/мл 0 50 100 200 5 10 15 20 25 30 35 40 Необроблений необсмажений кавовий екстракт 100+/-9 110+/-10 85+/-9 80+/-8 Оброблений необсмажений кавовий екстракт 1 100+/-9 18+/-2 6+/-0.9 1+/-0.1 Оброблений необсмажений кавовий екстракт 2 100+/-9 43+/-5 10+/-1.1 1+/-0.2 Приклад 2 Необсмажений кавовий екстракт зі 100 % необсмажених зерен Robusta NESCAFE PROTECT ® - висушений коекстракт необсмажених та обсмажених кавових зерен Ферменти та клітини Мікроорганізми Lactobacillus johnsonii (CNCM I-1225) Bifidobacterium lactis BB12 (CNCM I-3446) Bifidobacterium longum BB536 (ATCC BAA-999) Поживне середовище MRS MRS+цистеїн MRS+цистеїн Хлорогенат естерази (24 од/г), одержаний з Aspergillus japonicus (Kikkoma, Японія) Таназа - з Aspergillus oryzae (Kikkoma, Японія) Препарат із бактеріальних клітин Протестовані штами зібрали (центрифугування 5000 г, 10хв), після успішного досягнення стаціонарної фази, що відповідає 16 годинній інкубації у поживному середовищі при 37 °C в анаеробному оточенні без перемішування. Для першої активації штамів заморожені первісні культури інокулювали у свіже середовище та виростили за ніч. Дану прекультуру застосували для інокуляції культури. Обробка кавових екстрактів бактеріальними клітинами Після культивації та центрифугування, осади повторно розвели у фосфатному буфері (рН 7,0) при концентрації 0,61 г/мл. До 200 мкл даного клітинного препарату додали 800 мкл кавового розчину (3 %), а суміш проінкубували при 37 °C протягом 4, 16 та 24 годин. Інкубація кавових екстрактів хлорогенатом естерази Розчин хлорогенату естерази (25 мг) у 200мкл фосфатного буферу (рН 7,0) додали до 800 мкл розчину кави (3 %). Потім суміш проінкубували при 37 °C протягом 4, 16 та 24 годин. Після завершення часу реакції ферментативну активність зупинили за допомогою нагрівання (3 хв при 90 °C), а суміш профільтрували перед тестуванням. Дослідження чутливого до антиоксиданту елементу ARE гену люциферази Аналогічно прикладу 1. Результати Легеневі ракові клітини людини (AREc32) трансфіціювали кількома зразками ГСТА2-ARE щурів, і застосували прилад-датчик для демонстрації активації кавою Nrf2-ARE. Необсмажений кавовий екстракт, що не застосовувався для гідролізу хлорогенових кислот (необроблений), необсмажений кавовий екстракт, оброблений протягом 24 годин Lactobacillus johnsonii (Lj), необсмажений кавовий екстракт, оброблений протягом 24 годин Bifidobacterium lactis (BL) та необсмажений кавовий екстракт, оброблений протягом 4 годин хлорогенатом естерази (СЕ), кожний проявив дозозалежне підвищення активності показника Nrf2-люциферази (див. табл. 9). Таблиця 9. Показник активності Nrf2-люциферази необроблених та оброблених кавових екстрактів (атомних одиниць) Види кави мг/мл 0 100 200 400 600 Необсмажена необроблена кава Необсмажена оброблена Lj кава Необсмажена оброблена Bl кава Необсмажена оброблена CE кава 0 0.3+/-0.1 0.8+/-0.1 1.0+/-0.1 2.0+/-0.2 0 0.5+/-0.1 1.0+/-0.1 5.2+/-0.4 11.1+/-0.5 0 0.3+/-0.1 1.1+/-0.1 3.1+/-0.3 7.2+/-1 0 1.0+/-0.1 2.1+/-0.2 8.2+/-1.4 11.3+/-1.4 45 9 UA 103764 C2 Необсмажені кавові екстракти обробили різноманітними мікроорганізмами та хлорогенатом естерази для гідролізу хлорогенових кислот. Результати продемонстровані у табл. 10. 5 Таблиця 10. Суміш необсмажених кавових екстрактів після обробок. Кофеїнова хінна кислота (CQA), ферулова хінна кислота (FQA), кафеолова кислота (CA) та ферулова кислота (FA) подані у % відносно необробленого контрольного зразку при t=0. Час (годин) Lactobacillus Johnsonii 4 16 24 Кафеолова хінна 42 кислота (CQA) Ферулова хінна 49 кислота Дикафеолова хінна 35 кислота (diCQA) Кофеїнова кислота 12505 (CA) Ферулова кислота 4607 (FA) Bifidobacterium lactis 4 16 24 Хлорогенат естерази 4 16 24 15 12 96 79 74 3 2 2 15 15 33 12 6 73 24 23 6 3 85 70 64 0 0 0 17148 18107 1521 4182 5283 18917 17275 18318 7192 7597 5020 6970 7105 2620 5685 6293 10 NESCAFE PROTECT ® обробили різними мікроорганізмами та хлорогенатом естерази для гідролізу хлорогенових кислот. Результати продемонстровано у табл. 11. 15 Таблиця 11. Суміш NESCAFE PROTECT ® після обробок. Кофеїнова хінна кислота, ферулова хінна кислота, кафеолова кислота та ферулова кислота подані у % відносно необробленого контрольного зразку при t=0. Час (годин) Lactobacillus Johnsonii 4 16 24 Кафеолова хінна 33 кислота (CQA) Ферулова хінна 42 кислота (FQA) Дикафеолова хінна 18 кислота (diCQA) Кофеїнова кислота 7942 (CA) Ферулова кислота 4051 (FA) 20 25 30 Bifidobacterium lactis 4 16 24 Хлорогенат естерази 4 16 24 13 13 97 81 80 5 3 3 21 20 54 23 20 54 15 14 2 2 91 72 67 0 0 1 9429 9933 968 2258 2840 10879 10198 10750 5226 5504 3065 4518 5144 2794 5140 5518 Приклад 3 Шлункова модель малого кишківника (ТІМ) Шлункова модель малого кишківника, ТІМ-1, містить 4 з'єднаних відділення, які представляють шлунок, дванадцятипалу кишку, тонку кишку та повздовжню кишку. Кожний відділ складається з твердої зовнішньої стінки з гнучкою внутрішньою стінкою. Гнучка стінка оточена водою при температурою 37 °C, що дозволяє перемішувати їжу з виділеними ферментами за допомогою перистальтичних рухів у шлунково-кишковому тракті. Експерименти у моделі проводили за нормальних фізіологічних умов, притаманних шлунково-кишковому тракту. Під час експериментів підтримували температуру 37 °C та імітували слинну, шлункову, жовчну та панкреатичну секрецію. За процесом травлення у моделі спостерігали протягом 6 годин. Протягом перших 3,5 годин вміст шлунку поступово перемістили до«пилоричного клапана" малого кишківника. В кінці експерименту приблизно 80 % вмісту малого кишківника поступово перемістили до "великого кишківника" через ілеоцекальний клапан. Приблизно за 5 годин секреції 1 М НС1 рівень рН у шлунку поступово знизився з 6,5 до 2,0; рівень рН вмісту малого кишківника залишався 6,5 у дванадцятипалій кишці, 6,8 у тонкій кишці та 7,2 у повздовжній кишці. Продукти травлення та воду абсорбували з дванадцятипалого 10 UA 103764 C2 5 10 15 20 25 30 35 та повздовжнього відділів шляхом відкачування рідини діалізу через порожні волокнисті мембрани з молекулярною масою перерізу 5000 Далтонів. Імітація травлення кавового ескстракту 4,5 г NESCAFE PROTECT® (коекстракту необсмажених та обсмажених кавових зерен) розвели у 310 мл ацетатного буферу (20 ммоль, рН 6,5). Після того, як додали 10 мл початкового осаду (розчину ферментів 5 г пепсину та 5 г ліпази), розчин ввели у шлункове відділення моделі ТІМ. Під час процесу травлення у часові проміжки 0-2, 2-4, 4-6 годин зібрали весь діалізат. Після 6 годин експерименту залишки з відділень шлунку, дванадцятипалої кишки, тонкої та повздовжньої кишки протестували для обчислення балансу маси хлорогенових кислот. Зразки пропустили через шприцеві фільтри з розміром пори 0,45 мкм (Millipore SLHA 025 BS) та протестували за допомогою рідинної хроматографії високого тиску, як описано у прикладі 1. Щодо експерименту з Lactobacillus johnsonii (CNCM I1225), то 310 мл розчину ацетатного 9 буферу (200 ммоль, рН 6,5), який містить всього 3,3 КУО, висушеного шляхом розпилювання препарату L. johnsonii, ввели у шлункове відділення, після додавання 10 мл початкового осаду. Потім 10 мл ацетатного буферу, який містить 4,5 г Nescafe Protect, за допомогою шприцу ввели у шлункове відділення через 15 хвилин від початку імітації процесу травлення. Під час процесу травлення у часові проміжки 0-2, 2-4, 4-6 годин зібрали весь діалізат, який проходив через напівпроникні порожнисто-волокнисті мембрани, приєднані до відділень тонкої та повздовжної кишки. Усю речовину, що надійшла до повздовжньої кишки, зібрали у часові проміжки 0-2, 2-4, 4-6 годин. Зі шлункового відділення аліквотні проби взяли одразу після додавання NESCAFE PROTECT® через 1 годину. Після 6 годин, за допомогою рідинної хроматографії високого тиску, протестували залишки з відділень шлунку, дванадцятипалої кишки, тонкої кишки та повздовжної кишки, щоб обчислити баланс маси 5-кафеолової хінної кислоти (5-CQA). Аналогічні дослідження провели з NESCAFE COOL® (екстрактом обсмаженої кави з вершками та підсолоджувачами) та із звичайною наявною на ринку профільтрованою завареною обсмаженою та меленою кавою з додаванням вершків та 5-кафеолової хінної кислоти (5-CQA). Результати Відсоток 5-кафеолової хінної кислоти (5-CQA), що був відмічений гідролізом протягом експериментів з додаванням L. johnsonii, продемонстровано у табл. 12. Не відмічено гідролізу 5кафеолової хінної кислоти (5-CQA) в експериментах з контрольним зразком без додавання L. johnsonii. Таблиця 12. Гідроліз 5-кафеолової хінної кислоти в кавових екстрактах та чистої 5кафеолової хінної кислоти (5-CQA), як це визначено у моделі ТІМ (% загальної 5-кафеолової хінної кислоти, наявної у зразках, що був підданий гідролізу). Продукт 5- кафеолова хінна кислота NESCAFE PROTECT® NESCAFE COOL® Фільтрована заварена обсмажена та мелена кава з вершками % гідролізованої 5-кафеолової хінної кислоти 48 34 79 53 Суміші для приготування напою 40 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 45 50 1. Порошок напою, який містить: a) сухий кавовий екстракт та b) мікроорганізм та/або фермент, придатний для гідролізу кафеолової хінної кислоти та діестерів з утворенням кофеїнової кислоти, який відрізняється тим, що мікроорганізм і/або фермент не ферментує кавовий екстракт і/або інші інгредієнти під час зберігання і/або не реагує із ними. 2. Порошок напою за п. 1, який містить вершки. 3. Порошок напою за будь-яким з пп. 1, 2, який містить підсолоджувач. 4. Порошок напою за будь-яким з пп. 1-3, який містить молочний білок та/або молочний жир. 11 UA 103764 C2 5 10 15 20 5. Порошок напою за будь-яким з пп. 1-4, який відрізняється тим, що мікроорганізм, придатний для гідролізу кафеолової хінної кислоти та діестерів з утворенням кофеїнової кислоти, є молочнокислою бактерією. 6. Комплект для приготування напою, який містить принаймні 2 складові: a) першу складову, яка містить кавовий екстракт, та b) другу складову, яка містить мікроорганізм та/або фермент, придатний для гідролізу хлорогенових кислот з утворенням фенолокислот, який відрізняється тим, що мікроорганізм і/або фермент не ферментує кавовий екстракт і/або інші інгредієнти під час зберігання і/або не реагує із ними. 7. Комплект за п. 6, який відрізняється тим, що перша складова містить розчинну каву без домішок. 8. Комплект за будь-яким з пп. 6, 7, який відрізняється тим, що друга складова містить молочний білок та/або рослинний білок. 9. Комплект за будь-яким з пп. 6-8, який відрізняється тим, що друга складова містить вершки та/або підсолоджувачі. 10. Комплект за будь-яким з пп. 6-9, який відрізняється тим, що мікроорганізм, придатний для гідролізу хлорогенових кислот з утворенням фенолокислот, є молочнокислою бактерією. 11. Застосування порошку напою за будь-яким з пп. 1-5 або комплекту за будь-яким з пп. 6-10 для підвищення антиоксидатної властивості in vivo у людини або тварини, що споживає приготовлений з них напій, причому наявний у порошку напою мікроорганізм і/або фермент не ферментує кавовий екстракт і/або інші інгредієнти під час зберігання і/або не реагує із ними. 25 Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 12